Introduction
このよう小頭症など人間の神経発達障害は、不十分にしかによる人間の脳は、拡張された皮質表面、ヒト以外の動物は異なる独特の特徴を持っているという事実のために、動物モデルで研究することができます。
この局面は、 インビトロ細胞培養系では 、人間の脳の発達に十分に2Dで研究することができない複雑なプロセスになります。新興3D培養技術は、人工多能性幹細胞（iPS細胞）から組織様オルガノイドの生成を可能にします。 3D懸濁培養における多能性幹細胞のインビトロ分化は、組織化、層状組織1、2、3を生じさせる、タイムリーかつ領域特異的な様式で種々の細胞型を形成することができます。 3D培養技術を開拓し、幹細胞から始まる、器官形成の複雑さを詳解研究所のおかげで、私たちは、人間の脳の発達の初期事象を描写すると試験管 1、2、3 に小頭症をモデル化するために、脳のオルガノイドを生成する強力な方法を開発しました。我々がランカスターらによって開発されたオリジナルの方法を適応することを注目すべきです。脳オルガノイド1を生成します。この方法は、我々の実験の要件に応じて変更されました。
ガブリエルらから研究の目的。脳の発達中の神経幹細胞の維持の細胞および分子メカニズムを分析することでした。これを行うためには、機械的な研究は、小頭症患者4由来の3D脳オルガノイドにおける神経前駆細胞（NPCの）を分析することにより行いました。この患者はCPAP、中心体の生合成に必要な5保存された中心体タンパク質に変異を運びました。広く受け入れられているハイポ論文は、小頭は、NPCのプールの枯渇の結果であり、これは、細胞死または早期分化1、6、7、8、9のいずれかに起因するかもしれないということです。
小頭脳オルガノイドの心室ゾーン（VZS）を分析することによって、それはのNPCのかなりの数は、健康なドナー4に由来する脳オルガノイドは異なり、非対称細胞分裂を受けることが示されました。小頭脳オルガノイドの広範な顕微鏡および生化学的解析は、タイムリーな繊毛分解4におけるCPAPのための予想外の役割を明らかにしました。具体的には、突然変異したCPAPは遅繊毛の分解に関連しているとのNPC 4の早期分化につながる、再入細胞周期を遅らせました。これらの結果は、小頭と目における繊毛の役割を示唆します神経発生と脳のサイズ制御10時のEIR関与。
このプロトコルの最初の部分は、均質脳オルガノイドを生成するための三段階法の説明です。前に述べたように、オリジナルのランカスタープロトコルが適応と我々の目的1に合わせて変更されました。まず、人間性IPSCは、エンゲル・ホルム - スウォーム（EHS）マトリックス上に定義された無フィーダー条件で培養します。このステップは、フィーダ依存性多能性幹細胞培養物の変動を回避します。このプロトコルでは、神経上皮を形成するために神経分化の誘導性IPSCから直接始まります。胚様体（EB）形成工程、より制御および指向様式で神経分化進行をスキップし。このアプローチは、中胚葉および内胚葉のような他の胚細胞層の自発的および無向形成を制限します。このプロトコルを適用することにより、神経のロゼットを含むニューロスフェアは、EHのために5日目に収穫することができますS行列の埋め込み静止懸濁培養。我々のプロトコルの第三の工程のために使用オルガノイド媒体はドルソモルフィンおよびSB431542が補充されます。ドルソモルフィンは、骨形成タンパク質（BMP）の小分子阻害剤であり、SB431542はTGFβ/アクチビン/ノーダルシグナル伝達経路を阻害します。これらの要因の組み合わせが神経分化よりも効率的に単独で11、12、13、14、レチノイン酸を促進し得ます。
要するに、これらの修飾は、オルガノイドを横切る最小の変動で、脳オルガノイドの再現可能な生成を可能にします。重要なことは、この方法が確実に中心体および細胞周期のダイナミクスに影響を与える遺伝子の変異を運ぶ患者性IPSC、から小頭脳オルガノイドを生成するために適用されました。
このプロトコルの第2の部分は、BRを調製するための指示を与えます小頭内の細胞の欠陥の分析と解釈のためにAINのオルガノイド。これは固定、凍結切片、免疫蛍光染色、および共焦点顕微鏡分析を含んでいます。このプロトコルは、期待される結果の詳細な説明とし、解釈のためのガイダンスを読者に提供します。
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Protocol
脳オルガノイドの1世代（23日）
- 神経外胚葉の開始（5日）
注：以下の点は、分化の開始前に検討すべきです。ヒトiPS細胞を得るための再プログラミング方法（lentiviral-、仙台ウィルス、エピソーム、またはマイクロRNAベースなど ） は 、理想的には、全ての患者に対して同じであるとのiPSCラインを制御しなければなりません。公開されたプロトコルに基づいて様々な再プログラミングキットおよび命令は15、16、17、18入手可能です。人間のiPSCラインの品質は、最適な分化を達成するための鍵です。顕微鏡でコロニー及び細胞形態をモニタし、そのようなのOct3 / 4、Nanogの、またはTRA-1-60のようなマーカーの発現を試験することによって多能性を検証します。- エンゲル・ホルム - スウォームで被覆された皿上の培地Aで無フィーダー条件下で培養ヒトiPS細胞（EHS）マトリックス。
