Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

جيل المستمدة IPSC-Organoids الدماغ البشري لنموذج اضطرابات النمو العصبي في وقت مبكر

Published: April 14, 2017 doi: 10.3791/55372
Automatic Translation
1, 1,2
1Center for Molecular Medicine Cologne, University of Cologne, 2Institute for Biochemistry I, Medical School of University of Cologne

Introduction

اضطرابات النمو العصبي الإنسان، مثل صغر الرأس، لا يمكن إلا أن تدرس بشكل سيئ في النماذج الحيوانية يرجع ذلك إلى حقيقة أن العقول البشرية لديها سطح القشرة الموسعة، وهي ميزة فريدة من نوعها مختلفة من الحيوانات غير البشرية.

هذا الجانب يجعل نمو الدماغ الإنسان عملية معقدة لا يمكن دراستها بشكل كاف في 2D، في نظام زراعة الخلايا في المختبر. الناشئة تقنيات زراعة 3D تسمح توليد organoids مثل الأنسجة من الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (iPSCs). تمايز في المختبر من خلايا جذعية المحفزة في ثقافة تعليق 3D يسمح بتشكيل مختلف أنواع الخلايا في الوقت المناسب وبطريقة منطقة محددة، مما أدى إلى والأنسجة المنظمة الطبقية 1، 2، 3. بفضل المختبرات التي كانت رائدة تقنيات ثقافة 3D وبسط تعقيد تشكيل الجهاز، بدءا من الخلايا الجذعية،قمنا بتطوير وسيلة قوية لتوليد organoids الدماغ لتحديد الأحداث في وقت مبكر من نمو الدماغ البشرية ونموذج صغر الرأس في المختبر 1، 2، 3. ومن الجدير بالذكر أننا تكييف طريقة الأصلي التي وضعتها لانكستر وآخرون. لتوليد organoids الدماغي 1. تم تعديل هذه الطريقة وفقا لمتطلبات التجريبية لدينا.

والهدف من دراسة من جبريل وآخرون. كان لتحليل الآليات الخلوية والجزيئية من العصبية صيانة الخلايا الجذعية أثناء نمو المخ. من أجل القيام بذلك، وقد أجريت دراسة الآلية عن طريق تحليل الخلايا الاولية العصبية (الشخصيات) في organoids الدماغ 3D المستمدة من المريض صغر الرأس (4). حمل هذا المريض طفرة في CPAP، وهو بروتين centrosomal الحفاظ اللازمة لنشوء حيوي الجسيم المركزي 5. A فراش لا تسبب مقبولة على نطاق واسعالأطروحة هو أن صغر الرأس هو نتيجة لنضوب حوض السباحة مجلس الشعب، وهذا قد يكون راجعا إما إلى موت الخلية أو التمايز من السابق لأوانه 1 و 6 و 7 و 8 و 9.

من خلال تحليل مناطق البطين (VZs) من organoids الدماغ صغر الرأس، تبين أن عددا كبيرا من الشخصيات الخضوع لانقسام الخلايا غير متناظرة، على عكس organoids الدماغ مشتقة من متبرع سليم (4). وكشفت التحليلات المجهرية والكيمياء الحيوية واسعة من organoids الدماغ صغر الرأس دورا غير متوقع لCPAP في أهداب في الوقت المناسب التفكيك 4. على وجه التحديد، ويرتبط CPAP تحور مع التفكيك هدب المتخلفين وتأخر دورة الخلية اعادة الدخول، مما يؤدي إلى تمايز سابق لأوانه من الشخصيات 4. وتشير هذه النتائج دور للأهداب في صغر الرأس والعشرينمشاركة الاستخراجية خلال تكوين الخلايا العصبية وحجم الدماغ السيطرة على 10.

الجزء الأول من هذا البروتوكول هو وصف لطريقة من ثلاث خطوات لتوليد organoids الدماغ متجانسة. كما ذكرت من قبل، تم تكييفها على بروتوكول لانكستر الأصلي وتعديلها لتتناسب مع هدفنا 1. أولا، iPSCs البشرية المستزرعة في حالة محددة خالية من التغذية على Engelbreth-هولم-سرب (EHS) المصفوفة. هذه الخطوة يتجنب الاختلافات المحفزة مزارع الخلايا الجذعية التي تعتمد على التغذية. في هذا البروتوكول، وتحريض التمايز العصبي لتشكيل الظهارة العصبية تبدأ مباشرة من iPSCs. من خلال تخطي الخطوة تشكيل هيئة مضغي (EB)، عائدات التمايز العصبية بطريقة أكثر رقابة وموجهة. هذا النهج يحد من تشكيل عفوية وصليات من طبقات الخلايا الجرثومية الأخرى مثل الأديم المتوسط ​​والأديم الباطن. من خلال تطبيق هذا البروتوكول، neurospheres تحتوي على ريدات العصبية يمكن أن تحصد في يوم 5 لEHS تضمين المصفوفة وثقافة تعليق ثابتة. وتستكمل المتوسط ​​عضوي الشكل المستخدمة في الخطوة الثالثة من بروتوكول لدينا مع dorsomorphin وSB431542. Dorsomorphin هو المانع جزيء صغير من البروتين morphogenic العظام (BMP)، وSB431542 يمنع TGFβ / activin / العقدي مسار الإشارات. مزيج من هذه العوامل يمكن أن تعزز التمايز العصبي أكثر كفاءة من حمض الريتينويك وحده 11 و 12 و 13 و 14.

وإجمالا، تمكن هذه التعديلات الجيل استنساخه من organoids الدماغ، مع الحد الأدنى من الاختلافات عبر organoids. الأهم من ذلك، تم تطبيق هذه الطريقة لتوليد بقوة organoids الدماغ صغر الرأس من iPSCs المرضى، والتي تحمل طفرات في الجينات التي تؤثر جسيم مركزي وديناميات دورة الخلية.

