Summary
Vi beskriver ett protokoll för visualisering av insulin exocytos i intakt holmar med pHluorin, en pH-känsliga grönt fluorescerande protein. Isolerade öar är infekterad med adenovirus kodning pHluorin kopplat till den vesikler Last neuropeptid Y. Detta möjliggör upptäckt av insulin granule fusion händelser av konfokalmikroskopi.
Abstract
Insulinutsöndringen spelar en central roll i glukos homeostas under normala fysiologiska förhållanden samt som sjukdom. Nuvarande metoder att studera insulin granulat exocytos antingen använda elektrofysiologi eller mikroskopi kopplat till uttrycket av fluorescerande reportrar. Men de flesta av dessa tekniker har optimerats för klonal cellinjer eller kräva separera Langerhanska. Däremot tillåter metoden presenteras här för realtid visualisering av insulin granulat exocytos i intakt Langerhanska. I detta protokoll beskriver vi först en virusinfektion som isolerade Langerhanska med adenovirus som kodar en pH-känsliga grönt fluorescerande protein (GFP), pHluorin, kopplad till neuropeptid Y (NPY). Det andra beskriver vi de confocal imaging av holmar fem dagar efter virusinfektion och hur att övervaka granule insulinutsöndringen. Kortfattat, de infekterade holmarna placeras på ett täckglas på en tänkbar kammare och avbildas en upprätt laserskanning confocal Mikroskop medan att vara kontinuerligt perfusion med extracellulära lösning innehållande olika stimuli. Confocal bilder som spänner över 50 µm ön förvärvas som time-lapse inspelningar med en snabb-resonant scanner. Fusion av insulin granulat med plasmamembranet kan följas över tid. Detta förfarande också medger provning ett batteri av stimuli i ett enda experiment, är kompatibel med både mus och mänskliga holmar och kan kombineras med olika färgämnen för funktionell avbildning (t.ex., membran potentiella eller cytosoliska kalcium färgämnen).
Introduction
Insulin produceras av betacellerna i bukspottskörteln Holmen och det är en viktig regulator av glukos metabolism1. Dödsfall eller dysfunktion av betacellerna stör glukoshomeostasen och leder till diabetes2. Insulin är förpackad i tät-core granulat som släpps i en Ca2 +-beroende sätt3. Belysa hur insulin granulat exocytos regleras är nödvändigt att helt förstå vad bestämmer insulinutsöndringen och öppnar nya vägar för identifiering av nya terapeutiska mål för behandling av diabetes.
Insulin exocytos har studerats med elektrofysiologiska metoder, såsom membran kapacitans mätningar och mikroskopiska metoder i kombination med fluorescerande molekyler. Membranet kapacitans mätningar har bra temporal upplösning och tillåta enstaka cell inspelningar. Men förändringar i kapacitansen reflektera ytbehandla nettoförändringen av cellen och inte fånga enskilda fusion händelser eller skilja insulin granule fusion från andra icke-insulinberoende sekretoriska vesikler3. Mikroskopiska metoder, såsom två-foton eller totala inre reflektion fluorescensmikroskopi (Frida) i kombination med fluorescerande sonder och vesikler Last proteiner, ge ytterligare information. Dessa tekniker fånga enstaka exocytotic händelser och även före och efter exocytotic stadier och kan användas för att studera exocytotic mönster i populationer av celler3.
Fluorescerande reportrar kan vara av tre typer: 1) extracellulära, 2) cytoplasma eller 3) vesikulär. (1) extracellulära reportrar är polar spårämnen (t.ex., dextrans, sulforhodamine B (SRB), lucifer gul, pyranine) som kan införas genom den extracellulära miljö4. Användning av polar spårämnen tillåter för utredning av fusion pore i en population av celler och fångar olika intercellulära strukturer som blodkärl. De rapporterar dock inte på vesikler Last beteende. (2) cytoplasmiska reportrar är fluorescerande sonder kopplade till membran-associerade proteiner som möter cytoplasman och medverkar i docknings- och exocytos. Exempel är medlemmar av familjen receptor (SNARA) lösliga N- ethylmaleimide-känslig faktor fastsättning protein som har använts framgångsrikt i neurovetenskap för att studera signalsubstansen release5. Sådana proteiner har flera bindande partners och inte insulin-granule specifika. (3) vesikulär reportrar är fluorescerande sonder smält till vesikulär Last proteiner som möjliggör undersökning av Last-specifika vesikler beteende. Insulin-granule Last proteiner är insulin, c-peptid, holme amyloid polypeptid och NPY bland andra6,7. NPY finns endast i insulin innehållande granulat och släpps tillsammans med insulin, vilket gör det till en utmärkt partner för en fluorescerande reporter8.
Fusion av olika fluorescerande proteiner till NPY har tidigare varit anställd att studera olika aspekter av exocytos i neuroendokrina celler, såsom kravet på särskilda synaptotagmin isoformer9,10 och hur tid-jaga av release beror på cytoskelettet aktin och myosin II11,12. I denna studie valde vi pHluorin som fluorescerande reportern, som är en modifierad GFP som är icke-fluorescerande på sura pH-värde inuti tät kärna granulat men blir ljust fluorescerande vid exponering till neutralt extracellulära pH13. Mogen insulin granulat har ett surt pH-värde under 5,5. När granulat säkringar med plasmamembranet och öppnar, är dess last utsatt för neutrala extracellulära pH 7,4, medger användning av de pH-känsliga proteiner pHluorin som reporter7,14.
Med tanke på pH känsliga karaktär pHluorin och selektiv uttrycket av NPY i insulin granulat, kan den NPY-pHluorin fusion bygga användas för att studera olika egenskaper av insulin granulat exocytos. Viral leveransen av den fusion konstruktionen säkerställer hög transfection effektivitet och fungerar på primära beta-celler eller cellinjer och isolerade öar. Denna metod kan också användas som en riktlinje för att studera exocytos i någon annan celltyp med NPY-innehållande vesikler. Det kan också kombineras med någon transgen musmodell att studera effekter av vissa villkor (knockdowns, överuttryck, etc.) på exocytos. Denna teknik har använts tidigare att karakterisera rumsliga och tidsmässiga mönster av granule insulinsekretionen i betacellen populationer i mänskliga holmar15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
den Djuretiska kommittén av University of Miami har godkänt alla experiment.
1. viral infektion av intakt isolerade mänskliga eller mus Langerhanska
- holme kultur: Förbered holme kultur: Connaught medicinsk forskning laboratorier (CMRL) 1066, 10% (v/v) FBS och 2 mM L-glutamin.
- Mänskliga Langerhanska erhålls från den integrerade Islet Distribution Program (NIDDK, NIH). Vid ankomsten, överföra holmarna (~ 500 holme medel) till 35 mm icke-vävnad kultur behandlas petriskålar med 2 mL CMRL kulturmassmedia vid 37 ° C, 5% / 95% CO 2 /O 2 för 24 h innan virusinfektion.
- Mus Langerhanska kan isoleras efter tidigare fastställda protokoll 16. Efter isolering, kultur ~ 200 holme medel i 35-mm icke-vävnadskultur behandlas petriskålar med 2 mL CMRL kulturmassmedia vid 37 ° C, 5% / 95% CO 2 /O 2 för 24 h innan virusinfektion.
Obs: Undvik att använda transgena möss med GFP eller YFP reportrar uttryckt på kobbar för att undvika fluorescens överlappning med NPY-pHluorin.
- Virus förberedelse
Obs: NPY-pHluorin fusion klonades till pcDNA3 vector 10 och subcloned i en adenovirala vektor för adenovirala produktion [adenovirus serotyp 5 (DE1/E3)] av ett rekombinant adenovirus tillverkande företag. Viruset var aliquoted och lagras vid-80 ° C. Viral beståndet tillhandahålls av bolaget på titrar av 10 12 till 10 13 viruspartiklar (~ 3 x 10 10 - 3 x 10 11 PFU).- För in vitro- holme infektion, användning 10 6 PFU/mL, vilket resulterar i en ungefärlig multiplicity av infektion (MOI) för runt 2 (se diskussion för detaljer)
- Virusinfektion av Langerhanska
Försiktighet: Arbeta med adenoviruses kräver biosäkerhetsnivå 2 (BSL2) förfaranden och certifiering. Kontrollera med den institutionella biosäkerhet Officer för vägledning och utbildning om BSL2 förfaranden.- Förbereda mänskliga/mus holmar som beskrivs ovan.
- Lägga 5-10 µL av lager virus varje 35 mm Petri skålen som innehåller mänskliga/mus holmar i 2 mL CMRL kultur media (med 10% FBS och 2 mM L-glutamin).
Obs: Justera volymen för det virus som används enligt viral titern som tillhandahålls av företaget databladet. - Kultur kobbar och skär i virusinnehållande media på 37 °C/5% CO 2 24 h.
- Efter 24 h, aspirera virusinnehållande media och ersätta med 2 mL CMRL kultur media (med 10% FBS och 2 mM L-glutamin).
- Kultur kobbar och skär i 4-6 dagar vid 37 °C/5% CO 2, ersätta media varje 3 dagar.
- Efter 4 - 6 dagars odling, räkna med runt 30% av cellöar att smittas. Kobbar kan sedan användas för levande imaging experiment.
2. Confocal Imaging av infekterade holmar
Obs: hänvisa till Tabellen för material för material och utrustning som krävs för confocal imaging.
- Reagens förberedelse och experimentella setup
- förbereda extracellulära lösning: Lägg till 125 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,56 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25 mM HEPES, 0,1% BSA, pH 7,4, sterila filtreras.
Obs: Denna buffert är normalt beredd utan glukos och kan lagras vid 4 ° C i upp till 1 månad. Glukos läggs på dagen för försöket att nå önskad slutliga koncentration.- Förbered basala glukos (3 mM) medium: Tillsätt 75 µL av 2 M glukos lager 50 ml av extracellulära lösning.
- Hyperglykemiska (16 mM) medium: Tillsätt 400 µL av 2 M glukos lager 50 ml av extracellulära lösning
- Späd någon extra stimulus (t.ex., KCl eller adenosintrifosfat (ATP)) extracellulära lösning innehållande 3 mM glukos.
- Innan du börjar ett experiment, förbehandla coverslips med poly-D-lysin genom att 30 µL poly-D-lysin lösning (1 mg/mL) till täckglaset för 1 h och noggrant skölja det med H 2 O.
Obs: Den poly-lysin belagda coverslips kan förvaras vid rumstemperatur i upp till 6 månader. - Minst 1 h innan experimentet, med 1 mL pipett, överföra kobbar och skär till en 35 mm petriskål innehållande extracellulära lösning med 3 mM glukos. Hålla holmarna vid 37 ° C och 5% CO 2.
Obs: Om det behövs, plasmamembranet kan märkas i det här steget. Etikettera plasmamembranet genom att lägga till 2 µM di-8-ANEPP dye till extracellulära lösningen med 3 mM glukos. Inkubera kobbar och skär i dye lösning för 1 h på 37 °C/5% CO 2. Plasmamembranet färgen kan vara upphetsad på 488 nm och upptäcks på 620 nm. - min innan start ett experiment, fäst täckglaset imaging kammaren genom att täta den med vakuum silikonfett. Fixa imaging kammaren till imaging-plattformen. Med pipett, placera 20-30 holmar på poly-D-lysin-behandlade området av täckglas och låt holmarna följa ytan för 20 min.
Obs: Det är viktigt att inte låta täckglaset torka för att undvika islet. - Medan holmarna följa täckglaset, förbereda perfusion systemet genom att noggrant skölja det med vatten. Lägga till varje lösning till en annan kanal: 3 mM glukos (kanal 1), 16 mM glukos (kanal 2), 16 mM glukos med 100 µM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) och 10 µM forskolin (kanal 3), 25 mM KCl i 3 mM glukos (kanal 4), 10 µM ATP i 3 mM glukos ( kanal 5). Ta bort alla bubblor från systemet genom att öppna varje kanal separat och låta lösning flödet i några minuter och se till att flödet är konsekvent (0,5 mL/min) och slangen inte läcker.
- Anslut enda inline lösning värmaren till perfusion outlet röret och justera temperaturen av utströmmande bufferten till 37 ° C.
- Förbered pumpen. Ta bort alla bubblor från systemet och se till att flödet är konsekvent och slangen inte läcker.
- När holmarna följa täckglas ytan, Fyll försiktigt upp imaging kammaren med extracellulära lösningen innehållande 3 mM glukos. Undvika tvätt kobbar och skär bort från ytan av täckglaset.
- Placera imaging plattformen med kobbar och skär till Mikroskop scenen och Anslut den till perfusion systemet och sugpump.
- Tur på flödet och ständigt BEGJUTA kobbar och skär med 3G extracellulära lösningen. Systemet är nu klar för confocal imaging.
- förbereda extracellulära lösning: Lägg till 125 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,56 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25 mM HEPES, 0,1% BSA, pH 7,4, sterila filtreras.
- Confocal imaging
- lokalisera holmarna i fältet Mikroskop med lägre förstoring. När fokuserade på holmarna, byta till högre förstoringsgrad (t.ex., 63 X vatten nedsänkning mål (63 X / 0.9 NA)).
- Öppna förvärvet med programvara (Tabell av material) och aktivera resonant scanner läget.
- Välj XYZT imaging läge och konfigurera förvärv inställningarna enligt följande:
- vända på Argon laser och 488 nm laser linje och justera laser kraften till 50% för pHluorin magnetisering.
- Samla utsläpp vid 505-555 nm.
- Välja en upplösning på 512 x 512 pixlar. Tryck på den " Live " för att starta imaging och justera vinst nivåerna (typisk vinst är omkring 600 V).
- Ange början och slut av z-stacken: fokusera på toppen av Holmen och välja " börja " och flytta till den sista planet som kan inriktas och välja " slutet ". Använda en z-steg storlek av 5 µm. Programvaran kommer automatiskt beräkna antalet confocal flygplan.
- Ställa in tidsintervallet för förvärvet av varje z-stack nära 1,5-2 s och välja alternativet " förvärva tills slutat " för kontinuerlig avbildning.
- Tryck på den " start " knappen initialize.
- Använda olika stimulering protokoll för att inducera granulat exocytos av startas kobbar och skär med de önskvärda stimuli. Stimulering protokoll kan anpassas till det vetenskapliga ändamålet (se nedan).
- Stimulering protokoll
Observera: I varje stimulering protokoll, start av inspelning minst 2 min av holme bakgrund aktivitet under konstant perfusion med extracellulära lösning innehållande 3 mM glukos. BEGJUTA med en stimulerande för en önskad tidsperiod. Ordningen på stimulantia, varaktigheten av stimulering samt varaktighet av inspelningar kan anpassas för att passa de önskade vetenskapliga ändamål. Se till att tvätta holmar med extracellulära lösning innehållande 3 mM glukos innan du startar en ny stimulans. Nedan finner du de prov stimulering protokoll som har använts för att demonstrera metoden funktionerna.- Stimulera med ammoniumklorid (NH 4 Cl) som en positiv kontroll för pHluorin pH känslighet och virusinfektion effektivitet ( figur 3): 3 mM glukos (2 min) → 50 mM NH 4 Cl (2 min) i 3 mM glukos → 3 mM glukos (2 min)
Observera: I the NH 4 Cl lösning, ersätta NaCl på basis av equimolar. - Stimulera insulin granulat exocytos av öka glukos koncentrationen ( figur 5 och figur 6): 3 mM glukos (2 min) → 16 mM glukos (15-30 min) → 3 mM glukos (2 min
Obs: För att se flera utbrott av aktivitet, BEGJUTA holmarna kontinuerligt med 16 G lösningen i minst 15 min.
Obs: För att öka samstämmigheten i sekretoriska Svaren 17, användare kan lägga till cAMP-raising agenter (100 µM IBMX och 10 µM forskolin) till både 3 G och 16 G lösningar. Detta ändrar inte de tidsmässiga mönster av granule sekretion. För detaljer se 15 och diskussion.
- Stimulera med ammoniumklorid (NH 4 Cl) som en positiv kontroll för pHluorin pH känslighet och virusinfektion effektivitet ( figur 3): 3 mM glukos (2 min) → 50 mM NH 4 Cl (2 min) i 3 mM glukos → 3 mM glukos (2 min)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hela arbetsflödet av tekniken visas i figur 1. Kort, mus eller mänskliga holmar kan vara infekterade med adenovirus kodning NPY-pHluorin och avbildas, efter några dagar i kultur, under en confocal Mikroskop. Som granulat säkring med plasmamembranet och öppna, en ökning av fluorescens observeras och kan kvantifieras (figur 1). För att avgöra om NPY-pHluorin verkligen är ett lämpligt verktyg för att övervaka insulin granule dynamics, var infekterade holmar immunostained med antikroppar mot GFP och olika holme hormonerna insulin, somatostatin eller glukagon. De flesta celler som uttrycker NPY-pHluorin (GFP positiv) var betacellerna som de uttryckte också insulin (~ 90%. Figur 2A, 2B). Endast några glukagon-positiva alpha celler eller somatostatin-positiv delta celler var GFP-märkta (figur 2B). Allt i infekterade celler, NPY fusion colocalized med insulin (Pearsons korrelationskoefficient på 0,61 ± 0,04 för god Jordbrukarsed och insulin vs. 0.21 ± 0,05 för god Jordbrukarsed och glukagon och 0,07 ± 0,01 för god Jordbrukarsed och somatostatin).
Vi visat att pHluorin är en effektiv pH-sensor, som ökar den intracellulära pH med 50 mM NH4Cl resulterade i en > 500% ökning i den intracellulära fluorescensen (figur 3A, 3B, Video 1). Som pH inuti granulat ökar vid fusion med plasmamembranet och öppnandet av fusion pore, blir granulat innehållande NPY-pHluorin synliga på villkor som stimulerar insulin exocytos såsom membran depolarisation med KCl (figur 4, video 2).
Inre sekretoriska händelser i beta-cellerna inom intakt holmar kan visualiseras med confocal time-lapse avbildning av NPY-pHluorin smittade holmar. Dessa förekomma svar på direkta membran depolarisation med KCl eller flera andra fysiologiska stimuli (figur 4 och figur 7, se nedan). I basala extracellulära glukos koncentrationen (3 mM) observeras lite sekretoriska aktivitet. Men utlöses granule fusion med plasmamembranet som svar på stimulering med hög glukos (16 mM) (figur 5A, Video 3). Genom att placera ROIs med olika storlekar och i olika områden, kan reaktion kineticsen av sekretoriska granuler jämföras med de enskilda celler eller grupper av celler i närheten (kluster) (figur 5B). Denna typ av analys aktiverat fastställer att: 1) enskilda sekretoriska händelser är mycket synkroniserade och utsöndras inom ett par sekunder från den genomsnittliga cellssvar, och 2) beta-cellerna i närheten bilda funktionella kluster av synkroniserade aktiviteten.
Insulinutsöndringen i kroppen uppstår i ett pulserande sätt. Stimulera de NPY-pHluorin-infekterade holmarna med förhöjda glukos koncentration för längre perioder (15-20 min) gav upphov till flera pulser (eller skurar) sekretion (figur 6, Video 4). Under varje puls säkring enskilda granulat med plasmamembranet i en synkroniserad mode som visas innan (figur 5). Skurar av sekretoriska aktiviteten kan vara sett varje 3-4 min.
Övergående ökningar av fluorescens i NPY-pHluorin innehållande granulat kunde också observeras som svar på den purinergic agonist ATP (10 µM) eller den muskarina agonist acetylkolin (ACh, 10 µM) (figur 7), vilka båda är kända stimulatorer av insulinutsöndringen i mänskliga holmar. Som förväntat, utlöste den membran depolarisation med KCl (30 mM) också insulin granulat exocytos (figur 5). Flera stimuli kan tillämpas på samma holme preparatet så länge holmarna tvättas väl mellan stimuli. Se till att ändra ordningen för tillämpning när upprepa experimentet.
Figur 1. Ett system som illustrera analysen utvecklat. Adenovirus som kodar en pH-känsliga GFP (pHluorin) kopplat till NPY producerades och används att infektera mus eller mänskliga Langerhanska. Fyra till sex dagar efter infektion, holmarna placerades på ett täckglas och avbildas en upprätt laserskanning confocal Mikroskop. Den NPY-pHluorin konstruktion uttrycks i insulin granulat i betacellerna. Dess fluorescens är kylda på mogen insulin granulat sura pH men blir ljusa vid granule fusion med plasmamembranet och exponering för neutrala extracellulära pH 7,4.
Figur 2. Av NPY Fusion konstruera uttrycks i Insulin granulat. (A) Confocal bilder av intakt mänskliga holmar infekterade med NPY-pHluorin, immunostained för god Jordbrukarsed (grön) och insulin (vänster panel, röd), somatostatin (mitten, röd) eller glukagon (höger, röd). Cellkärnorna visas i blått (DAPI märkt). Skala barer = 10 µm. (B) kvantifiering av fraktionen av GFP-positiva celler som också innehåller insulin (Ins), somatostatin (Soma) eller glukagon (Glu). Visas är de medelvärde ± SEMs, n = 5 holmar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. NPY-pHluorin är en effektiv pH-Sensor. (A) Maximal projektion av confocal bilder av en mus holme infekterade med NPY-pHluorin extracellulära lösning innehållande 3 mM glukos före (övre panel, 3 G) och i närvaro av 50 mM NH4Cl (nedre panelen). Skalstapeln = 100 µm. (B) spår visar förändringen i genomsnittlig fluorescensintensiteten (godtyckliga enheter) i hela Holmen induceras av NH4Cl. streckad linje anger NH4Cl ansökan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Granulat innehållande NPY-pHluorin blir synliga när de säkring med plasmamembranet och öppen. Mänskliga isletsinfected med NPY-pHluorin adenovirus var incubatEd med plasmamembranet färga di-8-ANEPP (röd). Islet stimulering med KCl (30 mM) utlöses en plötslig och övergående utseende fluorescerande granulat på cellytan (visas i grönt). Confocal bilder av celler inom en mänsklig holme visas på innan den exocytotic svaren (t = 0), under (t = 3-9 s) och efter (t = 12 s). Kontrast justerades för att ta bort bakgrunden grön fluorescens. Skalstapeln = 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5. Hög glukos utlöser NPY-pHluorin Fusion med plasmamembranet. (A) Maximal projektion av confocal bilder av en intakt mänskliga holme i basala glukos koncentration (3 G - 3 mM glukos, vänster panel) eller hög glukos (16 G - 16 mM glukos, högra panelen) är infekterade med NPY-pHluorin. Extracellulära lösningar innehöll lägret att höja agenter forskolin och IBMX (se protokoll för detaljer). Skalstapeln = 10 µm. (B) spår visar förändringar i genomsnittlig fluorescens stödnivåer (godtyckliga enheter) i den gröna kanalen i ROIs placeras runt inre sekretoriska händelser (röd, granulat), celler (grön) eller cell kluster (blå). Hög glukos tillämpades för 5 min efter ~ 2,5 minuter i 3G. Fluorescens värden var normaliserade till värdet inledande fluorescens (baslinje). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Sekretoriska händelser generera diskret pulser av sekretion vid hög glukos. Spår som visar förändringar i menar fluorescensintensiteten (godtyckliga enheter) i ROIs placeras runt olika celler inom en intakt mänskliga holme vid ihållande stimulering med 16 mM glukos. Varje färg representerar en enskild cell. Explosion av sekretoriska aktiviteten kan vara sett varje 3-4 min. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 7. NPY-pHluorin Fusion med plasmamembranet utlöses av känd stimulatorer av insulinutsöndringen. Spår som visar förändringar i genomsnittlig fluorescensintensiteten (godtyckliga enheter) i ROIs placeras runt enskilda sekretoriska händelser i celler inom intakt mänskliga holmar som induceras av KCl (30 mM), ATP (10 µM), hög glukos (16G, 16 mM) och acetylkolin (Ach, 10 µM). KCl och ATP tillämpades i basala glukos koncentrationen (3 mM). Svarta linjer visar det genomsnittliga granulat och gråa linjer återspeglar SEM värden. Grönt spår visar motsvarande cellssvar. Horisontella tidsskala (2 min) gäller för alla grafer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1. NPY-pHluorin Adenovirus effektivt infektera cellöar och känsla pH-förändringar.
Mus holmar smittades i 4 dagar med adenovirus kodning NPY-pHluorin. Infekterade holmar placerades på ett täckglas och monterad på imaging kammaren. För att öka intracellulära pH, var holmarna perfusion med 50 mM NH4Cl läggas till den extracellulära lösning innehållande 3 mM glukos. En snabb och stark ökning av fluorescens kan ses på NH4Cl ansökan. Skalstapeln = 100 µm. hastighet film = 5 fps. Filmen varar totalt 90 s. vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video 2. Granulat innehållande NPY-pHluorin blir synliga när de säkring med plasmamembranet och öppen.
Mänskliga holmar infekterade med NPY-pHluorin adenovirus inkuberades med plasmamembranet dye di-8-ANEPP. Islet stimulering med KCl (30 mM) utlöses en plötslig och övergående utseende fluorescerande granulat på cellytan. En maximal projektion av confocal flygplan visas. Kontrast justerades för att ta bort bakgrunden grön fluorescens. Skalstapeln = 20 µm. hastighet film = 5 fps. Filmen varar totalt 60 s. vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video 3. Hög glukos utlösare exocytos av granulat innehållande NPY-pHluorin.
Fusion av NPY-pHluorin innehållande granulat utlöses som svar på stimulering med hög glukos (16 mM). I basal extracellulära glukos koncentration (3 mM) observeras lite sekretoriska aktivitet. Men vid hög glukos visas insulin granulat normalnivå på plasmamembranet av olika celler i en holme i en synkroniserad mode. Hög glukos tillämpades efter ~ 2,5 minuter i 3G (16G etikett visas). En maximal projektion av confocal flygplan visas. Skalstapeln = 20 µm. hastighet film = 10 fps. Filmen varar totalt 7 min. vänligen klicka här att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video 4. Långvarig stimulering med hög glukos utlöser flera skurar av exocytos.
Långvarig stimulering med hög glukos ger upphov till flera pulser av sekretion holmar, under vilken granulat normalnivå visas. Pulser av sekretoriska aktivitet kan ses varje ~ 3-4 min. Confocal plan av en mänsklig holme visas. En falsk systemet tillämpades för fluorescensintensiteten. Skalstapeln = 20 µm. hastighet film = 30 fps. Filmen varar totalt 20 min. vänligen klicka här att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta manuskript beskriver en teknik som kan användas för att visualisera exocytos av insulin granulat i beta-cellerna inom intakt Langerhanska av konfokalmikroskopi. Det använder NPY-pHluorin som fluorescerande reportern klonade in adenovirus för att säkerställa en hög transfection effektivitet.
Även om metoden var mycket effektiva i våra händer, det kan krävas vissa ändringar som primärt beror på två parametrar: 1) kvaliteten på islet förberedelse och 2) antikroppnivåns på viral lager med optimering av infektion villkor. Före virusinfektion av holmar, tillåta holme preparatet att återhämta sig från isolering och transport stress över natten vid 37 ° C. Inspektera holme morfologi under ett ljusmikroskop hela infektion/expressionsperioden och kontrollera för tecken på minskad lönsamhet som celler som sticker ut från islet ytan eller förekomst av hypoxisk celler (mörkare celler) i holme center18 . Varje viral bestånd kan variera i titer och infektion effektivitet. Se till att justera volymen på det virus som används enligt viral titern och tidpunkten för kultur före mikroskopi analysen. Den mest kritiska steget är optimering av infektion villkoren (t.ex., antal viruspartiklar, kulturtid innan assay) så att nog av reportern uttrycks och holme integritet och lyhördhet bibehålls. När du optimerar infektion protokollet och med varje ny viral batch, samla några holmar vid olika tidpunkter och kontrollera huruvida exocytos kan utlösas med KCl (30 mM) och/eller hög glukos (16 mM). Vi hittade att analysen fungerar bättre och cellöar förbli friska och glukos lyhörd när MOI är låg (cirka 2) och kultur tiden förlängs (ca 5 dagar) för att öka uttrycksnivåerna i av den fusion konstruktion. Våra resultat är i linje med en tidigare studie som visar att effektiv uttryck för genprodukter kan uppnås bättre på lägre transfecting koncentrationer av adenovirala vektorn samtidigt bevara holme funktionen19.
Tekniken har dock vissa begränsningar. En är att med hjälp av NPY-pHluorin som reporter, granulat inte kan visualiseras innan de säkring med plasmamembranet och fusion pore öppnar. För att studera insulin granule människohandel i stället för exocytos, kan adenovirus kodning NPY-andra användas i stället. En annan begränsning är att i lägre utsträckning NPY-pHluorin kan riktas till icke-insulinberoende innehållande granulat. Majoriteten av de celler som var infekterade med NPY-pHluorin uttryckte dock också insulin och mindre än 10% av celler uttrycks glukagon eller somatostatin. Faktiskt, glukos beroendet av granule sekretion, dess pulserande mönster och samtidig lokalisering med insulin, anges att mest sekretoriska händelser utgör Last release från insulin granulat. För att garantera övervakningen av insulin sker exocytos, analysen bör utföras under förhållanden som stimulerar insulinsekretionen (t.ex., hög glukos). Ändå, för att förbättra specificitet betacellen uttryck, NPY-pHluorin kunde sättas under kontroll av en mer selektiv promotor såsom råtta insulin arrangören. En annan begränsning av tekniken är att den kräver uttryck av exogena proteiner i insulin granulat, som kan störa deras biogenes och/eller beteende20. Detta bör beaktas när man tolkar resultaten av experimenten och, om möjligt, slutsatserna bör valideras med andra insulin granule Last proteiner (t.ex., C-peptid, holme amyloid polypeptid) som reportrar.
Detta protokoll rekommenderar också inklusive cAMP-raising agenter (IBMX och forskolin) för att förstärka effekterna av hög glukos på insulin granulat exocytos. Denna stimulering protokoll härmar aktivering av fysiologiskt relevanta ljudförstärkande vägar (utlöses av Inkretinerna eller parakrin och neurala signalmolekyler) att potentierar insulinutsöndringen genom att öka cAMP i betacellerna. Ändå, i avsaknad av cAMP jäsningsmedel, hög glukos (16 mM) framkallar också granulat exocytos men antalet sekretoriska händelser observeras är lägre. Granulat visas fortfarande i diskreta skurar, synkroniseras med den genomsnittliga cellssvar och Visa liknande burst perioder: 1,4-6,6 min i hög glukos plus IBMX/forskolin vs 1,5-10 min i hög glukos ensam.
Analysen beskrivs här är betydelse med avseende på befintliga metoder har tillräcklig rumsliga och temporal upplösning att visualisera enda fusion händelser i realtid i beta-cellerna inom intakt holmar. Det avslöjade exempelvis hög synkroniseringen med som insulin frigörs granulat i mänskliga holmar vid glukos stimulering. Om holmar är väl kopplade till täckglaset, kan de dessutom avbildas under längre perioder (minst 15-20 min). Detta användes för att visa att i mänskliga holmar exocytos uppstår i distinkta skurar som visas i perioder liknar dem av pulserande i vivo insulinsekretionen. Analysen kan också för att testa effekten av flera stimuli på insulin exocytos använder murina eller mänskliga holmar. Dessutom eftersom det inte kräver islet cell dissociation som andra metoder, kan det användas för att studera beteendet hos beta cellpopulationer inom en holme. Faktiskt, vi observerade att närliggande beta-cellerna bildar kluster av ~ 5-10 celler där aktiviteten synkroniseras. Beta-celler från samma kluster är förmodligen kombination av gap junction kanaler av connexin 3621. Deras synkroniserade svar illustrerar den beta cell anslutningen som är nödvändig för korrekt insulin sekretionen22.