注：定義された培養条件を維持し、分化の開始前に、マウス胚性フィーダー細胞（MEFの）を除去するための追加的なステップを避けるために、ヒトiPS細胞のフィーダーフリー、無血清を成長させます。ヒトiPS細胞のための最適な通過回数は、合計で通路70に再プログラミング時に通路15から分化範囲を開始します。継代する場合、新しい皿に凝集物を転写する低い機械的応力を有する適切な細胞剥離溶液と2-mLの血清学的ピペットを使用して集計細胞としてhiPSCコロニーを取り外します。これは、ほとんどのiPSCラインでの分化とアポトーシスを誘導する可能性があるとして、単一の細胞に解離を避けてください。これは、長期的な、単一細胞継代は、ヒトのiPS細胞19、20におけるゲノム変化を増加させることができることが報告されました。これはiPS細胞の全体的な生存率を低下させるように、剥離液を除去するための遠心分離工程を必要とする細胞剥離手順を避けます。テスト定期的に微生物汚染のためのすべての文化、特にマイコプラズマ、これはiPS細胞の品質とその分化能を変える可能性があるため。- コート製造者の説明書に従ってEHSマトリックスとの60mm組織培養皿。
- 1×10 6個のヒトiPS細胞のアリコートを解凍。 EHSマトリックスでコーティングされた60 mmの組織培養皿にiPS細胞を播種し、培地A（ 材料表を参照）の5 mLを含みます。細胞は〜80％コンフルエントに達したときに5〜7日後に毎日、メディアとの通路を変更します。
注：通路80％コンフルエントで融解性IPSCが少なくとも一度分化を開始する前に、そのようなコロニー21の酵素を含まない剥離などの標準的な方法を用いて。簡単に述べると、のiPSC培地を除去し、予め温めた37℃のダルベッコ変法イーグル培地で細胞を1回洗浄：栄養混合物のF12（DMEM / F12）、及び製造業者の次iPS細胞をインキュベート試薬A（材料の表を参照）を使用説明書。単一の細胞に解離を避けるために推奨されるインキュベーション時間を超えないようにしてください。ヒトiPS細胞は剥離し、凝集体としてではなく、単一細胞としてフローティングされるべきです。そして、彼らは新しいEHSマトリックスでコーティングされた皿に転送することができます。例えば、一つのiPSC 60-mmディッシュから凝集体は、4つの新しい60-mmディッシュに分配することができます。 - 製造元の指示に従ってマイコプラズマ検出キットでマイコプラズマを確認してください。マイコプラズマは、iPS細胞の分化能を変更できるよう、唯一のマイコプラズマフリーのiPS細胞を使用してください。
- iPS細胞（80％コンフルエント）を解離し、試薬Bを用いて、単一細胞懸濁液を調製
- 予め温めた（37℃）DMEM / F12で一回性IPSCを洗います。
- CO 2予め温めておいた試薬B（ 例えば 60 mmディッシュに1 ml）を加え、37℃で5分間、iPS細胞をインキュベートし、5％。
- の側部および底部に指先でフリック20回iPS細胞を剥離する一品。顕微鏡下で細胞の剥離を確認してください。
- 1 mLのマイクロピペットで皿に上下に5回の細胞懸濁液をピペット。
- 試薬Bの1ミリリットルを希釈し、15 mL遠心管中の細胞懸濁液を収集するために、媒体Aの3ミリリットルを加えます。
- 穏やかに室温で4分間性IPSC（500 XG）をスピンダウン。
- 媒体Bの1mLに細胞ペレットを再懸濁し、血球計数器で細胞数を数えます。
注：再懸濁用培地のみBを使用して注意してください。それが分化を阻害可能性があるbFGFの高すぎる濃度を、含まれているとして、培地Aを使用しないでください。
- 10μMのRho関連タンパク質キナーゼ阻害剤（Y-27632）を添加した培地B 1ml当たり4.5×10 5細胞に細胞懸濁液を希釈します。
- 非接着、V底96ウェルプレートにウェル当たり100μLを加えます。
注：ことを確認した細胞を均等にSUSに分散されています100μL部分を取り出す前に、チューブを毎回揺れによって年金。各ウェルのサイズ及び形状（円形、定義された面）に均一なニューロスフェアを得るために、同等の細胞数を含むべきであることが重要です。 - 穏やかに3分間500×gで、室温で細胞をプレートをスピンダウンし、37℃、5％CO 2でインキュベートします。
- 50μLを削除し、次の5日間、各ウェルに新鮮な培地Bの50μLを追加することにより、日々のメディアを変更します。
- エンゲル・ホルム - スウォームで被覆された皿上の培地Aで無フィーダー条件下で培養ヒトiPS細胞（EHS）マトリックス。
EHSマトリックス2.埋め込みニューロスフェア（4日）
- （W /なし100（v / v）の補充2：1：DMEM / F12培地C 1混合物（v / v）を、1：200（v / v）の補充1、1以下を混合することによってニューロスフィア培地を調製O）ビタミンA、1：100 L-グルタミン、0.05mMの非必須アミノ酸（MEM）、100 U / mLペニシリン、100μg/ mLのストレプトマイシン、1.6グラム/ Lのインスリン、及び0.05mMのβメルカプトエタノール。
- ニューロスフェアのウィットを収集予め滅菌ハサミで切っ〜2mmのチップを用いて200μLマイクロピペットヘクタール。
- 空の100mmの皿に約5mm離れたパラフィンフィルム（3×3 cm 2）を上の互いに神経球を配置し、慎重にできるだけ残り媒体のできるだけ多くを除去します。
- 各単一のニューロスフェアにEHSマトリックスの低下（7μL）を加えます。
- EHSマトリックスはインキュベーターで15分間、ニューロスフェアとインキュベート低下します。
- ニューロスフィア培地でそれらをフラッシュすることによって慎重にパラフィンフィルムからニューロスフェアを洗います。フラッシュするために、1 mLのマイクロピペット及びニューロスフィア培地10mLを含有する新たな100 ム・ペトリ皿を使用します。
