Introduction
Humane nevrologiske lidelser, for eksempel microcephaly, kan bare lite studert i dyremodeller på grunn av det faktum at menneskelige hjerne har en utvidet kortikale overflate, en unik funksjon som er forskjellig fra ikke-humane dyr.
Dette aspektet gjør menneskelige hjerne utvikling en kompleks prosess som ikke i tilstrekkelig grad kan studeres i en 2D, in vitro cellekultursystem. Vekst 3D-kulturteknikker muliggjør genereringen av vev-lignende organoids fra induserte pluripotente stamceller (iPSCs). Den in vitro differensiering av pluripotente stamceller i et 3D-suspensjonskultur muliggjør dannelsen av forskjellige celletyper på en riktig og område-spesifikk måte, noe som gir opphav til en organisert, lagdelt vev 1, 2, 3. Takket være laboratorier som var foregangs 3D kulturteknologi og demystified kompleksiteten av organdannelse, ved å starte fra stamcellervi utviklet en robust metode for å generere hjerne organoids å avgrense tidlige hendelser av human utvikling av hjernen og å modellere microcephaly in vitro-1, 2, 3. Det er bemerkelsesverdig at vi tilpasset den opprinnelige metoden utviklet av Lancaster et al. å generere cerebrale organoids 1. Denne metoden ble endret i henhold til våre eksperimentelle krav.
Hensikten med en studie fra Gabriel et al. var å analysere de cellulære og molekylære mekanismer for neurale stamcelle vedlikehold i løpet av utvikling av hjernen. For å gjøre dette, ble en mekanistisk studie utført ved analyse av neurale progenitorceller (NPC) i 3D hjerne organoids avledet fra en pasient microcephaly 4. Denne pasienten båret en mutasjon i CPAP, en konservert centrosomal protein som er nødvendig for sentrosomen biogenese 5. En allment akseptert hypoOppgaven er at microcephaly er et resultat av en utarming av NPC bassenget, og dette kan skyldes enten til celledød, eller til for tidlig differensierings 1, 6, 7, 8, 9.
Ved å analysere de ventrikulære sonene (VZs) av microcephaly hjerne organoids, ble det vist at et betydelig antall av NPC gjennomgå asymmetrisk celledeling, i motsetning til hjernen organoids som stammer fra en frisk donor 4. Omfattende mikroskopiske og biokjemiske analyser av microcephalic hjerne organoids viste en uventet rolle for CPAP i tide cilia demontering 4. Nærmere bestemt er mutert CPAP forbundet med retardert cilium demontering og forsinket cellesyklus reentring, som fører til for tidlig differensiering av NPC-4. Disse resultatene tyder på en rolle for flimmerhårene i microcephaly og thEIR engasjement under nevrogenesen og hjernestørrelse kontroll 10.
Den første delen av denne protokollen er en beskrivelse av en tre-trinns metode for å frembringe homogene hjerne organoids. Som nevnt før, ble den opprinnelige Lancaster protokollen tilpasset og modifisert for å passe vårt formål 1. For det første humane iPSCs dyrkes i et definert mater-fri tilstand på Engelbreth-Holm-sverm (HMS) matrise. Dette trinnet unngår variasjoner av mater-avhengige pluripotent stamcelle-kulturer. I denne protokollen, til induksjon av nevrale differensiering danner neurale epitel starter direkte fra iPSCs. Ved å hoppe over den embryoid legeme (EB) dannelsestrinn, neural differensiering foregår i en mer kontrollert og dirigert måte. Denne fremgangsmåten begrenser den spontane og urettet dannelse av andre kimcelle-lag, så som mesoderm og endoderm. Ved å bruke denne protokollen, kan neurosfærer som inneholder neurale rosetter bli høstet på dag 5 etter EHS matrise innebygging og stasjonær suspensjonskultur. Den organoid medium som anvendes for det tredje trinn i vår protokoll er supplert med dorsomorphin og SB431542. Dorsomorphin er en småmolekyl-inhibitor av benmorfogent protein (BMP), og SB431542 hemmer TGFp / aktivin / nodal signalveien. Kombinasjonen av disse faktorene kan fremme nerve differensiering mer effektivt enn retinsyre alene 11, 12, 13, 14.
Til sammen er disse modifikasjoner muliggjøre reproduserbare generering av hjerne organoids, med minimale variasjoner på tvers av organoids. Viktigere, ble denne metoden anvendt for å generere robuste microcephalic hjerne organoids fra pasient iPSCs, som bærer mutasjoner i gener som påvirker centrosomer og celle-syklus dynamikk.
Den andre delen av denne protokollen gir instruksjoner om å forberede brain organoids for analyse og tolkning av cellulære defekter i microcephaly. Dette inkluderer fiksering, cryosectioning, immuno-fluorescensfarging, og konfokal mikroskopisk analyse. Denne protokollen vil gi leseren en detaljert beskrivelse av forventede resultater, og med veiledning for tolkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generering av Brain Organoids (23 dager)
- Oppstart av neuroectoderm (5 dager)
MERK: Følgende punkter bør vurderes før starten av differensiering. Reprogrammerings-metoden (lentiviral-, Sendai-virus-, episomal-, eller mikroRNA-baserte etc.) for å oppnå humane iPSCs bør ideelt sett være den samme for alle pasient og kontrollere IPSC linjer. Forskjellige omprogrammering kits og instruksjoner basert på publiserte protokoller er tilgjengelige 15, 16, 17, 18. Kvaliteten av de menneskelige IPSC linjene er nøkkelen til å oppnå en optimal differensiering. Overvåk koloni og cellemorfologi med et mikroskop og validere pluripotency ved å teste ekspresjonen av markører som Oct3 / 4, Nanog, eller TRA-1-60.- Kultur humane iPSCs henhold mater frie betingelser i medium A på en plate dekket med Engelbreth-Holm-sverm(HMS) matrise.