I framtiden kan denna teknik kombineras med andra fluorescerande färgämnen för funktionella imaging att visualisera i realtid hur förändringar i cytosoliskt kalcium eller membranpotentialen, exempelvis korrelerar med granulat exocytos i betacellerna. I synnerhet som nya pH känsliga röd fluorescerande proteiner blir tillgängliga14,23 , och kan vara smält NPY eller andra insulin granule Last proteiner, kan gröna färgämnen för funktionell avbildning användas. Denna teknik kan dessutom kombineras med en musmodell för i vivo imaging av simblåsa holmar transplanteras in i främre kammaren av mus ögat24. Kobbar kan vara infekterad med adenoviruses 48-72 h före transplantation in i ögat. Immun bristfällig möss bör användas om mänskliga holmar transplanteras. Använda denna modell, kan subcellulär rumsliga mönstret av granule insulinsekretionen korreleras med vaskulär arrangemang25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Marcia Boulina från DRI imaging core facilitet för hjälp med Mikroskop. Detta arbete stöds av NIH grants 1K01DK111757-01 (JA), F31668418 (MM), R01 DK111538, R33 ES025673 och R56 DK084321 (AC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Upright laser-scanning confocal microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS-SP5 | includes LAS AF, the image acquisition software |
| Imaging chamber | Warner instruments | RC-26 | |
| Imaging chamber platform | Warner instruments | PH-1 | |
| 22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA | |
| Multichannel perfusion system | Warner instruments | VC-8 | |
| Single inline solution heater | Warner instruments | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-324C | |
| Peristaltic Suction pump | Pharmacia | P-1 | |
| 35 mm Petri dish, non-tissue culture treated | VWR | 10861-586 | |
| CMRL Medium, no glutamine | ThermoFisher | 11530037 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| 5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| 3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| 1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| Vacuum filter | VWR | 431098 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-aldrich | P6407 | |
| Di-8-ANNEP | ThermoFisher | D3167 | |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 |
References
- Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis. Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).
- Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J., Martinez-Sanchez, A. Pancreatic beta-cell identity, glucose sensing and the control of insulin secretion. Biochem J. 466 (2), 203-218 (2015).
- Rorsman, P., Renstrom, E. Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells. Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297 (5585), 1349-1352 (2002).
- Ramirez, D. M., Khvotchev, M., Trauterman, B., Kavalali, E. T. Vti1a identifies a vesicle pool that preferentially recycles at rest and maintains spontaneous neurotransmission. Neuron. 73 (1), 121-134 (2012).
- Michael, D. J., Xiong, W., Geng, X., Drain, P., Chow, R. H. Human insulin vesicle dynamics during pulsatile secretion. Diabetes. 56 (5), 1277-1288 (2007).
- Ohara-Imaizumi, M., et al. Monitoring of exocytosis and endocytosis of insulin secretory granules in the pancreatic beta-cell line MIN6 using pH-sensitive green fluorescent protein (pHluorin) and confocal laser microscopy. Biochem J. 363 (Pt 1), 73-80 (2002).
- Whim, M. D. Pancreatic beta cells synthesize neuropeptide Y and can rapidly release peptide co-transmitters. PLoS One. 6 (4), e19478 (2011).
- Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
- Zhu, D., et al. Synaptotagmin I and IX function redundantly in controlling fusion pore of large dense core vesicles. Biochem Biophys Res Commun. 361 (4), 922-927 (2007).
- Aoki, R., et al. Duration of fusion pore opening and the amount of hormone released are regulated by myosin II during kiss-and-run exocytosis. Biochem J. 429 (3), 497-504 (2010).
- Felmy, F. Modulation of cargo release from dense core granules by size and actin network. Traffic. 8 (8), 983-997 (2007).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Gandasi, N. R., et al. Survey of Red Fluorescence Proteins as Markers for Secretory Granule Exocytosis. PLoS One. 10 (6), e0127801 (2015).
- Almaca, J., et al. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58 (12), 2810-2818 (2015).
- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. J Vis Exp. (99), e52632 (2015).
- Hanna, S. T., et al. Kiss-and-run exocytosis and fusion pores of secretory vesicles in human beta-cells. Pflugers Arch. 457 (6), 1343-1350 (2009).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
- Weber, M., et al. Adenoviral transfection of isolated pancreatic islets: a study of programmed cell death (apoptosis) and islet function. J Surg Res. 69 (1), 23-32 (1997).
- Michael, D. J., et al. Fluorescent cargo proteins in pancreatic beta-cells: design determines secretion kinetics at exocytosis. Biophys J. 87 (6), L03-L05 (2004).
- Serre-Beinier, V., et al. Cx36 makes channels coupling human pancreatic beta-cells, and correlates with insulin expression. Hum Mol Genet. 18 (3), 428-439 (2009).
- Rutter, G. A., Hodson, D. J. Beta cell connectivity in pancreatic islets: a type 2 diabetes target? Cell Mol Life Sci. 72 (3), 453-467 (2015).
- Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57 (8), 1655-1663 (2014).