- 次の4日間の神経球をインキュベートし、2日目に新鮮なニューロスフェア培地の2ミリリットルを追加します。
注：EHSマトリックスに埋め込まれたニューロスフェアは、皿の片側に集まってしまうしないようにインキュベータ内の棚が平らであることを確認してください。
ロータリーサスペンション3.オルガノイド文化（14日）
- 1：DMEM / F12培地C 1混合物（v / v）を、1：200（v / v）の補充1、1：W / O 100（v / v）のサプリメント2以下を混合することにより脳オルガノイド培地を調製ビタミンA、1：100 L-グルタミン、0.05mMのMEM、100 U / mLペニシリン、100μg/ mLのストレプトマイシン、1.6グラム/ Lのインスリン、0.5μMドルソモルフィン、5μMSB431542、及び0.05mMのβメルカプトエタノール。
- そのサイドアームを介して各スピナーフラスコに脳オルガノイド培地100mlを添加し、少なくとも20分間予備加温するための恒温器に置きます。
- 製造元の指示に従って、25 rpmで攪拌しながらプログラムを設定します。
注：スピナーフラスコにEHSマトリックスに埋め込まれたニューロスフェアを転送する前に、彼らはすべて分離されていることを確認してください。二つ以上がEHSマトリックスを介して接続されている場合は、メスと連結マトリックスを切断することによって、それらを分離します。 - 注意深くオルガノイド培地100mlを含むスピナーフラスコにEHSマトリックス包埋ニューロスフェアを転送米国2mLの血清学的ピペットをする。フラスコ内の神経球を転送するためにスピナーフラスコの側の腕を使用してください。
- 37℃および5％CO 2インキュベーター中の磁気攪拌プラットフォーム上のスピナーフラスコを置きます。これは、オルガノイド文化の日0です。
- （またはより頻繁に色の変化があるとき）培地の半分を取り除き、新鮮な培地の同量を追加することでは週に1回の媒体を変更します。
注：インキュベーターのうち、スピナーフラスコを取った場合、オルガノイドは、フラスコの底まで沈むようにする3-5分待ちます。液体の表面上（ポンプに接続された）ガラスピペットチップを配置することによって培地を除去。フラスコの一方の側の開口部/アームを通して注意深く培地を吸引します。これらの操作は、層流フードの下に行われなければなりません。
脳オルガノイド4.分析
- オルガノイドの固定
- スピナーフラスコ培養のwiの14日目にオルガノイドを収集カット1mLのマイクロピペット（カット約5 mm）の目。 60ミリメートル皿にそれらのすべてを入れて、3分間のウォームDMEM / F12 5mLで一度洗って。
- 暖かい4％パラホルムアルデヒド（PFA）の500μLと1.5mLのチューブを準備します。
注意：PFA固定液を取り扱う際の安全フードの下の皮膚や目の保護と仕事を着用してください。 - それぞれが別々に各チューブに室温で少なくとも30分間、それらを修正オルガノイド置きます。長くより60分オルガノイドを固定しないでください。オルガノイドを移動させるために、白金耳又は好都合である任意の他の工夫を使用します。
- PFAを除去し、PBS 1mLで10分間2回固定オルガノイドを洗います。
- さらに使用するまで、最大で7日間、4℃でPBS 1mL中オルガノイドを格納します。
- 凍結切片のためのオルガノイドを埋め込み
- PBSを除去し、それらをcryofreezing前オルガノイドを脱水するチューブ当たり蒸留水の溶液中の30％ショ糖の1ミリリットルを加えます。 SUCROを追加した後SE溶液は、オルガノイドは表面に浮遊しなければなりません。 4°Cでのショ糖溶液中で一晩オルガノイドを保管してください。次の日で、オルガノイドは、チューブの底に沈んでダウンしている必要があります。
注：必要に応じてオルガノイドは、ショ糖溶液中で4℃で最長3〜5日間保存することができます。 - 最適切断温度（OCT）化合物の400μLとビニル検体金型を満たすと、金型の中心にオルガノイドを配置するために白金耳を使用します。サンプル名を持つ金型のリムにラベルを付けます。
- 凍結切片まで-80℃でオルガノイドを含む金型をフリーズします。
- 室温で5分間、PBS中の0.1％ポリ-L-リジン溶液（PLL）を用いてコートガラスcryoslidesスライドを3時間乾燥させ。 4℃でスライドを保存し、使用前に温帯部屋にそれらをウォームアップ。
注：PLL-コーティング、それは離れて浮いからオルガノイドスライスを防ぐことができますよう、重要なステップです。最大3 4℃でPLL溶液を収集し、店舗数ヶ月。再使用する前に、0.22μmのシリンジでそれをフィルタリングし、室温までそれが暖かくてみましょう。 - PLLでコーティングされたガラス上に20~50ミクロンの厚さのスライスに区分cryofrozenのオルガノイド22を cryoslides。セクションで、スライドを室温で1時間乾燥させます。さらに処理するまで-80℃でセクションを保管してください。
- PBSを除去し、それらをcryofreezing前オルガノイドを脱水するチューブ当たり蒸留水の溶液中の30％ショ糖の1ミリリットルを加えます。 SUCROを追加した後SE溶液は、オルガノイドは表面に浮遊しなければなりません。 4°Cでのショ糖溶液中で一晩オルガノイドを保管してください。次の日で、オルガノイドは、チューブの底に沈んでダウンしている必要があります。
オルガノイドセクションの5.免疫染色