MERK: vokser humane iPSCs mater frie og serumfritt for å opprettholde en definert dyrkingsbetingelser og for å unngå et ytterligere trinn for fjerning av muse-embryonale mateceller (MEFs) før starten av differensieringen. Den optimale passasjenummer for humane iPSCs å starte differensierings varierer fra kanalen 15 ved omprogrammering til passasjen 70 i total. Ved passering, løsner hiPSC kolonier som celler aggregat ved hjelp av en passende celle løsgjøring løsning med lav mekanisk belastning og en 2-ml serologisk pipette for å overføre tilslag til en ny antenne. Unngå dissosiasjon til enkeltceller, da dette kan indusere differensiering og apoptose i de fleste IPSC linjer. Det ble rapportert at på lang sikt kan encellede aging øke genom endringer i menneskelig iPSCs 19, 20. Unngå celleadskillelsesfremgangsmåtene, som krever et sentrifugeringstrinn for å fjerne løsgjøring løsning, da dette reduserer den totale levedyktigheten til iPSCs. Testalle kulturer for mikrobielle forurensninger, spesielt mykoplasma, på regelmessig basis, fordi dette kan forringe kvaliteten på iPSCs og deres differensiering kapasitet.- Coat en 60 mm vevskulturskål med EHS matrise i henhold til produsentens instruksjoner.
- Tine en aliquot av 1 x 10 6 humane iPSCs. Seed iPSCs i en 60-mm vevskulturskål belagt EHS matrise og inneholdende 5 ml av medium A (se Materialer tabellen). Endre medium daglig og passasjen etter 5 til 7 dager når cellene nå ~ 80% sammenflytning.
MERK: Passasje den opptinte iPSCs ved 80% konfluens ved bruk av standard metoder, slik som den enzymfritt løsgjøring av kolonier 21, minst en gang før differensiering. I korte trekk, fjern IPSC medium, vaskes cellene én gang med forvarmet 37 ° C Dulbeccos modifiserte Eagles medium: næringsblanding F12 (DMEM / F12), og inkuberes iPSCs å følge produsentensinstruksjoner under anvendelse av reagens A (se materialer tabellen). Ikke overskrid anbefalt inkubasjonstid for å unngå dissosiasjon til enkeltceller. Humane iPSCs bør være frittliggende og flytende som tilslag, ikke som enkeltceller. De kan da bli overført til nye HMS-matrise-belagt retter; for eksempel tilslag IPSC fra en 60 mm skål kan distribueres til 4 nye 60-mm skåler. - Sjekk for mykoplasma med mykoplasma deteksjon kit i henhold til produsentens instruksjoner. Bruk bare mycoplasma-free iPSCs, som mykoplasma kan endre differensiering evnen til iPSCs.
- Dissosiere iPSCs (80% sammenflytende) og fremstille en enkeltcellesuspensjon ved bruk av reagens B.
- Vask iPSCs gang med forvarmet (37 ° C) DMEM / F12.
- Legg forvarmet reagens B (f.eks, 1 ml i en 60 mm skål) og inkuber iPSCs i 5 min ved 37 ° C og 5% CO2.
- Flick 20 ganger med en fingertupp på siden og bunnen avfatet for å løsne iPSCs. Sjekk for avløsning av celler under mikroskop.
- Pipetter cellesuspensjonen opp og ned i fatet 5 ganger med en 1-ml mikropipette.
- Tilsett 3 ml av medium A for å fortynne 1 ml av reagens B og samle cellesuspensjonen i et 15 ml sentrifugerør.
- Forsiktig spinne ned de iPSCs (500 x g) i 4 min ved romtemperatur.
- Cellepelleten suspenderes i 1 ml medium B og telle celletallet med et hemocytometer.
MERK: Vær oppmerksom på å bruke kun medium B for resuspensjon. Unngå å bruke medium A, da den inneholder en for høy konsentrasjon av bFGF, som kan hemme den differensiering.
- Fortynn cellesuspensjonen til 4,5 x 10 5 celler per ml i medium B supplert med 10 uM rho-assosiert protein kinase inhibitor (Y-27632).
- Tilsett 100 pl pr brønn i en ikke-klebende, v-bunn, 96-brønners plate.
MERK: Pass på at cellene er likt fordelt i suspensjon ved å riste røret hver gang før tar ut 100 ul porsjoner. Det er viktig at hver brønn bør inneholde en tilsvarende celle nummer for å oppnå neurosfærer homogene i størrelse og form (rund, definerte flater). - Forsiktig spinne ned platen med cellene ved 500 xg og ved romtemperatur i 3 minutter, og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2.
- Skift medium daglig ved å ta 50 ul og tilsetning av 50 ul av frisk medium B i hver brønn for de neste 5 dager.
- Kultur humane iPSCs henhold mater frie betingelser i medium A på en plate dekket med Engelbreth-Holm-sverm(HMS) matrise.
2. Inkludering Neurosfærer EHS Matrix (4 dager)
- Forbered neurosfære medium ved å blande det følgende: 1: 1 blanding av DMEM / F12, og middels C (v / v), 1: 200 (volum / volum) supplement 1, 1: 100 (volum / volum) supplement 2 uten (w / o) Vitamin A, 1: 100 L-glutamin, 0,05 mM ikke-essensielle aminosyrer (MEM), 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 1,6 g / l insulin, og 0,05 mM β-merkaptoetanol.
