Introduction
troubles neurodéveloppementaux humains, tels que microcéphalie, ne peuvent être mal étudiés dans des modèles animaux en raison du fait que les cerveaux humains ont une surface corticale étendue, une caractéristique unique différent des animaux non humains.
Cet aspect rend le développement du cerveau humain un processus complexe qui ne peut pas être suffisamment étudié dans une 2D, système in vitro de culture cellulaire. Nouvelles techniques de culture 3D permettent la génération d'organites analogue à un tissu à partir de cellules souches pluripotentes induites (CISP). La différenciation des cellules souches pluripotentes dans une culture en suspension 3D in vitro permet la formation de différents types de cellules en temps opportun et spécifique à la région, ce qui donne lieu à une organisation, d'un tissu stratifié 1, 2, 3. Merci aux laboratoires qui furent les pionniers des technologies de culture 3D et démystifié la complexité de la formation d'organes, à partir de cellules souches,nous avons développé une méthode robuste de générer organites du cerveau pour délimiter les événements précoces du développement du cerveau humain et de modéliser microcéphalie in vitro 1, 2, 3. Il est à noter que nous avons adapté la méthode originale développée par Lancaster et al. pour générer des organites cérébraux 1. Cette méthode a été modifiée en fonction de nos exigences expérimentales.
Le but d'une étude de Gabriel et al. était d'analyser les mécanismes cellulaires et moléculaires de l'entretien des cellules souches neurales au cours du développement du cerveau. Pour ce faire, une étude mécaniste a été réalisée en analysant les cellules progénitrices neurales (PNJ) dans organites du cerveau 3D provenant d'un patient microcéphalie 4. Ce patient effectue une mutation dans CPAP, une protéine centrosomale conservée nécessaire pour biogenèse centrosome 5. Une hypo largement acceptéethèse est que microcephaly est le résultat d'une diminution de la piscine de l' APN, et cela peut être dû soit à la mort cellulaire ou de différenciation précoce 1, 6, 7, 8, 9.
En analysant les zones ventriculaires (VZS) de organites du cerveau microcéphalie, il a été montré qu'un nombre important de PNJ subissent une division cellulaire asymétrique, contrairement organites du cerveau provenant d'un donneur sain 4. De nombreuses analyses microscopiques et biochimiques des organites du cerveau microcéphalie ont révélé un rôle inattendu pour la PPC dans le démontage de 4 cil en temps opportun. Plus précisément, CPAP mutée est associée à un démontage de cil retardé et le cycle cellulaire retardée ré-entrée, ce qui conduit à la différenciation prématurée des NPC 4. Ces résultats suggèrent un rôle dans microcéphalie et cilia eimplication EIR lors du contrôle de la neurogenèse et la taille du cerveau 10.
La première partie de ce protocole est une description d'un procédé en trois étapes pour générer des organites homogènes du cerveau. Comme mentionné précédemment, le protocole de Lancaster original a été adapté et modifié en fonction de notre objectif 1. Tout d'abord, iPSCs humains sont cultivées dans un état opérationnel sans matrice définie sur Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Cette étape permet d'éviter les variations des cultures de cellules souches pluripotentes dépendant de l'alimentation. Dans ce protocole, l'induction de la différenciation de neurones pour former un épithélium neural commence directement à partir de iPSCs. En sautant l'étape de formation corps embryoïdes (EB), le produit de différenciation de neurones, d'une manière plus contrôlée et dirigée. Cette approche limite la formation spontanée et non orienté d'autres couches de cellules germinales, tels que le mésoderme et l'endoderme. En appliquant ce protocole, neurosphères contenant des rosettes de neurones peuvent être récoltées au jour 5 pour EHS enrobage de matrice et une culture en suspension stationnaire. Le milieu organoïde utilisé pour la troisième étape de notre protocole est complété par dorsomorphin et SB431542. Dorsomorphin est un inhibiteur de petite molécule de protéine morphogénique osseuse (BMP), et SB431542 inhibe la TGFß / activine / voie de signalisation nodal. La combinaison de ces facteurs pourrait favoriser la différenciation neuronale plus efficace que l' acide rétinoïque seul 11, 12, 13, 14.
Au total, ces modifications permettent la génération reproductible de organites du cerveau, avec des variations minimes à travers organites. Fait important, cette méthode a été appliquée pour générer des organites robuste du cerveau microcéphales de iPSCs patients qui portent des mutations dans des gènes qui affectent centrosomes et de la dynamique du cycle cellulaire.
La seconde partie de ce protocole donne des instructions pour préparer brain organites pour l'analyse et l'interprétation des défauts cellulaires dans microcéphalie. Cela comprend la fixation, cryosectioning, immunofluorescence et analyse microscopique confocale. Ce protocole fournira au lecteur une description détaillée des résultats attendus et des conseils d'interprétation.