注：ネスチン、神経前駆マーカー、およびTUJ1、汎神経マーカーで染色するオルガノイドの一般的な特性については、推奨されます。追加の例、有糸分裂の頂端放射状グリア細胞を標識ホスホ - ビメンチン（P-のVim）、及びArl13bと免疫蛍光染色として、繊毛のために、記載されています。アポトーシスをテストするには、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdTを）dUTPニック - 末端標識（TUNEL）アッセイを使用しています。ほこり、光から保護するためにインキュベーションの間にプラスチック製の箱にスライドを置き、そして乾燥。
- 室温で30分間スライドを解凍します。
- PFA誘発性自己蛍光をクエンチするために3分間PBS-グリシン（PBS中のグリシンの0.225グラム）の200μLで二回スライドを洗浄します。
- 0.5％のTriton X100の200μL/室温で10分間PBS溶液中の0.1％Tweenで切片を透過性。
- 3分間PBS-グリシン溶液200μLで二回、それらを洗ってください。
- 非特異的抗原結合をブロックするために室温で又は一晩4℃で1時間、PBS中の0.5％魚ゼラチンの200μL/ 0.1％トリトンX100でそれらをインキュベートします。
注：TUNELアッセイが必要な場合は、製造元のプロトコルに従ってアッセイを行います。それは二次抗体に干渉し、その後使用時のフルオロフォアを消光可能性があるとして、免疫染色を行う前に、TUNELアッセイを開始します。 - 、ネスチン1：以下の濃度でブロッキング溶液中の抗体を希釈する200。 P-Vimは、1：500。 TUJ1、1：200;Arl13b、1：20;および二次抗体、1：1,000。
- 室温または4℃で一晩1-2時間、第一の一次抗体（ 例えば、ネスチン）の200μLとインキュベートします。
- ブロッキング溶液200μLで3×3分間洗浄します。
- ブロッキング溶液中で1,000〜室温で1~2時間、200μLでスライドをインキュベートする：最初の（抗マウス488）二次抗体1を希釈。これからは、常に光からスライドを保護します。
- ブロッキング溶液200μLで3×3分間洗浄します。
- 室温または4℃で一晩1~2時間、次の一次抗体（ 例えば、TUJ1）の200μLとインキュベートします。
- ブロッキング溶液200μLで3×3分間洗浄します。
- 室温で1~2時間、次の二次抗体（抗ウサギ647）の200μLを加えます。
- 3×3分を洗います。ブロッキング溶液の200μLと。
- 30 nMの濃にて4' の200μL、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を追加核染色のために室温で15分間PBSでentration。
- ブロッキング溶液200μLで2×3分洗浄します。
- 蒸留水200μLと、1×1分間洗浄し、明白な水滴がもはや表示されなくなるまでのセクションでは、10〜20分間乾燥させ。
- メディアを埋め込んでセクションをマウントします。彼らは数週間まで4℃で光から保護して保管してください。
- 画像の顕微鏡分析オルガノイド、心室ゾーン、原始皮質板、及び関心の他の領域の概要を進めます。
- 1、10を使用する蛍光色素タグ化二次抗体に応じて選択63X油目的と蛍光フィルターを備えた共焦点顕微鏡を使用します。
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Representative Results
脳オルガノイドの生成は、連続培養（ 図1A）の少なくとも三週間を要します。再現性のある結果を達成するために、我々は、研究者は、すべてのステップを文書化して、重要なのは、培地成分、時刻、およびセルの取り扱いに関するあらゆる変更を回避することをお勧めします。ここでは、重要なマイルストーンは、実験の終了時に十分な品質のオルガノイドを得るために達しているかどうかを評価する方法の概要を与えます。 96ウェルプレート中のニューロスフェアの形成は、前記神経球を各ウェル（ 図1B、ステップ1）の底部に同様に定義された球を認識することができる日からはっきりと見えるであるべきです。
5日目に、ニューロスフェアは、直径〜500μmであるべきであり、暗い中心を囲む明るいリムと、滑らかな表面を示します。すでに、神経ロゼットのような拡張STRUを観察することが可能であるかもしれませんこの明るいリム（ 図1C、ステップ2の開始）内ctures。ニューロスフェアがバラバラ以上の細胞集合体のように表示された場合は、分化がさらに継続されるべきではありません。最後に、オルガノイドは増加し、スピナーフラスコ（ 図1D、ステップ3）における分化プロセスの間に同様の大きさを示すべきです。詳細については、トラブルシューティングの表（ 表1）を参照してください。
14日オルガノイドの品質は、光学顕微鏡によって検証されなければなりません。 VZSは、頂端側の柵核形状のネスチン陽性のNPC /放射状グリア細胞の厚い層で構成されています。一方、原始皮質板が頂端側（ 図1E）から空間的に異なる、基底側に豊富TUJ1陽性ニューロンを含むであろう。重要なことは、TUJ1陽性ニューロンは、VZの先端側で見られるべきではありません。
図1F及びG）23,24の初期の対称拡張のために不可欠です。十分ARG拡張に到達すると、神経発生が開始されると、分裂細胞は、管腔に向かって、その向きを変更し、分割面が垂直（非対称）4、12、24に水平（対称）から切り替えます。