- Samle Neurosfærene viddhektar 200 ul mikropipette ved hjelp av en spiss mm ~ 2 på forhånd spaltet med steril saks.
- Plasser neurosfærene omtrent 5 mm fra hverandre på parafin film (3 x 3 cm 2) i et tomt 100 mm skål og forsiktig fjerne så mye av den gjenværende mediet som mulig.
- Tilsett en dråpe (7 ul) fra EHS matrise på hver enkelt neurosfære.
- Inkuber EHS matrisen faller sammen med neurosfærene i 15 minutter i en inkubator.
- Vask neurosferer nøye fra parafin filmen ved å skylle dem med neurosfæren medium. Å tømme, bruke en 1 ml mikropipette og en ny 100 mm Petri skål inneholdende 10 ml av neurosfære medium.
- Inkuber Neurosfærene for de neste 4 dager og tilsett 2 ml av fersk neurosfæren medium på dag to.
MERK: Kontroller at hyllene i inkubatoren er flat slik at HMS-matrise-embedded neurosferer ikke vil klumpe seg sammen på den ene siden av fatet.
3. Organoids i en roterende SuspensjonKultur (14 dager)
- Forbered hjerne organoid medium ved å blande det følgende: 1: 1 blanding av DMEM / F12, og middels C (v / v), 1: 200 (volum / volum) supplement 1, 1: 100 (volum / volum) supplement 2 w / o vitamin A, 1: 100 L-glutamin, 0,05 mM MEM, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 1,6 g / l insulin, 0,5 uM dorsomorphin, 5 uM SB431542, og 0,05 mM β-merkaptoetanol.
- Tilsett 100 ml hjerne organoid medium til hver spinnerkolbe gjennom dens sidearmer og plassere dem i en inkubator i pre-oppvarming i minst 20 min.
- Sett opp en røre program ved 25 rpm, i henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: Før du overfører EHS matriseinnebygd neurosferer i spinnerflasker, sørg for at de er separert. Hvis to eller flere er forbundet via EHS matrise, skille dem ved å kutte forbindelses matrise med en skalpell. - overføre nøye EHS matrise innleiret neurosfærer i spinnerflasker som inneholdt 100 ml medium organoid ossing en 2 ml serologisk pipette. Bruk sidearmene av den roterende kolbe til å overføre neurosfærene inn i kolben.
- Plasser spinnerflasker på en magnetisk røre plattform i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2; Dette er dag 0 av organoid kultur.
- Endre medium gang per uke (eller oftere når det er en fargeendring) ved å fjerne halvparten av mediet og tilsette samme mengde friskt medium.
MERK: Når du tar spinnerflasker ut av inkubatoren, vent 3-5 min å la organoids synke ned til bunnen av kolben. Fjern mediet ved å plassere glasset pipettespissen (koblet til en pumpe) på overflaten av væsken; aspirere mediet forsiktig gjennom en sideåpning / arm av kolben. Disse manipulasjoner må gjøres under laminær panseret.
4. Analyse av Brain Organoids
- Fiksering av organoids
- Samle organoids på dag 14 av spinnerkolbekultur with et snitt 1 ml mikropipette (cut ~ 5 mm). Sett alle av dem i en 60 mm skål og vaske dem én gang med 5 ml varm DMEM / F12 i 3 min.
- Fremstill en 1,5 ml rør med 500 ul varm 4% paraformaldehyd (PFA).
Forsiktig: Bruk hud og vernebriller og arbeid under en sikkerhetshette ved håndtering PFA fiksativ. - Plasser hver organoid separat i hvert rør og festes i minst 30 minutter ved romtemperatur. Ikke fikse organoids i mer enn 60 min. For å flytte organoids, bruker en inokulasjon sløyfe eller en hvilken som helst annen tenke som er praktisk.
- Fjern PFA og vaske de faste organoids to ganger i 10 minutter hver med 1 ml PBS.
- Oppbevar organoids i 1 ml PBS ved 4 ° C i opp til 7 dager, inntil videre anvendelse.
- Embedding de organoids for cryosectioning
- Fjern PBS og tilsett 1 ml av 30% sucrose i destillert vann, oppløsning per rør for å dehydrere organoids før cryofreezing dem; etter tilsetning sucroSE-løsning, bør organoids være flytende på overflaten. Oppbevar organoids over natten i sukroseoppløsning ved 4 ° C; av neste dag, bør organoids har sunket ned til bunnen av røret.
MERK: Organoids kan lagres i opp til 3-5 dager ved 4 ° C i sukrose-løsning, om nødvendig. - Fyll en vinylprøvestøpeform med 400 mL av en optimal skjære temperatur (OCT) forbindelse og bruke en inokulering sløyfe til å plassere en organoid i sentrum av støpeformen. Label kanten av formen med prøven navn.
- Fryse den organoid holdig form ved -80 ° C inntil cryosectioning.
- Belegge glass cryoslides med 0,1% poly-L-lysin-løsning (PLL) i PBS i 5 min ved romtemperatur og la skinnene tørke i 3 timer. Oppbevar lysbildene ved 4 ° C og varm dem opp til rommet temperert før bruk.