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Protocol
1. Génération du cerveau organites (23 jours)
- Initiation de neuroectoderme (5 jours)
REMARQUE: Les points suivants doivent être pris en considération avant le début de la différenciation. La méthode de reprogrammation (lentiviral-, sendai-virus-, épisomiques ou etc. , selon microARN) pour obtenir CSPi humaines devrait idéalement être la même pour tous les patients et le contrôle des lignes iPSC. Divers kits de reprogrammation et instructions basées sur des protocoles publiés sont disponibles 15, 16, 17, 18. La qualité des lignes iPSC humaines est la clé pour une différenciation optimale accomplir. Surveiller la colonie et la morphologie des cellules au microscope et valider la pluripotence en testant l'expression de marqueurs tels que Oct3 / 4, Nanog, ou TRA-1-60.- CSPi humaines de la culture dans des conditions sans alimentation dans le milieu A sur un plat recouvert de Engelbreth-Holm-Swarmmatrice (EHS).
REMARQUE: cultiver des liaisons de connexion iPSCs humains et exempt de sérum pour maintenir une condition de culture défini et d'éviter une étape supplémentaire pour l'élimination des cellules nourricières embryonnaires de souris (MEF) avant le début de la différenciation. Le nombre de passage optimal pour l'homme iPSCs pour démarrer les plages de différenciation de passage 15 lors de la reprogrammation de passage 70 au total. Lorsque repiquage, détacher colonies hiPSC en tant que cellules globale à l'aide d'une solution de détachement cellulaire appropriée avec une faible contrainte mécanique et d'une pipette sérologique de 2 mL pour transférer les agrégats dans une nouvelle boîte. Évitez la dissociation des cellules individuelles, car cela pourrait induire la différenciation et l'apoptose dans la plupart des lignes iPSC. Il a été rapporté que le long terme, une seule cellule repiquage pourrait augmenter les altérations génomiques dans CSPi humaine 19, 20. Évitez les procédures de détachement de cellules, qui nécessitent une étape de centrifugation pour éliminer la solution de détachement, car cela réduit la viabilité globale de CSPi. Testertoutes les cultures pour microbiennes, en particulier les contaminations mycoplasmes, sur une base régulière, car cela pourrait altérer la qualité des CSPi et leur capacité de différenciation.- Enduire un plat de culture de tissu de 60 mm avec la matrice EHS selon les instructions du fabricant.
- Décongeler une aliquote de 1 x 10 6 iPSCs humains. Ensemencer les iPSCs dans une boîte de culture tissulaire de 60 mm revêtues dans une matrice EHS et contenant 5 ml de milieu A (voir le tableau des matériaux). Changer le support quotidien et passage après 5 à 7 jours lorsque les cellules atteignent ~ 80% de confluence.
REMARQUE: Passage de la iPSCs à 80% de confluence décongelées en utilisant des méthodes standard, telles que le détachement sans enzyme de colonies 21, au moins une fois avant de commencer la différenciation. En bref, éliminer le milieu COPS, laver les cellules une fois avec préchauffé à 37 ° C modifié par Dulbecco milieu Eagle: mélange nutritif F12 (DMEM / F12), et laisser incuber les CSPi suivant le fabricantdes instructions en utilisant le réactif A (voir le tableau de matériaux). Ne pas dépasser le temps d'incubation recommandé afin d'éviter la dissociation des cellules individuelles. CSPi humaines doivent être détachés et flottants sous forme d'agrégats, non pas comme des cellules individuelles. Ils peuvent ensuite être transférés vers de nouveaux plats enrobés de matrice EHS; par exemple, COPSi agrégats d'un plat de 60 mm peut être distribué à 4 nouveaux plats de 60 mm. - Vérifier les mycoplasmes avec un kit de détection de mycoplasmes selon les instructions du fabricant. Utilisez uniquement CSPi sans mycoplasmes, comme mycoplasmes peut modifier la capacité de différenciation des CSPi.
- Dissociable iPSCs (80% de confluence) et préparer une suspension de cellules isolées à l'aide de réactif B.
- Laver les iPSCs une fois avec préchauffé (37 ° C) DMEM / F12.
- Ajouter le réactif préchauffé B (par exemple, 1 mL dans une boîte de 60 mm) et incuber les iPSCs pendant 5 min à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Flick 20 fois avec un doigt sur le côté et le bas dele plat à détacher les CSPi. Vérifiez que le détachement des cellules au microscope.
- Pipeter la suspension cellulaire et dans le plat 5 fois avec une micropipette 1 ml.
- Ajouter 3 ml de milieu A pour diluer 1 ml de réactif B et récupérer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugation de 15 ml.
- tourner doucement les iPSCs (500 xg) pendant 4 min à température ambiante.
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de milieu B et compter le nombre de cellules avec un hémocytomètre.
REMARQUE: Sachez que l'utilisation moyenne B pour la remise en suspension. Éviter d'utiliser le milieu A, car il contient une concentration trop élevée de bFGF, ce qui pourrait inhiber la différenciation.
- Diluer la suspension de cellules à 4,5 x 10 5 cellules par ml dans du milieu B supplémenté avec 10 pM de protéine kinase associée à rho-inhibiteur (Y-27632).
- Ajouter 100 ul par puits dans un non-adhérent, v-fond, la plaque à 96 puits.