図1： ヒトiPS細胞から脳オルガノイドの生成。 （A）分化プロトコルのワークフロー。ステップ1：分化のスタート。この段階中、96ウェルプレート中のヒトiPS細胞からニューロスフェアの形成が起こります。持続時間は5日間です。ステップ2：EHSマトリックス滴でニューロスフェアを埋め込みます。 EHSマトリックス包埋ニューロスフェアの静止懸濁培養4日の継続時間を有します。ステップ3：スピナーフラスコでオルガノイド。フラスコをスピナーするEHSマトリックスに埋め込まれたニューロスフェアの転送が行われます。持続時間は14日です。 （B）マルチウェルプレートにおけるニューロスフェア。ステップ1中、96ウェルプレートにおいて4日目のニューロスフェアの代表画像が示されています。球は、滑らかな、丸い表面（赤arroと、ウェルの底にはっきりと見えなければなりませんワット）。 EHSマトリックス埋め込みの前（C）ニューロスフェアの形態。ステップ1の5日目に採取した神経球は、サイズが均一で明るいリム（ブラケットと矢印）で平滑な表面を表示する必要があります。スピナーフラスコにおける（D）オルガノイド。工程中脳オルガノイド3（赤矢印）とスピナーフラスコは、ここで示されています。典型的なVZと原始皮質板を表示凍結切片オルガノイドの（E）免疫蛍光イメージング。左側のパネルにはVZでの細胞の核の染色を示します。 VZは、基底側（黄線）の先端側（管腔L）から及びます。 VZ表示柵のような核内の細胞は、彼らは放射状グリア細胞であることを示唆していることに注意してください。右のパネルは、VZと原始皮質板におけるTUJ1陽性ニューロン（マゼンタ）内のネスチン陽性のNPC（緑色）の免疫蛍光染色を示します。 =50μmのスケールバー。凍結切片オルガノイドの（F）免疫蛍光イメージング。二つの例VZSのPのVimとArl13b（IおよびIII）で染色しました。白い四角でマークされた領域が各画像はめ込み（II及びIV）のための右側に拡大されます。後期頂端放射状グリア細胞（ARGS）の分割面。 VZの頂端側に頂端放射状グリア細胞分割は、p-Vimの陽性（マゼンタ）です。対称的に分割ARGSの例は、（白四角及びインセット）を示します。分割面は、白線として与えられます。後期セルの分割面は、内腔表面線（黄色点線）に水平であり、Arl13b染色（緑色）によってマークされています。 =50μmのスケールバー。 （G）この概略図は、内腔の後期相対ARGSの垂直または水平の方向性を提供します。 14日目に対照オルガノイドの分裂細胞ほとんど水平に配向されている（0~30°）VZの内腔面に対して。ルーメンの先端側は、VZ（緑色のライン）の内腔表面を指定する引数の一次繊毛によって裏打ちされています。対照的に、MOS小頭オルガノイドの放射状グリア細胞のTは、垂直配向（60~90°）の分割面を表示します。白線は、分割平面の軸を示します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 問題： | 考えられる理由： | 提案： |
| ステップ1.1.1.2 | 再プログラミングの効率が悪いです | 品質が低い場合は、手動で多能性コロニーを豊かにするために、いくつかの継代のために未分化コロニーを選択：多能性マーカーのためのhiPSCsをチェック |
| ヒトiPS細胞は、分化の開始前に、差別化 | ||
| 早期継代またはpassagiによるストレス単一細胞としてngの | 80％の密集度に到達する前にいないの通路を行います。集合体ではなく、単一細胞として継代 | |
| マイコプラズマによる汚染 | マイコプラズマ汚染のテスト | |
| ステップ2 | hiPSCsの品質が悪いです | hiPSCsの品質を向上させる（上記参照） |
| ニューロスフェアは全く形成や分化の開始後5日目でバラバラにしないでください | ウェルあたりの細胞数を起動すると、低すぎたり高すぎます | 正確にセルの数をカウントし、各ウェルに均等に配布 |
| hiPSC媒体ではなく、神経分化培地を使用しました | 神経分化培地を使用します | |
| 遠心分離工程は、あまりにも過酷または軽度にしました | 3分間96ウェルプレートを500×gでスピンし、細胞が中央に蓄積されたかどうかを確認各ウェルの底 | |
| 分化の開始時にY-27632いいえ | 細胞の生存を高めるために、Y-27632を使用します | |
| 細胞取り付けられ、プレートの底部に成長 | 非接着性96ウェルV底プレートが使用されていることを確認してください。 | |
| ステップ2 | いいえ、毎日培地を交換していません | 毎日培地の半分量を変更します |
| ニューロスフェアのサイズは均質ではありません | ウェルあたりの細胞数を開始することと等しくありませんでした | 毎回100μLの細胞懸濁液を取り出す前に、単一細胞懸濁液とチューブを混ぜます |
| 培地交換は、各ウェル毎日のために行われていませんでした | すべてのウェルは、毎日培地交換を取得していることを確認します | |
| ステップ2 | hiPSCは、int型を解離していませんでした分化の開始前に、単一の細胞O | hiPSCはACCUTASE処理後に単一細胞に解離されている場合は、顕微鏡下で確認してください。残っている場合は、集約100μLマイクロピペットで上下にピペット細胞の10倍をして、再度確認するか、治療ACCUTASEリピート |
| ニューロスフェアは、明るいリム又は丸い表面を示しません。彼らは、表面に大きな嚢胞を形成します | ウェルあたりの細胞数を開始することが高すぎました | 正確にセルの数をカウントし、各ウェルに均等に配布 |
| 培地交換は、各ウェルについて、毎日行われていませんでした | 毎日培地の半分を変更 | |