MERK: PLL-belegget er et viktig trinn, da det vil hindre organoid skivene i å flyte bort. Samle inn og lagre PLL løsning ved 4 ° C i opptil 3måneder. Før ny bruk filtrere den med en 0,22 pm sprøyte og lar det oppvarmes til romtemperatur. - Seksjon cryofrozen organoids til 20-50 um tykke stykker på PLL-belagte glass cryoslides 22. La lysbilder med seksjonene tørke i 1 time ved romtemperatur. Oppbevar seksjonene ved -80 ° C inntil videre bearbeidelse.
- Fjern PBS og tilsett 1 ml av 30% sucrose i destillert vann, oppløsning per rør for å dehydrere organoids før cryofreezing dem; etter tilsetning sucroSE-løsning, bør organoids være flytende på overflaten. Oppbevar organoids over natten i sukroseoppløsning ved 4 ° C; av neste dag, bør organoids har sunket ned til bunnen av røret.
5. Immunofluorescent Farging av Organoid Seksjoner
MERK: For generell karakteristikk av organoids, farging med Nestinmarkøren, en neural stamfar markør, og TUJ1, en pan-neuronal markør, anbefales. Som ytterligere eksempler, immuno-fluorescensfarging med fosfo-vimentin (p-Vim), hvilke etiketter mitotiske apikale radiale gliaceller, og Arl13b, for cilium, er beskrevet. For å teste apoptose ved å bruke terminal deoksynukleotidyl-transferase (TdT) dUTP Nick End-Merking (TUNEL) assay. Plasser glir i en plastboks under inkuberingen for å beskytte dem mot støv, lys,og uttørking.
- Tine lysbildene i 30 minutter ved romtemperatur.
- Vask objektglassene to ganger med 200 ul PBS-glycin (0,225 g glycin i PBS) i 3 minutter for å stanse PFA-indusert autofluorescens.
- Permeabilisere seksjonene med 200 ul av 0,5% Triton X-100 / 0,1% Tween i PBS-oppløsning i 10 minutter ved romtemperatur.
- Vasker dem to ganger med 200 ul PBS-glycin-oppløsning i 3 min.
- Inkuber dem med 200 ul 0,5% fiskegelatin / 0,1% Triton X-100 i PBS i 1 time ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C for å blokkere uspesifikk antigenbinding.
MERK: Hvis en TUNEL-analysen er nødvendig, utføre analysen i henhold til produsentens protokoll. Start med TUNEL-analysen før utfører farging, da det kan interferere med sekundære antistoffer og slukke fluoroforen når det brukes etterpå. - Fortynn antistoffene i blokkerende oppløsning i følgende konsentrasjoner: nestin, 1: 200; p-Vim, 1: 500; TUJ1, 1: 200;Arl13b, 01:20; og sekundære antistoffer, 1: 1000.
- Inkuber med 200 pl av den første primære antistoff (f.eks nestin) i 1-2 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C.
- Vask 3 x 3 min med 200 ul blokkeringsløsning.
- Fortynn den første (anti-muse-488) sekundært antistoff 1: 1000 i blokkeringsløsning og inkuber sleiden i 200 ul i 1-2 timer ved romtemperatur. Fra nå av alltid beskytte lysbildene mot lys.
- Vask 3 x 3 min med 200 ul blokkeringsløsning.
- Inkuber med 200 ul av den neste primære antistoffet (for eksempel, TUJ1) i 1-2 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C.
- Vask 3 x 3 min med 200 ul blokkeringsløsning.
- Tilsett 200 ul av den neste sekundært antistoff (anti-kanin 647) i 1-2 timer ved romtemperatur.
- Vask 3 x 3 min. med 200 ul blokkeringsløsning.
- Tilsett 200 ul av 4' , 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) ved en 30 nM konsentration i PBS i 15 minutter ved romtemperatur for nukleær farging.
- Vask 2 x 3 min med 200 ul blokkeringsløsning.
- Vask 1 x 1 min med 200 ul destillert vann og la seksjonene tørke i 10-20 minutter, inntil ingen åpenbare vanndråpe er synlig lenger.
- Monter delene med innstøpningsmediet. Lagre dem beskyttet mot lys ved 4 ° C i opptil flere uker.
- Fortsett med mikroskopisk analyse av bildet en oversikt over organoid, ventrikulær sone, primitive kortikal plate, og andre områder av interesse.
- Bruke et konfokalt mikroskop med et 63X objektiv olje- og fluoriserende filter, velges i henhold til de fluorescerende fargestoffmerkede sekundære antistoffer som brukes 1, 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genereringen av hjerne organoids krever minst tre uker med kontinuerlig dyrking (figur 1A). For å oppnå reproduserbare resultater, anbefaler vi at forskeren dokumenterer hvert trinn, og enda viktigere, unngår eventuelle endringer vedrørende mellom komponenter, tidspunkter og cellebehandling. Her gir vi en oppsummering av hvordan man skal vurdere om kritiske milepæler er nådd for å få organoids av tilstrekkelig kvalitet på slutten av forsøket. Dannelsen av neurosfærer i en 96-brønns plate skal være godt synlig fra dag 4. Neurosfærer kan bli gjenkjent som veldefinerte kuler på bunnen av hver brønn (figur 1 B, trinn 1).
På dag 5, bør være neurosfærer ~ 500 mikrometer i diameter, og oppviser en glatt overflate, med en lys rand som omgir et mørkt senter. Det kan være mulig å allerede observere nevrale rosett-aktig utvidet sliter mennctures innenfor dette lys kant (figur 1C, start av trinn 2). Dersom neurosfærene falle fra hverandre eller ligne mer på celleaggregatene, bør differensiering ikke fortsette videre. Til slutt bør organoids øke og utviser en lignende størrelse under differensieringsprosessen i spinnerflasker (figur 1D, trinn 3). Se i feilsøkingstabellen (tabell 1) for ytterligere informasjon.