الجزء الثاني من هذا البروتوكول يعطي تعليمات لإعداد رعين organoids لتحليل وتفسير العيوب الخلوية في صغر الرأس. وهذا يشمل التثبيت، cryosectioning، تلوين مناعي، والتحليل المجهري متحد البؤر. وهذا البروتوكول توفر للقارئ وصفا مفصلا للنتائج المتوقعة ومع التوجيه للتفسير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. جيل من الدماغ Organoids (23 يوما)

  1. بدء الأديم الظاهر العصبي (5 أيام)
    ملاحظة: ينبغي النظر في النقاط التالية قبل بدء التمايز. طريقة إعادة برمجة (الخ lentiviral-، المستندة إلى الرنا الميكروي-سينداي virus-، episomal-، أو) للحصول على iPSCs الإنسان يجب أن يكون مثاليا واحدة لجميع المريض والسيطرة على خطوط IPSC. تتوفر 15، 16، 17، 18 مجموعات برمجة مختلفة والتعليمات بناء على البروتوكولات التي تم نشرها. نوعية خطوط IPSC الإنسان هو المفتاح لتحقيق والتمايز الأمثل. مراقبة مستعمرة ومورفولوجيا الخلايا تحت المجهر والتحقق من صحة تعدد القدرات عن طريق اختبار التعبير عن علامات مثل Oct3 / 4، NANOG، أو TRA-1-60.
    1. iPSCs الثقافة البشرية في ظل ظروف خالية من التغذية في المتوسط ​​وعلى طبق المغلفة مع Engelbreth-هولم-سرب(EHS) المصفوفة.
      ملاحظة: تنمو iPSCs الإنسان والحفاظ على حالة ثقافة محددة وتجنب خطوة إضافية لإزالة الخلايا المغذية الماوس الجنينية (MEFS) قبل بدء التمايز خالية من المصل خالية من وحدة التغذية. عدد مرور الأمثل لiPSCs الإنسان لبدء نطاقات التمايز من مرور 15 على إعادة برمجة لمرور 70 في المجموع. عندما الركض، فصل المستعمرات hiPSC باسم خلايا الكلي باستخدام محلول الخلايا المفرزة المناسب مع إجهاد منخفضة وماصة المصلية 2 مل لنقل الركام إلى طبق جديد. تجنب التفكك إلى خلايا واحدة، لأن ذلك قد يحفز التمايز وموت الخلايا المبرمج في معظم خطوط IPSC. وأفيد أن على المدى الطويل، الركض وحيدة الخلية يمكن أن تزيد التعديلات الجينية في الإنسان iPSCs 19 و 20. تجنب الإجراءات مفرزة الخلية، والتي تتطلب خطوة الطرد المركزي لإزالة حل مفرزة، وهذا يقلل من الجدوى الشاملة للiPSCs. اختبارجميع الثقافات عن التلوث الميكروبي وخاصة الميكوبلازما، على أساس منتظم، لأن هذا قد يغير نوعية iPSCs والقدرة على التمايز بهم.
      1. معطف 60 ملم الأنسجة صحن الثقافة مع EHS المصفوفة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
      2. ذوبان الجليد قسامة من 1 × 10 6 iPSCs الإنسان. البذور وiPSCs في طبق نسيج الثقافة 60 ملم مغلفة الصحة والسلامة في المصفوفة وتحتوي على 5 مل من المتوسط A (انظر الجدول المواد). تغيير متوسطة يوميا والمرور بعد 5-7 أيام عندما تصل خلايا ~ 80٪ confluency.
        ملاحظة: تمرير iPSCs إذابة بنسبة 80٪ confluency باستخدام الأساليب القياسية، مثل مفرزة خالية من إنزيم المستعمرات 21، مرة واحدة على الأقل قبل البدء في التمايز. وباختصار، وإزالة المتوسطة IPSC، وغسل خلايا مرة واحدة مع درجة حرارة ما قبل 37 المعدلة ° C Dulbecco والمتوسطة النسر: المغذيات خليط F12 (DMEM / F12)، واحتضان iPSCs التالية الشركة المصنعةتعليمات باستخدام كاشف A (انظر الجدول المواد). لا تتجاوز فترة حضانة الموصى بها من أجل تفادي التفكك إلى الخلايا واحد. يجب فصل iPSCs الإنسان ويتحرك كما المجاميع والخلايا لا واحدة كما. أنها يمكن بعد ذلك نقل إلى أطباق جديدة المغلفة مصفوفة الصحة والسلامة. على سبيل المثال، IPSC المجاميع من يمكن توزيعها واحد طبق 60 ملم إلى 4 أطباق جديدة من عيار 60 ملم.
      3. تحقق من الميكوبلازما مع مجموعة الكشف عن الميكوبلازما وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. استخدام iPSCs فقط خالية من الميكوبلازما، والميكوبلازما يمكن أن يغير من قدرة التفريق بين iPSCs.
    2. فصل iPSCs (80٪ متموجة) وإعداد وحيدة الخلية تعليق باستخدام كاشف B.
      1. يغسل مرة واحدة مع iPSCs قبل تحسنت (37 ° C) DMEM / F12.
      2. إضافة قبل تحسنت كاشف B (على سبيل المثال، 1 مل في صحن 60 ملم) واحتضان iPSCs لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
      3. نفض الغبار 20 مرات مع بصعوبة على الجانب السفلي منطبق لفصل iPSCs. التحقق من وجود مفرزة من الخلايا تحت المجهر.
      4. ماصة تعليق الخلية صعودا وهبوطا في الطبق 5 مرات مع micropipette 1 مل.
      5. إضافة 3 مل من المتوسط ​​ولتمييع 1 مل من كاشف B وجمع تعليق خلية في أنبوب الطرد المركزي 15 مل.
      6. تدور بلطف أسفل iPSCs (500 x ج) لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      7. إعادة تعليق بيليه خلية في 1 مل من المتوسط ​​B وحساب عدد الخلايا مع عدادة الكريات.
        ملاحظة: كن على علم فقط باستخدام المتوسط ​​B لإعادة تعليق. تجنب استخدام المتوسطة A، كما أنه يحتوي على تركيز عال من اللازم bFGF، والتي قد تحول دون تمييز.
    3. تمييع تعليق خلية إلى 4.5 × 10 5 خلايا لكل مل في المتوسط B تستكمل مع المرتبطة رو 10 ميكرومتر بروتين كيناز المانع (Y-27632).
    4. إضافة 100 ميكرولتر لكل بئر في غير ملتصقة، والخامس أسفل، لوحة 96-جيدا.
      ملاحظة: تأكد من توزيع الخلايا على قدم المساواة في سوسالتقاعد عن طريق هز أنبوب كل مرة قبل أخذ 100 ميكرولتر أجزاء. من المهم أن كل بئر يجب أن تحتوي على عدد الخلايا يعادل من أجل الحصول على neurospheres متجانسة في الحجم والشكل (جولة والأسطح محددة).
    5. تدور بلطف إلى أسفل لوحة مع الخلايا في 500 x ج ودرجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق واحتضان عند 37 درجة مئوية و CO 2 5٪.
    6. تغيير المتوسطة يوميا عن طريق إزالة 50 ميكرولتر وإضافة 50 ميكرولتر من الطازجة المتوسطة B في كل بئر لمدة 5 أيام القادمة.