| ステップ2.7 | hiPSCsの品質が悪いです | hiPSCsの品質を向上させる（上記参照） |
| EHSマトリックス埋め込まれたニューロスフェアは、スティックと一緒に凝集します | 十分ではない培地（ボリューム） | を提供する100mmのペトリ皿に10mlの培地の最小 |
| インキュベータの棚もありません | でも、表面上の皿を置き | |
| ニューロスフィアを均等に分散されるように、インキュベーターに配置した後、皿を移動 |
表1：トラブルシューティング表。
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Discussion
MCPHは、in vivoまたはin vitroでの単純なヒト細胞培養アプローチに動物モデルで再現されることができない複雑なヒト神経発達障害です。 MCPHの臨床症状は、早期の神経発生が開始されると、最初の学期中に現れ始めます。このように、3D脳オルガノイドはMCPH開発をモデル化するための信頼性の高い実験系を表します。また、3Dヒト脳オルガノイドは重要なこと、iii）は、様々な分化I）は、それらが様々な遺伝的背景を有する患者サンプルのスペクトルの適応を可能にするが、II）は、異なる神経細胞型を含む組織の組織を表示するので、理想的なアプローチであり、そしてこのin vitro手法における神経発達の段階は、それらのインビボ対応物25、26、27に連結されています。例えば、ニューラルロゼットは、発展途上の神経と同等の構造でありますチューブ。
ランカスターら。 2回使用患者iPS細胞の数は、患者オルガノイドの生成に成功するためにiPS細胞を制御するために比較しました。注目すべきは、既存の方法を変更することによって、ここに記載されているプロトコルで、我々はコントロールと同じセル番号4から始まる小頭脳オルガノイドを生成することができます。これは、iPS細胞の定義された培養条件に起因より指向分化することが可能でした。このプロトコルでは、オルガノイド生成はiPS細胞から直接的に神経分化を開始することによって一般的に行わEB形成工程を置換することによって改善されました。次に、ステップ3において、ドルソモルフィンとSB431542ではなく単独でレチノイン酸の培養培地に補充しました。細胞培養培地28に適用した場合のレチノイン酸は、容易に異性化されます。したがって、その生物学的活性は、ドルソモルフィン、より安定な化合物のより少ない定義されます。ドルソモルフィンの阻害シグナル伝達経路BMP4、およびSB431542は、アクチビン/ノーダルシグナル伝達経路（TGF-β1ALK阻害剤）の阻害剤です。両化合物の組み合わせはBMPの阻害及びアクチビン/ nodalシグナリング経路をもたらす、神経分化を誘導し、そして同様の効率29でヒトESまたはヒトiPS細胞から種々の細胞株における他の系統への分化を減少させます。化合物の安定性および化合物に対する普遍的な細胞応答は、 インビトロで疾患をモデル化するために、異なる患者の細胞系に適用することができるプロトコルを確立するための重要なポイントです。このように、均質な脳内堅牢かつ効率的な分化の結果は、より再現性のデータでは、最終的には、文化をオルガノイドと。
これらの変更で、プロトコル内の重要なステップは、この時点で、ステップ1における分化の開始に最小化され、穏やかに単一細胞懸濁液AにiPS細胞を解離することが重要ですND 96ウェルプレートの各ウェルに正確かつ均等に分配します。 Rho関連タンパク質キナーゼ阻害剤（Y-27632）は、単一の細胞に、それらの解離の際にiPS細胞の生存を支持するように、最初の24時間の間、培地Bを添加しなければなりません。ウェルの底にそれらをスピンダウンして、相互に密着した細胞をもたらすことが重要です。ニューロスフェアは、ステップ1の端部に形成されると、さらに実験手順が正常に完了したが期待できます。場合ニューロスフィアが、ヒトiPS細胞の多能性を形成しない、96ウェルプレート中の細胞、および遠心分離条件の非付着が確認されなければなりません。ステップ1の0日目に全体の手順は、人間のiPS細胞の感度のために1時間以上、もはや取るべきではありません。次の日中の中の変化は、細胞間のたて形成細胞接触を破壊しないようにするために、剪断力を避け、慎重に行う必要があります。
これは、そのcentrosom注目すべきですらの変異体は、欠陥のある細胞増殖および改変された細胞周期動態を有します。このように、モデリングMCPHは妥協細胞機能に耐えることができる強力なプロトコルが必要です。したがって、現在のプロトコルは、高品質の均質オルガノイドの生成を可能にし、VZに幹細胞の恒常性を研究するためのユニークなツールとして役立ちます。他のプロトコルとは対照的に、このプロトコルは、等しい細胞数で開始、制御及び患者のiPSCからオルガノイドの生成を可能にします。 インビトロ分化に基づいて研究のために、異なる性IPSCに対して同一の培養条件は、疾患に関連する変化を同定するための培養条件アーチファクトを回避するために、基本的な要件です。遺伝的起源の小頭をモデリングするだけでなく、このプロトコルはまた、神経栄養ウイルス感染症、化学物質、または放射線からを含め、非遺伝的起源の小頭に適用することができます。また30は、そのようなCRISPR / Cas9ゲノム編集など、現代の分子生物学ツール、技術をINGの、 インビトロでの 31、32、33 に人間の脳の発達パラダイムの特定の側面を分析するための3Dオルガノイドに適用することができます。
