Introduction
Böyle mikrosefali gibi İnsan nörogelişimsel bozukluklar, sadece kötü nedeniyle insan beyni uzun bir kortikal yüzeye, insan olmayan hayvanlardan farklı benzersiz bir özelliğe sahip olması nedeniyle hayvan modellerinde incelenebilir.
Bu özellik, insan beyin gelişimi yeterli in vitro hücre kültürü sisteminde, bir 2D incelenecek bir karmaşık işlemi yapar. Gelişmekte olan 3D kültür teknikleri uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) doku benzeri organoids üretilmesini sağlar. 3B süspansiyon kültüründe pluripotent kök hücrelerinin in vitro farklılaşma organize, tabakalı doku, 1, 2, 3 sebebiyet veren, zamanında ve bölgeye özgü bir şekilde, çeşitli hücre tiplerinin oluşmasını sağlar. 3D kültür teknolojilerini öncülük ve kök hücrelerinden başlayarak, organ oluşumu karmaşıklığını demystified laboratuarlar sayesindeinsan beyin gelişimi erken olayları tanımlamak için ve in vitro, 1, 2, 3 mikrosefali model beyin organoids üreten güçlü bir yöntem geliştirdi. Biz Lancaster ve arkadaşları tarafından geliştirilen bir yöntem adapte olması dikkat çekicidir. serebral organoids 1 oluşturmak için. Bu yöntem deneysel gereksinimlerine göre değiştirildi.
Gabriel ve diğerleri arasından bir çalışmanın amacı. beyin gelişimi sırasında nöral kök hücre bakımı hücresel ve moleküler mekanizmaların analiz etmektir. Bunu yapmak için, mekanik bir çalışma mikrosefali hasta 4 türetilen 3D beyin organoids nöral projenitör hücreler (NPC) analiz ederek gerçekleştirildi. Bu hasta CPAP, sentrozom biogenezinin 5 için gerekli olan korunmuş centrosomal proteininde bir mutasyonun taşıdı. Bir yaygın olarak kabul hipoTez mikrosefali NPC havuz tükenmesi sonucu olduğunu ve bu, hücre ölümüne veya erken farklılaşma 1, 6, 7, 8, 9 ya da bağlı olabilir.
Mikrosefali beyin organoids ventriküler dilimleri (VZS) analiz ederek, bu NPC önemli sayıda sağlıklı bir vericiden 4 türetilmiş beyin organoids farklı olarak, asimetrik hücre bölünmesinin olmadığı gösterilmiştir. Mikrosefalik beyin organoids kapsamlı mikroskopik ve biyokimyasal analizler zamanında kirpikler sökme 4 CPAP için beklenmeyen bir rol ortaya çıkardı. Spesifik olarak, mutasyona uğramış CPAP NPC 4 erken farklılaşmasına yol açan, gecikmeli kirpik sökme ve gecikmeli hücre döngüsü yeniden giriş ile bağlantılıdır. Bu sonuçlar mikrosefali ve th cilia bir rol oynadığını düşündürmektedirnörogenez ve beyin büyüklüğü kontrol 10 sırasında EIR tutulumu.
Bu protokolün birinci parçası homojen beyin organoids oluşturmak için üç aşamalı bir yöntemi bir açıklamasıdır. Daha önce belirtildiği gibi, orijinal Lancaster protokol adapte ve amacımızı 1 uyacak şekilde değiştirildi. İlk olarak, insan iPSCs Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matris üzerinde tanımlı bir besleyici içermeyen durumda kültürlenir. Bu adım, besleyici bağımlı pluripotent kök hücre kültürlerinin varyasyonları önler. Bu protokol, sinir farklılaşmasının indüksiyonu, sinir epiteli iPSCs şirketinden başlar oluşturulur. embriyoit gövde (EB) oluşturma aşamasını, daha kontrollü ve yönlendirilmiş bir şekilde sinir farklılaşma ilerler atlanarak. Bu yaklaşım, mezoderm ve endoderm gibi germ hücre katmanları, spontan ve yönsüz oluşumunu kısıtlar. Bu protokolü uygulayarak, nöral rozetler içeren Neurospheres EH için 5. günde hasat edilebilirS matrisi gömme ve sabit süspansiyon kültürü. Protokolde üçüncü adımı için kullanılan Organoid ortam dorsomorphin ve SB431542 ile takviye edilir. Dorsomorphin kemik morfojenik protein (BMP), küçük moleküllü inhibitörüdür ve SB431542 TGF / aktivin / düğüm sinyal yolunu inhibe eder. Bu faktörler bir araya sinir farklılaşmasını daha etkili bir tek 11, 12, 13, 14-cis retinoik asit teşvik edebilir.
Hep birlikte, bu modifikasyonların organoids boyunca en az varyasyonları ile, beyin organoids tekrarlanabilir üretilmesini mümkün kılmak. Önemli olarak, bu yöntem sağlam sentrozom ve hücre döngüsü dinamiklerini etkileyen genlerinde mutasyon taşıyan hasta iPSCs gelen mikrosefalik beyin organoids oluşturmak için uygulanmıştır.
Bu protokolün ikinci bölümü br hazırlamak için talimatlar verirain analizi ve mikrosefali hücresel kusurların yorumlanması için organoids. Bu tespit, krio-bölümleme, immünofloresan boyama ve odaklı mikroskopik analiz içerir. Bu protokol beklenen sonuçların ayrıntılı bir açıklama ile ve yorumlanması için rehberlik okuyucu sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Beyin Organoids 1. Nesil (23 gün)
- Nöroektoderm başlatılması (5 gün)
NOT: Aşağıdaki noktalar farklılaşma başlamadan önce düşünülmelidir. İnsan iPSCs elde etmek üzere yeniden programlama yöntemi (lentiviral- sendai-virüs- epizomal-, veya mikroRNA bazlı vs.), ideal hastada için aynı ve iPSC hatları kontrol edilmelidir. Çeşitli yeniden programlama kitleri ve yayınlanmış protokollere göre talimatları 15, 16, 17, 18 mevcuttur. İnsan iPSC hatlarının kalite optimal farklılaşma gerçekleştirmek için bir anahtardır. Bir mikroskop ile koloni ve hücre morfolojisi Monitör ve Oct3 / 4, Nanog veya TRA-1-60 Markerlerin ekspresyonunu test ederek pluripotensini doğrulamak.- Engelbreth-Holm-Swarm ile kaplanmış bir tabak üzerinde kültür ortamı A içinde besleyici içermeyen koşullar altında kültür insan iPSCs(EHS) matris.