REMARQUE: Assurez-vous que les cellules sont également distribuées dans le SUSpension en secouant le tube à chaque fois avant de retirer des portions de 100 ul. Il est important que chaque puits contienne un nombre équivalent de cellules afin d'obtenir des neurosphères homogènes en taille et en forme (ronde, des surfaces définies). - Tourner doucement la plaque avec les cellules à 500 xg et à température ambiante pendant 3 minutes et incuber à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Changer le support quotidien en enlevant 50 pi et en ajoutant 50 pi de milieu frais B dans chaque puits pour les 5 prochains jours.
- CSPi humaines de la culture dans des conditions sans alimentation dans le milieu A sur un plat recouvert de Engelbreth-Holm-Swarmmatrice (EHS).
2. Embedding Neurosphères dans Matrix EHS (4 jours)
- Préparer milieu neurosphères en mélangeant ce qui suit: mélange 1: 1 de DMEM / F12 et le milieu C (v / v), 1: 200 (v / v) Supplément 1, 1: 100 (v / v) Supplément 2 sans (p / o) la vitamine A, 1: 100 L-glutamine, 0,05 mM d'acides aminés non essentiels (MEM), 100 U / mL de pénicilline, 100 ug / mL de streptomycine, 1,6 g / L d'insuline et 0,05 mM de β-mercaptoéthanol.
- Recueillir l'esprit neurosphèresha 200 ul micropipette utilisant un ~ 2 mm pointe préalablement coupé avec des ciseaux stériles.
- Placer les neurosphères environ 5 mm de distance les uns des autres sur un film de paraffine (3 x 3 cm 2) dans un récipient vide de 100 mm et enlever soigneusement autant du milieu restant possible.
- Ajouter une goutte (7 pi) de la matrice EHS sur chaque neurosphères unique.
- Incuber la matrice EHS gouttes avec les neurosphères pendant 15 min dans un incubateur.
- Laver les neurosphères soigneusement du film de paraffine par les bouffées de chaleur avec le milieu Neurosphère. Pour rincer, utiliser une micropipette de 1 ml et une nouvelle boîte de Pétri de 100 mm contenant 10 ml de milieu neurosphères.
- Incuber les neurosphères pour les 4 prochains jours et ajouter 2 ml de milieu frais Neurosphère le jour 2.
REMARQUE: Assurez-vous que les étagères dans l'incubateur sont à plat afin que les neurosphères de matrice intégrée EHS ne s'agglutiner d'un côté du plat.
3. organites dans une suspension RotaryCulture (14 Jours)
- Préparer cerveau moyen organoïde en mélangeant ce qui suit: mélange 1: 1 de DMEM / F12 et le milieu C (v / v), 1: 200 (v / v) Supplément 1, 1: 100 (v / v) Supplément 2 w / o La vitamine A, 1: 100 L-glutamine, 0,05 mM de MEM, 100 U / mL de pénicilline, 100 ug / mL de streptomycine, 1,6 g / L d'insuline, 0,5 pM dorsomorphin, 5 uM SB431542, et 0,05 mM de β-mercaptoéthanol.
- Ajouter 100 ml de cerveau organoide moyenne à chaque flacon à rotation par ses bras latéraux et les placer dans un incubateur pour préchauffage pendant au moins 20 min.
- Mettre en place un programme d'agitation à 25 tours par minute, selon les instructions du fabricant.
NOTE: Avant de transférer les neurosphères de matrice intégrée EHS dans des flacons spinner, assurez-vous qu'ils sont tous séparés. Si deux ou plus sont connectés à travers la matrice EHS, les séparer par découpage de la matrice de liaison avec un scalpel. - Transférer délicatement les neurosphères de matrice intégrée EHS dans des flacons contenant spinner 100 ml de milieu organoide nousune pipette sérologique ing 2 ml. Utiliser les bras latéraux de la fiole centrifuge pour transférer les neurosphères dans le ballon.
- Placer les flacons rotatifs sur une plate - forme d'agitation magnétique dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2; c'est le jour 0 de la culture organoide.
- Changer le support une fois par semaine (ou plus souvent quand il y a un changement de couleur) en supprimant la moitié du milieu et en ajoutant la même quantité de milieu frais.
REMARQUE: Lorsque vous prenez les flacons spinner de l'incubateur, attendez 3-5 minutes pour laisser les organites couler au fond du flacon. Éliminer le milieu en plaçant la pointe de pipette en verre (relié à une pompe) sur la surface du liquide; aspirer le milieu avec précaution à travers une ouverture latérale / bras du ballon. Ces manipulations doivent être effectuées sous la hotte laminaire.
4. Analyse du cerveau organites
- Fixation des organites
- Recueillir les organites au jour 14 de la culture de flacon spinner with une réduction de 1 ml micropipette (cut ~ 5 mm). Mettez tous dans un plat de 60 mm et les laver une fois avec 5 ml de DMEM / F12 chaud pendant 3 min.
- Préparer un tube de 1,5 ml avec 500 ul de chaleur paraformaldehyde à 4% (PFA).
Attention: Porter une protection peau et les yeux et le travail sous une hotte de sécurité lors de la manipulation PFA fixatif. - Placez chaque organoide séparément dans chaque tube et les fixer pendant au moins 30 min à température ambiante. Ne pas fixer les organites pendant plus de 60 min. Pour déplacer les organites, utilisez une boucle d'inoculation ou tout autre legs qui est pratique.
- Retirer le PFA et laver les organites fixes deux fois pendant 10 min chacune avec 1 ml de PBS.