一方、これまでの脳オルガノイドの世代は、まだ人間開発34の第1及び早期妊娠第二期を超えて行っておりません。この制限を上回ると、in vitroで成熟した脳オルガノイドの生成を有効にすると、例えば、パーキンソンやアルツハイマー病などの後期に現れ、神経変性疾患をモデル化するために新たな道を開くだろう。将来のアプリケーションのために、プロトコルは前脳や中脳のような、より多くの特定の領域への分化を指示する、自閉症や統合失調症35、36、37のような複雑な神経疾患を研究することは興味深いかもしれません、 38アップ。
オルガノイド研究から結論を描画するときに重要なのは、特定の側面を考慮する必要があります。最初の制限は、オルガノイドに明らかな血管新生がないことです。従って、 インビトロでのガス交換及び栄養補給は、 インビボ条件に近づけます。脳オルガノイドは、複雑な器官系に接続されていないので、第二に、オルガノイドモデルは、完全な免疫、代謝、およびホルモンシステムを欠いています。それにもかかわらず、これらの側面の不在は時々利点を提供します。脳疾患の病因における免疫系への影響に対処する場合たとえば、ここで説明するオルガノイドは、in vivoモデルで免疫抑制置き換えることができます。
スピナーフラスコを使用すると、オルガノイド多数の生化学的実験、全トランスクリプトーム配列解析、および高スループット薬物スクリーニングのために生成することができます。 uで、一緒になってこの現在のプロトコルを歌う、一つはその後確実に将来の動物試験を交換するために、疾患モデルからの薬物検査プラットフォームに、アプリケーションの広い範囲で利用することができるヒトiPS細胞の細胞から脳オルガノイドを生成することができます。
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Acknowledgments
この作品は、フリッツ・ティッセン財団（Az.10.14.2.152）によってサポートされていました。私たちは、組織の埋め込み施設とCMMCの顕微鏡中核施設に感謝しています。私たちは、中心体および細胞骨格生物学研究所のメンバーが提供する議論と技術サポートのために感謝しています。私たちは、原稿を校正するために李明グーイに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse 488 | Invitrogen | A-11001 | Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
| Anti-rabbit 647 | Invitrogen | A-21245 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 |
| Arl13b | proteintech | 17711-1-AP | ARL13B rabbit polyclonal antibody |
| CELLSPIN system | IBS Integra Bioscience | 183001 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, US | 32670 | 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| DMEM/F-12 | Gibco, US | 31331093 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 |
| Dorsomorphin | Sigma-Aldrich, US | P5499 | Compound C; multiple suppliers |
| Embedding medium | AppliChem | A9011, 0100 | Mowiol; embedding medium; multiple suppliers |
| Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix | Corning | 354277 | Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified |
| Fish gelatin | Sigma-Aldrich, US | G7765-250ML | Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4 °C |
| Glycine | AppliChem | A1067,1000 | Glycine for molecular biology; multiple suppliers |
| Inoculation loop with needle, disposable (1 µL) | Sigma Aldrich, US | BR452201-1000EA | multiple suppliers |
| Insulin | Sigma-Aldrich, US | I3536-100MG | multiple suppliers |
| L-glutamine | Gibco, US | 25030081 | L-glutamine (200 mM) |
| Medium A | Stem cell technologies | #05850 | mTeSR1 (hiPSC medium) |
| Medium B | Stem cell technologies | #05835 | Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium |
| Medium C | Gibco, US | 21103049 | Neural Basal Medium |
| MEM | Gibco, US | 11140035 | MEM non-essential amino acids solution (100x) |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza, Switzerland | #LT07-218 | Mycoplasma detection kit; multiple suppliers |
| Nestin | Novus biologicals | NBP1-92717 | Nestin mouse monoclonal antibody (4D11) |
| Paraformaldehyde (PFA) | AppliChem | A3813, 0500 | 4% in PBS, store solution at -20 °C; caution: wear skin and eye protection and work under hood |
| PBS tablets | Gibco, US | 18912014 | See manufacturer´s instructions; multiple suppliers |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL) | Gibco, US | 15140122 | Multiple suppliers |
| Poly-L-lysine solution (PLL) | Sigma-Aldrich, US | P8920-100ML | Multiple suppliers |
| pVim | MBL | D076-3S | Phospho-Vimentin (Ser55) mAb |
| Reagent A | Stem cell technologies | # 05872 | Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available |
| Reagent B | Sigma-Aldrich, US | A6964-100ML | Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution” |
| Research Cryostat Leica CM3050 S | Leica biosystems | CM3050 S | Multiple suppliers |
| SB431542 | Selleckchem.com | S1067 | Multiple suppliers |
| Spinner flask 250 mL | IBS Integra Bioscience | 182026 | |
| Sucrose | AppliChem | A4734, 1000 | Multiple suppliers |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo scientific, US | J3800AMNZ | Slides should be labeled with a "+" and positively charged |
| Supplement 1 | Gibco, US | 17502048 | N-2 supplement (100x) |
| Supplement 2 w/o Vitamin A | Gibco, US | 12587010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, NL | 4565 | Multiple suppliers |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura, NL | 4583 | Multiple suppliers |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388,0500 | Multiple suppliers |
| TUJ1 | Sigma-Aldrich, US | T2200 | β-Tubulin III (rabbit polyclonal) |
| TUNEL assay | Promega, US | G3250 | DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers |
| Tween 20 for molecular biology | AppliChem | A4974,0500 | Multiple suppliers |
| waterproof sheet | BEMIS company, inc. | PM996 | Parafilm “M”; multiple suppliers |
| Y-27632 | Selleckchem.com | S1049 | ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers |
| β-mercaptoethanol | Gibco, US | 31350010 | 2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers |
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