2. تضمين Neurospheres الصحة والسلامة في مصفوفة (4 أيام)

  1. إعداد المتوسطة neurosphere عن طريق خلط ما يلي: 1: 1 خليط من DMEM / F12 والمتوسطة C (ت / ت)، 1: 200 (ت / ت) الملحق 1، 1: 100 (ت / ت) ملحق 2 بدون (ث / س) فيتامين A، 1: 100 L-الجلوتامين، 0.05 ملي الأحماض الأمينية غير الأساسية (MEM)، و 100 U / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، 1.6 غرام / L الأنسولين، و 0.05 ملم β-المركابتويثانول.
  2. جمع neurospheres الطرافةها 200 ميكرولتر micropipette باستخدام ملم غيض ~ 2 قطع سابقا مع مقص العقيمة.
  3. ضع neurospheres حوالي 5 ملم بعيدا عن بعضها البعض على الفيلم البارافين (3 × 3 سم 2) في طبق فارغ 100 ملم وإزالة بعناية أكبر قدر من المتوسطة المتبقية وقت ممكن.
  4. إضافة قطرة (7 ميكرولتر) من EHS مصفوفة على كل neurosphere واحد.
  5. احتضان مصفوفة EHS تنخفض مع neurospheres لمدة 15 دقيقة في حاضنة.
  6. غسل neurospheres بعناية من الفيلم البارافين عن طريق تنظيف لهم المتوسطة neurosphere. للقضاء، واستخدام 1 مل micropipette والجديد 100 ملم طبق بتري تحتوي على 10 مل من المتوسط ​​neurosphere.
  7. احتضان neurospheres لمدة 4 أيام القادمة، وإضافة 2 مل من المتوسط ​​neurosphere جديدة في يوم 2.
    ملاحظة: تأكد من أن الرفوف في حاضنة مسطحة بحيث سوف neurospheres جزءا لا يتجزأ من مصفوفة EHS لا تتجمع معا على جانب واحد من الطبق.

3. Organoids في تعليق الروتاريثقافة (14 يوم)

  1. إعداد الدماغ المتوسط ​​عضوي الشكل عن طريق خلط ما يلي: 1: 1 خليط من DMEM / F12 والمتوسطة C (ت / ت)، 1: 200 (ت / ت) الملحق 1، 1: 100 (ت / ت) ملحق 2 ث / س فيتامين A، 1: 100 L-الجلوتامين، 0.05 ملي MEM، 100 U / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، 1.6 غرام / L الأنسولين، و 0.5 ميكرومتر dorsomorphin، 5 ميكرومتر SB431542، و 0.05 ملم β-المركابتويثانول.
  2. إضافة 100 مل من الدماغ عضي المتوسطة إلى كل قارورة الدوار من خلال الأسلحة جانبها ووضعها في حاضنة لمرحلة ما قبل ارتفاع درجات الحرارة لمدة 20 دقيقة على الأقل.
  3. وضع برنامج التحريك في 25 دورة في الدقيقة، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    ملاحظة: قبل نقل neurospheres جزءا لا يتجزأ من مصفوفة الصحة والسلامة في قوارير الدوار، تأكد من أن يتم فصل أنهم جميعا. إذا كنت متصلا اثنين أو أكثر من خلال EHS المصفوفة، تفصل بينهما عن طريق قطع مصفوفة التواصل مع مشرط.
  4. نقل بعناية neurospheres جزءا لا يتجزأ من مصفوفة الصحة والسلامة في قوارير الدوار تحتوي على 100 مل من المتوسط ​​عضوي الشكل لناجي ماصة المصلية 2 مل. استخدام الأسلحة جانبية القارورة الدوار لنقل neurospheres في قارورة.
  5. وضع قوارير الدوار على منصة التحريك المغناطيسي في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. هذا هو اليوم 0 من الثقافة عضي.
  6. تغيير متوسطة مرة واحدة في الأسبوع (أو أكثر في كثير من الأحيان عندما يكون هناك تغير لونها) عن طريق إزالة نصف المتوسط ​​وإضافة نفس الكمية من متوسطة جديدة.
    ملاحظة: عند نقل قوارير الدوار من الحاضنة، الانتظار 3-5 دقائق للسماح للorganoids تغرق إلى أسفل القارورة. إزالة المتوسطة من خلال وضع طرف زجاج ماصة (متصلة مضخة) على سطح السائل. نضح المتوسطة بعناية من خلال فتح جانب واحد / ذراع القارورة. يجب أن يتم هذه المناورات تحت غطاء محرك السيارة الصفحي.

4. تحليل الدماغ Organoids

  1. تثبيت من organoids
    1. جمع organoids في يوم 14 من واي ثقافة الدوار قارورةث قطع 1 مل micropipette (قطع ~ 5 ملم). وضع كل منهم في صحن 60 ملم وغسلها مرة واحدة مع 5 مل من DMEM دافئ / F12 لمدة 3 دقائق.
    2. إعداد أنبوب 1.5 مل مع 500 ميكرولتر من الحارة 4٪ بارافورمالدهيد (PFA).
      الحذر: ارتداء الجلد وحماية العين والعمل تحت غطاء السلامة عند التعامل مع PFA تثبيتي.
    3. وضع كل عضي على حدة في كل أنبوب واصلاحها لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. لا إصلاح organoids لمدة أطول من 60 دقيقة. لنقل organoids، استخدم حلقة التلقيح أو أي ابتكار الأخرى التي هي مريحة.
    4. إزالة PFA وغسل organoids الثابتة مرتين لمدة 10 دقيقة لكل منهما مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
    5. تخزين organoids في 1 مل من برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 7 أيام، حتى استخدامها مرة أخرى.
  2. تضمين organoids لcryosectioning
    1. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل من السكروز 30٪ في محلول الماء المقطر في أنبوب ليذوى organoids قبل cryofreezing عليها؛ بعد إضافة sucroحد ذاتها الحل، organoids يجب أن يتحرك على السطح. تخزين organoids بين عشية وضحاها في حل السكروز في 4 درجات مئوية. في اليوم التالي، كان ينبغي أن غرقت organoids إلى أسفل الأنبوب.
      ملاحظة: Organoids يمكن تخزينها لمدة تصل إلى 3-5 أيام في 4 درجات مئوية في محلول السكروز، إذا لزم الأمر.
    2. ملء قالب الفينيل عينة مع 400 ميكرولتر من أفضل درجة حرارة القطع (أكتوبر) مركب واستخدام حلقة التلقيح لوضع عضي في وسط القالب. تسمية حافة القالب مع اسم العينة.
    3. تجميد قالب يحتوي عضوي الشكل-في -80 درجة مئوية حتى cryosectioning.
    4. cryoslides الزجاج معطف مع 0.1٪ بولي لام، ليسين حل (PLL) في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة والسماح للشرائح تجف لمدة 3 ساعات. تخزين الشرائح في 4 درجات مئوية، وتدفئة لهم حتى المعتدلة الغرفة قبل الاستخدام.
      ملاحظة: PLL طلاء خطوة هامة، لأنها سوف تمنع شرائح عضي من العائمة بعيدا. جمع وتخزين حل PLL في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3الشهور. قبل إعادة استخدامها، تصفية مع حقنة 0.22 ميكرون والسماح لها الحارة إلى درجة حرارة الغرفة.
    5. organoids قسم cryofrozen إلى 20-50 ميكرون شرائح سميكة على الزجاج المطلي PLL-cryoslides 22. دعونا الشرائح مع أقسام تجف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تخزين المقاطع في -80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.