- Stocker les organites dans 1 ml de PBS à 4 ° C pendant jusqu'à 7 jours, jusqu'à utilisation ultérieure.
- Intégrer les organites pour cryosectioning
- Retirez le PBS et ajouter 1 ml de saccharose à 30% dans une solution d'eau distillée par tube pour déshydrater les organites avant de les cryofreezing; après avoir ajouté sucrosolution soi, les organites doit être flottant à la surface. Stocker les organites pendant une nuit dans une solution de saccharose à 4 ° C; le lendemain, les organites auraient dû sombré au fond du tube.
REMARQUE: Les organites peuvent être conservés jusqu'à 3-5 jours à 4 ° C en solution de saccharose, le cas échéant. - Remplir un moule de spécimen de vinyle avec 400 pi de composé de température de coupe optimale (OCT) et en utilisant une boucle d'inoculation pour placer une organoïde au centre du moule. Étiqueter le bord du moule avec le nom de l'échantillon.
- Congeler le moule organoïde contenant à -80 ° C jusqu'à ce que cryosectioning.
- Manteau cryoslides de verre avec 0,1% de poly-L-lysine solution (PLL) dans du PBS pendant 5 min à température ambiante et laisser les lames sécher pendant 3 h. Conserver les lames à 4 ° C et les réchauffer au tempérée ambiante avant utilisation.
REMARQUE: PLL revêtement est une étape importante, car elle empêche les tranches organoïdes de flotter loin. Collecter et stocker une solution PLL à 4 ° C pendant jusqu'à 3mois. Avant de réutiliser, filtrer avec une seringue de 0,22 um et laisser réchauffer à la température ambiante. - Section cryofrozen organites dans des tranches 20-50 pm d'épaisseur sur verre revêtu PLL-cryoslides 22. Laissez les lames avec les sections sécher pendant 1 h à température ambiante. Stocker les sections à -80 ° C jusqu'à traitement ultérieur.
- Retirez le PBS et ajouter 1 ml de saccharose à 30% dans une solution d'eau distillée par tube pour déshydrater les organites avant de les cryofreezing; après avoir ajouté sucrosolution soi, les organites doit être flottant à la surface. Stocker les organites pendant une nuit dans une solution de saccharose à 4 ° C; le lendemain, les organites auraient dû sombré au fond du tube.
5. immunofluorescente des sections organoide Staining
NOTE: Pour la caractérisation générale des organites, coloration avec nestine, un marqueur progénitrices neurales et TUJ1, un marqueur pan-neuronale, il est recommandé. A titre d'exemples supplémentaires, une coloration immunofluorescente avec phospho-vimentine (p-VIM), qui marque mitotiques apicales des cellules gliales radiales, et Arl13b, pour cil, sont décrits. Pour tester l'apoptose, utilisez le test terminal désoxynucléotidyle transférase (TdT) dUTP Nick-End étiquetage (TUNEL). Placer les lames dans une boîte en plastique pendant les incubations pour les protéger de la poussière, la lumière,et sécher.
- Décongeler les diapositives pendant 30 min à température ambiante.
- Laver les lames deux fois avec 200 pl de PBS-glycine (0,225 g de glycine dans du PBS) pendant 3 min pour étancher l'autofluorescence induite par PFA.
- Perméabiliser les sections avec 200 ul de 0,5% de Triton X100 / 0,1% de Tween dans une solution de PBS pendant 10 min à température ambiante.
- Laver les deux fois avec 200 ul de solution PBS-glycine pendant 3 min.
- les incuber avec 200 ul de 0,5% de gélatine de poisson / 0,1% de Triton X100 dans du PBS pendant 1 h à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C pour bloquer la liaison non spécifique d'antigène.
NOTE: Si un test TUNEL est nécessaire, effectuer l'essai selon le protocole du fabricant. Commencez par le dosage TUNEL avant d'effectuer la immunomarquage, car elle pourrait interférer avec des anticorps secondaires et étancher fluorophores quand il est utilisé par la suite. - Diluer les anticorps dans une solution de blocage aux concentrations suivantes: nestine, 1: 200; p-Vim, 1: 500; TUJ1, 1: 200;Arl13b, 01h20; et des anticorps secondaires, 1: 1.000.
- Incuber avec 200 ul du premier anticorps primaire (par exemple, la nestine) pendant 1-2 h à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C.
- Laver 3 x 3 min avec 200 pi de solution de blocage.
- Diluer le premier anticorps secondaire (anti-souris 488) 1: 1000 dans une solution de blocage et incuber la lame dans 200 ul pendant 1-2 h à température ambiante. Désormais, protéger toujours les diapositives de la lumière.
- Laver 3 x 3 min avec 200 pi de solution de blocage.
- Incuber avec 200 ul de la prochaine anticorps primaire (par exemple, TUJ1) pendant 1-2 h à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C.
- Laver 3 x 3 min avec 200 pi de solution de blocage.
- Ajouter 200 ul de l'anticorps secondaire suivant (anti-lapin 647) pendant 1-2 h à la température ambiante.
- Laver 3 x 3 min. avec 200 pi de solution de blocage.