Not: İnsan iPSCs büyütün besleyici içermeyen ve serumsuz tanımlanmış bir kültür muhafaza edilmesi için ve farklılaşma başlamadan önce fare embriyonik besleyici hücreler (MEF'ler) çıkarılması için ek bir adım önlemek için. İnsan iPSCs için en uygun geçiş sayısı, toplam geçit 70 yeniden programlama üzerine geçit 15 farklılaşma aralığını başlatın. pasaj, yeni bir çanak agrega aktarmak için düşük mekanik stresle uygun bir hücre ayırma çözeltisi ve 2 ml serolojik pipet kullanarak agrega hücreleri gibi hiPSC koloniler ayırmak. bu en iPSC hatlarında farklılaşmayı ve apoptosis edilebileceği gibi tek hücrelere dissosiyasyonu kaçının. Uzun vadeli, tek-hücreli pasajlama insan iPSCs 19, 20 genomik değişiklik artırabilir olduğu bildirilmiştir. Bu iPSCs genel canlılığını azaltır, sıyrılma çözeltinin ayrılması için bir santrifüj aşamasını gerektirir hücre ayırma işlemleri, kaçının. Ölçekmikrobiyal kontaminasyonlarla, düzenli olarak özellikle mikoplazma, tüm kültürler bu iPSCs kalitesini ve bunların farklılaşma kapasitesinin değiştirmesi nedeniyle.- Kaplama, üreticinin talimatlarına uygun olarak EHS matris ile bir 60 mm doku kültürü çanağı.
- 1 x 10 6, insan iPSCs bir kısım çözülme. EHS matris içinde kaplandı ve ortam A 5 mL (Malzeme Tablo) ihtiva eden bir 60 mm doku kültürü çanağı içinde iPSCs Seed. Hücreler ~% 80 birleşmeye ulaştığında 5 ila 7 gün sonra günlük orta ve geçit değiştirin.
Not: Geçiş farklılaşmasını başlamadan önce en az bir kez, örneğin koloni 21 enzim içermeyen ayrılması gibi standart yöntemler kullanılarak% 80 birleşme çözülmüş iPSCs. üreticinin aşağıdaki iPSCs Besin Karışımı F12 (DMEM / F12), ve inkübe: Kısaca, iPSC orta kaldırmak önceden ısıtılmış 37 ° C Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı ile bir kez yıkama hücreleriReaktif A kullanılarak talimatları (malzeme tabloya bakınız). Tek hücrelere ayrışma önlemek için tavsiye edilen inkübasyon süresi aşmayın. İnsan iPSCs müstakil ve agrega gibi tek değil hücreleri olarak yüzen edilmelidir. Daha sonra, yeni EHS matris kaplı tabaklara transfer edilebilir; örneğin, iPSC bir 60 mm çanak 4 yeni 60 mm'lik tabaklara dağıtılabilir agrega. - üreticinin talimatlarına göre bir mikoplazma algılama kiti ile mikoplazma için kontrol edin. mikoplazma iPSCs farklılaşma yeteneğine değiştirebilir olarak, sadece mikoplazma içermeyen iPSCs kullanın.
- iPSCs (% 80 kaynaşık), ayrıştırmaları ve reaktif B ile tek bir hücre süspansiyonu hazırlamak
- Önceden ısıtılmış (37 ° C), DMEM / F12 ile bir kez iPSCs yıkayın.
- 37 ° C'de 5 dakika ve% 5 CO2 için iPSCs (60 mm tabak içinde, örneğin, 1 mL) önceden ısıtılmış reaktif B ilave edin ve inkübe edilir.
- tarafında ve alt tarafında bir parmak ile Flick 20 katçanak iPSCs ayırmak için. Mikroskop altında hücrelerin dekolmanı kontrol edin.
- 1 ml mikropipet ile tabak içinde yukarı ve aşağı 5 kez hücre süspansiyonu pipetle.
- reaktif B 1 mL seyreltik ve 15-ml santrifüj tüpü içinde hücre süspansiyonu toplamak için ortam A 3 mL ekleyin.
- Yavaşça oda sıcaklığında 4 dakika boyunca iPSCs (500 x g) aşağı doğru döndürün.
- Ortam B'de 1 mL hücre pelletini ve bir hemositometrede hücre sayısını.
NOT: yeniden süspanse edilmesi için sadece orta B'yi kullanarak farkında olun. Bu farklılaşmasını inhibe olabilir bFGF bir çok yüksek bir konsantrasyonda, olarak, ortam, bir kaçının.
- 10 uM rho-ilgili protein kinaz önleyicisi (Y-27632) ile desteklenmiş ortam B'de ml başına 4.5 x 10 5 hücre hücre süspansiyonu seyreltin.
- Bir yapışkan olmayan, V tabanlı 96 oyuklu bir plaka içerisinde, oyuk başına 100 uL ekleyin.
NOT: emin olun hücreler eşit sus dağıtılır100 uL kısımları alınmadan önce tüpü her çalkalayarak pansiyon. Her bir boyut ve şekil (yuvarlak, oluşturulan yüzeylerin) içinde homojen nöroküreleri elde etmek üzere bir eşdeğer hücre sayısı içermelidir önemlidir. - Yavaşça 3 dakika boyunca 500 x g'de oda sıcaklığında hücreler plaka aşağı spin ve 37 ° C'de ve% 5 CO2 inkübe edin.
- 50 mcL kaldırılması ve önümüzdeki 5 gün boyunca her kuyuya taze ortam B 50 mcL ekleyerek günlük orta değiştirin.
- Engelbreth-Holm-Swarm ile kaplanmış bir tabak üzerinde kültür ortamı A içinde besleyici içermeyen koşullar altında kültür insan iPSCs(EHS) matris.