5. مناعي تلطيخ الأقسام عضي

ملاحظة: للحصول على توصيف العام للorganoids، تلطيخ مع nestin، علامة السلف العصبية، وTUJ1، علامة عموم العصبية، فمن المستحسن. كأمثلة إضافية، مناعي تلطيخ مع الفوسفات-فيمنتين (ف فيم)، التي تصف الخلايا الدبقية شعاعي قمية الإنقسامية، وArl13b، على هدب، موصوفة. لاختبار موت الخلايا المبرمج، استخدم فحص محطة deoxynucleotidyl ترانسفيراز (TDT) dUTP نيك-نهاية الوسم (النفق). ضع الشرائح في علبة بلاستيكية خلال حضانات لحمايتهم من الغبار والضوء،والجفاف.

  1. ذوبان الجليد الشرائح لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  2. تغسل الشرائح مرتين مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني-الجلايسين (0.225 غرام من الجلايسين في PBS) لمدة 3 دقائق لإرواء تألق ذاتي الناجمة PFA.
  3. Permeabilize الأقسام مع 200 ميكرولتر من 0.5٪ تريتون X100 / 0.1٪ توين في حل PBS لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. غسلها مرتين مع 200 ميكرولتر من محلول PBS-جليكاين لمدة 3 دقائق.
  5. احتضان لهم مع 200 ميكرولتر من 0.5٪ الجيلاتين الأسماك / 0.1٪ تريتون X100 في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية لمنع المستضد غير محددة ملزمة.
    ملاحظة: إذا كنت بحاجة لفحص النفق، نفذ الفحص وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. نبدأ مع فحص النفق قبل تنفيذ المناعية، لأنها قد تتداخل مع الأجسام المضادة الثانوية وإخماد fluorophores عند استخدامها بعد ذلك.
  6. تمييع الأجسام المضادة في عرقلة الحل في التركيزات التالية: nestin، 1: 200. ف فيم، 1: 500. TUJ1، 1: 200.Arl13b، 01:20. والأجسام المضادة الثانوية، 1: 1000.
  7. احتضان مع 200 ميكرولتر من أول الأجسام المضادة الأولية (على سبيل المثال، nestin) لمدة 1-2 ساعات في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  8. غسل 3 × 3 دقائق مع 200 ميكرولتر من عرقلة الحل.
  9. تمييع الأول (مكافحة فأر 488) الأجسام المضادة الثانوية 1: 1000 في عرقلة الحل واحتضان الشريحة في 200 ميكرولتر لمدة 1-2 ساعات في درجة حرارة الغرفة. من الآن فصاعدا، ودائما حماية الشرائح من الضوء.
  10. غسل 3 × 3 دقائق مع 200 ميكرولتر من عرقلة الحل.
  11. احتضان مع 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المقبل (على سبيل المثال، TUJ1) لمدة 1-2 ساعات في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  12. غسل 3 × 3 دقائق مع 200 ميكرولتر من عرقلة الحل.
  13. إضافة 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية التالي (المضادة للأرنب 647) لمدة 1-2 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
  14. غسل 3 × 3 دقائق. مع 200 ميكرولتر من عرقلة الحل.
  15. إضافة 200 ميكرولتر من 4، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي) في 30 نانومتر اضربentration في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتلطيخ النووي.
  16. غسل 2 × 3 دقائق مع 200 ميكرولتر من عرقلة الحل.
  17. غسل 1 × 1 دقيقة مع 200 ميليلتر من الماء المقطر، والسماح للأقسام تجف لمدة 10-20 دقيقة، حتى لا قطرة ماء وضوحا هو واضح أكثر من ذلك.
  18. جبل الأقسام مع تضمين المتوسطة. تخزينها محمية من الضوء في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى عدة أسابيع.
  19. الشروع في التحليل المجهري لصورة لمحة عامة عن، منطقة عضي البطين، لوحة القشرية البدائية، وغيرها من المجالات ذات الاهتمام.
  20. استخدام المجهر متحد البؤر مع النفط 63X مرشحات موضوعية والفلورسنت، الذي تم اختياره وفقا لالأجسام المضادة الثانوية فلوري الموسومة الصبغة المستخدمة 1، 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

توليد organoids المخ يتطلب على الأقل ثلاثة أسابيع من زراعة المستمرة (الشكل 1A). ولتحقيق نتائج يمكن استنساخه، ونحن نوصي بأن الباحث يوثق كل خطوة، والأهم من ذلك، يتجنب أي تعديلات بشأن المكونات المتوسطة، ونقاط الوقت، والتعامل مع الخلية. هنا، نقدم ملخصا لكيفية تقييم ما إذا تم التوصل إلى معالم حاسمة من أجل الحصول على organoids ذات نوعية كافية في نهاية التجربة. وينبغي أن يكون تشكيل neurospheres في لوحة 96 جيدا واضحة للعيان من يوم 4. Neurospheres يمكن التعرف على المجالات بوصفها واضحة المعالم على الجزء السفلي من كل بئر (الشكل 1B، الخطوة 1).

في يوم 5، وينبغي أن يكون neurospheres ~ 500 ميكرون في القطر، وتظهر على سطح أملس، مع حافة مشرق المحيطة مركز الظلام. قد يكون من الممكن أن نلاحظ بالفعل العصبي stru الموسعة مثل وردة ctures في هذا حافة مشرق (الشكل 1C، تبدأ من الخطوة 2). إذا كان neurospheres ينهار أو تبدو أكثر مثل المجاميع الخلية، لا ينبغي أن يستمر كذلك التمايز. وأخيرا، ينبغي organoids زيادة وتظهر حجم مماثل أثناء عملية التمايز في قوارير الدوار (1D الشكل، الخطوة 3). راجع الجدول استكشاف الأخطاء وإصلاحها (الجدول 1) لمزيد من المعلومات.