Kvaliteten på dagen-14 organoids bør verifiseres ved lysmikroskopi. VZs er sammensatt av tykke lag av nestin-positive NPC / radielle gliaceller med en palisade atom form på den apikale side. På den annen side vil den primitive kortikale platen inneholde rikelig TUJ1-positive neuroner i den basale side, romlig atskilte fra den apikale side (figur 1E). Viktigere, TUJ1-positive nevroner bør ikke bli sett på den apikale siden av VZ.
(figur 1F og G) 23,24. Når tilstrekkelig Arg ekspansjon nås, neurogenese begynner, de delende celler endre sin orientering mot lumen, og divisjonen planet skifter fra horisontal (symmetrisk) til vertikal (asymmetrisk) 4, 12, 24.
Figur 1: Generering av Brain Organoids fra humant IPS celler. (A) Prosess med den differensiering-protokollen. Trinn 1: Start på differensiering. Under denne fase, dannelse av neurosfærer fra humane iPSCs i en 96-brønns plate finner sted. Tiden varighet er 5 dager. Trinn 2: Innbygging neurosfærene EHS matrise dråper. En stasjonær suspensjonskultur av HMS matrise innleiret neurosfærer har en tidsvarighet på 4 dager. Trinn 3: Organoids i spinnerflasker. Overføringen av HMS matrise innleiret neurosfærer til spinnerflasker foregår. Tiden varighet er 14 dager. (B) En neurosfære i en multi-brønn-plate. Representative bilde av en neurosfærene på dag 4 i en 96-brønns plate under trinn 1 er vist. Kulen skal være godt synlig på bunnen av brønnen, med en glatt, rund overflate (red arrow). (C) Morfologi neurosfærer før EHS matrise innebygging. Neurosfærer samlet på dag 5 i trinn 1 bør være ensartet i størrelse og ha en glatt overflate med en klar kant (brakett og pil). (D) Organoids i spinnerflasker. En roterende kolbe med hjerne organoids i trinn 3 (røde piler) er vist her. (E) Immunofluorescent avbildning av cryosectioned organoids viser en typisk VZ og primitive kortikale plate. Det venstre panelet viser nukleær farging av cellene ved det VZ. VZ strekker seg fra den apikale side (lumen L) til den basale side (gul linje). Legg merke til at celler i VZ skjerm Palisade lignende kjerner, noe som tyder på at de er radiale gliaceller. Høyre panel viser immunfluorescens-fargingen av nestin-positive NPC (grønne) innenfor VZ og TUJ1-positive neuroner (magenta) i den primitive kortikale plate. Skala bar = 50 um. (F) Immunofluorescent avbildning av cryosectioned organoids. to eksemplerav VZs farget med p-Vim og Arl13b (I og III). De områder som er merket med hvite kvadrater er forstørret til høyre for hvert bilde nedfelling (II og IV). Delingen planet anafase apikal radiale gliaceller (ARGS). Oppdeling apikale radiale gliaceller på den apikale siden av VZ er p-Vim-positive (magenta). Eksempler på symmetrisk skille ARGS er vist (hvite firkanter og innfellinger). Divisjonen plan er gitt som en hvit linje. Inndelingen planet av en anafase celle er horisontal i forhold til lumen mantellinjen (gul stiplet linje) og er markert ved Arl13b farging (grønn). Skala bar = 50 um. (G) Et skjematisk gir vertikal eller horisontal orientering av ARGS i anafase forhold til angjeldende lumen. De celler som deler av styre organoids på dag 14 er hovedsakelig horisontalt orientert (0-30 °) i forhold til lumen overflaten av VZ. Den apikale side av hulrommet er omgitt av den primære cilia av ARGS, som angir lumen overflaten av VZ (grønn linje). I kontrast, most av de radielle gliacellene av microcephaly organoids viser et vertikalt orientert (60-90 °) divisjon plan. Den hvite linjen viser aksen for divisjon planet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Problem: | Mulige årsaker: | forslag: |
| Trinn 1.1.1.2 | Dårlig effektiviteten av omprogrammering | Sjekk hiPSCs for pluripotency markører: hvis kvaliteten er lav, manuelt plukke udifferensierte kolonier for noen passasjer å berike pluripotente kolonier |
| Humane iPSCs differensiere før starten differensiering | ||
| Stress på grunn av tidlig aging eller passaging som enkeltceller | Ikke passasje før 80% konfluens er nådd. Passasje som aggregater, ikke enkeltceller | |
| Forurensning med mycoplasma | Test for mykoplasmaforurensning | |
| Steg 2 | Dårlig kvalitet på hiPSCs | Forbedre kvaliteten på hiPSCs (se ovenfor) |
| Neurosfærer danner ikke i det hele tatt eller falle fra hverandre på dag 5 etter start av differensiering | Starter antall celler per brønn er for lavt eller for høyt | Nøyaktig telle antallet celler og fordele dem likt i hver brønn |
| hiPSC medium ble anvendt i stedet for nevral differensieringsmedium | Bruke nevrale differensieringsmedium | |
| Sentrifugeringstrinn var for harde eller for mild | Spin 96-brønns plate 500 x g i 3 minutter, og sjekke om cellene samlet sentralt hosbunnen av hver brønn | |
| Ingen Y-27632 ved start av differensiering | Bruk Y-27632 for å forbedre celleoverlevelses | |
| Cellene festet og vokste på bunnen av platen | Sørge for at en ikke-vedhengende 96-brønn v-bunn plate anvendes. | |
| Steg 2 | Ingen daglig medium endring | Endre halv mengde medium daglig |