EHS Matrix 2. gömülmesi Neurospheres (4 gün)
- W / olmadan (100 (h / h) takviyesi 2: 200 (h / h) takviyesi 1, 1: 1: DMEM / F12 ve orta C (h / h), 1: 1 karışımı, aşağıdakileri karıştırarak neurosphere orta hazırlayın o) A vitamini, 1: 100, L-glutamin, 0.05 mM esansiyel olmayan amino asitler (MEM), 100 U / mL penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 1.6 g / L insülini, ve 0.05 mM β-merkaptoetanol.
- Neurospheres espri toplayınha bir ~ 2 mm uç kullanılarak 200 uL mikropipet daha önce steril bir makas ile kesilmiştir.
- Boş 100 mm tabak içinde yaklaşık 5 mm uzaklıkta parafin film (3 x 3 cm 2) üzerinde birbirinden nöroküreleri yerleştirin ve dikkatli bir sürede geri kalan ortam kadar çıkarın.
- Her bir neurosphere üzerine EHS matrisinin bir damla (7 uL) ilave edilir.
- EHS matris, bir kuluçka makinesi içinde 15 dakika için neurospheres ile damla inkübe edin.
- neurosphere ortamla onları yıkanmak suretiyle parafin filmden dikkatle nöroküreleri yıkayın. temizlemek için, 1 ml mikropipet ve neurosphere ortamı 10 mL içeren yeni bir 100 mm Petri kabı kullanılır.
- Sonraki 4 gün boyunca nöroküreleri inkübe ve 2 gün sonra, taze neurosphere orta 2 ml.
NOT: EHS matris gömülmüş Neurospheres yemeğin bir tarafta yığın birlikte olmayacak şekilde kuluçka raflar düz olduğundan emin olun.
Bir döner süspansiyon 3. OrganoidsKültür (14 Gün)
- 200 (h / h) takviyesi 1, 1: 100 (h / h) takviyesi 2 w / o 1: DMEM / F12 ve orta C (h / h), 1: 1 karışımı, aşağıdakileri karıştırarak beyin Organoid orta hazırlayın Vitamin A, 1: 100, L-glutamin, 0.05 mM MEM, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 1.6 g / L insulin, 0.5 uM dorsomorphin, 5 uM SB431542 ve 0.05 mM β-merkaptoetanol.
- yan kollar üzerinden her bükme şişesi beyin Organoid ortamın 100 ml ilave edilir ve en az 20 dakika boyunca ön ısıtma için bir kuluçka makinesi içinde yerleştirin.
- üreticinin talimatlarına göre, 25 rpm'de bir karıştırma programı kurun.
NOT: döndürücü şişelere EHS matris gömülmüş nöroküreleri aktarmadan önce, hepsi ayrıldığından emin olun. İki veya daha fazla EHS matris boyunca bağlı ise, bir bisturi ile bağlantı matrisi kesilerek ayırın. - Dikkatle Organoid ortamın 100 mL içeren döndürücü şişelere EHS matris gömülmüş nöroküreleri transferi bize2 ml serolojik pipet ing. şişe içine nöroküreleri aktarmak için bükme şişesi yan kollarını kullanın.
- 37 ° C'de ve% 5 CO2 ile bir inkübatör içerisinde bir manyetik karıştırma platformu üzerinde döndürme şişeleri yerleştirin; Bu Organoid kültürün gün 0'dır.
- (Ya da daha sık bir renk değişimi olduğunda) orta yarısını kaldırılması ve taze ortam aynı miktarda ekleyerek haftada bir ortam değiştirin.
Not: kuluçka döndürme şişeleri çekerken, organoids şişenin tabanına iner izin 3-5 dakika bekleyin. sıvının yüzeyi üzerinde (bir pompaya bağlı) bir cam pipet yerleştirerek orta çıkarın; dikkatli bir şekilde bir yan açıklık / şişenin kolu ile orta aspire. Bu manipülasyonlar laminer kaputun altında yapılmalıdır.
Beyin Organoids 4. analizi
- Organoids fiksasyonu
- spinner şişesi kültür wi 14. gününde organoids toplayınbir kesim 1 ml mikropipet (kesim ~ 5 mm) th. 60 mm tabak hepsini koyun ve 3 dakika için sıcak DMEM / F12 5 mL kez yıkayın.
- Sıcak% 4 paraformaldehit 500 uL (PFA) ile 1.5 ml tüp hazırlanır.
Dikkat: PFA fiksatif tutarken bir emniyet başlık altında cilt ve göz koruması ve iş giyin. - her biri ayrı ayrı ve her bir tüp içinde oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca, onları gidermek organoid yerleştirin. daha uzun 60 dakika boyunca organoids düzeltmek etmeyin. organoids taşımak için bir aşılama döngü veya uygun başka herhangi bir vasiyetle kullanın.
- PFA çıkarın ve 1 mL PBS ile her biri 10 dakika için iki kere sabit organoids yıkayın.
- sonraki kullanıma kadar, en fazla 7 gün boyunca 4 ° C'de 1 mL PBS içinde organoids saklayın.
- Cryosectioning için organoids katıştırma
- PBS çıkarın ve cryofreezing önce organoids kurutmak için tüp başına damıtılmış su çözeltisi içinde% 30 sukroz, 1 mL eklemek; Sukro ekledikten sonrase Çözelti organoids yüzeyde yüzen olmalıdır. 4 ° C'de sukroz çözeltisi gece boyunca organoids saklayın; Bir sonraki gün geçtikçe, organoids tüpün dibine batmış olması gerekirdi.
Not: gerekirse Organoids, sukroz çözeltisi içinde 4 ° C'de en fazla 3-5 gün saklanabilir. - Optimum kesme ısısı (OCT), bileşik 400 uL bir vinil numune kalıbı doldurmak ve kalıp merkezindeki bir organoid yerleştirmek için bir aşılama döngü kullanılır. Numune adıyla kalıp kenarını etiketleyin.
- cryosectioning kadar -80 ° C 'de organoid içeren kalıp dondurun.
- Kat cam, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde% 0.1 poli-L-lizin çözeltisi (PLL) ile cryoslides ve izin slaytlar, 3 saat boyunca kurutulur. 4 ° C'de slaytlar saklayın ve kullanmadan önce oda ılımana onları ısıtın.