يجب التأكد من صحتها نوعية يوم 14 organoids بواسطة المجهر الضوئي. وتتكون VZs من طبقات سميكة من الشخصيات / الخلايا الدبقية شعاعي nestin الإيجابي مع شكل النووي الحاجز في الجانب قمي. من ناحية أخرى، سوف يحتوي على لوحة القشرية البدائية وفرة الخلايا العصبية TUJ1 إيجابي على الجانب القاعدي، مميزة مكانيا من الجانب قمي (الشكل 1E). الأهم من ذلك، لا ينبغي أن ينظر إلى الخلايا العصبية TUJ1 إيجابية في الجانب قمية من VZ.

رقيقة الصفحات = "1"> تحليل الطائرة تقسيم قمية الخلايا الدبقية شعاعي (وسائط)، ونحن نوصي باستخدام الفوسفات-فيمنتين (ف فيم) وArl13b تلطيخ. Arl13b تسميات أهداب الأساسي من وسائط الأعمق المبطنة للتجويف VZ. وهكذا، تخدم المنطقة مهدبة Arl13b إيجابية باعتبارها الدليل التوجيهي لتحديد وتحليل طائرة تقسيم وسائط-فيم إيجابية p في طور الصعود. عادة، وVZ من عضي السيطرة العمر 14 يوما تعرض عدد كبير من وسائط، الذين أفقيا الموجهة للطائرات الانقسام. طائرة تقسيم الموجهة أفقيا أمر ضروري لتوسيع متماثل في وقت مبكر من وسائط (الشكل 1F وG) 23،24. عندما يتم التوصل إلى التوسع كافية الأرجنتين، يبدأ تكوين الخلايا العصبية، الخلايا تقسيم تغير توجهها نحو التجويف، ومفاتيح الطائرة قسم من الأفقي (متماثل) إلى العمودي (غير المتماثلة) 4 و 12 و 24.

شكل 1
الشكل 1: جيل من Organoids الدماغ من خلايا الجذع الإنسان. (A) سير العمل في بروتوكول التمايز. الخطوة 1: بدء التمايز. خلال هذه المرحلة، وتشكيل neurospheres من iPSCs الإنسان في لوحة 96-جيدا يحدث. المدة الزمنية هي 5 أيام. الخطوة 2: تضمين neurospheres في قطرات مصفوفة الصحة والسلامة. ثقافة تعليق ثابتة من EHS neurospheres جزءا لا يتجزأ من مصفوفة لديها المدة الزمنية 4 أيام. الخطوة 3: Organoids في قوارير الدوار. نقل EHS neurospheres جزءا لا يتجزأ من مصفوفة إلى الدوار قوارير تأخذ مكان. المدة الزمنية هي 14 يوما. (B) A neurosphere في لوحة متعددة جيدا. وأظهرت صورة ممثل neurosphere في يوم 4 في لوحة 96-جيدا خلال الخطوة 1. يجب أن يكون المجال واضحة للعيان في قاع البئر، وعلى نحو سلس، سطح جولة (arro الأحمرث). (C) مورفولوجية neurospheres قبل EHS مصفوفة التضمين. يجب Neurospheres التي تم جمعها في يوم 5 من الخطوة 1 أن تكون موحدة في الحجم وعرض سطح أملس ذو حافة مشرق (قوس والسهم). (D) Organoids في قوارير الدوار. ويرد قارورة الدوار مع organoids الدماغ أثناء الخطوة 3 (الأسهم الحمراء) هنا. (E) التصوير مناعي من organoids cryosectioned عرض على VZ نموذجي ولوحة القشرية البدائية. تعرض اللوحة اليمنى تلطيخ النووي للخلايا في VZ. وVZ يمتد من الجانب قمي (التجويف L) إلى الجانب القاعدي (الخط الأصفر). لاحظ أن الخلايا داخل عرض VZ نوى مثل السور، يقترح أن تكون الخلايا الدبقية شعاعي. وتبين اللوحة اليمنى تلوين مناعي من الشخصيات-nestin إيجابي (الخضراء) داخل VZ والخلايا العصبية TUJ1 إيجابية (قرمزي) في لوحة القشرية البدائية. شريط مقياس = 50 ميكرومتر. (F) التصوير مناعي من organoids cryosectioned. مثالينمن VZs ملطخة ف فيم وArl13b (الأول والثالث). تم تكبيرها المناطق تميزت المربعات البيضاء في حق لكل أقحم صورة (الثاني والرابع). الطائرة تقسيم طور الصعود قمي الخلايا الدبقية شعاعي (وسائط). تقسيم الخلايا الدبقية شعاعي قمي في الجانب قمية من VZ هي ف فيم بفيروس (قرمزي). وترد أمثلة عن وسائط تقسيم متناظر (المربعات البيضاء وإدراجات). ونظرا للطائرة تقسيم كخط أبيض. الطائرة تقسيم خلية طور الصعود أفقية إلى خط سطح التجويف (الخط المنقط الأصفر)، وتميزت Arl13b تلطيخ (الأخضر). شريط مقياس = 50 ميكرومتر. (G) ويوفر هذا التخطيطي اتجاه عمودي أو أفقي من وسائط في طور الصعود بالنسبة إلى التجويف. وتقسيم الخلايا من organoids تحكم في يوم 14 هي في معظمها موجهة أفقيا (0-30 درجة) بالنسبة لسطح تجويف VZ. واصطف الجانب قمية من التجويف التي كتبها أهداب الأساسي من وسائط، والتي تحدد سطح تجويف VZ (الخط الأخضر). في المقابل، موسطن من الخلايا الدبقية شعاعي من organoids صغر الرأس يعرض موجه عموديا (60-90 درجة) طائرة الانقسام. يظهر خط أبيض محور الطائرة الانقسام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

