Summary
Vi beskriver en protokol for visualisering af insulin exocytose i intakt Holme ved hjælp af pHluorin, en pH-følsom grøn fluorescerende proteiner. Isolerede øer er inficeret med adenovirus kodning pHluorin koblet til vesikel cargo neuropeptid Y. Dette giver mulighed for påvisning af insulin granulet fusion begivenheder af Konfokal mikroskopi.
Abstract
Insulinsekretion spiller en central rolle i glukose homøostase under normale fysiologiske forhold såvel som sygdom. Nuværende metoder til at studere insulin granulet exocytose enten bruge Elektrofysiologi eller mikroskopi koblet til udtryk af fluorescerende journalister. Men de fleste af disse teknikker er blevet optimeret til klonede cellelinjer eller kræve, at miljøomkostningerne i bugspytkirtlen Holme. Derimod tillader metoden præsenteres her for realtid visualisering af insulin granulet exocytose i intakt i bugspytkirtlen Holme. I denne protokol beskrive vi først virusinfektion i isolerede pancreas Holme med adenovirus, der koder en pH-følsom grøn fluorescerende proteiner (NGL), pHluorin, koblet til neuropeptid Y (NPY). For det andet beskriver vi de Konfokal imaging af Holme fem dage efter virusinfektion, og hvordan man kan overvåge granulet insulinsekretion. Kort, de inficerede Holme er placeret på en coverslip på en billeddannelse kammer og afbildet i en opretstående laser-scanning Konfokal mikroskop mens bliver løbende perfunderet med ekstracellulære løsning indeholdende forskellige stimuli. Konfokal billeder der spænder over 50 µm af holmen er erhvervet som time-lapse optagelser ved hjælp af en fast-resonant scanner. Fusion af insulin granulat med plasma membran kan følges over tid. Denne procedure også giver mulighed for at teste et batteri af stimuli i en enkelt eksperiment, er kompatibel med både mus og menneskelige Holme, og kan kombineres med forskellige farvestoffer for funktionel billeddannelse (fx, membran potentielle eller cytosole calcium farvestoffer).
Introduction
Insulin er produceret af beta-celler i pancreas Holmen, og det er et centralt regulator af glukose metabolisme1. Død eller dysfunktion af betaceller forstyrrer glukose homøostase og fører til diabetes2. Insulin er pakket i tætte-core granulat, der er udgivet i en Ca2 +-afhængige måde3. Belyse, hvordan insulin granulet exocytose reguleres er afgørende for fuldt ud at forstå hvad bestemmer insulinsekretion og åbner nye muligheder for identifikation af nye terapeutiske mål for behandling af diabetes.
Insulin exocytose er blevet grundigt undersøgt, brug af elektrofysiologiske tilgange, såsom membran kapacitans målinger og mikroskopiske tilgange i kombination med fluorescerende molekyler. Membran kapacitans målinger har god tidsmæssige opløsning og tillade enkelt celle optagelser. Men ændringer i kapacitansen afspejle netto overflade af cellen og ikke fange enkelte fusion begivenheder eller skelne insulin granulet fusion fra andre ikke-insulinkrævende sekretoriske vesikler3. Mikroskopiske tilgange, såsom to-foton eller total interne reflection fluorescens (JOHANNAS) mikroskopi i kombination med fluorescerende sonder og vesikel cargo proteiner, give yderligere detaljer. Disse teknikker fange enkelt exocytotic begivenheder og også de præ- og post exocytotic faser og kan bruges til at studere exocytotic mønstre i populationer af celler3.
Fluorescerende journalister kan være af følgende tre typer: 1) ekstracellulære, 2) cytoplasmatisk eller 3) vesikulære. 1) ekstracellulære reportere er polar røbestoffer (fx, dextrans, sulforhodamine B (SRB), lucifer gule, pyranine), der kan indføres gennem det ekstracellulære miljø4. Brugen af polar røbestoffer giver mulighed for undersøgelse af fusion pore i en population af celler og indfanger forskellige intercellulære strukturer såsom blodkar. De rapporterer imidlertid ikke på vesikel cargo adfærd. 2) cytoplasmatisk reportere er fluorescerende prober koblet til membran-associerede proteiner, der står over cytoplasmaet og er involveret i docking og exocytose. Eksempler omfatter medlemmer af opløselige N- ethylmaleimide-følsomme faktor vedhæftet fil protein receptor (SNARE) familie, der er brugt med succes i neurovidenskab for at studere neurotransmitter frigivelse5. Sådanne proteiner har flere partnere, bindende og ikke insulin-granul specifikke. 3) vesikulære reportere er fluorescerende sonder smeltet til vesikulære cargo proteiner, der giver mulighed for undersøgelse af fragt-specifikke vesikel adfærd. Insulin-granul last proteiner omfatter insulin, c-peptid, Holmen amyloid polypeptid og NPY blandt andet6,7. NPY er kun til stede i insulin indeholdende granulat og udgives sammen med insulin, hvilket gør det en fremragende partner for en fluorescerende reporter8.
