Summary

באמצעות In Vivo , רקמות, תאים Explant גישות ללמוד מורפוגנזה ו פתוגנזה של הלידה של אבי העורקים

Published: September 12, 2017
doi:

Summary

פרוטוקולים ללמוד העורקים מאתר של הלידה באמצעות ויוו ניתוח המשובטים, מיפוי הגורל, אבי העורקים explants שריר חלק מבודד התאים מפורטים כאן. גישות מגוונות אלה לקדם את חקירת מורפוגנזה של אבי העורקים של הלידה בהתפתחות נורמלית, בפתוגנזה של המחלה.

Abstract

אבי העורקים הוא העורק הגדול ביותר בגוף. הקיר אבי העורקים מורכב של השכבה הפנימית של תאי אנדותל, שכבה אמצעית לסירוגין lamellae אלסטית ותאי שריר חלק (SMCs), השכבה החיצונית של fibroblasts, מטריצה חוץ-תאית. בניגוד המחקר הנרחב של מודלים פתולוגי (למשל, טרשת עורקים) באבי העורקים למבוגרים, הרבה פחות ידוע על הלידה של אבי העורקים. כאן, אנו מתמקדים SMCs ולספק פרוטוקולים עבור הניתוח של מורפוגנזה ו בפתוגנזה של הלידה של אבי העורקים SMCs להתפתחות התקינה, המחלה. באופן ספציפי, הפרוטוקולים ארבע כללה הן: אני) ויוו גורל עובריים מיפוי וניתוח המשובטים; ii) explant העורקים עובריים תרבות; iii) SMC בידוד מן העורקים הלידה; ו- iv) תת עורית משאבת מיני osmotic השמה בעכברים בהריון (או שאינה בהריון). לפיכך, גישות אלה לקדם את החקירה של origin(s), גורל, אדריכלות המשובטים של SMCs אבי העורקים vivo בתוך. הם מאפשרים להתכוונן העורקים עובריים מורפוגנזה בתוך הרחם על ידי חשיפה מתמשכת סוכנים תרופתי. בנוסף, מבודד רקמות אבי העורקים explants או SMCs של אבי העורקים יכול לשמש כדי לקבל תובנות לגבי התפקיד של גנים ספציפיים מטרות במהלך תהליכי יסוד כגון muscularization, הפצה, העברה. ניסויים אלה השערת מניבות SMCs מבודדים, העורקים explanted יכול להידרש ואז בהקשר ויוו דרך גישות תרופתי גנטי.

Introduction

מערכת הדם של אורגניזמים רב תאיים פונקציה כדי לספק חומרים מזינים וחמצן לתאים כי הם לא בקשר עם הסביבה החיצונית כדי להסיר תאים אלה הפסולת, פחמן דו-חמצני. החוליות, מורכבת מערכת הדם העיקריים הלב, אשר שואב דם דרך סדרה של כלי הדם. דפנות כלי דם גדולים, כגון העורקים והוורידים, מורכבת משלוש שכבות: אני) אינטימה או השכבה הפנימית של תאי אנדותל; ii מדיה), או שכבה אמצעית לסירוגין circumferentially מוארך תאי שריר חלק SMCs ואת lamellae אלסטית; ו- iii) adventitia, או השכבה החיצונית של רקמות החיבור ואת fibroblasts. הרוב המכריע של לימודי ביולוגיה וסקולרית מתמקדים תאי אנדותל, חוקר היווצרות חדשים אנדותל מצופה תא צינורות דרך אנגיוגנזה. לשם השוואה, SMCs מקבלים תשומת לב מועטה יחסית. עם זאת, SMCs הם סוג תא קריטי בניית הקיר עורקי נורמלי, פתולוגיות כלי הדם.