مشكلة: أسباب محتملة: اقتراحات:
خطوة 1.1.1.2 ضعف كفاءة إعادة برمجة تحقق hiPSCs للعلامات تعدد القدرات: إذا كانت جودة منخفضة، واختيار المستعمرات غير متمايزة يدويا لبضع فقرات لإثراء المستعمرات المحفزة
iPSCs الإنسان تفرق قبل بداية التمايز
التوتر يعود إلى الركض في وقت مبكر أو passagiنانوغرام خلايا منفردة لا يتم التوصل مرور قبل 80٪ confluency. مرور كما المجاميع والخلايا لا واحدة
التلوث الميكوبلازما اختبار لتلوث الميكوبلازما
الخطوة 2 نوعية رديئة من hiPSCs تحسين نوعية hiPSCs (انظر أعلاه)
Neurospheres لا تشكل على الإطلاق، أو ينهار في يوم 5 بعد بداية التمايز عدد بدءا من الخلايا لكل بئر منخفضة جدا أو مرتفعة جدا عد بدقة عدد الخلايا وتوزيعها بالتساوي في كل بئر
وقد استخدم hiPSC المتوسطة بدلا من المتوسطة التمايز العصبي استخدام المتوسطة التمايز العصبي
كانت خطوة الطرد المركزي قاسية جدا أو خفيفة تدور 96-جيدا لوحة 500 x ج لمدة 3 دقائق ومعرفة ما اذا الخلايا المتراكمة مركزيا فيالجزء السفلي من كل بئر
لا Y-27632 في بداية التمايز استخدام Y-27632 لتعزيز بقاء الخلية
خلايا المرفقة ونمت في الجزء السفلي من لوحة تأكد من أن يتم استخدام غير ملتصقة 96-جيدا لوحة-V السفلي.
الخطوة 2 لم يطرأ أي تغيير المتوسط ​​اليومي تغيير نصف كمية يوميا المتوسطة
Neurospheres ليست متجانسة في الحجم ابتداء من عدد الخلايا في كان جيدا لا تساوي مزيج من أنبوب مع تعليق خلية واحدة في كل مرة قبل أخذ 100 ميكرولتر تعليق الخلية
لم يحدث تغيير المتوسطة لكل يوميا بشكل جيد تأكد من كل بئر يحصل تغيير المتوسطة يوميا
الخطوة 2 hiPSC لم نأت كثافة العملياتس الخلايا واحدة قبل بدء المفاضلة الاختيار تحت المجهر إذا تم فصل hiPSC إلى الخلايا وحيدة بعد العلاج accutase. إذا كان هناك ما زالت تجمع، وخلايا ماصة 10 مرات صعودا وهبوطا مع 100 ميكرولتر micropipette والتحقق مرة أخرى أو تكرار accutase العلاج
Neurospheres لا تعرض حافة مشرق أو سطح جولة. أنها تشكل الخراجات كبيرة على السطح ابتداء من عدد الخلايا في كان جيدا عالية جدا عد بدقة عدد الخلايا وتوزيعها بالتساوي في كل بئر
لم يحدث تغيير المتوسطة يوميا لكل بئر تغيير نصف يوميا المتوسطة
خطوة 2.7 نوعية رديئة من hiPSCs تحسين نوعية hiPSCs (انظر أعلاه)
EHS مصفوفة جزءا لا يتجزأ من neurospheres العصا وتتجمع معا لا يكفي المتوسطة (حجم) توفيرلا يقل عن 10 مل المتوسطة في petridish 100 ملم
الجرف من الحاضنة ولا حتى وضع الطبق على سطح حتى
بعد وضع في الحاضنة، حرك الطبق بحيث يتم توزيعها بالتساوي neurospheres

الجدول 1: استكشاف الأخطاء وإصلاحها الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

MCPH هو اضطراب النمو العصبي البشري المعقد الذي لا يمكن تلخيصها في النماذج الحيوانية في الجسم الحي أو في نهج بسيطة زراعة الخلايا البشرية في المختبر. مظهر من مظاهر السريرية للMCPH يبدأ في الظهور خلال الأشهر الثلاثة الأولى، عندما يبدأ في وقت مبكر الخلايا العصبية. وهكذا، organoids الدماغ 3D يمثل نظام تجريبي يمكن الاعتماد عليها لنموذج التنمية MCPH. وبالإضافة إلى ذلك، 3D organoids الدماغ البشري والنهج المثالي منذ ط) أنها تسمح للتكيف طائفة من عينات المرضى مع مختلف خلفيات وراثية، والثاني) لأنها تكشف الأنسجة المنظمة التي تحتوي على أنواع مختلفة من الخلايا العصبية، والأهم، ثالثا) مختلف التمايز وترتبط مراحل النمو العصبي في هذا النهج في المختبر لفي الجسم الحي نظرائهم 25 و 26 و 27. على سبيل المثال، ريدة العصبية هي بنية يعادل العصبية تطويرالة النفخ.

لانكاستر وآخرون. يستخدم ضعف عدد iPSCs المرضى مقارنة للسيطرة على iPSCs من أجل تحقيق النجاح في توليد organoids المريض. وتجدر الإشارة، مع بروتوكول الموصوفة هنا، عن طريق تعديل الطرق القائمة، ونحن يمكن أن تولد السيطرة وorganoids الدماغ صغر الرأس بدءا من نفس الخلية 4 أرقام. وكان هذا ممكنا نظرا للظروف ثقافة محددة من iPSCs، ونظرا لتمايز أكثر توجيهات. في هذا البروتوكول، وتحسن الجيل عضوي الشكل عن طريق استبدال EB تشكيل خطوة يؤديها عادة قبل بدء التمايز العصبي مباشرة من iPSCs. ثانيا، في الخطوة 3، dorsomorphin وSB431542 واستكملت في مستنبت بدلا من حمض الريتينويك وحدها. وأزمرته حمض الريتينويك بسهولة عندما تطبق على خلية ثقافة المتوسط 28. ولذلك، نشاطها البيولوجي هو أقل تحديدا من ذلك المركبات أكثر استقرارا مثل dorsomorphin. يمنع Dorsomorphinإشارات الطريق BMP4، وSB431542 هو المانع من activin / العقدي مسار الإشارات (TGF-β1 ALK المانع). مزيج من الاثنين معا المركبات يؤدي إلى تثبيط BMP وactivin / العقدي مسار الإشارات، يدفع التمايز العصبي، ويقلل من التمايز في الأنساب الأخرى في خطوط الخلايا المختلفة من ES الإنسان أو خلايا الجذع الإنسان مع كفاءة مماثلة (29). استقرار مركب واستجابة الخلية العالمية إلى مجمع هي النقاط الهامة لإنشاء البروتوكول الذي يمكن تطبيقه على مختلف خطوط الخلايا المرضى في تصميم نموذج لمرض في المختبر. وهكذا، عضي على قوة وكفاءة النتائج التمايز في الدماغ متجانسة الثقافات و، في نهاية المطاف، في بيانات أكثر استنساخه.