| Neurosfærer ikke er homogene i størrelse | Starter antall celler per brønn var ikke lik | Bland røret med enkeltcellesuspensjon hver gang før tar ut 100 ul cellesuspensjon |
| Medium endringen ble ikke gjort for hver brønn daglig | Sørg for at hver brønn blir medium endring daglig | |
| Steg 2 | hiPSC ble ikke dissosiert into enkeltceller før starten av differensieringen | Sjekk under mikroskopet hvis hiPSC dissosiert til enkeltceller etter accutase behandling. Hvis det fremdeles er aggregater, pipettes cellene 10 ganger opp og ned med 100 pl mikropipette og kontrollere igjen eller gjenta accutase behandlings |
| Neurosfærer viser ikke en lys kant eller rund overflate; de danner store cyster ved overflaten | Starter antall celler per brønn var for høy | Nøyaktig telle antallet celler og fordele dem likt i hver brønn |
| Medium endringen ble ikke gjort daglig for hver brønn | Endre halve medium daglig | |
| trinn 2.7 | Dårlig kvalitet på hiPSCs | Forbedre kvaliteten på hiPSCs (se ovenfor) |
| HMS-matrise innebygd neurosferer stokk og klumpe seg sammen | Ikke nok medium (volum) | gi enminimum på 10 ml medium i en 100 mm petriskål |
| Hylle av inkubator ikke engang | Sett fatet på en jevn overflate | |
| Etter å ha satt inn i kuvøsen bevege fatet, slik at neurosfærer fordeles jevnt |
Tabell 1: Feilsøking tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MCPH er en kompleks human nevrologiske lidelser som ikke kan rekapitulert i dyremodeller in vivo eller i enkle humane cellekultur nærmer seg in vitro. Den kliniske manifestasjon av MCPH begynner å dukke opp i løpet av første trimester, når tidlig neurogenesis begynner. Således, 3D hjernen organoids representerer en pålitelig eksperimentelt system for å modellere MCPH utvikling. I tillegg, 3D human hjerne organoids er en ideell fremgangsmåte fordi i) de gir mulighet for tilpasning av et spekter av pasientprøver med forskjellige genetiske bakgrunner, ii) de viser organisert vev som inneholder forskjellige neurale celletyper, og, viktigst av alt, iii) forskjellige differensiering stadier av neurodevelopment i denne in vitro-metode er knyttet til deres in vivo motstykker 25, 26, 27. For eksempel, er det nevrale rosett en tilsvarende struktur til det fremkallende nevralerør.
Lancaster et al. brukte to ganger antall pasient iPSCs sammenlignet med kontroll iPSCs for å lykkes i å generere pasient organoids. Av notatet, med den protokoll som er beskrevet her, ved å modifisere de eksisterende metoder, kan vi generere kontroll og microcephaly hjerne organoids starter fra de samme celletall 4. Dette var mulig på grunn av de definerte dyrkningsbetingelser iPSCs og på grunn av en mer rettet differensiering. I denne protokollen, ble organoid ble forbedret ved å erstatte det ofte utføres EB dannelsestrinn ved å initiere neural differensiering direkte fra iPSCs. Dernest, i trinn 3, dorsomorphin og SB431542 ble tilsatt i dyrkningsmedium i stedet for retinsyre alene. Retinsyre er lett isomeriseres når den anvendes på cellekulturmedium 28. Derfor er dets biologiske aktivitet mindre definert enn den mer stabile forbindelser slik som dorsomorphin. Dorsomorphin hemmerden BMP4 signalveien, og SB431542 er en hemmer av aktivin / nodal-signalveien (TGF-β1 ALK-inhibitor). En kombinasjon av begge forbindelser fører til hemming av BMP og aktivin / nodal signalveien, fremkaller neural differensiering, og reduserer differensiering i andre cellelinjer i forskjellige cellelinjer fra menneske ES eller humane iPS celler med en tilsvarende virkningsgrad 29. Forbindelse stabilitet og universal-cellerespons på en forbindelse er et viktig poeng for å etablere en protokoll som kan anvendes på ulike pasientcellelinjer for å modellere en sykdom in vitro. Således er en robust og effektiv differensiering resulterer i homogen hjerne organoid kulturer og, til slutt, i mer reproduserbare data.
Med disse modifikasjoner, blir kritiske trinn i protokollen minimert til initiering av differensiering i trinn 1. Ved dette punkt er det viktig å forsiktig dissosiere iPSCs inn i en enkeltcellesuspensjon ennd for å fordele dem nøyaktig og jevnt fordelt til hver brønn av 96-brønners plate. Rho-assosiert protein kinase inhibitor (Y-27632) må det tilsettes til mediet B i løpet av de første 24 timer, da den understøtter overlevelsen av iPSCs på deres dissosiasjon til enkeltceller. Det er viktig å få celler i nær kontakt med hverandre ved å spinne dem ned til bunnen av brønnene. Når neurosfærer er dannet ved slutten av trinn 1, kan en vellykket gjennomføring av ytterligere eksperimentelle prosedyrer forventes. I tilfelle neurosfærer ikke danner, den pluripotency av de humane iPSCs, må den ikke-adhesjon av cellene i 96-brønners plate, og sentrifuge betingelsene kontrolleres. Hele prosedyren på dag 0 i trinn 1 bør ikke ta mer enn 1 time på grunn av følsomheten av humane iPSCs. Medium endringer i løpet av de neste dagene må gjøres forsiktig, unngå rene krefter, for ikke å ødelegge nydannede celler kontakter mellom cellene.