אבי העורקים הוא העורק בקוטר הגדול ביותר בגוף, מקבל את תפוקת הלב של החדר השמאלי של הלב. זה הוא נגועים על ידי מחלות אנושיות מגוונות, כולל טרשת עורקים, מפרצת לנתיחה. אורגניזמים למבוגרים, אבי העורקים ואת סניפיה הגדולים נלמדים באופן אינטנסיבי במודלים של מחלת כלי דם. למשל, בשומן האכיל עכברים שאינם null עבור הגן קידוד של קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה או אפוליפופרוטאין E, לפתח טרשת עורקים, מחקרים אחרונים של מיפוי גורל מציינים כי קיימים SMCs להצמיח סוגי תאים מרובים ב- פלאק טרשת עורקים1. מפרצת אבי העורקים, שינויים פתולוגיים לכלול SMC ואפופטוזיס ו מטריצה חוץ-תאית שיפוץ2,3.

באופן משמעותי פחות ידוע לגבי SMC מורפוגנזה ו פתוגנזה בתקופות של הלידה. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים עבור הלומדים הלידה של אבי העורקים SMCs ויוו, explants רקמות, תאים בודדים. למשל, החלק הראשון של הפרוטוקול משרטט גורל מיפוי וניתוח המשובטים בעכברים עובריים. Recombinase Cre הביע תחת השליטה של תאים ספציפיים מקדם מכירות מאפשר הסימון של תאים ספציפיים, שלהם רומא4,5,6; עם זאת, שליטה הטמפורלי של תאים ספציפיים תיוג יכול להיות מאתגר במהלך התפתחות עובריים בעכברים. בהקשר זה, עם עוברי לבטא את CreER מותנה תחת מקדם מכירות פעיל של SMCs (e.g.,Myh11 או Acta2), עיתונאי Cre, אנו מספקים שיטות הזרקת טמוקסיפן או שלה המטבוליט הפעיל 4-OH-טמוקסיפן, סכרים בהריון עבור ניתוח התאים שכותרתו עוברי או צאצא כמחנכת. יתר על כן, בניגוד גורל מיפוי מחקרים, אשר predominately לנצל Cre עיתונאים עם1,fluorophore7כתב יחיד, ניתוח המשובטים באופן משמעותי מוגברת עם צבע רב Cre כתבים.

החלקים השני והשלישי של פרוטוקול מתארים שיטות בידוד, culturing עובריים explants של אבי העורקים, אבי העורקים SMCs מ- neonates, בהתאמה. גישות אלה מאפשרות המניפולציה של איתות המסלולים, בפרט explants של אבי העורקים או SMCs, וכן ניתוח ההשפעות הישירות של סוכנים תרופתי. לפיכך, התפקיד של גנים ספציפיים ברקמות עניין יכולים להיות מוקרן בצורה מהירה הרבה יותר מאשר דרך מסורתית שינויים גנטיים בעכברים. בנוסף, המחקרים SMC מבודד להקל על הניתוח של נדידת תאים, הדבקה, אשר מבחינה טכנית מוגבל בתוך vivo.

בסופו של דבר, החלק הרביעי פרוטוקול מתארת את המיקום של משאבת מיני תת עורית osmotic נטען עם סוכנים תרופתי בהריון (או שאינה בהריון) עכברים. שיטה זו מקלה על הניתוח של ההשפעה על התפתחות הנגרמת על ידי סוכנים הדורשים תקינות בגלל חילוף חומרים מהיר. החלופה של זריקות תכופות אינה מעשית עבור סוכנים רבים, יש להימנע, שכן היא עלולה לגרום אי נוחות משמעותי בסכר בהריון.