NOT: uzağa yüzmesini Organoid dilim önleyecektir olarak PLL-kaplama, önemli bir adımdır. Toplamak ve en fazla 3 kadar 4 ° C'de saklayın PLL çözeltisiaydır. tekrar kullanılmadan önce, 0.22 mikron bir şırınga ile filtre edilir ve oda sıcaklığına kadar sıcak sağlar. - PLL kaplı cam üzerinde 20-50 um kalınlığında dilimler halinde Kısım cryofrozen organoids 22 cryoslides. bölümlerle Slaytlar, oda sıcaklığında 1 saat boyunca kurumasına izin verin. daha sonra işlenene kadar -80 ° C'de bölümleri saklayın.
- PBS çıkarın ve cryofreezing önce organoids kurutmak için tüp başına damıtılmış su çözeltisi içinde% 30 sukroz, 1 mL eklemek; Sukro ekledikten sonrase Çözelti organoids yüzeyde yüzen olmalıdır. 4 ° C'de sukroz çözeltisi gece boyunca organoids saklayın; Bir sonraki gün geçtikçe, organoids tüpün dibine batmış olması gerekirdi.
Organoid Bölümlerin 5. Immunofluorescent Boyama
NOT: Nestin, bir sinirsel kök işaretleyici ve Tuj1, bir pan-nöronal marker ile boyama organoids genel karakterizasyonu için, tavsiye edilir. Ek örnekler, mitotik apikal radyal glial hücreleri etiketler fosfo-vimentin (p-um), ve Arl13b ile immünofloresan boyama gibi, kirpiksi cisim için tarif edilmiştir. apoptozu test etmek için, DSB'leri (TdT) dUTP Nick Sonu Etiketleme (TÜNEL) deneyi kullanmaktadır. tozdan korumak için inkubasyon sırasında plastik bir kutu içinde slaytlar yerleştirin, hafif,ve kurutma.
- Oda sıcaklığında 30 dakika için slaytlar çözülme.
- PFA-kaynaklı otoflüoresan söndürmek için 3 dakika süre ile PBS-glisin, 200 uL (PBS içerisinde glisin 0.225 g) ile, iki kez slaytlar yıkayın.
- % 0.5 Triton X-100'ün 200 uL / oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS çözeltisi içinde% 0.1 Tween ile bölümleri permeabilize.
- 3 dakika için PBS-glisin çözeltisi 200 uL ile iki kez yıkanır.
- Spesifik olmayan antijen bağlanma bloke etmek için oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca PBS içinde% 0.5 balık jelatini 200 uL /% 0.1 Triton X 100 ile inkübe edin.
NOT: Bir TÜNEL deneme gerekiyorsa, üreticinin protokolüne uygun olarak tahlil gerçekleştirin. ikincil antikorlar müdahale ve sonrasında kullanıldığında fluorophores gidermek edebileceğiniz gibi, immun boyama yapmadan önce TÜNEL tahliline ile başlayın. - Nestin, 1: aşağıdaki konsantrasyonlarda çözüm engelleme antikorlar seyreltilir 200; p-um, 1: 500; Tuj1, 1: 200;Arl13b, 1:20; ve ikincil antikorlar, 1: 1,000.
- Oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C'de 1-2 saat boyunca, ilk birincil antikor 200 uL (örneğin, Nestin) ile inkübe edin.
- bloke etme çözeltisi, 200 uL 3 x 3 dakika yıkayın.
- bloke etme çözeltisi içinde 1.000 ve oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca 200 uL slayt inkübe: ilk (anti-fare 488) sekonder antikoru 1 seyreltin. Şu andan itibaren her zaman ışıktan slaytlar korur.
- bloke etme çözeltisi, 200 uL 3 x 3 dakika yıkayın.
- Oda sıcaklığında 1-2 saat veya gece boyunca 4 ° C (örneğin, Tuj1) aşağıdaki primer antikor 200 uL kuluçkalayın.
- bloke etme çözeltisi, 200 uL 3 x 3 dakika yıkayın.
- Oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca bir sonraki ikincil antikor (anti-tavşan 647) 200 uL ekleyin.
- 3 x 3 dakika yıkayın. bloke etme çözeltisi, 200 uL.
- 30 nM konsantre en az 4' , 200 uL, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ekleyinnükleer boyama için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS içinde entration.
- bloke etme çözeltisi 200 uL 2 x 3 dakika yıkayın.
- damıtılmış su 200 uL 1 x 1 dak yıkanır ve belirgin bir su damlası daha fazla görünür hale gelene kadar bölümler, 10-20 dakika boyunca kurumaya bırakın.
- orta gömme bulunduğu bölümleri monte edin. onları birkaç haftaya kadar 4 ° C'de ışıktan korunmuş olarak saklayın.
- görüntüye mikroskopik analizi organoid, ventriküler bölge, ilkel kortikal plaka ve ilgilenilen diğer alanlarında bir bakış ile devam edin.
- 1, 10, kullanılan floresan boya etiketli sekonder antikor göre seçilen bir 63X yağ objektif ve flüoresan filtreler ile konfokal mikroskop kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beyin organoids üretilmesi, sürekli kültürleme (Şekil 1A), en az üç hafta gerekir. tekrarlanabilir sonuçlar başarmak için araştırmacı her adımda belgeleyen ve daha da önemlisi, orta bileşenleri, zaman noktaları ve baz muameleleri ile ilgili herhangi bir değişiklik önler öneririz. Burada, kritik kilometre taşları deney sonunda yeterli kalitede organoids elde etmek için ulaşılır eğer nasıl değerlendirileceğini bir özetini verir. 96 oyuklu bir plaka içerisinde neurospheres oluşumu 4. Neurospheres dibine de (Şekil 1B, aşama 1) ile ilgili olarak iyi tanımlanmış küreler kabul edilebilir günden itibaren açık bir şekilde görünür olmalıdır.