Fusion af forskellige fluorescerende proteiner til NPY har været tidligere ansat til at studere forskellige aspekter af exocytose i neuroendokrine celler, såsom kravet om specifikke synaptotagmin isoformer9,10 , og hvordan den tidsforløb for frigivelse afhænger af actin cytoskelettet og myosin II11,12. I denne undersøgelse, vi valgte pHluorin som de fluorescerende reporter, som er en modificeret normal god landbrugspraksis, der er ikke-fluorescerende på sure pH-værdi inde tæt kerne granulat men bliver smukt fluorescerende ved udsættelse for neutral ekstracellulære pH13. Modne insulin granulat har en sur pH under 5,5. Når granulet sikringer med plasma membran og åbner, udsat sin last neutral ekstracellulære pH-værdi på 7,4, der tillader anvendelse af pH-følsom proteiner pHluorin som reporter7,14.
PH følsomme karakter af pHluorin og selektiv udtryk for NPY i insulin granulat, kan NPY-pHluorin fusion konstruktion bruges til at studere forskellige egenskaber for insulin granulet exocytose. Viral levering af fusion konstruktion sikrer høj Transfektion effektivitet og virker på primære beta celler eller cellelinjer og isolerede småøer. Denne metode kan også bruges som en retningslinje for at studere exocytose i enhver anden celletype med NPY-holdige vesikler. Det kan også kombineres med enhver transgene musemodel til at undersøge virkningerne af visse betingelser (knockdowns, overekspression, etc.) på exocytose. Denne teknik er tidligere blevet brugt til at karakterisere rumlige og tidsmæssige mønstre af granulet insulinsekretion i beta cellepopulationer i menneskelige Holme15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreetik Udvalget af University of Miami har godkendt alle eksperimenterne.
1. viral infektion af intakt isolerede menneskelige eller mus i bugspytkirtlen Holme
- Holmen kultur: forberede islet Kulturmedier: Connaught medicinsk forskning laboratorier (CMRL) 1066, 10% (v/v) FBS og 2 mM L-glutamin.
- Menneskelige pancreas Holme er fremstillet af den integrerede Islet Distribution Program (NIDDK, NIH). Ved ankomsten, overføre småøerne (~ 500 islet ækvivalenter) til 35-mm ikke-vævskultur behandlet petriskåle med 2 mL CMRL Kulturmedier ved 37 ° C, 5/95% CO 2 /O 2 til 24 timer før virusinfektion.
- Mus i bugspytkirtlen Holme kan være isoleret efter tidligere etablerede protokoller 16. Efter isolering, kultur ~ 200 islet ækvivalenter i 35-mm ikke-vævskultur behandlet petriskåle med 2 mL CMRL Kulturmedier ved 37 ° C, 5/95% CO 2 /O 2 til 24 timer før virusinfektion.
Bemærk: Undgå at bruge Transgene mus med normal god landbrugspraksis eller YFP journalister udtrykt på Holme for at undgå fluorescens overlapning med NPY-pHluorin.
- Virus forberedelse
Bemærk: NPY-pHluorin fusion er blevet klonet i pcDNA3 vektor 10 og subcloned i en adenoviral vektor til adenoviral produktion [adenovirus serotype 5 (DE1/E3)] af en rekombinant adenovirus produktionsvirksomhed. Virussen var aliquoted og opbevares ved-80 ° C. Viral bestanden er fastsat af virksomheden på titers 10 12 til 10 13 virale partikler (~ 3 x 10 10 - 3 x 10 11 PFU).- Til i vitro islet infektion, brug 10 6 PFU/mL, hvilket resulterer i en omtrentlig mangfoldighed af infektion (MOI) af omkring 2 (Se diskussion for detaljer)
- Viral infektion i bugspytkirtlen Holme
Forsigtig: Arbejde med adenovirus kræver biosikkerhedsniveau 2 (BSL2) procedurer og certificering. Check med den institutionelle biosikkerhed Officer for vejledning og uddannelse på BSL2 procedurer.- Forberede menneskelige/mus Holme, som beskrevet ovenfor.
- Tilføje 5-10 µL af stock virus til hver 35-mm petriskål indeholdende menneskelige/mus Holme i CMRL kultur medier (med 10% FBS og 2 mM L-glutamin) sættes 2 mL.
Bemærk: Justere lydstyrken på den virus, som benyttes ifølge viral titer, som fastsat af selskabet dataark. - Kultur Holme i virus-holdige medier på 37 °C/5% CO 2 til 24 h.
- Efter 24 h, Opsug den virus-holdige medier og erstatte med 2 mL CMRL kultur medier (med 10% FBS og 2 mM L-glutamin).
- Kultur holmene i 4-6 dage ved 37 °C/5% CO 2, erstatter medierne hver 3 dag.