Protocol

כל הפרוטוקולים העכבר אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה ב אוניברסיטת ייל. 1-ב Vivo עובריים גורל מיפוי וניתוח המשובטים הערה: השתמשנו גישות אלה באופן נרחב כדי להעריך את מקורותיה של תאים ואדריכלות המשובטים שלהם מחלות ופיתוח דגמים <sup class="xref"…

Representative Results

בניתוח נציג המשובטים של SMCs ב עוברים מוטציה עבור Eln (הגן קידוד אלסטין חלבון של מטריצה חוץ-תאית), Eln(+ /-), Acta2-CreERT2 עכברים היו הזדווגו to Eln(+ /-) עכברים נושאת גם צבע רב ROSA26R(Rb/Rb) כתב. כפי שמתואר בשלב 1, תקעים שנבדקו, סכרים בהריון היו המושרה עם זרי?…

Discussion

בניגוד חקירה מקיפה של העורקים מאתר ואת סניפיה הגדולים במצבים פתולוגיים למבוגרים, כגון מודלים של טרשת עורקים, פחות ידוע לגבי את מורפוגנזה בפתוגנזה של העורקים של הלידה. כאן, אנו מתמקדים העורקים עובריים/הלידה, במיוחד SMCs, ולספק פרוטוקולים ללמוד העורקים באמצעות ויוו, רקמת explant, ואת הגישות S…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים דין Li על שיתוף הפרוטוקול של המעבדה שלו לבידוד SMC אבי העורקים. תמיכה במימון סופק על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (R21NS088854, R01HL125815, R01HL133016 אל D.M.G), איגוד הלב האמריקני (מענק הסיוע 14GRNT19990019 כדי D.M.G.), ואת אוניברסיטת ייל (מלגת בראון-Coxe כדי לפנות בוקר וההרצה כספים D.M.G.).

Materials

Tamoxifen Sigma T5648
Corn oil Sigma C-8267 Vehicle for tamoxifen
4-OH-tamoxifen Sigma H7904 Active metabolite of tamoxifen
Progesterone Sigma P8783-5G Use at half the concentration of tamoxifen
OCT compound Sakura tissue tek 4583 For making cryoblocks
Cryomolds Polysciences inc 18986
DAPI Sigma D9542 IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/ml
Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody Sigma A2547 IHC staining of SMA, final dilution 1:500
Anti-CD31 antibody BD Pharmingen 550274 IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/ml
Anti-GFP antibody Thermo Fisher Scientific A-11121 IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/ml
Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647 Life Technologies a21244 IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml
Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488 Life Technologies a11008 IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml
DMEM Thermo Fisher Scientific 10567-014 For cell culture
FBS Thermo Fisher Scientific 10437028
Anti-integrin beta3 blocking antibody BD Biosciences 553343 Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/ml
Collagenase Worthington Biochemical Corp 44H14977A For digesting aorta
Elastase Worthington Biochemical Corp 34K15139 For digesting aorta
Antibiotic-antimycotic (100X) Thermo Fisher Scientific 15240062
Recombinant human FGF Promega G5071
Recombinant human EGF Promega G5021
Penicillin/streptomycin (10,000 U/ml) Thermo Fisher Scientific 15140122
Amphotericin B Thermo Fisher Scientific 15290026
Tissue culture plates Corning CLS430165
Alzet osmotic mini-pump Durect Corporation 2001
ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope Nikon
TCS SP5 Leica
Branson Sonifier 450 VWR
Myh11-CreERT2 mice The Jackson Laboratory 19079
Acta2-CreERT2 mice Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger
ROSA26R-CreERT2 mice The Jackson Laboratory 8463
ROSA26R(mTmG/mTmG) mice The Jackson Laboratory 026862
ROSA26R(EYFP/EYFP) mice The Jackson Laboratory 006148
ROSA26R(Confetti/Confetti) mice The Jackson Laboratory 13731
ROSA26R(Rb/Rb) mice Lab of Dr. Irv Weissman Obtained from lab of Dr. Irv Weissman