- Ajouter 200 ul de 4' , 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) à une 30 nM Concntration dans du PBS pendant 15 min à température ambiante pour la coloration nucléaire.
- Laver 2 x 3 min avec 200 pi de solution de blocage.
- Laver 1 x 1 min avec 200 pi d'eau distillée et laisser les sections sécher pendant 10-20 min, jusqu'à ce qu'aucune goutte d'eau évidente est plus visible.
- Monter les sections avec un milieu d'inclusion. les conserver à l'abri de la lumière à 4 ° C pendant plusieurs semaines.
- Procéder à une analyse microscopique de l'image d'une vue d'ensemble de la zone organoïde, ventriculaire, la plaque corticale primitive, et d'autres zones d'intérêt.
- Utiliser un microscope confocal avec les filtres objectifs et fluorescents huile 63X, choisi en fonction des anticorps secondaires marqués par un colorant fluorescents utilisés 1, 10.
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Representative Results
La génération des organites du cerveau nécessite au moins trois semaines de culture en continu (Figure 1A). Pour obtenir des résultats reproductibles, nous recommandons que le chercheur documente toutes les étapes et, surtout, évite toute modification concernant les composants du milieu, des points de temps, et la manipulation des cellules. Nous donnons ici un résumé de la façon d'évaluer si les étapes critiques sont atteints afin d'obtenir organites de qualité suffisante à la fin de l'expérience. La formation de neurosphères dans une plaque à 96 puits doit être clairement visible au jour 4. Les neurosphères peuvent être reconnus comme des sphères bien définies sur le fond de chaque puits (figure 1B, étape 1).
Le jour 5, neurosphères devrait être ~ 500 um de diamètre et présentent une surface lisse, avec un bord brillant entourant un centre sombre. Il pourrait être possible d'observer déjà stru étendue de rosette comme neuralectures au sein de ce rebord lumineux (Figure 1C, début de l' étape 2). Si les neurosphères se désagréger ou apparaissent plus comme des agrégats de cellules, la différenciation ne devrait pas se poursuivre plus loin. Enfin, organites devraient augmenter et présentent une taille similaire pendant le processus de différenciation dans des flacons rotatifs (figure 1D, étape 3). Voir le tableau de dépannage (tableau 1) pour plus d' informations.
La qualité du jour 14 organites doit être vérifiée par microscopie optique. VZS sont composées de couches épaisses de NPC nestine-positives / cellules gliales radiales ayant une forme nucléaire palissade au niveau du côté apical. D'autre part, la plaque corticale primitive contiendra abondants neurones TUJ1 positifs du côté de base, l' espace distinct du côté apical (figure 1E). Fait important, les neurones TUJ1 positifs ne doivent pas être vus au côté apical du VZ.
(figure 1F et G) 23,24. Lorsque l' expansion arg suffisante est atteinte, la neurogenèse commence, les cellules en division changent leur orientation vers la lumière, et le plan de division passe de l' horizontale (symétrique) à la verticale (asymétrique) 4, 12, 24.
Figure 1: Génération de cerveau organites de cellules iPS humaines. (A) Workflow du protocole de différenciation. Étape 1: Début de la différenciation. Pendant cette phase, la formation de neurosphères à partir de iPSCs humains dans une plaque à 96 puits se produit. La durée est de 5 jours. Etape 2: Enrobage les neurosphères dans des gouttelettes de matrice EHS. Une culture en suspension stationnaire de neurosphères de matrice EHS-intégré a une durée de 4 jours. Étape 3: organites dans des flacons spinner. Le transfert de neurosphères de matrice intégrée EHS spinner flacons a lieu. La durée est de 14 jours. (B) A neurosphères dans une plaque multi-puits. l'image représentative d'un neurosphères le jour 4 dans une plaque à 96 puits pendant l'étape 1 est représentée. La sphère doit être clairement visible sur le fond du puits, avec une surface lisse, rond (rouge arrow). (C) Morphologie des neurosphères avant l'incorporation de la matrice EHS. Neurosphères récoltés au jour 5 de l'étape 1 doivent être uniformes en taille et en affichant une surface lisse avec un bord vif (support et flèche). (D) organites dans des flacons à centrifuger. Un ballon rotatif avec organites du cerveau lors de l'étape 3 (flèches rouges) est montré ici. (E) l' imagerie par immunofluorescence des organites cryosectioned présentant un VZ typique et la plaque corticale primitive. Le panneau de gauche montre la coloration nucléaire des cellules au VZ. Le VZ étend depuis le côté apical (lumen L) vers le côté de base (ligne jaune). Notez que les cellules dans l'affichage de VZ noyaux Palisade ressemblant, ce qui suggère qu'ils sont des cellules gliales radiales. Le panneau de droite montre la coloration immunofluorescente de NPC nestine-positives (vert) dans le VZ et les neurones TUJ1-positifs (magenta) de la plaque corticale primitive. Barre d'échelle = 50 pm. (F) l' imagerie par immunofluorescence des organites cryosectioned. deux exemplesde VZS colorées avec du p-Vim et Arl13b (I et III). Les régions marquées par des carrés blancs sont amplifiés au droit de chaque insert d'image (II et IV). Le plan de division de l'anaphase apical des cellules gliales radiales (ARG). En divisant les cellules gliales radiales apical au côté apical du VZ sont