- Efter 4 - 6 dage for dyrkning, forventer omkring 30% af ø-celler til at være inficeret. Holme kan derefter bruges til live imaging eksperimenter.
2. Konfokal Imaging af inficeret Holme
Bemærk: henvise til Bordet af materialer til materialer og udstyr, der kræves for Konfokal imaging.
- Reagens forberedelse og eksperimentel opsætning
- forberede ekstracellulære løsning: Tilføj 125 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,56 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25 mM HEPES, 0,1% BSA, pH 7,4, sterile filtreret.
Bemærk: Denne buffer er normalt forberedt uden glukose og kan opbevares ved 4 ° C i op til 1 måned. Glucose er tilføjet på dagen af forsøget at nå den ønskede slutkoncentration.- Forbered basal glukose (3 mM) medium: tilføje 75 µL af 2 M glukose materiel til 50 mL af ekstracellulære løsning.
- Hyperglycemic (16 mM) medium: tilføje 400 µL af 2 M glukose materiel til 50 mL af ekstracellulære løsning
- Fortyndes enhver yderligere stimulans (fx, KCl eller adenosin trifosfat (ATP)) i ekstracellulær løsning indeholdende 3 mM glucose.
- Før du starter et eksperiment, forbehandle coverslips med poly-D-lysin ved at tilføje 30 µL af poly-D-lysin løsning (1 mg/mL) til coverslip for 1 h og grundigt skylning det med H 2 O.
Bemærk: Poly-lysin belagt coverslips kan opbevares ved stuetemperatur i op til 6 måneder. - Mindst 1 time før forsøget, ved hjælp af 1 mL pipette, overføre småøerne til en 35-mm petriskål indeholdende ekstracellulære løsning med 3 mM glukose. Holde holmene ved 37 ° C og 5% CO 2.
Bemærk: Hvis det er nødvendigt, plasma membran kan mærkes i dette trin. For at mærke plasmamembran, tilføje 2 µM di-8-ANEPP farvestof til den ekstracellulære løsning med 3 mM glukose. Inkuber Holme i dye løsning for 1 h 37 °C/5% CO 2. Plasma membran farvestof kan være glade på 488 nm og opdaget på 620 nm. - min før du starter et eksperiment, vedhæfte coverslip til den billeddiagnostiske afdeling ved forsegling det med vakuum siliconefedt. Fix imaging salen imaging-platformen. Ved hjælp af en pipette, sted 20-30 Holme poly-D-lysin-behandlede område ved coverslip og lad holmene overholder overfladen i 20 min.
Bemærk: Det er vigtigt ikke at lade coverslip tørre helt for at undgå skader på Holmen. - Mens småøerne overholder coverslip, forberede perfusion system ved at skylle det grundigt med vand. Tilføje hver løsning til en anden kanal: 3 mM glukose (kanal 1), 16 mM glukose (kanal 2), 16 mM glukose med 100 µM 3-isobutylacetophenon-1-Methylxanthin (IBMX) og 10 µM forskolin (kanal 3), 25 mM KCl i 3 mM glukose (kanal 4), 10 µM ATP i 3 mM glukose ( Kanal 5). Fjerne alle bobler fra systemet ved at åbne hver kanal adskilt og lade løsning flow i et par minutter, og sørg for, at strømmen er konsekvent (0,5 mL/min) og slangen er ikke utæt.
- Tilsluttes perfusion outlet rør enkelt inline løsning varmelegeme og justere temperaturen af den outflowing buffer til 37 ° C.
- Forbered med vakuumpumpen. Fjerne alle bobler fra systemet, og kontroller, at strømmen er konsekvent og slangen er ikke utæt.
- Når holmene tiltræde coverslip overfladen, forsigtigt fylde den billeddiagnostiske afdeling med det ekstracellulære løsning indeholdende 3 mM glukose. Undgå at vaske Holme væk fra overfladen af coverslip.
- Placere den billeddiagnostiske platform med småøer på mikroskop scenen og Tilslut den til perfusion system og vakuumpumpen.
- Tur på flow og konstant perfuse Holme med 3G ekstracellulære løsning. Systemet er nu klar til Konfokal imaging.
- forberede ekstracellulære løsning: Tilføj 125 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,56 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25 mM HEPES, 0,1% BSA, pH 7,4, sterile filtreret.
- Konfokal imaging
- Find holmene i feltet mikroskop med lavere forstørrelse. Når fokuseret på holmene, skifte til højere forstørrelse mål (fx, 63 X vand fordybelse mål (63 X / 0,9 NA)).
- Åbne erhvervelse ved hjælp af software (Table of Materials) og aktivere tilstanden resonant scanner.
- Vælg tilstanden XYZT billeddannelse og konfigurere indstillingerne for erhvervelse som følger:
- tænder på Argon laser og 488 nm laser linje og regulere laser magten til 50% for pHluorin excitation.
- Indsamle emission på 505-555 nm.