5. günde, Neurospheres ~ çapı 500 um olmalı ve koyu merkezini çevreleyen parlak kenar ile, düzgün bir yüzey sergiler. Zaten sinirsel gül benzeri genişletilmiş stru gözlemlemek mümkün olabilirBu parlak jant içinde ctures (Şekil 1C, Aşama 2'nin başlangıcı). Neurospheres fazla hücre agrega gibi çökmeye veya görünüyorsa, farklılaşma daha da devam edilmemelidir. Son olarak, organoids artırmak ve döndürme şişeleri (Şekil 1D, aşama 3) 'de farklılaşma sırasında benzer boyuta sergilemelidir. Daha fazla bilgi için sorun giderme tablosunu (Tablo 1) Bkz.
gün-14 organoids kalitesi, ışık mikroskobu ile doğrulanması gerekir. VZS apikal tarafında bir çit nükleer şekle sahip Nestin pozitif NPC radyal / glial hücreler kalın tabakalar oluşur. Öte yandan, ilk kortikal tabaka apikal taraftan (Şekil 1 E) gelen uzamsal olarak ayrı bazal tarafında bol Tuj1 pozitif nöronların, ihtiva edecektir. Önemli olan, Tuj1-pozitif nöronlar VZ apikal tarafında görülmemelidir.
(Şekil 1F ve G) 23,24 erken simetrik genişlemesi için esastır. Yeterli Arg genişleme ulaşıldığında, nöron başlar, bölünen hücrelerin lümene doğru kendi yönünü değiştirmek, ve bölme düşey düzlem (asimetrik olduğu zaman) 4, 12, 24, yatay (simetrik) olarak geçer.
Şekil 1: İnsan iPS Hücrelerden Beyin Organoids üretilmesi. Farklılaşma protokolü (A) iş akışı. Adım 1: farklılaşma başlangıcı. Bu faz esnasında, 96 oyuklu bir plaka içerisinde, insan iPSCs gelen neurospheres oluşumu meydana gelir. Zaman süresi 5 gündür. Aşama 2: EHS matris damlacıkları içinde Neurospheres gömülmesi. EHS matris gömülmüş neurospheres bir sabit süspansiyon kültürü 4 günlük bir zaman süresine sahiptir. Aşama 3: bükücü şişelerde Organoids. şişeler spinner EHS matris gömülmüş neurospheres transferi gerçekleşir. Zaman süresi 14 gündür. (B), bir çok-yuvalı plaka içinde bir neurosphere. Aşama 1 sırasında bir 96 oyuklu bir plaka içerisinde, 4. günde bir neurosphere Örnek bir resim gösterilir. Küre pürüzsüz, yuvarlak bir yüzey (kırmızı burnu ile, kuyunun altındaki açıkça görünür olmalıdırw) arasındadır. Neurospheres (C) morfolojisi önce EHS matris gömme. Adım 1 5 gün toplanan Neurospheres aynı boyutlarda olması ve parlak bir kenar (taşıyıcı ve ok) bir pürüzsüz bir yüzeye sahip olmalıdır. (D) Organoids bükücü şişelerde. adım sırasında beyin organoids 3 (kırmızı oklar), dönen bir şişede burada gösterilir. Tipik bir VZ ve ilkel kortikal plaka gösteren cryosectioned organoids (E) immünofloresan görüntüleme. Sol panel VZ hücrelerin nükleer boyamasını gösterir. VZ bazal tarafında (sarı çizgi), apikal taraftan (lümen L) kadar sürer. VZ görüntüleme çit gibi çekirdeklerin içinde hücreler, bunlar radyal glial hücreler olduğu öne unutmayın. Sağ panel, VZ ve ilkel kortikal plaka Tuj1 pozitif nöronlarının (kırmızı) içinde Nestin pozitif NPC (yeşil) immünofloresan boyamasını gösterir. Ölçek çubuğu 50 um =. Cryosectioned organoids (F) immünofloresan görüntüleme. İki örnekp-um ve Arl13b ile boyanmış VZS (i iii). beyaz kareler ile işaretlenmiş bölgeler her bir görüntü içerlek için sağ büyütülmüş, (ii ve iv) vardır. anafaz apikal radyal glial hücreleri (ARGS) bölünmesi düzlemi. VZ apikal tarafında apikal radyal glial hücreler bölme p-Vim pozitif (kırmızı) vardır. simetrik bölünmesi Args örnekleri (beyaz kareler ve-parçalar) 'da gösterilmiştir. bölme düzlemi, beyaz bir çizgi olarak verilmiştir. Bir anafaz hücre bölünmesi düzlemi lümen yüzeyi hattı (sarı noktalı çizgi) yatay ve Arl13b boyama (yeşil) ile işaretlenir. Ölçek çubuğu 50 um =. (G) Bu şematik bir lümene anafaz göreceli olarak bağımsız değişken dikey ya da yatay yönlendirme sağlar. 14. günde, kontrol organoids arasında bölünen hücreler, çoğunlukla yatay VZ lümen yüzeyine (0-30 ° C) göre yönlendirilir. lümenin apikal yan VZ (yeşil hat) lümen yüzeyine belirtmek Args birincil kirpikler, ile kaplıdır. Kontrast, mos yılındamikrosefali organoids radyal glial hücreler t dikey olarak yönlendirilmiş (60-90 °) bölme düzlemi gösterir. beyaz çizgi bölümü düzleminin eksen vardır. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
| Sorun: | Olası nedenler: | Öneriler: |
| Adım 1.1.1.2 | reprogramming Kötü verimliliği | Pluripotency belirteçler için hiPSCs edin: kalite düşükse birkaç pasajlar pluripotent kolonileri zenginleştirmek için, elle farklılaşmamış koloniler almak |
| İnsan iPSCs farklılaşma başlamadan önce ayırt | ||
| Erken pasajlayarak veya passagi nedeniyle Stresng olarak tek hücre | Do% 80 birleşme öncesinde geçit ulaşıldığında değil. Passage agrega, tek değil hücreleri olarak | |
| Mycoplasma ile Bulaşma | mikoplazma kontaminasyonu için test | |
| Adım 2 | hiPSCs Kalitesiz | hiPSCs kalitesini artırmak (yukarıya bakınız) |
| Neurospheres hiç oluşturmak veya farklılaşma başlamasından 5 gün sonra ayrı düşmez | oyuk başına hücre başlangıç sayısı çok düşük veya çok yüksek | Doğru hücrelerin sayısını ve her bir eşit olarak dağıtmak |
| hiPSC ortamı yerine sinir farklılaştırma ortamının kullanılmıştır | Nöral farklılaşma ortamı kullanın | |
| Santrifüj adım çok sert ya da yumuşak oldu | Sıkma, 96 gözlü plaka, 500 x g'de 3 dakika boyunca ve hücreler, merkezi olarak biriken kontrolHer bir alt kısmı | |
| farklılaşma başlangıcında hiçbir Y 27632 | hücre yaşamını geliştirmek için Y-27632 kullanın | |
| Hücreler, bağlı ve plakanın alt büyümüştür | yapışkan olmayan 96-kuyu v-alt plaka kullanıldığından emin olun. | |
| Adım 2 | Hiçbir günlük orta değişim | orta Günde yarım miktarını değiştirme |
| Neurospheres boyutunda homojen değildir | de eşit değildir başına hücre sayısı başlangıç | her 100 uL hücre süspansiyonu alınmadan önce, tek bir hücre süspansiyonu ile bir tüp karıştırın |
| Orta değişiklik her kuyu günlük yapılmadığı | Emin olun her kuyu günlük Orta değişiklik alır | |
| Adım 2 | hiPSC int ayrışmış değildifarklılaşma başlamadan önce o tek hücre | hiPSC Accutase tedaviden sonra tek hücrelere ayrışmış olup olmadığını mikroskop altında bakın. hala ve 100 uL mikropipet ile aşağı pipet hücreleri 10 kez orada toplar halinde ve tekrar kontrol veya tedavi Accutase tekrarlamak |
| Neurospheres parlak jant veya yuvarlak yüzey göstermez; bunlar yüzeyde büyük kist oluşturan | kuyu çok yüksek başına hücre sayısını başlayan | Doğru hücrelerin sayısını ve her bir eşit olarak dağıtmak |
| Orta değişiklik her kuyu için günlük yapılmadı | Yarım orta gazetesine değiştirme | |
| Adım 2.7 | hiPSCs Kalitesiz | hiPSCs kalitesini artırmak (yukarıya bakınız) |
| EHS matris gömülü Neurospheres sopa ve bir araya gelme | Yeterli ortamı (hacim) | sağlayın bir100 mm petri çanağı içinde 10 ml ortamı en az |
| kuluçka Raf bile | düz bir yüzey üzerinde çanak yerleştirin | |
| Neurospheres eşit olarak dağıtılmış şekilde inkübatör içine yerleştirildikten sonra, çanak taşımak |
Tablo 1: Sorun Giderme Tablosu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MCPH in vivo ya da insan hücre kültürü, in vitro olarak yaklaşımlar hayvan modellerinde değinmeyecek edilemez bir karmaşık insan nöro hastalıktır. MCPH klinik tezahürü erken nöron başladığında, ilk trimesterde görünmeye başlar. Böylece, 3D beyin organoids MCPH gelişimini modellemek için güvenilir deneysel sistemi temsil etmektedir. Buna ek olarak, 3D insan beyni organoids önemlisi, iii) çeşitli farklılaşma i) çeşitli genetik arka planı olan hasta numunelerinin spektrumu uyarlanması için izin ii) farklı bir nöral hücre türlerini içeren organize doku gösterdiğinden ideal bir yaklaşım, ve Bu in vitro yaklaşımda nöro aşamaları in vivo meslektaşları 25, 26, 27 ile bağlantılıdır. Örneğin, sinir rozet geliştirme nöral eşdeğer yapıdırtüp.
Lancaster ve diğ. Hasta organoids üreten başarılı olmak için iPSCs kontrol ile karşılaştırıldığında hasta iPSCs iki kat kullanılır. Unutmayın ki, mevcut yöntemleri değiştirerek, burada açıklanan protokol ile, kontrolü ve aynı hücre sayıları 4 başlayarak mikrosefali beyin organoids yaratabilir. Bunun nedeni, iPSCs belirlenen kültür koşullarına bağlı olarak ve daha yönlendirilmiş farklılaşma mümkündü. Bu protokol, Organoid nesil iPSCs şirketinden sinir farklılaşmasını başlatarak sık gerçekleştirilen EB oluşturma aşamasını değiştirilmesi ile iyileştirildi. İkinci olarak, aşama 3, dorsomorphin ve SB431542 kültür ortamı yerine, tek başına retinoik asit içine ilave edildi. Hücre kültür ortamı 28 uygulandığında Retinoik asit kolaylıkla izomerize edilir. Bu nedenle, biyolojik aktivitesi, dorsomorphin olarak daha kararlı bileşiklere kıyasla daha az hassas olarak tanımlanmıştır. Dorsomorphin inhibeBMP4 sinyal yolu ve SB431542 aktivin / düğüm bir sinyal yolunun bir önleyicisi olan (TGF-β1 ALK inhibitörü). Her iki bileşiğin bir kombinasyonudur, BMP inhibisyonu ve aktivin / düğüm sinyal yolunun yol açan sinirsel farklılaşmasını indükler, ve benzer bir verim 29 insan ES veya insan iPS hücrelerinden çeşitli hücre hatlarında diğer soylarına farklılaşmasını azaltır. Bileşik stabilite ve bileşik evrensel hücresi tepkisi, in vitro bir hastalık modeli için farklı hasta hücre hatlarına uygulanabilen bir protokol kurulması için önemli noktalardır. Bu nedenle, homojen beyin sağlam ve etkili bir farklılaşma sonuçlar daha çoğaltılabilir verileri, en sonunda, kültür organoid ve.
Bu modifikasyonlar ile, protokol içindeki kritik adım Bu noktada adım 1'de farklılaşmanın başlamasına yol minimize edilir, yavaşça tek hücre süspansiyonu halinde iPSCs ayırmak önemlidirnd, 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna doğru ve eşit bir şekilde dağıtmak için. Bu tek hücre üzere ayrılmaları üzerine iPSCs canlılığını destekler olarak Rho-ilgili protein kinaz önleyicisi (Y-27632), ilk 24 saat boyunca ortam B'de eklenmelidir. Kuyuların dibine onları aşağı iplik birbirleri ile yakın temas içinde hücreleri getirmek için önemlidir. Neurospheres adım 1 ucunda oluşturulan sonra, daha fazla deneysel prosedürler başarıyla tamamlanması beklenebilir. halinde Neurospheres insan iPSCs arasında pluripotensini oluşturmazlar, 96 oyuklu bir plaka içerisinde hücreler ve santrifüj koşullarının uyumsuzluk kontrol edilmelidir. Adım 1 0. günde tüm prosedürü nedeniyle insan iPSCs duyarlılığına artık 1 saat daha sürer. Aşağıdaki günlerde Orta değişiklikler hücreler arasında yeni oluşan hücre kişileri yok etmek değil sırayla, sırf güçleri kaçınarak, özenle yapılmalıdır.
O centrosom dikkat çekicidirark mutantları kusurlu hücre çoğalması ve değiştirilmiş hücre döngüsü dinamiği. Böylece, MCPH modelleme tehlikeye hücresel fonksiyonları dayanabilir güçlü bir protokol gerektirir. Bu nedenle, mevcut protokol, yüksek kalitede homojen organoids üretilmesine imkan tanır ve VZ de kök hücre homeostazı incelemek için eşsiz bir araç olarak hizmet eder. Diğer protokoller aksine, bu protokol eşit hücre sayıları ile başlayarak, kontrol ve hasta iPSCs gelen organoids üretilmesini sağlar. In vitro farklılaşması göre çalışmaları için, farklı iPSCs için aynı kültür koşulları hastalıkla ilişkili değişiklikleri tespit etmek ve kültür durum bozulmaları önlemek için kullanılan temel bir gereklilik vardır. genetik kaynaklı mikrosefali modelleme yanı sıra, bu protokol, aynı zamanda, nörotrofik viral enfeksiyonlar, kimyasal maddeler veya radyasyon da dahil olmak üzere, genetik olmayan kökenli mikrosefali uygulanabilir. Buna ek olarak, 30, örneğin dızı CRISPR'nın gibi modern moleküler biyoloji araçları, / Cas9 genom düzenlemekteknolojileri ing, in vitro 31, 32, 33 insan beyin gelişimi paradigmasının belirli yönlerini incelemek 3D organoids uygulanabilir.
Öte yandan, bugüne kadar beyin organoids nesil hala insan gelişiminin 34 birinci ve erken ikinci üç aya ötesine gitmemiştir. Bu sınırlama geride bırakarak, Parkinson veya Alzheimer hastalığı gibi daha sonraki aşamalarında, ortaya çıkan nörodejeneratif hastalıkların modellemek için yeni yollar açacağını, in vitro olarak, olgun beyin organoids üretilmesini mümkün kılar. Gelecekteki uygulamalarda, protokoller ön beyin ya da orta beyin gibi, daha spesifik bölgelerine farklılaşma yönlendirilmesi, otizm ve şizofreni 35, 36, 37 gibi kompleks nörolojik bozukluklar çalışma ilgi çekici olabilir, 38 kadar.
Organoid çalışmalardan sonuç çizerken önemlisi, bazı yönleri dikkate alınmalıdır. İlk sınırlama organoids içinde belirgin vaskülarizasyon olmasıdır. Bu nedenle, in vitro olarak gaz değişimi ve besin kaynağı ile in vivo koşullara en yaklaştığı. Beyin organoids kompleks organ sistemlerine bağlı değildir İkinci olarak da, Organoid modeli tam bir bağışıklık, metabolik ve hormonal sistemi yoktur. Bununla birlikte, bu açıdan yokluğu bazen avantaj sağlamaktadır. Beyin hastalıklarının patogenezinde immün sisteminin etkisini ele Örneğin, burada tarif edilen organoids vivo modellerde bağışıklık yerini alabilir.
döndürme şişeleri kullanımıyla, organoids çok sayıda biyokimyasal deneylerde, tüm transcriptome dizi analizi ve yüksek verimli ilaç taramalarında için oluşturulabilir. u tarafından, birlikte ele alındığındaBu, mevcut protokolü şarkı birinin güvenilir bir şekilde gelecekte hayvan deneyleri yerini almak amacıyla, daha sonra ilaç test platformlara hastalık modellemeden, geniş bir uygulama aralığında kullanılabilir insan iPSCs hücreleri, beyin organoids üretebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma Fritz Thyssen Vakfı (Az.10.14.2.152) tarafından desteklenmiştir. Biz doku gömme tesisi ve CMMC mikroskop çekirdek tesisine minnettarız. Biz Sentrozom ve Sitoiskelet Biyoloji Laboratuvarı üyeleri tarafından sunulan tartışmalar ve teknik destek için müteşekkiriz. Yazıları ve düzeltilmesi için Li Ming Gooi teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse 488 | Invitrogen | A-11001 | Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
| Anti-rabbit 647 | Invitrogen | A-21245 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 |
| Arl13b | proteintech | 17711-1-AP | ARL13B rabbit polyclonal antibody |
| CELLSPIN system | IBS Integra Bioscience | 183001 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, US | 32670 | 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| DMEM/F-12 | Gibco, US | 31331093 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 |
| Dorsomorphin | Sigma-Aldrich, US | P5499 | Compound C; multiple suppliers |
| Embedding medium | AppliChem | A9011, 0100 | Mowiol; embedding medium; multiple suppliers |
| Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix | Corning | 354277 | Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified |
| Fish gelatin | Sigma-Aldrich, US | G7765-250ML | Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4 °C |
| Glycine | AppliChem | A1067,1000 | Glycine for molecular biology; multiple suppliers |
| Inoculation loop with needle, disposable (1 µL) | Sigma Aldrich, US | BR452201-1000EA | multiple suppliers |
| Insulin | Sigma-Aldrich, US | I3536-100MG | multiple suppliers |
| L-glutamine | Gibco, US | 25030081 | L-glutamine (200 mM) |
| Medium A | Stem cell technologies | #05850 | mTeSR1 (hiPSC medium) |
| Medium B | Stem cell technologies | #05835 | Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium |
| Medium C | Gibco, US | 21103049 | Neural Basal Medium |
| MEM | Gibco, US | 11140035 | MEM non-essential amino acids solution (100x) |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza, Switzerland | #LT07-218 | Mycoplasma detection kit; multiple suppliers |
| Nestin | Novus biologicals | NBP1-92717 | Nestin mouse monoclonal antibody (4D11) |
| Paraformaldehyde (PFA) | AppliChem | A3813, 0500 | 4% in PBS, store solution at -20 °C; caution: wear skin and eye protection and work under hood |
| PBS tablets | Gibco, US | 18912014 | See manufacturer´s instructions; multiple suppliers |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL) | Gibco, US | 15140122 | Multiple suppliers |
| Poly-L-lysine solution (PLL) | Sigma-Aldrich, US | P8920-100ML | Multiple suppliers |
| pVim | MBL | D076-3S | Phospho-Vimentin (Ser55) mAb |
| Reagent A | Stem cell technologies | # 05872 | Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available |
| Reagent B | Sigma-Aldrich, US | A6964-100ML | Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution” |
| Research Cryostat Leica CM3050 S | Leica biosystems | CM3050 S | Multiple suppliers |
| SB431542 | Selleckchem.com | S1067 | Multiple suppliers |
| Spinner flask 250 mL | IBS Integra Bioscience | 182026 | |
| Sucrose | AppliChem | A4734, 1000 | Multiple suppliers |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo scientific, US | J3800AMNZ | Slides should be labeled with a "+" and positively charged |
| Supplement 1 | Gibco, US | 17502048 | N-2 supplement (100x) |
| Supplement 2 w/o Vitamin A | Gibco, US | 12587010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, NL | 4565 | Multiple suppliers |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura, NL | 4583 | Multiple suppliers |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388,0500 | Multiple suppliers |
| TUJ1 | Sigma-Aldrich, US | T2200 | β-Tubulin III (rabbit polyclonal) |
| TUNEL assay | Promega, US | G3250 | DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers |
| Tween 20 for molecular biology | AppliChem | A4974,0500 | Multiple suppliers |
| waterproof sheet | BEMIS company, inc. | PM996 | Parafilm “M”; multiple suppliers |
| Y-27632 | Selleckchem.com | S1049 | ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers |
| β-mercaptoethanol | Gibco, US | 31350010 | 2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers |
References
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, 373-379 (2013).
- Eiraku, M., Sasai, Y. Mouse embryonic stem cell culture for generation of three-dimensional retinal and cortical tissues. Nat Protoc. 7, 69-79 (2012).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35 (8), 803-819 (2016).
- Al-Dosari, M. S., Shaheen, R., Colak, D., Alkuraya, F. S. Novel CENPJ mutation causes Seckel syndrome. J Med Genet. 47, 411-414 (2010).
- Wollnik, B. A common mechanism for microcephaly. Nat Genet. 42, 923-924 (2010).
- Thornton, G. K., Woods, C. G. Primary microcephaly: do all roads lead to Rome? Trends Genet. 25, 501-510 (2009).
- Barbelanne, M., Tsang, W. Y. Molecular and cellular basis of autosomal recessive primary microcephaly. Biomed Res Int. 2014, 547986 (2014).
- Homem, C. C., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nat. Rev. Neurosci. 16, 647-659 (2015).
- Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35, 803-819 (2016).
- Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. , (2012).
- Morizane, A., Doi, D., Kikuchi, T., Nishimura, K., Takahashi, J. Small-molecule inhibitors of bone morphogenic protein and activin/nodal signals promote highly efficient neural induction from human pluripotent stem cells. J. Neurosci. Res. 89, 117-126 (2011).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).
- Zhou, J., et al. High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors. Stem Cells. 28, 1741-1750 (2010).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8, 409-412 (2011).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
- Bai, Q., et al. Temporal analysis of genome alterations induced by single-cell passaging in human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 24, 653-662 (2015).
- Garitaonandia, I., et al. Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions. PLoS One. 10, e0118307 (2015).
- Ohnuma, K., et al. Enzyme-free passage of human pluripotent stem cells by controlling divalent cations. Sci. Rep. 4, 4646 (2014).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. J Vis Exp. , (2007).
- Yingling, J., et al. Neuroepithelial stem cell proliferation requires LIS1 for precise spindle orientation and symmetric division. Cell. 132, 474-486 (2008).
- Rakic, P. A small step for the cell, a giant leap for mankind: a hypothesis of neocortical expansion during evolution. Trends Neurosci. 18, 383-388 (1995).
- Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 4335-4340 (2010).
- Wilson, P. G., Stice, S. S. Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells. Stem Cell Reviews. 2, 67-77 (2006).
- Dhara, S. K., Stice, S. L. Neural differentiation of human embryonic stem cells. J. Cell Biochem. 105, 633-640 (2008).
- Christie, V. B., et al. Synthesis and evaluation of synthetic retinoid derivatives as inducers of stem cell differentiation. Org Biomol Chem. 6, 3497-3507 (2008).
- Kim, D. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Reviews. 6, 270-281 (2010).
- Gabriel, E., et al. Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids. Cell stem cell. , (2017).
- Wu, J., Hunt, S. D., Xue, H., Liu, Y., Darabi, R. Generation and Characterization of a MYF5 Reporter Human iPS Cell Line Using CRISPR/Cas9 Mediated Homologous Recombination. Sci. Rep. 6, 18759 (2016).
- Li, H. L., Gee, P., Ishida, K., Hotta, A. Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR-Cas9 system. Methods. 101, 27-35 (2016).
- Grobarczyk, B., Franco, B., Hanon, K., Malgrange, B. Generation of Isogenic Human iPS Cell Line Precisely Corrected by Genome Editing Using the CRISPR/Cas9 System. Stem Cell Reviews. 11, 774-787 (2015).
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 15672-15677 (2015).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165, 1238-1254 (2016).
- Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19, 248-257 (2016).
- Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
- D'Avanzo, C., et al. Alzheimer's in 3D culture: challenges and perspectives. Bioessays. 37, 1139-1148 (2015).