p-Vim positif (magenta). Des exemples d'arguments de division symétrique sont représentés (carrés blancs et cartons). Le plan de division est donnée à une ligne blanche. Le plan de division d'une cellule anaphase est horizontale à la ligne de surface de lumière (ligne pointillée jaune) et est marqué par une coloration Arl13b (vert). Barre d'échelle = 50 pm. (G) Ce schéma fournit l'orientation verticale ou horizontale de ARGS en anaphase par rapport à la lumière. Les cellules en division des organites de contrôle le jour 14 sont principalement orientées horizontalement (0-30 °) par rapport à la surface de la lumière du VZ. La partie apicale de la lumière est bordé par les cils primaire de ARGS, qui spécifient la surface de la lumière du VZ (ligne verte). En revanche, most des cellules gliales radiales des organites microcéphalie afficher un plan de division (60-90 °) orienté verticalement. La ligne blanche indique l'axe du plan de division. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Problème: | Raisons possibles: | Suggestions: |
| étape 1.1.1.2 | Une mauvaise efficacité de la reprogrammation | Vérifiez hiPSCs des marqueurs de pluripotence: si la qualité est faible, choisir manuellement des colonies non différenciées pour quelques passages pour enrichir les colonies pluripotentes |
| CSPi humaines se différencient avant le début de la différenciation | ||
| Le stress dû au début ou passagi repiquageng comme des cellules individuelles | Ne pas avant le passage de 80% est atteint de confluence. Passage sous forme d'agrégats, et non pas des cellules individuelles | |
| La contamination par des mycoplasmes | Test de la contamination par des mycoplasmes | |
| Étape 2 | La mauvaise qualité de hiPSCs | Améliorer la qualité de hiPSCs (voir ci-dessus) |
| Neurosphères ne forment pas du tout ou se désagréger au jour 5 après le début de la différenciation | nombre À partir de cellules par puits est trop faible ou trop élevée | compter avec précision le nombre de cellules et de les distribuer également dans chaque puits |
| hiPSC moyen a été utilisé à la place du milieu de différenciation neuronale | Utiliser un milieu de différenciation neuronale | |
| étape de centrifugation était trop sévère ou légère | Spin plaque à 96 puits 500 g pendant 3 min et vérifier si les cellules accumulées au centrefond de chaque puits | |
| Non Y-27632 au début de la différenciation | Y-27632 pour améliorer la survie des cellules | |
| Les cellules fixées et ont augmenté à la partie inférieure de la plaque | Assurez-vous qu'une plaque de fond en V 96 puits non-adhérent est utilisé. | |
| Étape 2 | Pas de changement moyen par jour | Changer la moitié du montant quotidien moyen |
| Neurosphères ne sont pas homogènes en taille | A partir nombre de cellules par puits n'a pas été égale | Mélanger le tube de suspension de cellules individuelles à chaque fois avant de retirer la suspension de cellules 100 uL |
| changement moyen n'a pas été fait pour chaque puits par jour | Assurez-vous que chaque puits obtient le changement moyen quotidien | |
| Étape 2 | hiPSC n'a pas été dissociées into cellules individuelles avant le début de la différenciation | Vérifiez au microscope si hiPSC sont dissociées à des cellules individuelles après traitement Accutase. S'il y a encore des agrégats, des cellules de pipette 10 fois haut et en bas avec 100 ul micropipette et vérifier de nouveau ou de répéter le traitement Accutase |
| Neurosphères ne présentent pas une jante lumineuse ou surface arrondie; ils forment de gros kystes à la surface | A partir nombre de cellules par puits était trop élevé | compter avec précision le nombre de cellules et de les distribuer également dans chaque puits |
| changement moyen n'a pas été fait par jour pour chaque puits | Changer la moitié du quotidien moyen | |
| étape 2.7 | La mauvaise qualité de hiPSCs | Améliorer la qualité de hiPSCs (voir ci-dessus) |
| matrice EHS neurosphères et des systèmes enfouis agglutiner | Pas assez moyen (volume) | Fournir unminimum de 10 ml de milieu dans une boîte de Petri de 100 mm |
| Plateau de l'incubateur même pas | Placez plat sur une surface plane | |
| Après avoir placé dans un incubateur, déplacer le plat de sorte que neurosphères sont répartis uniformément |
Tableau 1: Tableau de dépannage.
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Discussion
MCPH est un trouble neurodéveloppemental complexe humain qui ne peut être récapitulé dans des modèles animaux in vivo ou dans un langage simple culture de cellules humaines approche in vitro. La manifestation clinique de MCPH commence à apparaître au cours du premier trimestre, lorsque la neurogenèse précoce commence. Ainsi, organites du cerveau 3D représentent un système expérimental fiable pour modéliser le développement MCPH. De plus, 3D organites du cerveau humain sont une approche idéale car i) ils permettent l'adaptation d'un spectre d'échantillons de patients avec divers milieux génétiques, ii) ils affichent un tissu organisé contenant différents types de cellules neurales, et, surtout, iii) diverses différenciation les stades de développement neurologique dans cette approche in vitro sont liées à leurs homologues in vivo 25, 26, 27. Par exemple, la rosette de neurones est une structure équivalente au développement de neuronestube.