مع هذه التعديلات، والتقليل من الخطوات الحاسمة في إطار بروتوكول لبدء التمايز في الخطوة 1. عند هذه النقطة، من المهم أن تنأى بلطف iPSCs إلى وحيدة الخلية تعليق علىالثانية لتوزيعها بدقة وبشكل متساو على كل بئر من لوحة 96-جيدا. (Y-27632) يجب إضافة المرتبطة رو مثبط بروتين كيناز إلى المتوسط ​​B خلال ال 24 ساعة الأولى، كما أنها تدعم بقاء iPSCs على التفكك لخلايا مفردة. ومن المهم لتحقيق الخلايا على اتصال وثيق مع بعضها البعض من خلال الدوران عليهم في الجزء السفلي من الآبار. مرة واحدة تتشكل neurospheres في نهاية الخطوة 1، يمكن توقع النجاح في إنجاز المزيد من الإجراءات التجريبية. في حالة neurospheres لا تشكل، وتعدد القدرات من iPSCs الإنسان، لا بد من التحقق من عدم الالتزام من الخلايا في لوحة 96-جيدا، وظروف الطرد المركزي. الإجراء بأكمله يوم 0 من الخطوة 1 ينبغي أن لا تزيد عن 1 ساعة نظرا لحساسية iPSCs الإنسان. التغييرات المتوسطة خلال الأيام التالية يجب أن يتم بعناية، وتجنب قوات محض، حتى لا تدمر الاتصالات خلية شكلت حديثا بين الخلايا.

ومن الجدير بالذكر أن centrosomآل المسوخ لها تكاثر الخلايا معيب وتغيير ديناميكيات دورة الخلية. وهكذا، ووضع نماذج MCPH يتطلب بروتوكول القوية التي يمكن أن تصمد أمام الوظائف الخلوية للخطر. وبالتالي، يسمح البروتوكول الحالي لتوليد organoids متجانسة ذات جودة عالية وبمثابة أداة فريدة لدراسة الخلايا الجذعية التوازن في VZ. وعلى النقيض من البروتوكولات الأخرى، هذا البروتوكول يتيح توليد organoids من السيطرة والمريض iPSCs، بدءا من أعداد الخلايا متساوية. لدراسات تقوم على التمايز في المختبر، وظروف ثقافة متطابقة لiPSCs مختلفة هي شرط أساسي لتحديد التعديلات المتعلقة المرض وتجنب القطع الأثرية ثقافة الشرط. وإلى جانب نمذجة صغر الرأس المنشأ الجيني، ويمكن أيضا أن تطبق هذا البروتوكول لصغر الرأس من أصل غير وراثية، بما في ذلك من الالتهابات الفيروسية عصبية، والمواد الكيميائية، أو الإشعاع. 30 وبالإضافة إلى ذلك، أدوات البيولوجيا الجزيئية الحديثة، مثل كريسبر / Cas9 الجينوم تحريرتقنيات جي، يمكن تطبيقها على organoids 3D لتشريح جوانب محددة من نموذج نمو الدماغ البشري في المختبر 31 و 32 و 33.

من ناحية أخرى، لم يذهب توليد organoids الدماغ إلى تاريخ أبعد من الأول وأوائل الثلث الثاني للتنمية البشرية 34. تجاوز هذا القيد وتمكين جيل من organoids الدماغ ناضجة في المختبر من شأنه أن يفتح آفاقا جديدة لنموذج الاضطرابات العصبية التي تظهر في مراحل لاحقة، مثل الشلل الرعاش أو مرض الزهايمر. وبالنسبة للتطبيقات المستقبلية والبروتوكولات بإخراج التمايز إلى مناطق أكثر تحديدا، مثل الدماغ الأمامي أو المخ الأوسط، قد تكون ذات فائدة لدراسة اضطرابات عصبية معقدة مثل التوحد والفصام 35، 36، 37، 38.

الأهم من ذلك، ينبغي اتخاذ بعض الجوانب في الاعتبار عند استخلاص النتائج من دراسات عضي. الحد الأول هو أنه لا يوجد الأوعية الدموية واضحا في organoids. وهكذا، التبادل الغازي وتوريد المواد الغذائية في المختبر تقارب فقط في الجسم الحي الظروف. ثانيا، لأنه لا ترتبط organoids الدماغ على أجهزة الجسم تعقيدا، ونموذج عضوي الشكل يفتقر إلى المناعة كاملة، والتمثيل الغذائي، والنظام الهرموني. ومع ذلك، فإن غياب هذه الجوانب يوفر أحيانا ميزة. على سبيل المثال، يمكن للorganoids الموصوفة هنا محل كبت المناعة في النماذج الحية عند التصدي لتأثير على الجهاز المناعي في التسبب في اضطرابات الدماغ.

