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Developmental Biology

IPSC व्युत्पन्न मानव मस्तिष्क Organoids की पीढ़ी जल्दी neurodevelopmental विकार मॉडल

Published: April 14, 2017 doi: 10.3791/55372
Automatic Translation
1, 1,2
1Center for Molecular Medicine Cologne, University of Cologne, 2Institute for Biochemistry I, Medical School of University of Cologne

Introduction

इस तरह के microcephaly के रूप में मानव neurodevelopmental विकार,, केवल खराब तथ्य यह है कि मानव मस्तिष्क एक विस्तारित cortical सतह, गैर मानव पशु से भिन्न एक अनूठी विशेषता है की वजह से पशु मॉडल में अध्ययन किया जा सकता।

इस पहलू मानव मस्तिष्क के विकास एक जटिल प्रक्रिया है कि पर्याप्त एक 2D में अध्ययन किया जा सकता है, इन विट्रो सेल संस्कृति प्रणाली में बनाता है। उभरते 3 डी कल्चर तकनीक प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs) से ऊतक की तरह organoids की पीढ़ी अनुमति देते हैं। एक 3 डी निलंबन संस्कृति में स्टेम सेल की इन विट्रो भेदभाव एक संगठित, स्तरीकृत ऊतक 1, 2, 3 को जन्म दे रही है, एक समय पर और क्षेत्र विशेष ढंग से विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के गठन की अनुमति देता है। प्रयोगशालाओं कि 3 डी संस्कृति प्रौद्योगिकियों का बीड़ा उठाया है और अंग गठन की जटिलता demystified, स्टेम सेल से शुरू करने के लिए धन्यवाद,हम मानव मस्तिष्क के विकास के प्रारंभिक घटनाओं को चित्रित करने और इन विट्रो 1, 2, 3 में microcephaly मॉडल करने के लिए मस्तिष्क organoids पैदा करने में एक मजबूत पद्धति विकसित की। यह हम अनुकूलित कि लैंकेस्टर एट अल द्वारा विकसित मूल विधि से उल्लेखनीय है। मस्तिष्क organoids 1 उत्पन्न करने के लिए। इस विधि हमारे प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार संशोधित किया गया था।

गेब्रियल एट अल से एक अध्ययन का उद्देश्य। मस्तिष्क के विकास के दौरान तंत्रिका स्टेम कोशिका रखरखाव के सेलुलर और आणविक तंत्र का विश्लेषण किया गया। ऐसा करने के लिए, एक यंत्रवत अध्ययन 3 डी मस्तिष्क organoids एक microcephaly रोगी 4 से व्युत्पन्न में तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (NPCs) का विश्लेषण करके किया गया था। इस मरीज CPAP, एक संरक्षित centrosomal प्रोटीन सेंट्रोसोम जीवजनन 5 के लिए आवश्यक में एक उत्परिवर्तन ले गए। एक व्यापक रूप से स्वीकार हाइपोथीसिस कि microcephaly एनपीसी पूल की कमी का परिणाम है, और इस या तो कोशिका मृत्यु के लिए या समय से पहले भेदभाव 1, 6, 7, 8, 9 की वजह से हो सकता है।

Microcephaly मस्तिष्क organoids की वेंट्रिकुलर क्षेत्र (VZs) का विश्लेषण करके, यह दिखाया गया था कि NPCs के एक महत्वपूर्ण संख्या विषम कोशिका विभाजन से गुजरना, मस्तिष्क organoids एक स्वस्थ दाता 4 से व्युत्पन्न के विपरीत है। Microcephalic मस्तिष्क organoids के व्यापक सूक्ष्म और जैव रासायनिक विश्लेषण के समय पर सिलिया disassembly 4 में CPAP के लिए एक अप्रत्याशित भूमिका का पता चला। विशेष रूप से, उत्परिवर्तित CPAP मंद पपनी disassembly और देरी कोशिका चक्र पुनः प्रवेश साथ जुड़ा हुआ है, NPCs 4 के समय से पहले भेदभाव के लिए अग्रणी। इन परिणामों microcephaly और वें में सिलिया के लिए एक भूमिका का सुझावन्यूरोजेनेसिस और मस्तिष्क के आकार नियंत्रण 10 के दौरान eir भागीदारी।

इस प्रोटोकॉल के पहले भाग समरूप मस्तिष्क organoids उत्पन्न करने के लिए तीन चरणों की विधि का वर्णन है। जैसा कि पहले उल्लेख किया है, मूल लैंकेस्टर प्रोटोकॉल अनुकूलित और हमारे उद्देश्य 1 सूट करने के लिए संशोधित किया गया था। सबसे पहले, मानव IPSCs Engelbreth-होल्म-झुंड (EHS) मैट्रिक्स पर एक परिभाषित फीडर मुक्त हालत में सुसंस्कृत हैं। यह कदम फीडर पर निर्भर स्टेम कोशिका संवर्धन के रूपांतरों बचा जाता है। इस प्रोटोकॉल में, तंत्रिका भेदभाव के शामिल होने तंत्रिका उपकला IPSCs से सीधे शुरू होता है के रूप में। embryoid शरीर (ईबी) गठन के कदम, एक और अधिक नियंत्रित और निर्देशित ढंग से तंत्रिका भेदभाव आय को छोड़ने पर। यह दृष्टिकोण अन्य जनन कोशिका परतों, इस तरह के मेसोडर्म और अन्तः के रूप में की सहज और अनिर्दिष्ट गठन सीमित करता है। इस प्रोटोकॉल को लागू करके, तंत्रिका rosettes युक्त neurospheres एह के लिए 5 दिन पर काटा जा सकता हैएस मैट्रिक्स एम्बेडिंग और स्थिर निलंबन संस्कृति। organoid हमारे प्रोटोकॉल के तीसरे चरण के लिए इस्तेमाल किया मध्यम dorsomorphin और SB431542 के साथ पूरक है। Dorsomorphin हड्डी morphogenic प्रोटीन (बीएमपी) के एक छोटे अणु अवरोध करनेवाला है, और SB431542 TGFβ / activin / नोडल संकेतन मार्ग को रोकता है। इन कारकों का संयोजन तंत्रिका भेदभाव और अधिक कुशलता से की तुलना में अकेले 11, 12, 13, 14 रेटिनोइक एसिड को बढ़ावा देने के कर सकते हैं।

कुल मिलाकर, इन संशोधनों organoids भर में कम से कम बदलाव के साथ, मस्तिष्क organoids की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पीढ़ी सक्षम करें। महत्वपूर्ण रूप से, इस विधि मजबूती के साथ रोगी IPSCs, जो जीन है कि तारक काय और सेल चक्र की गतिशीलता को प्रभावित में परिवर्तन ले जाने से microcephalic मस्तिष्क organoids उत्पन्न करने के लिए लागू किया गया था।

इस प्रोटोकॉल के दूसरे भाग br तैयार करने के लिए निर्देश देता हैऐन विश्लेषण और microcephaly में सेलुलर दोषों की व्याख्या के लिए organoids। यह निर्धारण, cryosectioning, immunofluorescent धुंधला, और कोंफोकल सूक्ष्म विश्लेषण भी शामिल है। यह प्रोटोकॉल अपेक्षित परिणाम का विस्तृत विवरण के साथ और व्याख्या के लिए मार्गदर्शन के साथ पाठक प्रदान करेगा।

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Protocol

1. मस्तिष्क Organoids की पीढ़ी (23 दिन)

  1. Neuroectoderm की शुरूआत (5 दिन)
    ध्यान दें: निम्नलिखित बातों भेदभाव की शुरुआत से पहले विचार किया जाना चाहिए। Reprogramming विधि (lentiviral-, सेंडाइ-वायरस, episomal-, या माइक्रो RNA आधारित आदि) मानव IPSCs प्राप्त करने के लिए आदर्श सभी रोगी के लिए एक ही हो सकता है और IPSC लाइनों को नियंत्रित करना चाहिए। विभिन्न reprogramming किट और प्रकाशित प्रोटोकॉल पर आधारित निर्देश उपलब्ध 15, 16, 17, 18 है। मानव IPSC लाइनों की गुणवत्ता एक इष्टतम भेदभाव को पूरा करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक खुर्दबीन के साथ कॉलोनी और सेल आकृति विज्ञान पर नज़र रखें और इस तरह के Oct3 / 4, Nanog, या टीआरए-1-60 के रूप में मार्कर की अभिव्यक्ति का परीक्षण करके pluripotency को मान्य।
    1. संस्कृति मानव Engelbreth-होल्म-झुंड के साथ लेपित एक डिश पर मध्यम ए में फीडर से मुक्त शर्तों के तहत IPSCs(EHS) मैट्रिक्स।
      नोट: मानव IPSCs बढ़ो फीडर से मुक्त और सीरम मुक्त एक परिभाषित संस्कृति हालत बनाए रखने के लिए और भेदभाव की शुरुआत से पहले माउस भ्रूण फीडर कोशिकाओं (MEFs) को हटाने के लिए एक अतिरिक्त कदम से बचने के लिए। मानव IPSCs के लिए इष्टतम मार्ग संख्या भेदभाव पर्वतमाला कुल में पारित होने से 70 reprogramming पर पारित होने के 15 से शुरू करने के लिए। जब passaging, hiPSC कालोनियों कोशिकाओं के रूप में कम यांत्रिक तनाव के साथ एक उपयुक्त सेल टुकड़ी समाधान और एक 2 एमएल सीरम वैज्ञानिक विंदुक का उपयोग कर कुल एक नया पकवान के समुच्चय हस्तांतरण करने के लिए अलग। एकल कक्षों के लिए पृथक्करण से बचें, के रूप में यह सबसे IPSC लाइनों में भेदभाव और apoptosis उत्पन्न हो सकता है। यह बताया गया कि लंबे समय तक, एकल कोशिका passaging मानव IPSCs 19, 20 में जीनोमिक परिवर्तन बढ़ा सकता है। सेल टुकड़ी प्रक्रियाओं, जो, सेना की टुकड़ी समाधान निकालने के लिए के रूप में इस IPSCs के समग्र व्यवहार्यता कम कर देता है एक centrifugation कदम की आवश्यकता से बचें। परीक्षणमाइक्रोबियल संदूषण, विशेष रूप से माइकोप्लाज़्मा, एक नियमित आधार पर, के लिए सभी संस्कृतियों, क्योंकि इस IPSCs की गुणवत्ता और उनके भेदभाव क्षमता में परिवर्तन हो सकता है।
      1. कोट निर्माता के निर्देशों के अनुसार EHS मैट्रिक्स के साथ एक 60 मिमी टिशू कल्चर पकवान।
      2. 1 x 10 6 मानव IPSCs के एक विभाज्य पिघलना। 60 मिमी टिशू कल्चर EHS मैट्रिक्स में लिपटे और मध्यम एक 5 एमएल (देखें सामग्री तालिका) युक्त डिश में IPSCs बीज। 5 से 7 दिनों के बाद मध्यम दैनिक और पारित होने के बदले जब कोशिकाओं तक पहुँचने ~ 80% confluency।
        नोट: पैसेज भेदभाव शुरू करने से पहले, इस तरह के कालोनियों 21 के एंजाइम मुक्त टुकड़ी के रूप में मानक तरीकों का उपयोग करते हुए कम से कम एक बार 80% confluency पर thawed IPSCs। निर्माता की निम्नलिखित पोषक तत्व मिश्रण F12 (DMEM / F12), और सेते IPSCs: संक्षेप में,, IPSC मध्यम हटाने पूर्व गर्म 37 डिग्री सेल्सियस Dulbecco संशोधित ईगल के माध्यम से एक बार कोशिकाओं को धोनेअभिकर्मक एक का उपयोग कर निर्देश (सामग्री तालिका देखें)। आदेश एकल कोशिकाओं को पृथक्करण से बचने के लिए सिफारिश की ऊष्मायन समय अधिक नहीं है। मानव IPSCs अलग किया जाना चाहिए और समुच्चय, एकल के रूप में नहीं कोशिकाओं के रूप में तैर रही है। वे तो नई EHS मैट्रिक्स में लिपटे बर्तन में स्थानांतरित किया जा सकता है; उदाहरण के लिए, IPSC एकत्रित करता है जिसकी एक 60 मिमी पकवान से 4 नए 60 मिमी व्यंजन को वितरित किया जा सकता है।
      3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक माइकोप्लाज़्मा का पता लगाने किट के साथ माइकोप्लाज़्मा लिए जाँच करें। केवल माइकोप्लाज़्मा मुक्त IPSCs का उपयोग करें, के रूप में माइकोप्लाज़्मा IPSCs के भेदभाव क्षमता बदल सकते हैं।
    2. अलग कर देना IPSCs (80% संगामी) और अभिकर्मक बी का उपयोग कर एक एकल कोशिका निलंबन तैयार
      1. पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) DMEM / F12 के साथ एक बार IPSCs धो लें।
      2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट और 5% सीओ 2 के लिए (एक 60 मिमी डिश में जैसे, 1 एमएल) पूर्व गर्म अभिकर्मक बी जोड़ें और IPSCs सेते हैं।
      3. फ़्लिक 20 पक्ष और के तल पर एक उंगलियों के साथ बारपकवान IPSCs अलग करने। खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की टुकड़ी के लिए जाँच करें।
      4. एक 1 एमएल micropipette के साथ डिश में ऊपर और नीचे सेल निलंबन विंदुक 5 बार।
      5. मध्यम एक के 3 एमएल अभिकर्मक बी के 1 एमएल पतला और 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में सेल निलंबन इकट्ठा करने के लिए जोड़ें।
      6. धीरे कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए IPSCs (500 XG) नीचे स्पिन।
      7. मध्यम बी के 1 एमएल में सेल गोली Resuspend और एक hemocytometer साथ सेल संख्या की गणना।
        नोट: मेजबान के लिए केवल मध्यम बी का उपयोग कर के प्रति सचेत रहें। , मध्यम एक का उपयोग कर के रूप में यह bFGF के एक भी उच्च एकाग्रता है, जो भेदभाव को बाधित कर सकते हैं शामिल करने से बचें।
    3. मध्यम बी में एमएल प्रति 4.5 x 10 5 कोशिकाओं 10 माइक्रोन रो जुड़े प्रोटीन kinase अवरोध करनेवाला (वाई 27,632) के साथ पूरक करने के लिए सेल निलंबन पतला।
    4. अच्छी तरह से प्रति 100 μL एक गैर पक्षपाती, वी-नीचे, 96-अच्छी तरह थाली में जोड़ें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को समान रूप से sus में वितरित कर रहे100 μL अंश बाहर लेने से पहले ट्यूब हर बार मिलाने से पेंशन। यह महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक अच्छी तरह से आदेश के आकार और आकृति (गोल, परिभाषित सतहों) में समरूप neurospheres प्राप्त करने के लिए एक बराबर सेल नंबर शामिल करना चाहिए।
    5. धीरे नीचे 3 मिनट के लिए 500 XG और कमरे के तापमान पर कोशिकाओं के साथ थाली स्पिन और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में सेते हैं।
    6. 50 μL को दूर करने और अगले 5 दिनों के लिए प्रत्येक कुएं में ताजा मध्यम बी के 50 μL जोड़कर दैनिक मध्यम बदलें।

2. EHS मैट्रिक्स में एम्बेडिंग Neurospheres (4 दिन)

  1. (बिना 100 (v / v) के पूरक 2 w /: 1:: 200 (v / v) पूरक 1, 1: DMEM / F12 और मध्यम सी (v / v), 1 का 1 मिश्रण निम्नलिखित मिश्रण से neurosphere मध्यम तैयार करें ओ) विटामिन ए, 1: 100 एल glutamine, 0.05 मिमी गैर आवश्यक अमीनो एसिड (सदस्य), 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1.6 ग्राम / एल इंसुलिन, और 0.05 मिमी β-mercaptoethanol।
  2. neurospheres बुद्धि इकट्ठाहा 200 μL एक ~ 2 मिमी टिप का उपयोग कर micropipette पहले से बाँझ कैंची से काट दिया।
  3. एक खाली 100 मिमी डिश में लगभग 5 मिमी पैराफिन फिल्म (3 x 3 सेमी 2) पर एक दूसरे से दूर neurospheres रखें और ध्यान से संभव के रूप में शेष माध्यम के रूप में ज्यादा हटा दें।
  4. EHS मैट्रिक्स की एक बूंद (7 μL) प्रत्येक एकल neurosphere पर जोड़ें।
  5. सेते EHS मैट्रिक्स एक इनक्यूबेटर में 15 मिनट के लिए neurospheres के साथ चला जाता है।
  6. उन्हें neurosphere माध्यम के साथ निस्तब्धता द्वारा तेल फिल्म से ध्यान से neurospheres धो लें। फ्लश करने के लिए, 1 मिलीलीटर micropipette और एक नया 100 म पेट्रि neurosphere माध्यम के 10 एमएल युक्त पकवान का उपयोग करें।
  7. अगले 4 दिनों के लिए neurospheres सेते हैं और 2 दिन पर ताजा neurosphere माध्यम की 2 एमएल जोड़ें।
    ध्यान दें: यह सुनिश्चित करें कि इनक्यूबेटर में अलमारियों फ्लैट ताकि EHS मैट्रिक्स एम्बेडेड neurospheres पकवान के एक तरफ पेड़ों का झुरमुट नहीं होगा रहे हैं।

3. एक रोटरी सस्पेंशन में Organoidsसंस्कृति (14 दिन)

  1. 1: 200 (वी / वी) के पूरक 1, 1: 100 (v / v) के पूरक 2 w / ओ DMEM / F12 और मध्यम सी (v / v), 1 का 1 मिश्रण निम्नलिखित मिश्रण से मस्तिष्क organoid मध्यम तैयार करें विटामिन ए, 1: 100 एल glutamine, 0.05 मिमी सदस्य, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1.6 ग्राम / एल इंसुलिन, 0.5 सुक्ष्ममापी dorsomorphin, 5 माइक्रोन SB431542, और 0.05 मिमी β-mercaptoethanol।
  2. अपने पक्ष हथियारों के माध्यम से एक स्पिनर कुप्पी के लिए मस्तिष्क organoid माध्यम की 100 एमएल जोड़ें और कम से कम 20 मिनट के लिए पूर्व वार्मिंग के लिए एक इनक्यूबेटर में रख दें।
  3. 25 rpm पर एक भावप्रवण कार्यक्रम स्थापित, निर्माता के निर्देशों के अनुसार।
    नोट: स्पिनर बोतल में EHS मैट्रिक्स एम्बेडेड neurospheres स्थानांतरित करने से पहले, यह सुनिश्चित करें कि वे सब अलग हो रहे हैं। दो या अधिक EHS मैट्रिक्स के माध्यम से जुड़े हुए हैं, उन्हें एक छुरी के साथ जोड़ने मैट्रिक्स कटौती करके अलग।
  4. ध्यान से स्पिनर organoid माध्यम की 100 एमएल युक्त बोतल में EHS मैट्रिक्स एम्बेडेड neurospheres हस्तांतरण हमेंएक 2 एमएल सीरम वैज्ञानिक विंदुक ing। फ्लास्क में neurospheres हस्तांतरण करने के लिए स्पिनर कुप्पी की ओर हथियारों का प्रयोग करें।
  5. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर एक इनक्यूबेटर में एक चुंबकीय सरगर्मी मंच पर स्पिनर बोतल रखें इस organoid संस्कृति के 0 दिन है।
  6. (या अधिक बार एक रंग परिवर्तन होता है जब) मध्यम के आधे को दूर करने और ताजा माध्यम की एक ही राशि जोड़कर प्रति सप्ताह एक बार मध्यम बदलें।
    नोट: जब इनक्यूबेटर से बाहर स्पिनर बोतल ले, organoids कुप्पी के निचले भाग तक डूब जाने के लिए 3-5 मिनट तक प्रतीक्षा करें। द्रव की सतह पर कांच विंदुक टिप (एक पंप से जुड़े) रखकर मध्यम निकालें; ध्यान से एक तरफ खोलने / कुप्पी की शाखा के माध्यम से मध्यम aspirate। इन जोड़तोड़ लामिना हुड के तहत किया जाना चाहिए।

4. मस्तिष्क Organoids का विश्लेषण

  1. Organoids का निर्धारण
    1. स्पिनर कुप्पी संस्कृति वाई के 14 दिन पर organoids इकट्ठाएक कट 1 मिलीलीटर micropipette (कट ~ 5 मिमी) वें। एक 60 मिमी डिश में उन सभी को रखो और 3 मिनट के लिए गर्म DMEM / F12 5 एमएल के साथ उन्हें एक बार धोएं।
    2. गर्म 4% paraformaldehyde के 500 μL (पीएफए) के साथ एक 1.5 एमएल ट्यूब तैयार करें।
      सावधानी: एक सुरक्षा हुड के नीचे त्वचा और आंखों की सुरक्षा के लिए और काम पहनें जब पीएफए ​​बंधक से निपटने।
    3. प्रत्येक को अलग से प्रत्येक ट्यूब में और organoid उन्हें कमरे के तापमान पर कम से कम 30 मिनट के लिए ठीक रखें। से अधिक समय के 60 मिनट के लिए organoids ठीक नहीं करें। organoids जाने के लिए, एक टीका पाश या किसी अन्य वसीयत कि सुविधाजनक है का उपयोग करें।
    4. पीएफए ​​निकालें और पीबीएस के 1 एमएल के साथ 10 मिनट के प्रत्येक के लिए दो बार तय organoids धोएं।
    5. अप करने के लिए 7 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस के 1 एमएल में organoids स्टोर, आगे उपयोग तक।
  2. Cryosectioning के लिए organoids एम्बेड
    1. पीबीएस निकालें और ट्यूब उन्हें cryofreezing से पहले organoids निर्जलीकरण के प्रति आसुत जल समाधान में 30% sucrose के 1 एमएल जोड़ने; sucro जोड़ने के बादसे समाधान, organoids सतह पर तैर रही किया जाना चाहिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर सुक्रोज समाधान में रात भर organoids स्टोर; अगले दिन से, organoids ट्यूब के नीचे करने के लिए नीचे डूब जाना चाहिए था।
      नोट: Organoids, सुक्रोज समाधान में 4 डिग्री सेल्सियस पर 3-5 दिनों के लिए भंडारित किया जा सकता यदि आवश्यक हो तो।
    2. इष्टतम काटने तापमान (OCT) परिसर के 400 μL के साथ एक विनाइल नमूना ढालना भरें और एक टीका पाश का उपयोग ढालना के केंद्र में एक organoid जगह। नमूना नाम के साथ मोल्ड के रिम लेबल करें।
    3. cryosectioning जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर organoid युक्त ढालना फ्रीज।
    4. और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए पीबीएस में 0.1% पाली एल-लाइसिन समाधान (पीएलएल) के साथ कोट गिलास cryoslides स्लाइड चलो 3 घंटे के लिए सूखी। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड स्टोर और उपयोग करने से पहले कमरे के शीतोष्ण करने के लिए उन्हें गर्म।
      नोट: पीएलएल कोटिंग, एक महत्वपूर्ण कदम है के रूप में यह दूर चल से organoid स्लाइस कर पाएगा। एकत्र करें और 3 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान पीएलएल समाधानमहीने। पुन: उपयोग करने से पहले, एक 0.22-सुक्ष्ममापी सिरिंज के साथ फिल्टर करने और यह कमरे के तापमान को गर्म करते हैं।
    5. पीएलएल में लिपटे कांच पर 20-50 सुक्ष्ममापी मोटी स्लाइस में धारा cryofrozen organoids 22 cryoslides। वर्गों के साथ स्लाइड कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सूखी हैं। -80 डिग्री सेल्सियस आगे की प्रक्रिया जब तक पर वर्गों की दुकान।

5. organoid अनुभागों का Immunofluorescent धुंधला

नोट: organoids के सामान्य लक्षण वर्णन, nestin, एक तंत्रिका पूर्वज मार्कर, और TUJ1 एक अखिल neuronal मार्कर के साथ धुंधला के लिए, की सिफारिश की है। अतिरिक्त उदाहरण, phospho-vimentin (पी विम) है, जो mitotic शिखर रेडियल glial कोशिकाओं लेबल, और Arl13b साथ immunofluorescent धुंधला के रूप में, पपनी के लिए, वर्णित हैं। apoptosis परीक्षण करने के लिए, टर्मिनल deoxynucleotidyl ट्रांसफेरेज़ (TdT) dUTP निक अंत लेबलिंग (TUNEL) परख का उपयोग करें। incubations के दौरान एक प्लास्टिक बॉक्स में स्लाइड जगह उन्हें धूल से बचाने के लिए, प्रकाश,और बाहर सुखाने।

  1. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए स्लाइड पिघलना।
  2. पीएफए ​​प्रेरित autofluorescence बुझाने के लिए 3 मिनट के लिए पीबीएस-ग्लाइसिन के 200 μL (पीबीएस में ग्लाइसिन की 0.225 ग्राम) के साथ दो बार स्लाइड धो लें।
  3. 0.5% ट्राइटन X100 के 200 μL / कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पीबीएस समाधान में 0.1% ट्वीन साथ वर्गों Permeabilize।
  4. उन्हें 3 मिनट के लिए पीबीएस-ग्लाइसिन समाधान के 200 μL के साथ दो बार धोएं।
  5. unspecific एंटीजन बाइंडिंग ब्लॉक करने के लिए कमरे के तापमान पर या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए पीबीएस में 0.5% मछली जिलेटिन की 200 μL / 0.1% ट्राइटन X100 के साथ उन्हें सेते हैं।
    नोट: एक TUNEL के परख की आवश्यकता है, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार परख प्रदर्शन करते हैं। , Immunostaining प्रदर्शन यह माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ हस्तक्षेप और जब बाद में इस्तेमाल किया fluorophores बुझाने सकता है के रूप में पहले TUNEL के परख साथ शुरू करो।
  6. nestin, 1: निम्नलिखित सांद्रता में समाधान को रोकने में एंटीबॉडी पतला 200; पी-विम, 1: 500; TUJ1, 1: 200;Arl13b, 1:20; और माध्यमिक एंटीबॉडी, 1: 1,000।
  7. 200 कमरे के तापमान पर या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 घंटे के लिए पहले प्राथमिक एंटीबॉडी के μL (जैसे, nestin) के साथ सेते हैं।
  8. समाधान अवरुद्ध के 200 μL से धोएं 3 x 3 मिनट।
  9. समाधान को रोकने में 1,000 और कमरे के तापमान पर 1-2 घंटे के लिए 200 μL में स्लाइड सेते हैं: पहला (विरोधी माउस 488) माध्यमिक एंटीबॉडी 1 पतला। अब से, हमेशा प्रकाश से स्लाइड की रक्षा करना।
  10. समाधान अवरुद्ध के 200 μL से धोएं 3 x 3 मिनट।
  11. कमरे के तापमान पर 1-2 घंटे या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अगले प्राथमिक एंटीबॉडी के 200 μL (जैसे, TUJ1) के साथ सेते हैं।
  12. समाधान अवरुद्ध के 200 μL से धोएं 3 x 3 मिनट।
  13. अगले माध्यमिक एंटीबॉडी (विरोधी खरगोश 647) के 200 μL कमरे के तापमान पर 1-2 घंटे के लिए जोड़ें।
  14. धो 3 x 3 मिनट। समाधान अवरुद्ध के 200 μL के साथ।
  15. 4 के 200 μL ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) एक 30 एनएम सान्द्र में जोड़ेंपरमाणु धुंधला के लिए कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए पीबीएस में entration।
  16. समाधान अवरुद्ध के 200 μL से धोएं 2 एक्स 3 मिनट।
  17. आसुत जल के 200 μL के साथ 1 x 1 मिनट धो लें और वर्गों, 10-20 मिनट के लिए सूखी जब तक कोई स्पष्ट पानी की बूंद किसी भी अधिक दिखाई देता।
  18. मध्यम embedding के साथ वर्गों माउंट करें। उन्हें कई सप्ताह लग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से संरक्षित दुकान।
  19. छवि के लिए सूक्ष्म विश्लेषण organoid, निलय क्षेत्र, आदिम cortical थाली, और ब्याज के अन्य क्षेत्रों के एक सिंहावलोकन के साथ आगे बढ़ें।
  20. एक 63x तेल उद्देश्य और फ्लोरोसेंट फिल्टर के साथ एक कोंफोकल माइक्रोस्कोप, 1, 10 का इस्तेमाल किया फ्लोरोसेंट डाई-टैग माध्यमिक एंटीबॉडी के अनुसार चुना प्रयोग करें।

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Representative Results

मस्तिष्क organoids की पीढ़ी निरंतर संवर्धन (चित्रा 1 ए) के कम से कम तीन सप्ताह की आवश्यकता है। प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम पूरा करने के लिए हमारी सलाह है कि शोधकर्ता हर कदम दस्तावेजों और, महत्वपूर्ण बात, मध्यम घटकों, समय बिंदुओं और सेल से निपटने के बारे में किसी भी परिवर्तन से बचा जाता है। यहाँ, हम यदि महत्वपूर्ण मील के पत्थर के क्रम प्रयोग के अंत में पर्याप्त गुणवत्ता की organoids प्राप्त करने के लिए पहुंचा जा सकता है कि कैसे मूल्यांकन करने के लिए का एक सारांश दे। एक 96 अच्छी तरह से थाली में neurospheres के गठन दिन 4. Neurospheres प्रत्येक के नीचे अच्छी तरह से (चित्रा 1 बी, चरण 1) के रूप में अच्छी तरह से परिभाषित क्षेत्रों पहचाना जा सकता है से स्पष्ट रूप से दिखाई देना चाहिए।

5 दिन, neurospheres व्यास में 500 सुक्ष्ममापी होना चाहिए ~ और एक चिकनी सतह प्रदर्शन, एक अंधेरे केंद्र के आसपास के एक उज्ज्वल रिम के साथ। यह पहले से ही तंत्रिका रोसेट की तरह बढ़ाया stru निरीक्षण करने के लिए संभव हो सकता हैइस उज्ज्वल रिम के भीतर ctures (चित्रा 1C, चरण 2 के शुरू)। neurospheres अलग गिर या एक से अधिक सेल समुच्चय की तरह दिखाई देते हैं, भेदभाव आगे जारी रखा नहीं किया जाना चाहिए। अंत में, organoids बढ़ाने के लिए और स्पिनर बोतल (चित्रा -1 डी, चरण 3) में भेदभाव की प्रक्रिया के दौरान एक समान आकार का प्रदर्शन करना चाहिए। समस्या निवारण तालिका (तालिका 1) अधिक जानकारी के लिए देखें।

दिन -14 organoids की गुणवत्ता प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा सत्यापित किया जाना चाहिए। VZs शिखर पक्ष में एक खंभ परमाणु आकार के साथ nestin पॉजिटिव NPCs / रेडियल glial कोशिकाओं की मोटी परतों से बनी हैं। दूसरी ओर, आदिम cortical थाली बेसल पक्ष पर प्रचुर मात्रा में TUJ1 पॉजिटिव न्यूरॉन्स, स्थानिक शिखर पक्ष (चित्रा 1E) से भिन्न शामिल होंगे। महत्वपूर्ण रूप से, TUJ1 पॉजिटिव न्यूरॉन्स VZ के शिखर पक्ष में नहीं देखा जाना चाहिए।

(चित्रा 1F और जी) 23,24 के शुरुआती सममित विस्तार के लिए आवश्यक है। जब पर्याप्त ARG विस्तार तक पहुँच जाता है, न्यूरोजेनेसिस शुरू होता है, विभाजित होने वाली कोशिकाओं लुमेन के प्रति उनके ओरिएंटेशन बदलने, और विभाजन विमान ऊर्ध्वाधर (विषम) 4, 12, 24 के लिए क्षैतिज (सममित) से स्विच करता है।

आकृति 1
चित्रा 1: मानव आईपीएस कोशिकाओं से मस्तिष्क Organoids की पीढ़ी। (ए) भेदभाव प्रोटोकॉल के कार्यप्रवाह। चरण 1: भेदभाव का प्रारंभ। इस चरण के दौरान, एक 96 अच्छी तरह से थाली में मानव IPSCs से neurospheres के गठन होता है। समय अवधि 5 दिन है। चरण 2: EHS मैट्रिक्स बूंदों में neurospheres एम्बेड। EHS मैट्रिक्स एम्बेडेड neurospheres के एक स्थिर निलंबन संस्कृति 4 दिनों की समय अवधि है। चरण 3: स्पिनर बोतल में Organoids। EHS मैट्रिक्स एम्बेडेड neurospheres के हस्तांतरण बोतल स्पिनर को जगह लेता है। समय अवधि 14 दिन है। (बी) के एक बहु अच्छी तरह से थाली में एक neurosphere। चरण 1 के दौरान एक 96-अच्छी तरह प्लेट में 4 दिन पर एक neurosphere के प्रतिनिधि छवि दिखाया गया है। क्षेत्र में अच्छी तरह से के तल पर स्पष्ट रूप से दिखाई देना चाहिए, एक चिकनी, गोल सतह (लाल Arro साथडब्ल्यू)। (सी) neurospheres के आकृति विज्ञान पूर्व EHS को मैट्रिक्स एम्बेडिंग। चरण 1 से 5 दिन पर एकत्र Neurospheres आकार में एक समान हो सकता है और एक उज्ज्वल रिम (ब्रैकेट और तीर) के साथ एक चिकनी सतह प्रदर्शित करना चाहिए। (डी) Organoids स्पिनर बोतल में। चरण के दौरान मस्तिष्क organoids 3 (लाल तीर) के साथ एक स्पिनर कुप्पी यहाँ दिखाया गया है। (ई) एक ठेठ VZ और आदिम cortical प्लेट प्रदर्शित cryosectioned organoids की Immunofluorescent इमेजिंग। बाएं पैनल VZ पर कोशिकाओं के परमाणु धुंधला को दर्शाता है। VZ शिखर की ओर (लुमेन एल) बेसल पक्ष (पीली लाइन) से फैला है। नोट VZ प्रदर्शन खंभ की तरह नाभिक के भीतर कोशिकाओं, सुझाव है कि है कि वे रेडियल glial कोशिकाओं रहे हैं। सही पैनल nestin पॉजिटिव NPCs (हरा) VZ और आदिम cortical थाली में TUJ1 पॉजिटिव न्यूरॉन्स (मैजंटा) के भीतर की immunofluorescent धुंधला को दर्शाता है। स्केल बार 50 सुक्ष्ममापी =। (एफ) cryosectioned organoids की Immunofluorescent इमेजिंग। दो उदाहरणपी-विम और Arl13b के साथ दाग VZs (i और iii)। क्षेत्रों सफेद वर्ग द्वारा चिह्नित प्रत्येक छवि इनसेट के लिए सही पर बढ़ाया (ii और iv) कर रहे हैं। पश्चावस्था शिखर रेडियल glial कोशिकाओं (args) के विभाजन विमान। VZ के शिखर पक्ष में शिखर रेडियल glial कोशिकाओं डिवाइडिंग पी विम पॉजिटिव (मैजंटा) कर रहे हैं। संतुलित विभाजित args के लिए उदाहरण (सफेद वर्ग और सन्निवेश वाली) दिखाए जाते हैं। विभाजन विमान एक सफेद लाइन के रूप में दिया जाता है। एक पश्चावस्था सेल के विभाजन विमान लुमेन सतह लाइन (पीले बिंदीदार रेखा) के लिए क्षैतिज और Arl13b धुंधला (हरा) द्वारा चिह्नित है। स्केल बार 50 सुक्ष्ममापी =। (G) यह योजनाबद्ध लुमेन पश्चावस्था सापेक्ष में args के लम्बवत या क्षैतिज अभिविन्यास प्रदान करता है। 14 दिन पर नियंत्रण organoids के विभाजित होने वाली कोशिकाओं ज्यादातर क्षैतिज उन्मुख होते हैं (0-30 डिग्री सेल्सियस) VZ के लुमेन सतह के सापेक्ष। लुमेन के शिखर की ओर args के प्राथमिक सिलिया, जो VZ (हरे रंग की रेखा) के लुमेन सतह निर्दिष्ट द्वारा तैयार किया जाता है। इसके विपरीत, mos मेंmicrocephaly organoids के रेडियल glial कोशिकाओं के टी एक खड़ी उन्मुख (60-90 °) विभाजन विमान प्रदर्शित करते हैं। सफेद रेखा विभाजन विमान की धुरी को दर्शाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मुसीबत: संभावित कारण: सुझाव:
चरण 1.1.1.2 reprogramming के गरीब दक्षता pluripotency मार्करों के लिए hiPSCs की जाँच करें: यदि गुणवत्ता कम है, मैन्युअल रूप से एक समान कालोनियों लेने कुछ अंश pluripotent कालोनियों को बेहतर बनाने के लिए
मानव IPSCs भेदभाव की शुरुआत से पहले अंतर
जल्दी passaging या passagi की वजह से तनावएनजी के रूप में एकल कोशिकाओं क्या पहले 80% confluency पारित होने तक पहुँच जाता है नहीं। मार्ग समुच्चय, एकल नहीं कोशिकाओं के रूप में
माइकोप्लाज़्मा साथ संदूषण माइकोप्लाज़्मा संदूषण के लिए टेस्ट
चरण 2 hiPSCs की खराब गुणवत्ता hiPSCs की गुणवत्ता में सुधार (ऊपर देखें)
Neurospheres सब पर फार्म या भेदभाव की शुरुआत के बाद 5 दिन में अलग गिर नहीं है अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं के शुरू संख्या बहुत कम या बहुत अधिक है सही रूप में कोशिकाओं की संख्या की गणना और उन्हें एक अच्छी तरह से में समान रूप से वितरित
hiPSC मध्यम तंत्रिका भेदभाव माध्यम के बजाय इस्तेमाल किया गया था तंत्रिका भेदभाव मध्यम का प्रयोग करें
Centrifugation कदम बेहद कठोर या हल्के के लिए गया था स्पिन 96-अच्छी तरह प्लेट 500 3 मिनट के लिए और यदि कोशिकाओं को केन्द्र में जमा की जाँच XG परप्रत्येक के नीचे अच्छी तरह से
भेदभाव के शुरू में कोई वाई 27,632 सेल अस्तित्व को बढ़ाने के लिए वाई 27,632 का प्रयोग करें
कोशिकाओं जुड़ा हुआ है और थाली के तल पर बढ़ी सुनिश्चित करें कि एक गैर पक्षपाती 96-अच्छी तरह वी-नीचे प्लेट प्रयोग किया जाता है सुनिश्चित करें।
चरण 2 कोई दैनिक मध्यम परिवर्तन मध्यम दैनिक के आधे राशि बदलें
Neurospheres आकार में समरूप नहीं हैं कोशिकाओं की संख्या शुरू प्रति अच्छी तरह से समान नहीं था 100 μL सेल निलंबन बाहर लेने से पहले हर बार एकल कक्ष निलंबन के साथ ट्यूब मिक्स
मध्यम परिवर्तन प्रत्येक अच्छी तरह से दैनिक के लिए नहीं किया गया था सुनिश्चित करें कि हर अच्छी तरह से दैनिक मध्यम परिवर्तन हो जाता है
चरण 2 hiPSC पूर्णांक अलग नहीं कर रहे थेभेदभाव की शुरुआत से पहले ओ एकल कोशिकाओं खुर्दबीन के नीचे की जाँच करें अगर hiPSC accutase उपचार के बाद एकल कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं। वहाँ अभी भी ऊपर और 100 μL micropipette के साथ नीचे एकत्रित करता है कर रहे हैं, पिपेट कोशिकाओं में 10 बार और फिर से जांच या इलाज accutase दोहराने
Neurospheres एक उज्ज्वल रिम या गोल सतह प्रदर्शित नहीं करते; वे सतह पर बड़े अल्सर फार्म कोशिकाओं की संख्या शुरू प्रति अच्छी तरह से बहुत अधिक थी सही रूप में कोशिकाओं की संख्या की गणना और उन्हें एक अच्छी तरह से में समान रूप से वितरित
मध्यम परिवर्तन प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए दैनिक नहीं किया गया था आधा मध्यम दैनिक बदलें
चरण 2.7 hiPSCs की खराब गुणवत्ता hiPSCs की गुणवत्ता में सुधार (ऊपर देखें)
EHS मैट्रिक्स एम्बेडेड neurospheres छड़ी और साथ पेड़ों का झुरमुट पर्याप्त मध्यम नहीं (मात्रा) उपलब्ध करेंएक 100 मिमी petridish में 10 एमएल माध्यम की न्यूनतम
इनक्यूबेटर की शेल्फ भी नहीं एक और भी सतह पर पकवान जगह
इनक्यूबेटर में रखने के बाद, पकवान ले जाने के लिए इतना है कि neurospheres समान रूप से वितरित कर रहे हैं

तालिका 1: समस्या निवारण टेबल।

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Discussion

MCPH एक जटिल मानव neurodevelopmental विकार है कि विवो में या साधारण मानव सेल संस्कृति इन विट्रो में दृष्टिकोण में पशु मॉडल में संक्षेप में दोहराया नहीं किया जा सकता है। MCPH के नैदानिक ​​अभिव्यक्ति है, पहली तिमाही के दौरान प्रकट करने के लिए जब जल्दी न्यूरोजेनेसिस शुरू होता है शुरू होता है। इस प्रकार, 3 डी मस्तिष्क organoids MCPH विकास मॉडल के लिए एक विश्वसनीय प्रायोगिक प्रणाली प्रतिनिधित्व करते हैं। इसके अलावा, 3 डी मानव मस्तिष्क organoids एक आदर्श दृष्टिकोण के बाद से मैं) वे विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ रोगी के नमूनों की एक स्पेक्ट्रम के अनुकूलन के लिए अनुमति देते हैं, ii) वे संगठित अलग तंत्रिका प्रकार की कोशिकाओं से युक्त ऊतक प्रदर्शित महत्वपूर्ण बात, iii) विभिन्न भेदभाव कर रहे हैं, और, इन विट्रो दृष्टिकोण में सक्षम के चिकित्सकों के चरणों उनके इन विवो समकक्षों 25, 26, 27 से जुड़ी हैं। उदाहरण के लिए, तंत्रिका रोसेट विकासशील तंत्रिका को एक समान संरचना हैट्यूब।

लैंकेस्टर एट अल। आदेश रोगी organoids पैदा करने में सफल होने के लिए IPSCs नियंत्रित करने के लिए की तुलना में रोगी IPSCs की दो बार नंबर का इस्तेमाल किया। ध्यान दें, प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित, मौजूदा तरीकों को संशोधित करके के साथ, हम नियंत्रण और microcephaly मस्तिष्क organoids एक ही सेल नंबर 4 से शुरू उत्पन्न कर सकता है। यह IPSCs की परिभाषित संस्कृति की स्थिति के कारण और एक अधिक निर्देशित भेदभाव की वजह से संभव हो गया था। इस प्रोटोकॉल में, organoid पीढ़ी IPSCs से सीधे तंत्रिका भेदभाव की शुरुआत द्वारा आमतौर पर प्रदर्शन किया ईबी गठन कदम की जगह द्वारा सुधार किया गया था। दूसरे, चरण 3, dorsomorphin और SB431542 में संवर्धन माध्यम के बजाय अकेले रेटिनोइक एसिड में पूरक थे। जब सेल संस्कृति मध्यम 28 के लिए आवेदन किया रेटिनोइक एसिड आसानी से isomerized है। इसलिए, अपने जैविक गतिविधि ऐसे dorsomorphin के रूप में और अधिक स्थिर यौगिकों की तुलना में कम परिभाषित किया गया है। Dorsomorphin रोकताBMP4 संकेतन मार्ग, और SB431542 activin / नोडल संकेतन मार्ग के एक अवरोध करनेवाला है (TGF-β1 ALK अवरोध करनेवाला)। दोनों जोड़ियों के का एक संयोजन, बीएमपी के निषेध और activin / नोडल संकेतन मार्ग की ओर जाता है तंत्रिका भेदभाव को प्रेरित करता है, और एक समान दक्षता 29 के साथ मानव ES या मानव आईपीएस कोशिकाओं से विभिन्न सेल लाइनों में अन्य प्रजातियों में भेदभाव कम कर देता है। यौगिक स्थिरता और एक यौगिक के लिए सार्वभौमिक कोशिकाओं की प्रतिक्रिया एक प्रोटोकॉल है जो इन विट्रो में एक बीमारी मॉडल करने के लिए विभिन्न रोगी सेल लाइनों के लिए लागू किया जा सकता की स्थापना के लिए महत्वपूर्ण बिंदु हैं। इस प्रकार, समरूप मस्तिष्क में एक मजबूत और कुशल भेदभाव परिणाम संस्कृतियों organoid और अंततः, अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा में।

इन संशोधनों के साथ, प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण चरणों इस बिंदु पर चरण 1 में भेदभाव की शुरुआत करने के लिए कम कर रहे हैं, यह महत्वपूर्ण है धीरे एक एकल कोशिका निलंबन एक में IPSCs अलग कर देना करने के लिएnd उन्हें सही ढंग से और समान रूप से 96-अच्छी तरह थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए वितरित करने के लिए। रो-जुड़े प्रोटीन kinase अवरोध करनेवाला (वाई 27,632), पहला 24 घंटे के दौरान मध्यम बी में जोड़ा जाना चाहिए के रूप में यह एकल कोशिकाओं को उनके पृथक्करण पर IPSCs के अस्तित्व का समर्थन करता है। यह उन कुओं के निचले भाग तक कताई द्वारा एक दूसरे के साथ निकट संपर्क में कोशिकाओं को लाने के लिए महत्वपूर्ण है। एक बार जब neurospheres चरण 1 के अंत में गठन कर रहे हैं, आगे प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के सफल समापन उम्मीद की जा सकती। मामले में neurospheres फार्म नहीं है, मानव IPSCs की pluripotency, 96-अच्छी तरह थाली में कोशिकाओं, और centrifuging की स्थिति का गैर-अवलम्बन जाँच की जानी चाहिए। चरण 1 से 0 दिन पर पूरी प्रक्रिया मानव IPSCs की संवेदनशीलता के कारण 1 घंटे से अधिक समय नहीं लेना चाहिए। बाद के दिनों के दौरान मध्यम परिवर्तन सावधानी से किया जाना चाहिए, सरासर बलों से बचने के क्रम में, कोशिकाओं के बीच हाल में गठित सेल संपर्कों को नष्ट नहीं है।

यह उल्लेखनीय है कि centrosomअल उत्परिवर्ती दोषपूर्ण सेल प्रसार और बदल सेल चक्र गतिशीलता है। इस प्रकार, मॉडलिंग MCPH एक शक्तिशाली प्रोटोकॉल जिनके साथ छेड़छाड़ की सेलुलर कार्यों का सामना कर सकते की आवश्यकता है। इसलिए, वर्तमान प्रोटोकॉल उच्च गुणवत्ता के समरूप organoids की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है और VZ में स्टेम सेल homeostasis अध्ययन करने के लिए एक अनूठा उपकरण के रूप में कार्य करता है। अन्य प्रोटोकॉल के विपरीत, इस प्रोटोकॉल नियंत्रण और रोगी IPSCs से organoids की पीढ़ी सक्षम बनाता है, बराबर सेल नंबर के साथ शुरू। इन विट्रो भेदभाव के आधार पर अध्ययन के लिए, विभिन्न IPSCs के लिए समान संस्कृति की स्थिति रोग से संबंधित परिवर्तन की पहचान करने और संस्कृति शर्त कलाकृतियों से बचने के लिए एक बुनियादी आवश्यकता है। आनुवंशिक मूल के microcephaly मॉडलिंग इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल भी neurotrophic वायरल संक्रमण, रसायन, या विकिरण से सहित गैर-आनुवंशिक मूल के microcephaly के लिए लागू किया जा सकता है। 30 इसके अलावा, इस तरह के CRISPR के रूप में आधुनिक आण्विक जीव विज्ञान उपकरण, / Cas9 जीनोम संपादित करेंप्रौद्योगिकियों ing, इन विट्रो 31, 32, 33 में मानव मस्तिष्क के विकास के प्रतिमान के विशिष्ट पहलुओं टुकड़े करना 3 डी organoids के लिए लागू किया जा सकता है।

दूसरी ओर, तारीख करने के लिए मस्तिष्क organoids की पीढ़ी अभी भी मानव विकास 34 के पहले और जल्दी दूसरी तिमाही से आगे नहीं गया है। इस सीमा को पार करते हैं और इन विट्रो नए रास्ते खोल न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार है कि इस तरह के पार्किंसंस या अल्जाइमर रोग के रूप में बाद के चरणों, पर प्रकट मॉडल करने के लिए होता है में परिपक्व मस्तिष्क organoids की पीढ़ी सक्षम करने से। भविष्य अनुप्रयोगों के लिए, प्रोटोकॉल, और अधिक विशिष्ट क्षेत्रों के लिए भेदभाव निर्देशन अग्रमस्तिष्क या मध्यमस्तिष्क की तरह, आत्मकेंद्रित और एक प्रकार का पागलपन 35, 36, 37 की तरह जटिल मस्तिष्क संबंधी बीमारियों का अध्ययन करने के ब्याज की हो सकता है, 38 अप।

महत्वपूर्ण रूप से, कुछ पहलुओं जब organoid अध्ययन से निष्कर्ष निकालने के ध्यान में रखा जाना चाहिए। पहले सीमा organoids में कोई स्पष्ट vascularization है कि वहाँ है। इस प्रकार, गैसीय विनिमय और इन विट्रो में पोषक तत्व की आपूर्ति केवल इन विवो की स्थिति का अनुमान लगा। दूसरा, के बाद से मस्तिष्क organoids जटिल अंग प्रणालियों से जुड़े नहीं हैं, organoid मॉडल पूरी तरह से प्रतिरक्षा, चयापचय, और हार्मोनल प्रणाली का अभाव है। फिर भी, इन पहलुओं के अभाव में कभी-कभी लाभ प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, organoids यहाँ वर्णित विवो मॉडल में immunosuppressed जब मस्तिष्क विकार के रोगजनन में प्रतिरक्षा प्रणाली के प्रभाव को संबोधित बदल सकते थे।

स्पिनर बोतल के उपयोग के साथ, organoids की एक बड़ी संख्या जैव रासायनिक प्रयोगों, पूरे transcriptome अनुक्रमण विश्लेषण, और उच्च throughput दवा स्क्रीनिंग के लिए उत्पन्न किया जा सकता। एक साथ लिया, यू द्वाराइस मौजूदा प्रोटोकॉल गाते हैं, एक मानव IPSCs कोशिकाओं है, जो तब औषधि परीक्षण प्लेटफार्मों पर आवेदनों की एक विस्तृत रेंज में उपयोग किया जा सकता है, रोग मॉडलिंग से, से मस्तिष्क organoids उत्पन्न कर सकते हैं क्रम मज़बूती से भविष्य में पशु परीक्षणों को बदलने के लिए।

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Acknowledgments

इस काम फ़्रिट्ज़ थिसन फाउंडेशन (Az.10.14.2.152) द्वारा समर्थित किया गया। हम ऊतक एम्बेडिंग सुविधा और CMMC की माइक्रोस्कोप कोर सुविधा के आभारी हैं। हम चर्चा और सेंट्रोसोम और cytoskeleton जीवविज्ञान के लिए प्रयोगशाला के सदस्यों द्वारा प्रदान की तकनीकी सहायता के लिए आभारी हैं। हम पांडुलिपि proofreading के लिए ली मिंग Gooi धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-mouse 488 Invitrogen A-11001 Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Anti-rabbit 647 Invitrogen A-21245 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647
Arl13b proteintech 17711-1-AP ARL13B rabbit polyclonal antibody 
CELLSPIN system IBS Integra Bioscience 183001
DAPI Sigma-Aldrich, US 32670 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers
DMEM/F-12 Gibco, US 31331093 Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 
Dorsomorphin Sigma-Aldrich, US P5499 Compound C; multiple suppliers
Embedding medium AppliChem A9011, 0100 Mowiol; embedding medium; multiple suppliers
Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix Corning 354277 Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified
Fish gelatin  Sigma-Aldrich, US G7765-250ML Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4 °C
Glycine AppliChem A1067,1000 Glycine for molecular biology; multiple suppliers 
Inoculation loop with needle, disposable (1 µL) Sigma Aldrich, US BR452201-1000EA multiple suppliers 
Insulin Sigma-Aldrich, US I3536-100MG multiple suppliers
L-glutamine Gibco, US 25030081 L-glutamine (200 mM)
Medium A Stem cell technologies #05850 mTeSR1 (hiPSC medium)
Medium B Stem cell technologies #05835 Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium
Medium C Gibco, US 21103049 Neural Basal Medium
MEM Gibco, US 11140035 MEM non-essential amino acids solution (100x)
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit Lonza, Switzerland #LT07-218 Mycoplasma detection kit; multiple suppliers
Nestin Novus biologicals NBP1-92717 Nestin mouse monoclonal antibody (4D11)
Paraformaldehyde (PFA) AppliChem A3813, 0500 4% in PBS, store solution at -20 °C; caution: wear skin and eye protection and work under hood 
PBS tablets Gibco, US 18912014 See manufacturer´s instructions; multiple suppliers
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL) Gibco, US 15140122 Multiple suppliers
Poly-L-lysine solution (PLL) Sigma-Aldrich, US P8920-100ML Multiple suppliers
pVim MBL D076-3S Phospho-Vimentin (Ser55) mAb
Reagent A  Stem cell technologies # 05872 Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available
Reagent B  Sigma-Aldrich, US A6964-100ML Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution” 
Research Cryostat Leica CM3050 S Leica biosystems CM3050 S Multiple suppliers
SB431542 Selleckchem.com S1067 Multiple suppliers
Spinner flask 250 mL IBS Integra Bioscience 182026
Sucrose AppliChem A4734, 1000 Multiple suppliers
Superfrost ultra plus microscope slides Thermo scientific, US J3800AMNZ Slides should be labeled with a "+" and positively charged
Supplement 1 Gibco, US 17502048 N-2 supplement (100x)
Supplement 2 w/o Vitamin A Gibco, US 12587010 B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers
Tissue-Tek Cryomold Sakura, NL 4565 Multiple suppliers
Tissue-Tek O.C.T. compound Sakura, NL 4583 Multiple suppliers
Triton X-100 AppliChem A1388,0500 Multiple suppliers
TUJ1 Sigma-Aldrich, US T2200 β-Tubulin III (rabbit polyclonal)
TUNEL assay Promega, US G3250 DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers
Tween 20 for molecular biology AppliChem A4974,0500 Multiple suppliers
waterproof sheet BEMIS company, inc. PM996 Parafilm “M”; multiple suppliers
Y-27632  Selleckchem.com S1049 ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers
β-mercaptoethanol Gibco, US 31350010 2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers

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References

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 122 IPSCs तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं मस्तिष्क organoids microcephaly तारक काय प्राथमिक पपनी
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Gabriel, E., Gopalakrishnan, J.… More

Gabriel, E., Gopalakrishnan, J. Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders. J. Vis. Exp. (122), e55372, doi:10.3791/55372 (2017).

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