References

  1. Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nat Med. 21, 628-637 (2015).
  2. Rowe, V. L., et al. Vascular smooth muscle cell apoptosis in aneurysmal, occlusive, and normal human aortas. J Vasc Surg. 31, 567-576 (2000).
  3. Rodella, L. F., et al. Abdominal aortic aneurysm and histological, clinical, radiological correlation. Acta Histochem. 118, 256-262 (2016).
  4. Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nat Rev Genet. 2, 743-755 (2001).
  5. Lakso, M., et al. Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6232-6236 (1992).
  6. Metzger, D., Clifford, J., Chiba, H., Chambon, P. Conditional site-specific recombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Cre recombinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 6991-6995 (1995).
  7. Sheikh, A. Q., Lighthouse, J. K., Greif, D. M. Recapitulation of developing artery muscularization in pulmonary hypertension. Cell Rep. 6, 809-817 (2014).
  8. Greif, D. M., et al. Radial construction of an arterial wall. Dev Cell. 23, 482-493 (2012).
  9. Misra, A., et al. Integrin beta3 inhibition is a therapeutic strategy for supravalvular aortic stenosis. J Exp Med. 213, 451-463 (2016).
  10. Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Sci Transl Med. 7, (2015).
  11. Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nat Med. 14, 64-68 (2008).
  12. Wendling, O., Bornert, J. M., Chambon, P., Metzger, D. Efficient temporally-controlled targeted mutagenesis in smooth muscle cells of the adult mouse. Genesis. 47, 14-18 (2009).
  13. Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
  14. Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
  15. Kumar, M. E., et al. Mesenchymal cells. Defining a mesenchymal progenitor niche at single-cell resolution. Science. 346, 1258810 (2014).
  16. Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev Biol. 1, 4 (2001).
  17. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
  18. Li, D. Y., et al. Elastin is an essential determinant of arterial morphogenesis. Nature. 393, 276-280 (1998).
  19. Miano, J. M., Cserjesi, P., Ligon, K. L., Periasamy, M., Olson, E. N. Smooth muscle myosin heavy chain exclusively marks the smooth muscle lineage during mouse embryogenesis. Circ Res. 75, 803-812 (1994).
  20. Curran, M. E., Atkinson, D. L., Ewart, A. K., Morris, C. A., Leppert, M. F., Keating, M. T. The elastin gene is disrupted by a translocation associated with supravalvular aortic stenosis. Cell. 73, 159-168 (1993).
  21. Li, D. Y., et al. Novel arterial pathology in mice and humans hemizygous for elastin. J Clin Invest. 102, 1783-1787 (1998).
  22. Li, D. Y., et al. Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis. Hum Mol Genet. 6, 1021-1028 (1997).
  23. Pober, B. R. Williams-Beuren syndrome. N Engl J Med. 362, 239-252 (2010).
  24. Pober, B. R., Johnson, M., Urban, Z. Mechanisms and treatment of cardiovascular disease in Williams-Beuren syndrome. J Clin Invest. 118, 1606-1615 (2008).
  25. Holtwick, R., et al. Smooth muscle-selective deletion of guanylyl cyclase-A prevents the acute but not chronic effects of ANP on blood pressure. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 7142-7147 (2002).
  26. Boucher, P., Gotthardt, M., Li, W. P., Anderson, R. G., Herz, J. LRP: role in vascular wall integrity and protection from atherosclerosis. Science. 300, 329-332 (2003).
  27. Zhang, J., et al. Generation of an adult smooth muscle cell-targeted Cre recombinase mouse model. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 23-24 (2006).
  28. Armstrong, J. J., Larina, I. V., Dickinson, M. E., Zimmer, W. E., Hirschi, K. K. Characterization of bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing mCherry fluorescent protein substituted for the murine smooth muscle alpha-actin gene. Genesis. 48, 457-463 (2010).
  29. Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
  30. Yokota, T., et al. Bone marrow lacks a transplantable progenitor for smooth muscle type alpha-actin-expressing cells. Stem Cells. 24, 13-22 (2006).

Play Video

Cite This Article
Misra, A., Feng, Z., Zhang, J., Lou, Z., Greif, D. M. Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta. J. Vis. Exp. (127), e56039, doi:10.3791/56039 (2017).

View Video