Lancaster et al. utilisé deux fois le nombre de patients iPSCs par rapport au témoin iPSCs afin de réussir à générer des organites patient. Il convient de noter, avec le protocole décrit ici, en modifiant les méthodes existantes, nous pourrions générer le contrôle et organites du cerveau microcéphalie à partir de la même nombre de cellules 4. Cela a été possible en raison des conditions de culture définies de CSPi et en raison d'une plus grande différenciation dirigée. Dans ce protocole, la production organoïde a été amélioré par le remplacement de l'étape de formation EB couramment effectuées en initiant la différenciation neuronale directement à partir de iPSCs. Deuxièmement, à l'étape 3, dorsomorphin et SB431542 ont été complétés dans le milieu de culture à la place de l'acide rétinoïque seul. L' acide rétinoïque est facilement isomérisé lorsqu'elle est appliquée à un milieu de culture cellulaire 28. Par conséquent, son activité biologique est moins bien définie que celle des composés plus stables tels que dorsomorphin. Dorsomorphin inhibela voie de signalisation de la BMP4, et SB431542 est un inhibiteur de la voie de signalisation de l'activine / nodal (TGF-β1 inhibiteur ALK). Une combinaison des deux composés conduit à l'inhibition de BMP et la voie de signalisation de l' activine / nodal, induit la différenciation neuronale et réduit la différenciation en lignées autres dans diverses lignées de cellules ES provenant de l' homme ou des cellules iPS humaines avec une efficacité similaire 29. La stabilité du composé et une réponse cellulaire à un composé universel sont des points importants pour l' établissement d' un protocole qui peut être appliqué à différentes lignées cellulaires de patients pour modéliser une maladie in vitro. Ainsi, un résultat de différenciation robuste et efficace dans le cerveau homogène cultures organoide et, éventuellement, des données plus reproductibles.
Avec ces modifications, les étapes critiques dans le protocole sont réduites au minimum pour l'initiation de la différenciation à l'étape 1. A ce stade, il est important de dissocier doucement les iPSCs dans une suspension à cellule unique d'unnd pour les distribuer avec précision et de façon uniforme dans chaque puits de la plaque à 96 puits. un inhibiteur de protéine kinase associée à Rho (Y-27632) doit être ajouté au milieu B pendant les premières 24 h, car il supporte la survie de iPSCs sur leur dissociation de cellules individuelles. Il est important de mettre les cellules en contact étroit les uns avec les autres en les faisant tourner vers le bas au fond des puits. Une fois neurosphères sont formées à la fin de l'étape 1, à la réalisation d'autres procédures expérimentales peut être attendue. Dans le cas neurosphères ne forment pas, la pluripotence des CSPi humaines, la non-adhérence des cellules dans la plaque de 96 puits, et les conditions de centrifugation doit être vérifiée. Toute la procédure le jour 0 de l'étape 1 ne devrait pas prendre plus de 1 h en raison de la sensibilité des CSPi humaines. changements à moyen pendant les jours suivants doivent être fait avec soin, en évitant des forces de cisaillement, afin de ne pas détruire des contacts cellulaires fraîchement formés entre les cellules.
Il est à noter que centrosomal mutants ont la prolifération des cellules défectueuses et modifiées dynamique du cycle cellulaire. Ainsi, la modélisation MCPH nécessite un protocole puissant qui peut résister aux fonctions cellulaires compromises. Par conséquent, le protocole actuel permet la génération d'organites homogène de haute qualité et est un outil unique pour étudier la tige homéostasie cellulaire au VZ. Contrairement à d'autres protocoles, ce protocole permet la génération d'organites de iPSCs de contrôle et de patients, en commençant par le nombre de cellules identiques. Pour les études fondées sur la différenciation in vitro, les conditions de culture identiques pour les différents CSPi sont une exigence de base pour identifier les modifications liées à la maladie et d'éviter des artefacts de condition de culture. Outre la modélisation microcephaly d'origine génétique, ce protocole peut également être appliquée à microcephaly d'origine non génétique, y compris des infections virales neurotrophiques, des produits chimiques ou à un rayonnement. 30 En outre, les outils modernes de biologie moléculaire, tels que CRISPR / génome modifier cas9ing technologies, peuvent être appliquées à organites 3D pour disséquer les aspects spécifiques du paradigme du développement du cerveau humain in vitro 31, 32, 33.
D'autre part, la génération de organites du cerveau à ce jour n'a toujours pas dépassé le premier et au début du deuxième trimestre du développement humain 34. Dépassant cette limitation et permettant de générer des organites cérébrales matures in vitro pourrait ouvrir de nouvelles voies pour modéliser les maladies neurodégénératives qui se manifestent à des stades ultérieurs, comme la maladie de Parkinson ou d' Alzheimer. Pour les applications futures, des protocoles diriger la différenciation vers des régions plus spécifiques, comme le cerveau antérieur ou mésencéphale, pourrait être intéressant d'étudier les troubles neurologiques complexes comme l' autisme et la schizophrénie 35, 36, 37, 38.