- Vælger en opløsning på 512 x 512 pixel. Tryk på den " Live " knappen for at starte imaging og justere de gevinst niveau (typisk gevinst er omkring 600 V).
- Indstille begin- og end af z-stack: fokusere på toppen Holmen og vælge " begin " og flytte til den sidste fly, der kan være fokuseret og vælge " slutningen ". Bruge en z-trin størrelse på 5 µm. Softwaren vil automatisk beregne antallet af Konfokal fly.
- Angive tidsintervallet for erhvervelse af hvert z-stak tæt på 1,5-2 s og vælge indstillingen " erhverve indtil stoppede " for kontinuerlig imaging.
- Tryk på den " start " knap til initialize.
- Anvender forskellige stimulation protokoller til at inducere granulet exocytose ved perfusing Holme med de ønskede stimuli. Stimulation protokoller kan tilpasses til at passe de ønskede videnskabelige formål (se nedenfor).
- Stimulation protokoller
Bemærk: I alle stimulation protokol, starte ved at optage mindst 2 min af holmen baggrund aktivitet under konstant perfusion med ekstracellulære løsning indeholdende 3 mM glukose. Perfuse med en stimulans for den ønskede periode. Rækkefølgen af stimulanser, varighed af stimulation og varighed af optagelser kan tilpasses til at passe de ønskede videnskabelige formål. Sørg for at vaske Holme grundigt med ekstracellulære løsning indeholdende 3 mM glukose før du starter en ny stimulation. Find prøven stimulation protokoller, der er blevet brugt til at demonstrere metode mulighederne nedenfor.- Stimulate med ammoniumklorid (NH 4 Cl) som en positiv kontrol for pHluorin pH følsomhed og viral infektion effektivitet ( figur 3): 3 mM glukose (2 min) → 50 mM NH 4 Cl (2 min) i 3 mM glukose → 3 mM glukose (2 min)
NOTE: I NH 4 Cl løsning, erstatte NaCl på grundlag af equimolar. - Stimulate insulin granulet exocytose ved at øge glukose koncentration ( figur 5 og figur 6): 3 mM glukose (2 min) → 16 mM glukose (15-30 min) → 3 mM glukose (2 min
Bemærk: For at se flere byger af aktivitet, perfuse Holme kontinuerligt med 16 G løsning i mindst 15 min.
Bemærk: For at øge sammenhængen i sekretoriske svar 17, kan brugere tilføje cAMP-raising agenter (100 µM IBMX og 10 µM forskolin) til både 3 G og 16 G løsninger. Dette ændrer ikke de tidsmæssige mønstre af granulet sekretion. For nærmere oplysninger se 15 og diskussion.
- Stimulate med ammoniumklorid (NH 4 Cl) som en positiv kontrol for pHluorin pH følsomhed og viral infektion effektivitet ( figur 3): 3 mM glukose (2 min) → 50 mM NH 4 Cl (2 min) i 3 mM glukose → 3 mM glukose (2 min)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hele arbejdsgangen for teknikken, der er vist i figur 1. Mus eller menneskelige Holme kan kortvarigt, inficeret med adenovirus kodning NPY-pHluorin og afbildet, efter nogle dage i kultur, under en Konfokal mikroskop. Som granulat fuse med plasma membran og åbne, en forøgelse af Fluorescens er observeret og kan kvantificeres (figur 1). For at afgøre, om NPY-pHluorin er faktisk et egnet redskab til at overvåge insulin granulet dynamics, var inficerede Holme immunostained med antistoffer mod normal god landbrugspraksis og forskellige islet hormoner insulin, somatostatin eller glukagon. De fleste celler udtrykker NPY-pHluorin (normal god landbrugspraksis positive) var beta-celler, som de gav også udtryk for insulin (~ 90%; Figur 2A, 2B). Kun et par glukagon-positive alfa celler eller celler, somatostatin-positive delta var normal god landbrugspraksis-mærket (figur 2B). Vigtigere, i inficerede celler, NPY fusion colocalized med insulin (Pearsons korrelationskoefficient 0,61 ± 0,04 for normal god landbrugspraksis og insulin vs 0.21 ± 0,05 for normal god landbrugspraksis og glukagon og 0,07 ± 0,01 for normal god landbrugspraksis og somatostatin).
Vi viste, at pHluorin er en effektiv pH sensor, som øger det intracellulære pH med 50 mM NH4Cl resulterede i en > 500% stigning i den intracellulære fluorescens (figur 3A, 3B, Video 1). PH inde granulet stiger efter fusion med plasma membran og åbningen af fusion pore, bliver granulat, der indeholder NPY-pHluorin synlige på betingelser, der stimulerer insulin exocytose såsom membran depolarisering med KCl (figur 4, video 2).
Enkelt sekretoriske begivenheder i beta celler i intakt Holme kan visualiseres med Konfokal time-lapse billeddannelse af NPY-pHluorin inficeret Holme. Disse forekomme som reaktion på direkte membran depolarisering med KCl eller flere andre fysiologiske stimuli (figur 4 og figur 7, se nedenfor). I basal ekstracellulære glukose koncentration (3 mM), er lille sekretoriske aktivitet observeret. Dog udløses granulet fusion med plasmamembran i respons på stimulation med høje glukose (16 mM) (figur 5A, Video 3). Ved at placere ROIs med forskellige størrelser og i forskellige områder, kan svar kinetik af sekretorisk granulat sammenlignes med de individuelle celler eller grupper af celler i umiddelbar nærhed (klynge) (figur 5B). Denne type analyse aktiveret fastslå, at: 1) de enkelte sekretoriske begivenheder er meget synkroniseret og udskilles i løbet af et par sekunder fra den gennemsnitlige celle respons, og 2) beta-cellerne i umiddelbar nærhed danne funktionelle klynger af synkroniseret aktivitet.
Insulinsekretion i kroppen opstår i en pulsatile måde. At stimulere de NPY-pHluorin-inficeret Holme med forhøjet glukose koncentration for længere perioder (15-20 min) gav anledning til flere bælgfrugter (eller brister) sekretion (figur 6, Video 4). Under hver puls fuse individuelle granulat med plasma membran i en synkroniseret måde som vist før (figur 5). Byger af sekretoriske aktivitet kan være set hver 3-4 min.
Forbigående stigning i fluorescens i NPY-pHluorin indeholdende granulat kunne også observeres i svar til purinergic agonist ATP (10 µM) eller muskarine agonist acetylkolin (ACh, 10 µM) (figur 7), som begge er kendt stimulatorer af insulinsekretion i menneskelige Holme. Som forventet, udløst membran depolarisering med KCl (30 mM) også insulin granulet exocytose (figur 5). Flere stimuli kan anvendes til de samme islet forberedelse, så længe holmene er skyllet godt i mellem stimuli. Sørg for at ændre rækkefølgen af programmet, når gentage eksperimentet.
Figur 1. En ordning, der illustrerer analysen udviklet. Adenovirus, der koder en pH-følsom normal god landbrugspraksis (pHluorin) koblet til NPY blev produceret og brugt til at inficere mus eller menneskelige pancreas Holme. Fire til seks dage efter infektion, blev holmene placeret på en coverslip og afbildet i en opretstående laser-scanning Konfokal mikroskop. NPY-pHluorin konstruktion er udtrykt i insulin granulat i beta celler. Dens Fluorescens er slukket på sure pH-værdi af modne insulin granulat men bliver lyse over granulet fusion med plasma membran og eksponering neutral ekstracellulære pH-værdi på 7,4.
Figur 2. NPY Fusion konstruere udtrykkes i Insulin granulat. (A) Konfokal billeder af intakt menneskelige Holme inficeret med NPY-pHluorin, immunostained for normal god landbrugspraksis (grøn) og insulin (venstre panel, red), somatostatin (midterste, røde) eller glukagon (højre, red). Cellekerner er vist i blåt (DAPI mærket). Skalere barer = 10 µm. (B) kvantificering af brøkdel af normal god landbrugspraksis-positive celler, som også indeholder enten insulin (Ins), somatostatin (Soma) eller glukagon (Glu). Vist er gennemsnit ± SEMs, n = 5 Holme. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. NPY-pHluorin er en effektiv pH Sensor. (A) maksimal projektion af Konfokal billeder af en mus islet inficeret med NPY-pHluorin i ekstracellulær løsning indeholdende 3 mM glukose før (øverste panel, 3 G) og 50 mM NH4Cl (nederste panel). Skalalinjen = 100 µm. (B) spor viser ændringen i gennemsnitlig fluorescens intensitet (arbitrære enheder) i hele Holmen induceret af NH4Cl. stiplet linje angiver NH4Cl ansøgning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Granulat der indeholder NPY-pHluorin bliver synlige, når de smelter med Plasma membran og åbne. Menneskelige isletsinfected med NPY-pHluorin adenovirus var incubatEd med plasmamembran farvestof di-8-ANEPP (rød). Holmen stimulation med KCl (30 mM) udløst en pludselig og kortvarig udseende af fluorescerende granulat på cellens overflade (vist med grønt). Konfokal billeder af celler i en menneskelig Holmen er vist på før den exocytotic reaktion (t = 0), under (t = 3-9 s) og efter (t = 12 s). Kontrast blev justeret for at fjerne baggrunden grønne fluorescens. Skalalinjen = 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Høje glukose udløser NPY-pHluorin Fusion med plasmamembran. (A) maksimal projektion af Konfokal billeder af en intakt menneskelige islet inficeret med NPY-pHluorin i basal glukose koncentration (3 G - 3 mM glukose, venstre panel) eller i høje glukose (16 G - 16 mM glukose, højre panel). Ekstracellulære løsninger indeholdt lejren hæve agenter forskolin og IBMX (Se protokol for detaljer). Skalalinjen = 10 µm. (B) spor viser ændringerne i gennemsnitlig fluorescens intensiteter (arbitrære enheder) i den grønne kanal i ROIs placeret omkring enkelt sekretoriske begivenheder (rød, granul), celler (grønne) eller celle klynger (blå). Høje glukose blev anvendt i 5 min efter ~ 2,5 min i 3G. Fluorescens værdier var normaliseret til indledende fluorescens værdi (baseline). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Sekretoriske begivenheder generere diskrete pulser af sekretion på høje glukose. Spor viser ændringer i betyde fluorescens intensitet (arbitrære enheder) i ROIs placeret omkring forskellige celler i en intakt menneskelige islet under vedvarende stimulering med 16 mM glukose. Hver farve repræsenterer en enkelt celle. Burst af sekretoriske aktivitet kan være set hver 3-4 min. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. NPY-pHluorin Fusion med plasmamembran er udløst af kendt stimulatorer af insulinsekretion. Spor viser ændringerne i gennemsnitlig fluorescens intensitet (arbitrære enheder) i ROIs placeret omkring enkelte sekretoriske begivenheder i celler i intakt menneskelige Holme induceret af KCl (30 mM), ATP (10 µM), høje glukose (16G, 16 mM) og acetylkolin (Ach, 10 µM). KCl og ATP blev anvendt i basal glukose koncentration (3 mM). Sorte linjer viser den gennemsnitlige granula og grå linjer afspejler SEM værdier. Grønne spor viser den tilsvarende celle respons. Vandrette tidshorisont (2 min) gælder for alle grafer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1. NPY-pHluorin Adenovirus effektivt inficere ø-celler og følelse pH-ændringer.
Musen Holme var smittet i 4 dage med adenovirus kodning NPY-pHluorin. Inficerede Holme blev placeret på en coverslip og monteret på den billeddiagnostiske afdeling. For at øge intracellulære pH, var holmene perfunderet med 50 mM NH4Cl føjes til den ekstracellulære løsning indeholdende 3 mM glukose. En hurtig og stærk stigning i fluorescens kan ses på NH4Cl ansøgning. Skalalinjen = 100 µm. film hastighed = 5 fps. Samlede varighed af filmen er 90 s. venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Video 2. Granulat der indeholder NPY-pHluorin bliver synlige, når de smelter med Plasma membran og åben.
Menneskelige Holme inficeret med NPY-pHluorin adenovirus var inkuberes med plasma membran farvestof di-8-ANEPP. Holmen stimulation med KCl (30 mM) udløst en pludselig og kortvarig udseende af fluorescerende granulat på cellens overflade. En maksimal projektion af Konfokal fly er vist. Kontrast blev justeret for at fjerne baggrunden grønne fluorescens. Skalalinjen = 20 µm. film hastighed = 5 fps. Samlede varighed af filmen er 60 s. venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Video 3. Høje glukose udløser exocytose af granulat der indeholder NPY-pHluorin.
Fusion af NPY-pHluorin indeholdende granulat udløses i respons på stimulation med høje glukose (16 mM). I basal ekstracellulære glukose koncentration (3 mM), er lille sekretoriske aktivitet observeret. Imidlertid på høje glukose vises insulin granulat forbigående på plasmamembran i forskellige celler i en Holm i en synkroniseret måde. Høje glukose blev anvendt efter ~ 2,5 min i 3G (16G etiket vises). En maksimal projektion af Konfokal fly er vist. Skalalinjen = 20 µm. film hastighed = 10 fps. Samlede varighed af filmen er 7 min. venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Video 4. Langvarig Stimulation med høje glukose udløser flere byger af exocytose.
Langvarig stimulation med høje glukose giver anledning til flere pulser af sekretion Holme, hvorunder granulat forbigående vises. Pulser af sekretoriske aktivitet kan ses hver ~ 3-4 min. Konfokal fly af en menneskelig Holmen er vist. En pseudocolor ordning blev anvendt til fluorescens intensitet. Skalalinjen = 20 µm. film hastighed = 30 fps. Samlede varighed af filmen er 20 min. venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette manuskript beskriver en teknik, der kan bruges til at visualisere exocytose af insulin granulat i beta celler i intakt i bugspytkirtlen Holme af Konfokal mikroskopi. Det bruger NPY-pHluorin som fluorescerende reporter klonet i adenovirus for at sikre en høj Transfektion effektivitet.
Selv om metoden var meget effektive i vores hænder, det kan kræve nogle ændringer, der primært afhænger af to parametre: 1) kvaliteten af holmen forberedelse, og 2) titer af viral lager med optimering af infektion betingelser. Før virusinfektion i Holme, tillade islet forberedelse til at inddrive fra isolation og transport stress natten over ved 37 ° C. Inspicere islet morfologi under et lysmikroskop hele infektion/udtryk periode og kontrollere for tegn på nedsat levedygtighed som celler fremspringende fra Holmen overflade eller tilstedeværelsen af hypoksiske celler (mørkere celler) i Holmen center18 . Hver viral bestand kan variere i titer og infektion effektivitet. Sørg for at justere lydstyrken på den virus, som benyttes ifølge viral titer og tidspunktet for kultur før mikroskopi assay. Den mest kritiske trin er optimering af infektion betingelser (fx, antallet af viruspartikler, kultur tid før analysen), så nok af journalisten udtrykkes og Holmen integritet og lydhørhed. Når du optimerer infektion protokol og med hver ny viral batch, indsamle et par Holme på forskellige tidspunkter og tjekke om exocytose kan være fremkaldt med KCl (30 mM) og/eller høje glukose (16 mM). Vi fandt, at analysen virker bedre og ø-celler forbliver sund og glucose responsive, når MOI er lav (omkring 2) og kultur-tid er udvidet (omkring 5 dage) for at øge udtryk fusion konstruktion. Vores resultater er i overensstemmelse med en tidligere undersøgelse, der viser, at effektiv udtryk af genet produkter bedre kan nås på lavere transfecting koncentrationer af adenoviral vektor samtidig bevare islet funktion19.
Teknikken har dog visse begrænsninger. Et er, at granulat ved hjælp af NPY-pHluorin som reporter, ikke kan visualiseres før de fuse med plasma membran og fusion pore åbner. For at studere insulin granulet handel i stedet for exocytose, kan adenovirus kodning NPY-eGFP bruges i stedet. En anden begrænsning er, at lavere grad NPY-pHluorin kan være målrettet mod ikke-insulinkrævende indeholdende granulat. Fleste af de celler, der var smittet med NPY-pHluorin udtrykte dog også insulin og mindre end 10% af celler udtrykt glucagon og somatostatin. Faktisk, glucose afhængighed af granulet sekretion, pulsatile mønster og co lokalisering med insulin, anført, at mest sekretoriske begivenheder repræsenterer cargo frigivelse fra insulin granulat. For at sikre overvågning af insulin sker exocytose, analysen bør udføres under betingelser, der stimulerer insulinsekretion (fx, høje glukose). Ikke desto mindre, for at forbedre specificiteten af beta cell udtryk, NPY-pHluorin kunne sættes under kontrol af en mere selektiv promotor som rotte insulin promotor. En anden begrænsning af teknik er, at det kræver udtryk af eksogene proteiner i insulin granulat, som kan forurolige deres Biogenese og/eller adfærd20. Dette bør overvejes ved fortolkningen af resultaterne af forsøgene og, hvis det er muligt, konklusionerne skal valideres ved hjælp af andre insulin granulet cargo proteiner (f.eks.C-peptid, Holmen amyloid polypeptid) som journalister.
Denne protokol anbefaler også, herunder cAMP-raising agenter (IBMX og forskolin) til at forstærke virkningerne af høje glukose på insulin granulet exocytose. Denne stimulation protokol efterligner aktivering af fysiologisk relevante forstærkende veje (udløst af incretins eller paracrine og neurale signaling molekyler), at forstærke insulinsekretion ved at øge cAMP i pancreas beta celler. Ikke desto mindre, i mangel af cAMP hævemidler, høje glukose (16 mM) også fremkalder granulet exocytose, men antallet af sekretoriske begivenheder observeret er lavere. Granulat vises stadig i diskrete byger, synkroniseres med den gennemsnitlige celle respons, og Vis lignende burst perioder: 1,4-6.6 min i høje glukose plus IBMX/forskolin vs 1,5-10 min i høje glukose alene.
Analysen beskrevet her er væsentlige for den eksisterende metoder, som det har tilstrækkelig rumlige og tidsmæssige opløsning til at visualisere enkelt fusion begivenheder i realtid i beta celler i intakt Holme. For eksempel, afsløret det den høje synkronisering med hvilken insulin granulat er udgivet i menneskelige Holme ved glucose stimulation. Desuden, hvis Holme er godt knyttet til coverslip, de kan være afbildet i længere perioder (mindst 15-20 min). Det blev brugt til at vise, at menneskelige Holme exocytose forekommer i forskellige serier, der vises i perioder svarende til pulsatile i vivo insulinsekretion. Analysen giver også mulighed for at teste effekten af flere stimuli på insulin exocytose ved hjælp af murine eller menneskelige Holme. Endvidere, fordi det ikke kræver islet celle dissociation ligesom andre metoder, det kan anvendes til at studere funktionen af beta cellepopulationer inden for en Holm. Ja, vi observeret, at beta naboceller danne klynger af ~ 5-10 celler, hvor aktiviteten synkroniseres. Beta celler fra den samme klynge er sandsynligvis koblet af gap junction kanaler lavet connexin 3621. Deres synkroniserede svar illustrerer den beta celle tilslutningsmuligheder, der er afgørende for korrekt insulin udskillelsen22.
Fremover vil kan denne teknik kombineres med andre fluorescerende farvestoffer for funktionel billeddannelse til at visualisere i realtid, hvordan ændringer i cytosole calcium eller membran potentiale, for eksempel, korrelere med granulet exocytose i beta celler. Navnlig som nye pH følsomme røde fluorescerende proteiner bliver tilgængelig14,23 og kan være smeltet NPY eller andre insulin granulet cargo proteiner, kan grøn farvestoffer for funktionel billeddannelse anvendes. Desuden, denne teknik kan kombineres med en musemodel for i vivo billeddannelse af vaskulariserede Holme transplanteret ind i forkammeret mus øje24. Småøer kan være inficeret med adenovirus 48-72 timer før transplantation ind i øjet. Immune mangelfuld mus bør anvendes, hvis menneskelige Holme er transplanteret. Brug af denne model, kan subcellulært rumlige mønster af insulinsekretion granul være korreleret med vaskulære ordninger25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takke Marcia Boulina fra DRI imaging core facilitet for hjælp med mikroskoper. Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud 1K01DK111757-01 (JA), F31668418 (MM), R01 DK111538, R33 ES025673 og R56 DK084321 (AC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Upright laser-scanning confocal microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS-SP5 | includes LAS AF, the image acquisition software |
| Imaging chamber | Warner instruments | RC-26 | |
| Imaging chamber platform | Warner instruments | PH-1 | |
| 22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA | |
| Multichannel perfusion system | Warner instruments | VC-8 | |
| Single inline solution heater | Warner instruments | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-324C | |
| Peristaltic Suction pump | Pharmacia | P-1 | |
| 35 mm Petri dish, non-tissue culture treated | VWR | 10861-586 | |
| CMRL Medium, no glutamine | ThermoFisher | 11530037 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| 5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| 3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| 1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| Vacuum filter | VWR | 431098 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-aldrich | P6407 | |
| Di-8-ANNEP | ThermoFisher | D3167 | |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 |
References
- Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis. Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).
- Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J., Martinez-Sanchez, A. Pancreatic beta-cell identity, glucose sensing and the control of insulin secretion. Biochem J. 466 (2), 203-218 (2015).
- Rorsman, P., Renstrom, E. Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells. Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297 (5585), 1349-1352 (2002).
- Ramirez, D. M., Khvotchev, M., Trauterman, B., Kavalali, E. T. Vti1a identifies a vesicle pool that preferentially recycles at rest and maintains spontaneous neurotransmission. Neuron. 73 (1), 121-134 (2012).
- Michael, D. J., Xiong, W., Geng, X., Drain, P., Chow, R. H. Human insulin vesicle dynamics during pulsatile secretion. Diabetes. 56 (5), 1277-1288 (2007).
- Ohara-Imaizumi, M., et al. Monitoring of exocytosis and endocytosis of insulin secretory granules in the pancreatic beta-cell line MIN6 using pH-sensitive green fluorescent protein (pHluorin) and confocal laser microscopy. Biochem J. 363 (Pt 1), 73-80 (2002).
- Whim, M. D. Pancreatic beta cells synthesize neuropeptide Y and can rapidly release peptide co-transmitters. PLoS One. 6 (4), e19478 (2011).
- Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
- Zhu, D., et al. Synaptotagmin I and IX function redundantly in controlling fusion pore of large dense core vesicles. Biochem Biophys Res Commun. 361 (4), 922-927 (2007).
- Aoki, R., et al. Duration of fusion pore opening and the amount of hormone released are regulated by myosin II during kiss-and-run exocytosis. Biochem J. 429 (3), 497-504 (2010).
- Felmy, F. Modulation of cargo release from dense core granules by size and actin network. Traffic. 8 (8), 983-997 (2007).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Gandasi, N. R., et al. Survey of Red Fluorescence Proteins as Markers for Secretory Granule Exocytosis. PLoS One. 10 (6), e0127801 (2015).
- Almaca, J., et al. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58 (12), 2810-2818 (2015).
- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. J Vis Exp. (99), e52632 (2015).
- Hanna, S. T., et al. Kiss-and-run exocytosis and fusion pores of secretory vesicles in human beta-cells. Pflugers Arch. 457 (6), 1343-1350 (2009).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
- Weber, M., et al. Adenoviral transfection of isolated pancreatic islets: a study of programmed cell death (apoptosis) and islet function. J Surg Res. 69 (1), 23-32 (1997).
- Michael, D. J., et al. Fluorescent cargo proteins in pancreatic beta-cells: design determines secretion kinetics at exocytosis. Biophys J. 87 (6), L03-L05 (2004).
- Serre-Beinier, V., et al. Cx36 makes channels coupling human pancreatic beta-cells, and correlates with insulin expression. Hum Mol Genet. 18 (3), 428-439 (2009).
- Rutter, G. A., Hodson, D. J. Beta cell connectivity in pancreatic islets: a type 2 diabetes target? Cell Mol Life Sci. 72 (3), 453-467 (2015).
- Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57 (8), 1655-1663 (2014).