مع استخدام قوارير الدوار، يمكن إنشاء عدد كبير من organoids للتجارب الكيمياء الحيوية، وكله تحليل Transcriptome على التسلسل، والإنتاجية العالية العروض المخدرات. مجتمعة، من خلال شالغناء هذا البروتوكول الحالي، يمكن للمرء أن تولد organoids الدماغ من خلايا iPSCs الإنسان، ومن ثم يمكن استخدامها في مجموعة واسعة من التطبيقات، من النمذجة المرض إلى منصات اختبار المخدرات، من أجل استبدال موثوق التجارب على الحيوانات في المستقبل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة تايسن فريتز (Az.10.14.2.152). ونحن ممتنون للمنشأة تضمين الأنسجة ومرفق المجهر جوهر CMMC. ونحن ممتنون للمناقشات والدعم الفني المقدم من أعضاء مختبر الجسيم المركزي والهيكل الخلوي علم الأحياء. نشكر لي مينغ GOOI لتنقيح الكتابة المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-mouse 488 Invitrogen A-11001 Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Anti-rabbit 647 Invitrogen A-21245 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647
Arl13b proteintech 17711-1-AP ARL13B rabbit polyclonal antibody 
CELLSPIN system IBS Integra Bioscience 183001
DAPI Sigma-Aldrich, US 32670 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers
DMEM/F-12 Gibco, US 31331093 Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 
Dorsomorphin Sigma-Aldrich, US P5499 Compound C; multiple suppliers
Embedding medium AppliChem A9011, 0100 Mowiol; embedding medium; multiple suppliers
Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix Corning 354277 Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified
Fish gelatin  Sigma-Aldrich, US G7765-250ML Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4 °C
Glycine AppliChem A1067,1000 Glycine for molecular biology; multiple suppliers 
Inoculation loop with needle, disposable (1 µL) Sigma Aldrich, US BR452201-1000EA multiple suppliers 
Insulin Sigma-Aldrich, US I3536-100MG multiple suppliers
L-glutamine Gibco, US 25030081 L-glutamine (200 mM)
Medium A Stem cell technologies #05850 mTeSR1 (hiPSC medium)
Medium B Stem cell technologies #05835 Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium
Medium C Gibco, US 21103049 Neural Basal Medium
MEM Gibco, US 11140035 MEM non-essential amino acids solution (100x)
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit Lonza, Switzerland #LT07-218 Mycoplasma detection kit; multiple suppliers
Nestin Novus biologicals NBP1-92717 Nestin mouse monoclonal antibody (4D11)
Paraformaldehyde (PFA) AppliChem A3813, 0500 4% in PBS, store solution at -20 °C; caution: wear skin and eye protection and work under hood 
PBS tablets Gibco, US 18912014 See manufacturer´s instructions; multiple suppliers
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL) Gibco, US 15140122 Multiple suppliers
Poly-L-lysine solution (PLL) Sigma-Aldrich, US P8920-100ML Multiple suppliers
pVim MBL D076-3S Phospho-Vimentin (Ser55) mAb
Reagent A  Stem cell technologies # 05872 Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available
Reagent B  Sigma-Aldrich, US A6964-100ML Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution” 
Research Cryostat Leica CM3050 S Leica biosystems CM3050 S Multiple suppliers
SB431542 Selleckchem.com S1067 Multiple suppliers
Spinner flask 250 mL IBS Integra Bioscience 182026
Sucrose AppliChem A4734, 1000 Multiple suppliers
Superfrost ultra plus microscope slides Thermo scientific, US J3800AMNZ Slides should be labeled with a "+" and positively charged
Supplement 1 Gibco, US 17502048 N-2 supplement (100x)
Supplement 2 w/o Vitamin A Gibco, US 12587010 B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers
Tissue-Tek Cryomold Sakura, NL 4565 Multiple suppliers
Tissue-Tek O.C.T. compound Sakura, NL 4583 Multiple suppliers
Triton X-100 AppliChem A1388,0500 Multiple suppliers
TUJ1 Sigma-Aldrich, US T2200 β-Tubulin III (rabbit polyclonal)
TUNEL assay Promega, US G3250 DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers
Tween 20 for molecular biology AppliChem A4974,0500 Multiple suppliers
waterproof sheet BEMIS company, inc. PM996 Parafilm “M”; multiple suppliers
Y-27632  Selleckchem.com S1049 ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers
β-mercaptoethanol Gibco, US 31350010 2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, 373-379 (2013).
  2. Eiraku, M., Sasai, Y. Mouse embryonic stem cell culture for generation of three-dimensional retinal and cortical tissues. Nat Protoc. 7, 69-79 (2012).
  3. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
  4. Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35 (8), 803-819 (2016).
  5. Al-Dosari, M. S., Shaheen, R., Colak, D., Alkuraya, F. S. Novel CENPJ mutation causes Seckel syndrome. J Med Genet. 47, 411-414 (2010).
  6. Wollnik, B. A common mechanism for microcephaly. Nat Genet. 42, 923-924 (2010).
  7. Thornton, G. K., Woods, C. G. Primary microcephaly: do all roads lead to Rome? Trends Genet. 25, 501-510 (2009).
  8. Barbelanne, M., Tsang, W. Y. Molecular and cellular basis of autosomal recessive primary microcephaly. Biomed Res Int. 2014, 547986 (2014).
  9. Homem, C. C., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nat. Rev. Neurosci. 16, 647-659 (2015).
  10. Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35, 803-819 (2016).
  11. Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. , (2012).
  12. Morizane, A., Doi, D., Kikuchi, T., Nishimura, K., Takahashi, J. Small-molecule inhibitors of bone morphogenic protein and activin/nodal signals promote highly efficient neural induction from human pluripotent stem cells. J. Neurosci. Res. 89, 117-126 (2011).
  13. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).
  14. Zhou, J., et al. High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors. Stem Cells. 28, 1741-1750 (2010).
  15. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  16. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8, 409-412 (2011).
  17. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
  18. Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
  19. Bai, Q., et al. Temporal analysis of genome alterations induced by single-cell passaging in human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 24, 653-662 (2015).
  20. Garitaonandia, I., et al. Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions. PLoS One. 10, e0118307 (2015).
  21. Ohnuma, K., et al. Enzyme-free passage of human pluripotent stem cells by controlling divalent cations. Sci. Rep. 4, 4646 (2014).
  22. Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. J Vis Exp. , (2007).
  23. Yingling, J., et al. Neuroepithelial stem cell proliferation requires LIS1 for precise spindle orientation and symmetric division. Cell. 132, 474-486 (2008).
  24. Rakic, P. A small step for the cell, a giant leap for mankind: a hypothesis of neocortical expansion during evolution. Trends Neurosci. 18, 383-388 (1995).
  25. Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 4335-4340 (2010).
  26. Wilson, P. G., Stice, S. S. Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells. Stem Cell Reviews. 2, 67-77 (2006).
  27. Dhara, S. K., Stice, S. L. Neural differentiation of human embryonic stem cells. J. Cell Biochem. 105, 633-640 (2008).
  28. Christie, V. B., et al. Synthesis and evaluation of synthetic retinoid derivatives as inducers of stem cell differentiation. Org Biomol Chem. 6, 3497-3507 (2008).
  29. Kim, D. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Reviews. 6, 270-281 (2010).
  30. Gabriel, E., et al. Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids. Cell stem cell. , (2017).
  31. Wu, J., Hunt, S. D., Xue, H., Liu, Y., Darabi, R. Generation and Characterization of a MYF5 Reporter Human iPS Cell Line Using CRISPR/Cas9 Mediated Homologous Recombination. Sci. Rep. 6, 18759 (2016).
  32. Li, H. L., Gee, P., Ishida, K., Hotta, A. Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR-Cas9 system. Methods. 101, 27-35 (2016).
  33. Grobarczyk, B., Franco, B., Hanon, K., Malgrange, B. Generation of Isogenic Human iPS Cell Line Precisely Corrected by Genome Editing Using the CRISPR/Cas9 System. Stem Cell Reviews. 11, 774-787 (2015).
  34. Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 15672-15677 (2015).
  35. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165, 1238-1254 (2016).
  36. Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19, 248-257 (2016).
  37. Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
  38. D'Avanzo, C., et al. Alzheimer's in 3D culture: challenges and perspectives. Bioessays. 37, 1139-1148 (2015).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 122، iPSCs، والخلايا العصبية السلف، organoids الدماغ، صغر الرأس، جسيم مركزي، هدب الأساسي
جيل المستمدة IPSC-Organoids الدماغ البشري لنموذج اضطرابات النمو العصبي في وقت مبكر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gabriel, E., Gopalakrishnan, J.… More

Gabriel, E., Gopalakrishnan, J. Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders. J. Vis. Exp. (122), e55372, doi:10.3791/55372 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter