Introduction
Mänskliga nervsjukdomar, såsom mikrocefali, bara kan vara dåligt studerats i djurmodeller på grund av det faktum att mänskliga hjärnor har en utökad kortikala ytan, en unik funktion som skiljer sig från icke-mänskliga djur.
Denna aspekt gör mänsklig hjärnans utveckling en komplex process som inte i tillräcklig utsträckning kan studeras i en 2D, in vitro cellodlingssystem. Emerging 3D kulturtekniker tillåter generering av vävnadsliknande organoids från inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs). In vitro differentiering av pluripotenta stamceller i en 3D-suspensionskultur medger bildning av olika celltyper i tid och region-specifikt sätt, vilket ger upphov till en organiserad, skiktad vävnad 1, 2, 3. Tack vare laboratorier som banade väg 3D odlingstekniker och avmystifierad komplexiteten av organbildning, med utgångspunkt från stamceller,vi utvecklat en robust metod för att generera hjärn organoids att avgränsa tidiga händelser av mänsklig hjärnans utveckling och att modellera mikrocefali in vitro 1, 2, 3. Det är anmärkningsvärt att vi anpassat den ursprungliga metod som utvecklats av Lancaster et al. att generera cerebrala organoids 1. Denna metod modifierades enligt våra experimentella krav.
Syftet med en studie från Gabriel et al. var att analysera de cellulära och molekylära mekanismer för neural stamcell underhåll under hjärnans utveckling. För att göra detta genomfördes en mekanistisk studie utförd genom att analysera neurala progenitorceller (NPC) i 3D hjärn organoids härledda från en mikrocefali patienten 4. Denna patient genom en mutation i CPAP, en konserverad centrosomal protein som krävs för centrosom biogenes 5. En allmänt accepterad hypotes är att mikrocefali är resultatet av en utarmning av NPC pool, och detta kan bero antingen på celldöd eller till för tidig differentiering 1, 6, 7, 8, 9.
Genom att analysera de ventrikulära zoner (VZs) av mikrocefali hjärn organoids, visades det att ett betydande antal NPC genomgå asymmetrisk celldelning, till skillnad från hjärn organoids härledda från en frisk givare 4. Omfattande mikroskopiska och biokemiska analyser av microcephalic hjärn organoids avslöjade en oväntad roll för CPAP i rätt tid cilier demontering 4. Specifikt, är muterad CPAP associerad med retarderad cilium demontering och fördröjd cellcykel återinträde, vilket leder till för tidig differentiering av NPC 4. Dessa resultat tyder på en roll för cilier i mikrocefali och thEIR engagemang under neurogenes och hjärnstorlek kontroll 10.
Den första delen av detta protokoll är en beskrivning av en trestegsmetod för att generera homogena hjärn organoids. Som tidigare nämnts, var den ursprungliga Lancaster protokollet anpassas och modifieras för att passa vårt syfte en. Först, mänskliga iPSCs odlas i ett definierat matare fritt tillstånd på Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matris. Detta steg undviker variationer av matarberoende pluripotenta stamcellkulturer. I detta protokoll för att induktion av neural differentiering bilda neural epitel börjar direkt från iPSCs. Genom att hoppa över embryoid kropp (EB) bildningssteget, de neurala differentieringsfortskrider i en mer kontrollerad och riktad sätt. Detta tillvägagångssätt begränsar spontan och oriktade bildandet av andra könscellsskikt, såsom mesoderm och endoderm. Genom att tillämpa detta protokoll, kan neurosfärer som innehåller neurala rosetter skördas på dag 5 för EHS matris inbäddning och stationär suspensionsodling. Den organoid medium som används för det tredje steget i våra protokoll kompletteras med dorsomorphin och SB431542. Dorsomorphin är en liten-molekyl hämmare av benmorfogent protein (BMP), och SB431542 hämmar TGFp / aktivin / nodal signalväg. Kombinationen av dessa faktorer skulle kunna främja neural differentiering mer effektivt än retinsyra ensam 11, 12, 13, 14.
Helt och hållet, dessa modifieringar möjliggöra reproducerbar alstring av hjärn organoids, med minimala variationer mellan organoids. Viktigare, var detta förfarande appliceras på robust generera microcephalic hjärn organoids från patientens iPSCs, som bär mutationer i gener som påverkar centrosomer och cellcykel dynamik.
Den andra delen av detta protokoll ger instruktioner för att förbereda brain organoids för analys och tolkning av cellulära defekter i mikrocefali. Detta inkluderar fixering, cryosectioning, immunofluorescerande färgning, och konfokal mikroskopanalys. Detta protokoll kommer att ge läsaren en detaljerad beskrivning av de förväntade resultaten och vägledning för tolkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generering av Brain Organoids (23 dagar)
- Inledande av neuroektoderm (5 dagar)
OBS: Följande punkter bör beaktas innan differentiering. Omprogrammering metoden (lentiviral-, sendai-virus-, episomal- eller microRNA baserade etc.) för att erhålla humana iPSCs bör helst vara densamma för alla patienter och styra IPSC linjer. Olika omprogrammering kit och instruktioner baserade på publicerade protokoll finns 15, 16, 17, 18. Kvaliteten på de humana IPSC linjerna är nyckeln till att åstadkomma en optimal differentiering. Övervaka koloni och cellmorfologi med ett mikroskop och validera pluripotens genom att testa uttrycket av markörer såsom Oct3 / 4, Nanog, eller TRA-1-60.- Kultur mänskliga iPSCs enligt matarfria betingelser i medium A på en maträtt belagd med Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) matris.
OBS: Grow humana iPSCs feeder fritt och serumfritt för att upprätthålla en definierad odlingsbetingelser och för att undvika ett ytterligare steg för avlägsnande av mus embryonala matarceller (MEFs) före starten av differentiering. Det optimala passagenummer för mänskliga iPSCs att starta differentierings varierar från passagen 15 vid omprogrammering till passagen 70 totalt. När passage, loss hiPSC kolonier som celler aggregera genom att använda en lämplig celllösgör lösning med låg mekanisk påfrestning och en 2-ml serologisk pipett för att överföra aggregat till en ny maträtt. Undvik dissociation till enstaka celler, eftersom det kan inducera differentiering och apoptos i de flesta IPSC linjer. Det rapporterades att långsiktigt kan encelliga passage öka iska förändringar i människans iPSCs 19, 20. Undvika celllösgör förfaranden, som kräver ett centrifugeringssteg för att avlägsna lösgör lösning, eftersom detta minskar den totala lönsamheten för iPSCs. Testaalla kulturer för mikrobiell kontaminering, särskilt mykoplasma, på regelbunden basis, eftersom detta kan förändra kvaliteten på iPSCs och deras differentiering kapacitet.- Belägga en 60 mm vävnadsodlingsskål med EHS matris enligt tillverkarens instruktioner.
- Tina en alikvot av 1 x 10 6 humana iPSCs. Ympa iPSCs i en 60-mm vävnadsodlingsskål belagd i EHS matrisen och innehållande 5 ml medium A (se Material tabell). Ändra mediet dagligen och passage efter 5 till 7 dagar när cellerna når ~ 80% konfluens.
OBS: Passage de upptinade iPSCs vid 80% konfluens med användning av standardmetoder, såsom den enzymfria lösgörande av kolonier 21, åtminstone en gång innan differentiering. I korthet, ta bort iPSC mediet, tvätta cellerna en gång med förvärmda 37 ° C Dulbeccos modifierade Eagles medium: Nutrient Mixture F12 (DMEM / F12), och inkubera iPSCs enligt tillverkarensinstruktioner med användning reagens A (se tabellen material). Överskrid inte den rekommenderade inkubationstiden för att undvika dissociation till enskilda celler. Mänskliga iPSCs bör tas loss och flyter som aggregat, inte som enskilda celler. De kan sedan överföras till nya EHS matrisbelagda rätter; till exempel, aggregat iPSC från en 60-mm skål kan distribueras till 4 nya 60-mm skålar. - Kontrollera om mykoplasma med mykoplasma upptäckt kit enligt tillverkarens anvisningar. Använd endast mykoplasmafria iPSCs, som mykoplasma kan ändra differentieringsförmåga iPSCs.
- Dissociera iPSCs (80% konfluens) och förbereda en enkel-cellsuspension med användning av reagens B.
- Tvätta iPSCs gång med förvärmd (37 ° C) DMEM / F12.
- Lägga förvärmda reagens B (t ex en ml i en 60 mm skål) och inkubera iPSCs under 5 min vid 37 ° C och 5% CO2.
- Flick 20 gånger med en fingertopp på sidan och botten avskålen lossa iPSCs. Kontrollera om avskiljandet av celler i mikroskop.
- Pipett cellsuspensionen upp och ner i skålen 5 gånger med en 1-ml mikropipett.
- Tillsätt 3 ml av medium A för att späda 1 ml av reagens B och samla cellsuspension i en 15-ml centrifugrör.
- snurra försiktigt ner iPSCs (500 xg) under 4 min vid rumstemperatur.
- Resuspendera cellpelleten i 1 ml medium B och räkna antalet celler med en hemocytometer.
OBS: Var medveten om att bara använda medel B för resuspension. Undvika att använda medium A, eftersom den innehåller en alltför hög koncentration av bFGF, som kan hämma differentieringen.
- Späda cellsuspensionen till 4,5 x 10 5 celler per ml i medium B med tillsats av 10 | iM rho-associerat proteinkinashämmare (Y-27632).
- Tillsätt 100 pl per brunn i en icke-vidhäftande, v-botten, 96-brunnars platta.
OBS: Se till att cellerna är jämnt fördelade i suspension genom att skaka röret varje gång innan du tar ut 100 ^ portioner. Det är viktigt att varje brunn bör innehålla ett ekvivalent antal celler för att erhålla neurosfärer homogena i storlek och form (runda, definierade ytor). - Snurra försiktigt ned plattan med cellerna vid 500 xg och rumstemperatur under 3 min och inkubera vid 37 ° C och 5% CO2.
- Ändra mediet dagligen genom att ta bort 50 | il och tillsats 50 mikroliter av färskt medium B i varje brunn under de följande 5 dagarna.
- Kultur mänskliga iPSCs enligt matarfria betingelser i medium A på en maträtt belagd med Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) matris.
2. Inbäddning Neurosfärer i EHS Matrix (4 dagar)
- Förbereda neurosfär mediet genom att blanda följande: 1: 1 blandning av DMEM / F12 och medel C (volym / volym), 1: 200 (volym / volym) supplement 1, 1: 100 (volym / volym) supplement 2 utan (w / o) vitamin A, 1: 100 L-glutamin, 0,05 mM icke-essentiella aminosyror (MEM), 100 U / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin, 1,6 g / L insulin, och 0,05 mM β-merkaptoetanol.
- Samla neurospheres witHA 200 pl mikropipett med användning av ett ~ 2 mm spets tidigare skurits med steril sax.
- Placera neurosfärerna cirka 5 mm från varandra på paraffinfilm (3 x 3 cm 2) i en tom 100 mm skål och försiktigt bort så mycket av det kvarvarande mediet som möjligt.
- Lägga till en droppe (7 | al) av EHS matris på varje enskild neurosfär.
- Inkubera EHS matrisen droppar med neurosfärerna under 15 min i en inkubator.
- Tvätta neurospheres försiktigt från paraffinfilmen genom att spola dem med neurosphere medium. Att spola, använda en 1 ml mikropipett och en ny 100 mm Petri skål innehållande 10 ml av neurosfärmedium.
- Inkubera neurospheres för de kommande 4 dagar och tillsätt 2 ml av färsk neurosphere medium på dag 2.
OBS: Se till att hyllorna i inkubatorn är platt så att EHS matrisinbäddade neurospheres inte klumpa ihop på ena sidan av skålen.
3. Organoids i en roterande SuspensionKultur (14 dagar)
- Förbereda hjärnan organoid mediet genom att blanda följande: 1: 1 blandning av DMEM / F12 och medel C (volym / volym), 1: 200 (volym / volym) supplement 1, 1: 100 (volym / volym) supplement 2 w / o vitamin A, 1: 100 L-glutamin, 0,05 mM MEM, 100 U / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin, 1,6 g / L insulin, 0,5 | iM dorsomorphin, 5 | iM SB431542, och 0,05 mM β-merkaptoetanol.
- Lägga 100 ml hjärna organoida medium till varje spinnkolv genom sina sidoarmar och placera dem i en inkubator för förvärmning under minst 20 min.
- Inrätta ett omrörningsprogram vid 25 rpm, enligt tillverkarens anvisningar.
OBS! Innan överföra EHS matrisinbäddade neurospheres i spinnerflaskor, se till att de alla är åtskilda. Om två eller flera är anslutna genom EHS matris, separera dem genom att skära den förbindande matrisen med en skalpell. - Noggrant överföra EHS matrisinbäddade neurosfärer in i spinnkolvar innehållande 100 ml organoid mediet ossing en 2 ml serologisk pipett. Använda sidoarmarna hos centrifugkolven att överföra neurosfärerna i kolven.
- Placera spinnerflaskor på en magnetisk omrörning plattform i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO 2; Detta är dag 0 av organoid kulturen.
- Ändra mediet en gång per vecka (eller oftare när det finns en färgförändring) genom att ta bort hälften av mediet och tillsätta samma mängd färskt medium.
OBS: När ta spinnerflaskor ur inkubatorn, vänta 3-5 min för att låta organoids sjunka ner till botten av kolven. Avlägsna mediet genom att placera glas pipettspetsen (ansluten till en pump) på ytan av vätskan; aspirera mediet försiktigt genom ena sidoöppningen / arm av kolven. Dessa manipulationer måste göras under laminärt huven.
4. Analys av Brain Organoids
- Fixering av organoids
- Samla organoids på dag 14 av centrifugkolven kultur with ett snitt 1 ml mikropipett (cut ~ 5 mm). Sätta alla av dem i en 60 mm skål och tvätta dem en gång med 5 ml varmt DMEM / F12 för 3 min.
- Förbereda en 1,5 ml rör med 500 mikroliter av varm 4% paraformaldehyd (PFA).
Varning: Använd hud- och ögonskydd och arbeta under en säkerhetskåpa vid hantering av PFA fixativ. - Placera varje organoid separat i varje rör och fixera dem i minst 30 minuter vid rumstemperatur. Inte fastställa organoids längre än 60 minuter. För att flytta organoids, använda en ympning slinga eller något annat utforma som är bekvämt.
- Ta bort PFA och tvätta de fasta organoids två gånger under 10 min vardera med en mL PBS.
- Lagra organoids i 1 ml PBS vid 4 ° C i upp till 7 dagar, tills vidare användning.
- Bädda in organoids för cryosectioning
- Ta bort PBS och tillsätt 1 ml av 30% sackaros i destillerat vatten-lösning per rör att dehydratisera de organoids före cryofreezing dem; efter tillsats sucrose lösning, bör de organoids vara flytande vid ytan. Lagra organoids över natten i sackaroslösning vid 4 ° C; nästa dag bör organoids ha sjunkit ner till botten av röret.
OBS: Organoids kan förvaras i upp till 3-5 dagar vid 4 ° C i sackaroslösning, om nödvändigt. - Fylla en vinylprovform med 400 mikroliter av optimal skärningstemperatur (OCT) förening och använda en ympning slinga för att placera en organoid vid centrum av formen. Märk kanten av formen med provnamnet.
- Frysa organoid innehållande formen vid -80 ° C tills cryosectioning.
- Belägga glas cryoslides med 0,1% poly-L-lysin-lösning (PLL) i PBS under 5 min vid rumstemperatur och låt objektglasen torka i 3 h. Förvara bilderna vid 4 ° C och värm upp dem till rummet tempererat före användning.
OBS: PLL-beläggning är ett viktigt steg, eftersom det kommer att hindra organoid skivor från att flyta bort. Samla in och lagra PLL-lösning vid 4 ° C i upp till tremånader. Före återanvändning, filtrera den med en 0,22-pm spruta och låt den värmas upp till rumstemperatur. - Avsnitt cryofrozen organoids till 20-50 pm-tjocka skivor på PLL-belagt glas cryoslides 22. Låt objektglasen med sektionerna torka under 1 h vid rumstemperatur. Lagra sektionerna vid -80 ° C tills vidare bearbetning.
- Ta bort PBS och tillsätt 1 ml av 30% sackaros i destillerat vatten-lösning per rör att dehydratisera de organoids före cryofreezing dem; efter tillsats sucrose lösning, bör de organoids vara flytande vid ytan. Lagra organoids över natten i sackaroslösning vid 4 ° C; nästa dag bör organoids ha sjunkit ner till botten av röret.
5. Immunofluorescens Färgning av organoid Sektioner
OBS: För den allmänna karakteriseringen av organoids, färgning med nestin, en neural stamfader markör och TUJ1, en pan-neuronal markör, rekommenderas. Som ytterligare exempel, immunofluorescerande färgning med fosfo-Vimentin (p-Vim), vilka etiketter mitotiska apikala radiella gliaceller, och Arl13b, för cilie, beskrivs. Att testa apoptos, använd Terminal deoxinukleotidyltransferas (TdT) dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) -analys. Placera glasen i en plastlåda under inkubationer för att skydda dem från damm, ljus,och att torka ut.
- Tina objektglasen under 30 min vid rumstemperatur.
- Tvätta bilderna två gånger med 200 | il av PBS-glycin (0,225 g glycin i PBS) under 3 min för att släcka PFA-inducerad autofluorescens.
- Permeabilize sektionerna med 200 mikroliter av 0,5% Triton X-100 / 0,1% Tween i PBS-lösning under 10 min vid rumstemperatur.
- Tvätta dem två gånger med 200 | il av PBS-glycin-lösning i 3 min.
- Inkubera dem med 200 mikroliter av 0,5% fiskgelatin / 0,1% Triton X-100 i PBS under 1 h vid rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C för att blockera ospecifik antigenbindning.
OBS: Om en TUNEL analys krävs, utföra analysen enligt tillverkarens protokoll. Börja med TUNEL-analysen innan du utför immunfärgning, eftersom det kan störa sekundära antikroppar och släcka fluoroforer när de används i efterhand. - Späd antikropparna i blockerande lösningen vid följande koncentrationer: nestin, ett: 200; p-Vim, 1: 500; TUJ1, 1: 200;Arl13b, 01:20; och sekundära antikroppar, 1: 1000.
- Inkubera med 200 mikroliter av den första primära antikroppen (t.ex., nestin) under 1-2 h vid rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C.
- Tvätta 3 x 3 min med 200 pl blockeringslösning.
- Späd den första (anti-mus-488) sekundär antikropp 1: 1000 i blockeringslösning och inkubera objektglaset i 200 | il under 1-2 h vid rumstemperatur. Från och med nu, alltid skydda bilderna från ljus.
- Tvätta 3 x 3 min med 200 pl blockeringslösning.
- Inkubera med 200 mikroliter av den nästa primära antikroppen (t.ex., TUJ1) under 1-2 timmar vid rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C.
- Tvätta 3 x 3 min med 200 pl blockeringslösning.
- Tillsätt 200 | il av nästa sekundär antikropp (anti-kanin 647) under 1-2 timmar vid rumstemperatur.
- Tvätta 3 x 3 min. med 200 mikroliter blockeringslösning.
- Lägga 200 mikroliter av 4' , 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) vid en 30 nM koncentration i PBS under 15 min vid rumstemperatur för nukleär färgning.
- Tvätta 2 x 3 min med 200 pl blockeringslösning.
- Tvätta en x 1 min med 200 | il av destillerat vatten och låt sektionerna torka i 10-20 min, tills ingen uppenbar vattendroppe är synlig längre.
- Montera sektioner med bädda medium. Lagra dem skyddad från ljus vid 4 ° C i upp till flera veckor.
- Fortsätt med mikroskopisk analys för att avbilda en översikt över organoid, ventrikulära zonen, primitiv kortikala plattan och andra områden av intresse.
- Använda ett konfokalt mikroskop med en 63X olja objektiva och fluorescerande filter, väljs i enlighet med de fluorescerande färgämnesmärkta sekundära antikroppar används en, 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genereringen av hjärn organoids kräver minst tre veckors kontinuerlig odling (Figur 1A). För att åstadkomma reproducerbara resultat rekommenderar vi att forskaren dokumenterar varje steg och, viktigare, undviker alla ändringar avseende medelkomponenter, tidpunkter och hanteringscellen. Här ger vi en sammanfattning av hur man ska värdera om kritiska milstolpar uppnås i syfte att erhålla organoids av tillräcklig kvalitet vid slutet av experimentet. Bildandet av neurosfärer i en 96-brunnsplatta bör vara klart synlig från dag 4. Neurosfärer kan kännas igen som väldefinierade sfärer på botten av varje brunn (Figur 1B, steg 1).
På dag 5, bör neurosfärer vara ~ 500 um i diameter och uppvisar en jämn yta, med en ljus kant som omger en mörk centrum. Det kan vara möjligt att redan följa neural rosett liknande förlängd kämpandeb lder inom denna ljusa kant (Figur 1C, start av steg 2). Om neurospheres falla sönder eller verkar mer som cellaggregat, bör differentieringen inte fortsätta ytterligare. Slutligen bör organoids öka och uppvisar en liknande storlek under differentieringsprocessen i spinnkolvar (figur 1D, steg 3). Se felsökningstabellen (tabell 1) för ytterligare information.
bör kontrolleras Kvaliteten på dag 14 organoids genom ljusmikroskop. VZs är sammansatta av tjocka lager av nestin-positiva NPC / radiella gliaceller med en palissad nukleär form vid den apikala sidan. Å andra sidan kommer den primitiva kortikala plattan innehålla rikliga TUJ1-positiva neuroner på den basala sidan, rumsligt distinkta från den apikala sidan (figur 1E). Viktigare, bör TUJ1-positiva neuroner inte ses på den apikala sidan av VZ.
(figur 1F och G) 23,24. När tillräcklig Arg expansionen uppnås, neurogenes börjar, de delande cellerna ändra sin orientering mot lumen, och uppdelningen planet växlar från horisontell (symmetrisk) till vertikal (asymmetrisk) 4, 12, 24.
Figur 1: Generering av Brain Organoids från Human iPS-celler. (A) arbetsflöde av differentieringsprotokollet. Steg 1: Start av differentiering. Under denna fas, inträffar bildningen av neurosfärer från humana iPSCs i en 96-brunnsplatta. Tidslängden är 5 dagar. Steg 2: inbäddning neurosfärerna i EHS matrisdroppar. En stationär suspensionsodling av EHS-matrix-inbäddade neurosfärer har en tidsvaraktighet på 4 dagar. Steg 3: Organoids i spinnerflaskor. Överföringen av EHS matris inbäddade neurospheres att spinnerflaskor sker. Tidslängden är 14 dagar. (B) En neurosfär i en flerbrunnsplatta. Representativ bild av en neurosfär på dag 4 i en 96-brunnsplatta under steg 1 visas. Sfären bör vara tydligt synliga på botten av brunnen, med en slät, rund yta (röd arrovikt). (C) Morfologi för neurosfärer före EHS matris inbäddning. Neurosfärer som samlats på dag 5 av steg 1 bör vara enhetlig i storlek och uppvisar en slät yta med en ljus kant (konsol och pil). (D) Organoids i spinnerflaskor. En spinnkolv med hjärn organoids under steg 3 (röda pilar) visas här. (E) Immunofluorescerande avbildning av cryosectioned organoids visar en typisk VZ och primitivt kortikala plattan. Den vänstra panelen visar nukleär färgning av celler vid VZ. VZ spänner från den apikala sidan (lumen L) till den basala sidan (gul linje). Notera att celler i VZ display Palisade liknande kärnor, vilket tyder på att de är radiella gliaceller. Den högra panelen visar immunofluorescerande färgning av nestin-positiva NPC (grön) inom VZ och TUJ1-positiva neuroner (magenta) i den primitiva kortikala plattan. Scale bar = 50 | im. (F) Immunofluorescerande avbildning av cryosectioned organoids. två exempelav VZs färgade med p-Vim och Arl13b (I och III). De regioner som är markerade med vita kvadrater förstoras vid rätt för varje bild infälld (ii och iv). Divisionen plan Anafasa apikala radiella glialceller (args). Dividera apikala radiella gliaceller på den apikala sidan av VZ är p-Vim-positiva (magenta). Exempel på symmetriskt delande args visas (vita kvadrater och infällningar). Delningsplanet ges som en vit linje. Delningsplanet hos en anafas cell är horisontell till lumenytan linjen (gul streckad linje) och är markerad med Arl13b färgning (grön). Scale bar = 50 | im. (G) Denna schematiska tillhandahåller vertikal eller horisontell orientering av args i anafas i förhållande till lumen. De uppdelande cellerna av kontroll organoids på dag 14 är mestadels horisontellt orienterade (0-30 °) i förhållande till lumen ytan av VZ. Den apikala sidan av lumen är fodrad av den primära cilier av args, vilket anger lumenytan av VZ (grön linje). I kontrast, most av de radiella gliaceller av mikrocefali organoids uppvisar en vertikalt orienterad (60-90 °) delningsplanet. Den vita linjen visar axeln hos delningsplanet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Problem: | Möjliga orsaker: | Förslag: |
| steg 1.1.1.2 | Dålig effektivitet av omprogrammering | Kolla hiPSCs för pluripotens markörer: om kvaliteten är låg, manuellt plocka odifferentierade kolonier i några passager för att berika pluripotenta kolonier |
| Mänskliga iPSCs skilja före start av differentiering | ||
| Stress på grund av tidig passage eller passaging som enskilda celler | Inte passage före 80% konfluens uppnås. Passage som aggregat, inte enstaka celler | |
| Förorening med mykoplasma | Test för mykoplasmkontaminering | |
| Steg 2 | Dålig kvalitet på hiPSCs | Förbättra kvaliteten på hiPSCs (se ovan) |
| Neuro bildar inte alls eller falla sönder på dag 5 efter start av differentiering | Utgångs antalet celler per brunn är för låg eller för hög | Noggrant räkna antalet celler och distribuera dem lika i varje brunn |
| hiPSC medium användes i stället för neural differentieringsmedium | Använd neural differentieringsmedium | |
| Centrifugeringssteget var för hård eller mild | Spin 96-brunnsplatta 500 xg under 3 min och kontrollera om celler ackumulerade centralt påbotten av varje brunn | |
| Ingen Y-27.632 vid start av differentiering | Använd Y-27.632 för att öka cellöverlevnad | |
| Celler fäst och växte vid bottnen av plattan | Se till att en icke vidhäftande 96 brunnar v-bottenplatta används. | |
| Steg 2 | Ingen daglig medel förändring | Ändra halv mängd medium dagligen |
| Neuro inte är homogena i storlek | Startnummer celler per brunn var inte lika | Blanda röret med enkelcellsuspension varje gång innan du tar ut 100 | il cellsuspension |
| Medium förändring gjordes inte för varje brunn dagligen | Se till att varje brunn blir medel förändring dagligen | |
| Steg 2 | hiPSC inte skiljas into enstaka celler före starten av differentiering | Kontrollera under mikroskop om hiPSC dissocieras till enstaka celler efter Accutase behandling. Om det fortfarande finns aggregat, pipett celler 10 gånger upp och ner med 100 mikroliter mikropipett och kontrollera igen eller upprepa Accutase behandling |
| Neuro inte visa en ljus kant eller rundade yta; de bildar stora cystor vid ytan | Startnummer celler per brunn var för hög | Noggrant räkna antalet celler och distribuera dem lika i varje brunn |
| Medium förändring gjordes inte dagligen för varje brunn | Ändra halv mediet dagligen | |
| steg 2,7 | Dålig kvalitet på hiPSCs | Förbättra kvaliteten på hiPSCs (se ovan) |
| EHS matris inbäddade neurosfärer klibba och klumpa ihop sig | Inte tillräckligt medium (volym) | Tillhandahålla enminimum av 10 ml medium i en 100 mm petriskål |
| Hylla inkubatorn inte ens | Placera skålen på en jämn yta | |
| Efter placering in i inkubatorn, flytta skålen så att neurosfärer är jämnt fördelade |
Tabell 1: Felsökning Tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MCPH är en komplex human neuroutvecklingsstörning som inte kan rekapituleras i djurmodeller in vivo eller i en enkel human cellkultur närmar in vitro. Den kliniska manifestationen av MCPH börjar dyka upp under den första trimestern, när tidig neurogenes börjar. Således 3D hjärn organoids representerar ett pålitligt experimentellt system för att modellera MCPH utveckling. Dessutom 3D mänsklig hjärn organoids är ett idealiskt tillvägagångssätt eftersom i) de tillåter för anpassning av ett spektrum av patientprover med olika genetisk bakgrund, ii) de visar organiserad vävnad som innehåller olika neurala celltyper, och, viktigare, iii) olika differentiering stadier av nervsystemets utveckling i detta in vitro metod är kopplade till deras in vivo motsvarigheter 25, 26, 27. Till exempel, är det neurala rosett en ekvivalent struktur till utveckla neuralarör.
Lancaster et al. används två gånger antalet patient iPSCs jämfört med kontroll iPSCs för att lyckas i att generera patientens organoids. Notera med det protokoll som beskrivs här, genom att modifiera de befintliga metoder, kan vi skapa kontroll och mikrocefali hjärn organoids börjar från samma cell nummer 4. Detta var möjligt på grund av att de definierade odlingsbetingelser för iPSCs och på grund av en mer riktad differentiering. I detta protokoll, var organoid generation förbättras genom att ersätta den vanligtvis utförs EB bildningssteget genom att initiera neural differentiering direkt från iPSCs. För det andra, i steg 3, dorsomorphin och SB431542 kompletterades i odlingsmediet istället för retinsyra enbart. Retinsyra lätt isomeriseras när det tillämpas på cellodlingsmedium 28. Därför är dess biologiska aktivitet mindre definierad än den av mer stabila föreningar, såsom dorsomorphin. Dorsomorphin hämmarBMP4 signalväg, och SB431542 är en hämmare av aktivin / nodal signalväg (TGF-β1 ALK-inhibitor). En kombination av båda föreningarna leder till hämningen av BMP och aktivin / nodal signalväg, inducerar neural differentiering, och minskar differentiering till andra linjer i olika cellinjer från humana ES eller humana iPS-celler med en liknande effektivitet 29. Förening stabilitet och universella cellsvar till en förening är viktiga poäng för upprättande av ett protokoll som kan tillämpas på olika patient cellinjer för att modellera en sjukdom in vitro. Sålunda, en robust och effektiv differentiering resulterar i homogen hjärnan organoid kulturer och, så småningom, i mer reproducerbara data.
Med dessa ändringar, är kritiska steg inom det protokoll minimeras till initieringen av differentiering i steg 1. Vid denna punkt är det viktigt att försiktigt dissociera iPSCs till en enda cellsuspension ennd att distribuera dem noggrant och jämnt till varje brunn i 96-brunnsplatta. Rho-associerat proteinkinashämmare (Y-27632) måste tillsättas till medium B under de första 24 timmarna, eftersom det stöder överlevnad iPSCs på deras dissociation till enskilda celler. Det är viktigt att ta med celler i nära kontakt med varandra genom att snurra dem ner till botten av brunnarna. Gång neurosfärer bildas vid slutet av steg 1, kan förväntas det framgångsrika slutförandet av ytterligare experimentella förfaranden. I fall neurosfärer inte bildar, pluripotens av humana iPSCs, måste den icke-vidhäftning av cellerna i 96-brunnars platta, och centrifugeringsbetingelser kontrolleras. Hela proceduren på dag 0 i steg 1 bör ta längre tid än 1 timme på grund av känsligheten hos mänskliga iPSCs. Medium förändringar under de följande dagarna måste göras noggrant, för att undvika skjuvkrafter, för att inte förstöra nybildade cellkontakter mellan cellerna.
Det är anmärkningsvärt att centrosomal mutanter har defekt cellproliferation och förändrade cellcykel dynamik. Således modellering MCPH kräver en kraftfull protokoll som kan motstå de komprometterade cellfunktioner. Hence, tillåter det nuvarande protokollet för generering av homogena organoids av hög kvalitet och fungerar som ett unikt verktyg för att studera stamcells homeostas vid VZ. I motsats till andra protokoll, möjliggör detta protokoll generering av organoids från kontroll och patient iPSCs, börjar med lika cellantal. För studier baserade på in vitro differentiering identiska odlingsbetingelser för olika iPSCs är en grundförutsättning för att identifiera sjukdomsrelaterade förändringar och för att undvika kulturkonditions artefakter. Förutom modellering mikrocefali av genetiskt ursprung, kan detta protokoll också tillämpas på mikrocefali av icke-genetiskt ursprung, bland annat från neurotrofiska virala infektioner, kemikalier eller strålning. 30 Dessutom moderna molekylärbiologiska verktyg, såsom CRISPR / Cas9 genomet-editing teknik kan tillämpas på 3D-organoids att dissekera specifika aspekter av den mänskliga hjärnans utveckling paradigm in vitro 31, 32, 33.
Å andra sidan har den generation av hjärn organoids hittills ännu inte gått längre än den första och början av andra trimestern av mänsklig utveckling 34. Träffar denna begränsning och möjliggör generering av mogna hjärnan organoids in vitro skulle öppna nya vägar för att modellera neurodegenerativa sjukdomar som manifesteras i ett senare skede, till exempel Parkinsons eller Alzheimers sjukdom. För framtida tillämpningar, protokoll styra differentiering till mer specifika områden, som framhjärnan eller mitthjärnan, kan vara av intresse att studera komplexa neurologiska sjukdomar som autism och schizofreni 35, 36, 37, 38.
Viktigt bör vissa aspekter beaktas när man drar slutsatser från organoid studier. Den första begränsningen är att det inte finns någon uppenbar vaskularisering i organoids. Sålunda, gasutbyte och näringstillförsel in vitro endast approximera in vivo förhållanden. För det andra, eftersom hjärnan organoids inte är ansluten till komplexa organsystem saknar organoid modell en komplett immun, metabola och hormonella system. Ändå ger frånvaron av dessa aspekter ibland en fördel. Till exempel kan de organoids beskrivs här ersätta immunsupprimerade in vivo-modeller när man hanterar effekterna av immunsystemet i patogenesen av sjukdomar i hjärnan.
Med hjälp av spinnerflaskor, kan genereras ett stort antal organoids för biokemiska experiment, hela transkriptom sekvenseringsanalys och hög genomströmning drog filmvisningar. Tagna tillsammans, genom usjunga den här aktuella protokoll, kan man generera hjärn organoids från humana iPSCs celler, som sedan kan användas i ett brett område av tillämpningar, från sjukdom modellering för att drogtester plattformar, i syfte att tillförlitligt ersätta djurförsök i framtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Fritz Thyssen Foundation (Az.10.14.2.152). Vi är tacksamma till vävnaden inbäddning anläggningen och mikroskopet kärnanläggningen i CMMC. Vi är tacksamma för de diskussioner och teknisk support som tillhandahålls av medlemmarna i laboratoriet för centrosom och Cytoskeleton Biology. Vi tackar Li Ming Gooi för korrekturläsning manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse 488 | Invitrogen | A-11001 | Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
| Anti-rabbit 647 | Invitrogen | A-21245 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 |
| Arl13b | proteintech | 17711-1-AP | ARL13B rabbit polyclonal antibody |
| CELLSPIN system | IBS Integra Bioscience | 183001 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, US | 32670 | 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| DMEM/F-12 | Gibco, US | 31331093 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 |
| Dorsomorphin | Sigma-Aldrich, US | P5499 | Compound C; multiple suppliers |
| Embedding medium | AppliChem | A9011, 0100 | Mowiol; embedding medium; multiple suppliers |
| Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix | Corning | 354277 | Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified |
| Fish gelatin | Sigma-Aldrich, US | G7765-250ML | Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4 °C |
| Glycine | AppliChem | A1067,1000 | Glycine for molecular biology; multiple suppliers |
| Inoculation loop with needle, disposable (1 µL) | Sigma Aldrich, US | BR452201-1000EA | multiple suppliers |
| Insulin | Sigma-Aldrich, US | I3536-100MG | multiple suppliers |
| L-glutamine | Gibco, US | 25030081 | L-glutamine (200 mM) |
| Medium A | Stem cell technologies | #05850 | mTeSR1 (hiPSC medium) |
| Medium B | Stem cell technologies | #05835 | Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium |
| Medium C | Gibco, US | 21103049 | Neural Basal Medium |
| MEM | Gibco, US | 11140035 | MEM non-essential amino acids solution (100x) |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza, Switzerland | #LT07-218 | Mycoplasma detection kit; multiple suppliers |
| Nestin | Novus biologicals | NBP1-92717 | Nestin mouse monoclonal antibody (4D11) |
| Paraformaldehyde (PFA) | AppliChem | A3813, 0500 | 4% in PBS, store solution at -20 °C; caution: wear skin and eye protection and work under hood |
| PBS tablets | Gibco, US | 18912014 | See manufacturer´s instructions; multiple suppliers |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL) | Gibco, US | 15140122 | Multiple suppliers |
| Poly-L-lysine solution (PLL) | Sigma-Aldrich, US | P8920-100ML | Multiple suppliers |
| pVim | MBL | D076-3S | Phospho-Vimentin (Ser55) mAb |
| Reagent A | Stem cell technologies | # 05872 | Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available |
| Reagent B | Sigma-Aldrich, US | A6964-100ML | Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution” |
| Research Cryostat Leica CM3050 S | Leica biosystems | CM3050 S | Multiple suppliers |
| SB431542 | Selleckchem.com | S1067 | Multiple suppliers |
| Spinner flask 250 mL | IBS Integra Bioscience | 182026 | |
| Sucrose | AppliChem | A4734, 1000 | Multiple suppliers |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo scientific, US | J3800AMNZ | Slides should be labeled with a "+" and positively charged |
| Supplement 1 | Gibco, US | 17502048 | N-2 supplement (100x) |
| Supplement 2 w/o Vitamin A | Gibco, US | 12587010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, NL | 4565 | Multiple suppliers |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura, NL | 4583 | Multiple suppliers |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388,0500 | Multiple suppliers |
| TUJ1 | Sigma-Aldrich, US | T2200 | β-Tubulin III (rabbit polyclonal) |
| TUNEL assay | Promega, US | G3250 | DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers |
| Tween 20 for molecular biology | AppliChem | A4974,0500 | Multiple suppliers |
| waterproof sheet | BEMIS company, inc. | PM996 | Parafilm “M”; multiple suppliers |
| Y-27632 | Selleckchem.com | S1049 | ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers |
| β-mercaptoethanol | Gibco, US | 31350010 | 2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers |
References
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, 373-379 (2013).
- Eiraku, M., Sasai, Y. Mouse embryonic stem cell culture for generation of three-dimensional retinal and cortical tissues. Nat Protoc. 7, 69-79 (2012).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35 (8), 803-819 (2016).
- Al-Dosari, M. S., Shaheen, R., Colak, D., Alkuraya, F. S. Novel CENPJ mutation causes Seckel syndrome. J Med Genet. 47, 411-414 (2010).
- Wollnik, B. A common mechanism for microcephaly. Nat Genet. 42, 923-924 (2010).
- Thornton, G. K., Woods, C. G. Primary microcephaly: do all roads lead to Rome? Trends Genet. 25, 501-510 (2009).
- Barbelanne, M., Tsang, W. Y. Molecular and cellular basis of autosomal recessive primary microcephaly. Biomed Res Int. 2014, 547986 (2014).
- Homem, C. C., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nat. Rev. Neurosci. 16, 647-659 (2015).
- Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35, 803-819 (2016).
- Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. , (2012).
- Morizane, A., Doi, D., Kikuchi, T., Nishimura, K., Takahashi, J. Small-molecule inhibitors of bone morphogenic protein and activin/nodal signals promote highly efficient neural induction from human pluripotent stem cells. J. Neurosci. Res. 89, 117-126 (2011).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).
- Zhou, J., et al. High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors. Stem Cells. 28, 1741-1750 (2010).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8, 409-412 (2011).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
- Bai, Q., et al. Temporal analysis of genome alterations induced by single-cell passaging in human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 24, 653-662 (2015).
- Garitaonandia, I., et al. Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions. PLoS One. 10, e0118307 (2015).
- Ohnuma, K., et al. Enzyme-free passage of human pluripotent stem cells by controlling divalent cations. Sci. Rep. 4, 4646 (2014).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. J Vis Exp. , (2007).
- Yingling, J., et al. Neuroepithelial stem cell proliferation requires LIS1 for precise spindle orientation and symmetric division. Cell. 132, 474-486 (2008).
- Rakic, P. A small step for the cell, a giant leap for mankind: a hypothesis of neocortical expansion during evolution. Trends Neurosci. 18, 383-388 (1995).
- Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 4335-4340 (2010).
- Wilson, P. G., Stice, S. S. Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells. Stem Cell Reviews. 2, 67-77 (2006).
- Dhara, S. K., Stice, S. L. Neural differentiation of human embryonic stem cells. J. Cell Biochem. 105, 633-640 (2008).
- Christie, V. B., et al. Synthesis and evaluation of synthetic retinoid derivatives as inducers of stem cell differentiation. Org Biomol Chem. 6, 3497-3507 (2008).
- Kim, D. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Reviews. 6, 270-281 (2010).
- Gabriel, E., et al. Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids. Cell stem cell. , (2017).
- Wu, J., Hunt, S. D., Xue, H., Liu, Y., Darabi, R. Generation and Characterization of a MYF5 Reporter Human iPS Cell Line Using CRISPR/Cas9 Mediated Homologous Recombination. Sci. Rep. 6, 18759 (2016).
- Li, H. L., Gee, P., Ishida, K., Hotta, A. Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR-Cas9 system. Methods. 101, 27-35 (2016).
- Grobarczyk, B., Franco, B., Hanon, K., Malgrange, B. Generation of Isogenic Human iPS Cell Line Precisely Corrected by Genome Editing Using the CRISPR/Cas9 System. Stem Cell Reviews. 11, 774-787 (2015).
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 15672-15677 (2015).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165, 1238-1254 (2016).
- Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19, 248-257 (2016).
- Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
- D'Avanzo, C., et al. Alzheimer's in 3D culture: challenges and perspectives. Bioessays. 37, 1139-1148 (2015).