Il est important, certains aspects doivent être pris en considération lors de l'élaboration des conclusions des études organoïdes. La première limite est qu'il n'y a pas évident dans organites vascularisation. Ainsi, les échanges gazeux et l' apport de nutriments in vitro qu'approximatifs conditions in vivo. Deuxièmement, étant donné organites du cerveau ne sont pas reliés à des systèmes d'organes complexes, le modèle organoide manque une immunitaire complète, le système métabolique et hormonal. Néanmoins, l'absence de ces aspects fournit parfois un avantage. Par exemple, les organites décrits ici pourraient remplacer immunodéprimés dans les modèles in vivo de remédier aux conséquences du système immunitaire dans la pathogenèse des troubles du cerveau.
Avec l'utilisation de ballons rotatifs, un grand nombre d'organites peut être généré pour des expériences biochimiques, analyse l'ensemble du séquençage du transcriptome, et des projections de médicaments à haut débit. Pris ensemble, par uchanter ce protocole actuel, on peut générer des organites du cerveau à partir de cellules CISP humaines, qui peuvent ensuite être utilisés dans une large gamme d'applications, de la modélisation de la maladie aux plates-formes de dépistage des drogues, afin de remplacer de manière fiable les essais sur les animaux dans l'avenir.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation Fritz Thyssen (Az.10.14.2.152). Nous sommes reconnaissants à l'installation d'enrobage des tissus et l'installation de base de microscope de CMMC. Nous sommes reconnaissants pour les discussions et le soutien technique fourni par les membres du Laboratoire de biologie Centrosome et cytosquelette. Nous remercions Li Ming Gooi pour la relecture du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse 488 | Invitrogen | A-11001 | Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
| Anti-rabbit 647 | Invitrogen | A-21245 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 |
| Arl13b | proteintech | 17711-1-AP | ARL13B rabbit polyclonal antibody |
| CELLSPIN system | IBS Integra Bioscience | 183001 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, US | 32670 | 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| DMEM/F-12 | Gibco, US | 31331093 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 |
| Dorsomorphin | Sigma-Aldrich, US | P5499 | Compound C; multiple suppliers |
| Embedding medium | AppliChem | A9011, 0100 | Mowiol; embedding medium; multiple suppliers |
| Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix | Corning | 354277 | Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified |
| Fish gelatin | Sigma-Aldrich, US | G7765-250ML | Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4 °C |
| Glycine | AppliChem | A1067,1000 | Glycine for molecular biology; multiple suppliers |
| Inoculation loop with needle, disposable (1 µL) | Sigma Aldrich, US | BR452201-1000EA | multiple suppliers |
| Insulin | Sigma-Aldrich, US | I3536-100MG | multiple suppliers |
| L-glutamine | Gibco, US | 25030081 | L-glutamine (200 mM) |
| Medium A | Stem cell technologies | #05850 | mTeSR1 (hiPSC medium) |
| Medium B | Stem cell technologies | #05835 | Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium |
| Medium C | Gibco, US | 21103049 | Neural Basal Medium |
| MEM | Gibco, US | 11140035 | MEM non-essential amino acids solution (100x) |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza, Switzerland | #LT07-218 | Mycoplasma detection kit; multiple suppliers |
| Nestin | Novus biologicals | NBP1-92717 | Nestin mouse monoclonal antibody (4D11) |
| Paraformaldehyde (PFA) | AppliChem | A3813, 0500 | 4% in PBS, store solution at -20 °C; caution: wear skin and eye protection and work under hood |
| PBS tablets | Gibco, US | 18912014 | See manufacturer´s instructions; multiple suppliers |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL) | Gibco, US | 15140122 | Multiple suppliers |
| Poly-L-lysine solution (PLL) | Sigma-Aldrich, US | P8920-100ML | Multiple suppliers |
| pVim | MBL | D076-3S | Phospho-Vimentin (Ser55) mAb |
| Reagent A | Stem cell technologies | # 05872 | Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available |
| Reagent B | Sigma-Aldrich, US | A6964-100ML | Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution” |
| Research Cryostat Leica CM3050 S | Leica biosystems | CM3050 S | Multiple suppliers |
| SB431542 | Selleckchem.com | S1067 | Multiple suppliers |
| Spinner flask 250 mL | IBS Integra Bioscience | 182026 | |
| Sucrose | AppliChem | A4734, 1000 | Multiple suppliers |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo scientific, US | J3800AMNZ | Slides should be labeled with a "+" and positively charged |
| Supplement 1 | Gibco, US | 17502048 | N-2 supplement (100x) |
| Supplement 2 w/o Vitamin A | Gibco, US | 12587010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, NL | 4565 | Multiple suppliers |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura, NL | 4583 | Multiple suppliers |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388,0500 | Multiple suppliers |
| TUJ1 | Sigma-Aldrich, US | T2200 | β-Tubulin III (rabbit polyclonal) |
| TUNEL assay | Promega, US | G3250 | DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers |
| Tween 20 for molecular biology | AppliChem | A4974,0500 | Multiple suppliers |
| waterproof sheet | BEMIS company, inc. | PM996 | Parafilm “M”; multiple suppliers |
| Y-27632 | Selleckchem.com | S1049 | ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers |
| β-mercaptoethanol | Gibco, US | 31350010 | 2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers |
References
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