Det er bemerkelsesverdig at centrosomal mutanter defekte celleproliferasjon og endret cellesyklus dynamikk. Således modellering MCPH krever en kraftig protokoll som kan motstå de kompromitterte cellulære funksjoner. Derfor lar strømmen protokoll for frembringelse av homogene organoids av høy kvalitet, og tjener som et unikt verktøy for å studere stamcelle homeostase ved VZ. I motsetning til andre protokoller, gjør denne protokollen generering av organoids fra kontroll- og pasient iPSCs, ved å starte med lik celleantall. For studier basert på in vitro differensiering, identiske dyrkningsbetingelser for forskjellige iPSCs er en grunnleggende forutsetning for å identifisere sykdomsrelaterte forandringer og for å unngå kultur-tilstand gjenstander. I tillegg til å modellere microcephaly av genetisk opprinnelse, kan denne protokollen også anvendes på microcephaly av ikke-genetisk opprinnelse, inkludert fra neurotrofiske virale infeksjoner, kjemikalier eller stråling. 30 I tillegg har moderne molekylærbiologi verktøy, for eksempel CRISPR / Cas9 genom-editing teknologi, kan anvendes på 3D-organoids å dissekere spesifikke aspekter av den menneskelige hjerne utvikling paradigme in vitro 31, 32, 33.
På den annen side har den generasjonen av hjerne organoids hittil fortsatt ikke gått utover den første og begynnelsen av andre trimester av menneskelig utvikling 34. Overgår denne begrensning, og muliggjør dannelsen av moden hjerne organoids in vitro vil åpne nye veier for å modellere neurodegenerative forstyrrelser som manifesterer ved senere trinn, som for eksempel Parkinsons eller Alzheimers sykdom. For fremtidige anvendelser, protokoller dirigere differensiering til mer spesifikke regioner, som forhjernen eller midthjernen, kan det være av interesse å studere komplekse neurologiske lidelser som autisme og schizofreni 35, 36, 37, 38.
Viktigere, bør visse aspekter tas i betraktning når trekke konklusjoner fra organoid studier. Den første begrensningen er at det ikke er noen åpenbar vaskularisering i organoids. Således gassformig utveksling, tilførselen av næringsstoffer in vitro bare tilnærmet in vivo-betingelser. For det andre, fordi hjernen organoids ikke er koblet til komplekse organsystemer, mangler organoid modellen en fullstendig immune, metabolske, og hormonsystemet. Likevel, fravær av disse aspektene gir noen ganger en fordel. For eksempel kan de organoids som er beskrevet her erstatte immunoundertrykket in vivo-modeller når adressering virkningen av immunsystemet i patogenesen av hjernelidelser.
Med bruk av spinnerflasker, kan et stort antall organoids genereres for biokjemiske forsøk, hel transcriptome sekvensanalyse, og high-throughput medikamentscreeninger. Til sammen ved usynge denne strøm protokollen, kan man generere hjerne organoids fra humane iPSCs celler, som deretter kan anvendes i et bredt spekter av applikasjoner, fra sykdom modellering til stoffet test plattformer, for å på en pålitelig måte erstatte dyreforsøk i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Fritz Thyssen Foundation (Az.10.14.2.152). Vi er takknemlige til vevet embedding anlegget og mikroskop kjernen innretningen av CMMC. Vi er takknemlige for diskusjonene og teknisk støtte fra medlemmer av Laboratorium for sentrosomen og Cytoskjelett biologi. Vi takker Li Ming Gooi for korrekturlesing av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse 488 | Invitrogen | A-11001 | Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
| Anti-rabbit 647 | Invitrogen | A-21245 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 |
| Arl13b | proteintech | 17711-1-AP | ARL13B rabbit polyclonal antibody |
| CELLSPIN system | IBS Integra Bioscience | 183001 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, US | 32670 | 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| DMEM/F-12 | Gibco, US | 31331093 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 |
| Dorsomorphin | Sigma-Aldrich, US | P5499 | Compound C; multiple suppliers |
| Embedding medium | AppliChem | A9011, 0100 | Mowiol; embedding medium; multiple suppliers |
| Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix | Corning | 354277 | Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified |
| Fish gelatin | Sigma-Aldrich, US | G7765-250ML | Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4 °C |
| Glycine | AppliChem | A1067,1000 | Glycine for molecular biology; multiple suppliers |
| Inoculation loop with needle, disposable (1 µL) | Sigma Aldrich, US | BR452201-1000EA | multiple suppliers |
| Insulin | Sigma-Aldrich, US | I3536-100MG | multiple suppliers |
| L-glutamine | Gibco, US | 25030081 | L-glutamine (200 mM) |
| Medium A | Stem cell technologies | #05850 | mTeSR1 (hiPSC medium) |
| Medium B | Stem cell technologies | #05835 | Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium |
| Medium C | Gibco, US | 21103049 | Neural Basal Medium |
| MEM | Gibco, US | 11140035 | MEM non-essential amino acids solution (100x) |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza, Switzerland | #LT07-218 | Mycoplasma detection kit; multiple suppliers |
| Nestin | Novus biologicals | NBP1-92717 | Nestin mouse monoclonal antibody (4D11) |
| Paraformaldehyde (PFA) | AppliChem | A3813, 0500 | 4% in PBS, store solution at -20 °C; caution: wear skin and eye protection and work under hood |
| PBS tablets | Gibco, US | 18912014 | See manufacturer´s instructions; multiple suppliers |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL) | Gibco, US | 15140122 | Multiple suppliers |
| Poly-L-lysine solution (PLL) | Sigma-Aldrich, US | P8920-100ML | Multiple suppliers |
| pVim | MBL | D076-3S | Phospho-Vimentin (Ser55) mAb |
| Reagent A | Stem cell technologies | # 05872 | Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available |
| Reagent B | Sigma-Aldrich, US | A6964-100ML | Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution” |
| Research Cryostat Leica CM3050 S | Leica biosystems | CM3050 S | Multiple suppliers |
| SB431542 | Selleckchem.com | S1067 | Multiple suppliers |
| Spinner flask 250 mL | IBS Integra Bioscience | 182026 | |
| Sucrose | AppliChem | A4734, 1000 | Multiple suppliers |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo scientific, US | J3800AMNZ | Slides should be labeled with a "+" and positively charged |
| Supplement 1 | Gibco, US | 17502048 | N-2 supplement (100x) |
| Supplement 2 w/o Vitamin A | Gibco, US | 12587010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, NL | 4565 | Multiple suppliers |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura, NL | 4583 | Multiple suppliers |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388,0500 | Multiple suppliers |
| TUJ1 | Sigma-Aldrich, US | T2200 | β-Tubulin III (rabbit polyclonal) |
| TUNEL assay | Promega, US | G3250 | DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers |
| Tween 20 for molecular biology | AppliChem | A4974,0500 | Multiple suppliers |
| waterproof sheet | BEMIS company, inc. | PM996 | Parafilm “M”; multiple suppliers |
| Y-27632 | Selleckchem.com | S1049 | ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers |
| β-mercaptoethanol | Gibco, US | 31350010 | 2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers |
References
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, 373-379 (2013).
- Eiraku, M., Sasai, Y. Mouse embryonic stem cell culture for generation of three-dimensional retinal and cortical tissues. Nat Protoc. 7, 69-79 (2012).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35 (8), 803-819 (2016).
- Al-Dosari, M. S., Shaheen, R., Colak, D., Alkuraya, F. S. Novel CENPJ mutation causes Seckel syndrome. J Med Genet. 47, 411-414 (2010).
- Wollnik, B. A common mechanism for microcephaly. Nat Genet. 42, 923-924 (2010).
- Thornton, G. K., Woods, C. G. Primary microcephaly: do all roads lead to Rome? Trends Genet. 25, 501-510 (2009).
- Barbelanne, M., Tsang, W. Y. Molecular and cellular basis of autosomal recessive primary microcephaly. Biomed Res Int. 2014, 547986 (2014).
- Homem, C. C., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nat. Rev. Neurosci. 16, 647-659 (2015).
- Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35, 803-819 (2016).
- Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. , (2012).
- Morizane, A., Doi, D., Kikuchi, T., Nishimura, K., Takahashi, J. Small-molecule inhibitors of bone morphogenic protein and activin/nodal signals promote highly efficient neural induction from human pluripotent stem cells. J. Neurosci. Res. 89, 117-126 (2011).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).
- Zhou, J., et al. High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors. Stem Cells. 28, 1741-1750 (2010).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8, 409-412 (2011).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
- Bai, Q., et al. Temporal analysis of genome alterations induced by single-cell passaging in human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 24, 653-662 (2015).
- Garitaonandia, I., et al. Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions. PLoS One. 10, e0118307 (2015).
- Ohnuma, K., et al. Enzyme-free passage of human pluripotent stem cells by controlling divalent cations. Sci. Rep. 4, 4646 (2014).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. J Vis Exp. , (2007).
- Yingling, J., et al. Neuroepithelial stem cell proliferation requires LIS1 for precise spindle orientation and symmetric division. Cell. 132, 474-486 (2008).
- Rakic, P. A small step for the cell, a giant leap for mankind: a hypothesis of neocortical expansion during evolution. Trends Neurosci. 18, 383-388 (1995).
- Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 4335-4340 (2010).
- Wilson, P. G., Stice, S. S. Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells. Stem Cell Reviews. 2, 67-77 (2006).
- Dhara, S. K., Stice, S. L. Neural differentiation of human embryonic stem cells. J. Cell Biochem. 105, 633-640 (2008).
- Christie, V. B., et al. Synthesis and evaluation of synthetic retinoid derivatives as inducers of stem cell differentiation. Org Biomol Chem. 6, 3497-3507 (2008).
- Kim, D. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Reviews. 6, 270-281 (2010).
- Gabriel, E., et al. Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids. Cell stem cell. , (2017).
- Wu, J., Hunt, S. D., Xue, H., Liu, Y., Darabi, R. Generation and Characterization of a MYF5 Reporter Human iPS Cell Line Using CRISPR/Cas9 Mediated Homologous Recombination. Sci. Rep. 6, 18759 (2016).
- Li, H. L., Gee, P., Ishida, K., Hotta, A. Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR-Cas9 system. Methods. 101, 27-35 (2016).
- Grobarczyk, B., Franco, B., Hanon, K., Malgrange, B. Generation of Isogenic Human iPS Cell Line Precisely Corrected by Genome Editing Using the CRISPR/Cas9 System. Stem Cell Reviews. 11, 774-787 (2015).
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 15672-15677 (2015).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165, 1238-1254 (2016).
- Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19, 248-257 (2016).
- Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
- D'Avanzo, C., et al. Alzheimer's in 3D culture: challenges and perspectives. Bioessays. 37, 1139-1148 (2015).
