Summary
该协议描述了一种有效的方法来监测人脂肪来源的骨髓间充质干细胞 (haMSCs) 的细胞持久性和分布的远红色荧光标记的大鼠膝骨关节炎 (KOA) 模型通过关节内 (IA) 注射。
Abstract
为了支持人脂肪源性间充质干细胞 (haMSC) 治疗膝骨关节炎 (KOA) 的临床应用, 我们研究了 haMSCs 在动物模型中的细胞持久性和分布的有效性。我们展示了一种用亲油性荧光染料标记 haMSCs 细胞膜的方法。随后, 由体内成像系统动态监测经手术诱导的 KOA 大鼠的关节内注射标记细胞。我们雇用的亲油性 carbocyanines 做了 (DilC18 (5)), 一个远红色荧光 Dil (dialkylcarbocyanines) 模拟, 它利用红色激光, 以避免激发自然绿色自发荧光从周围的组织。此外, 红移发射光谱的确有允许深层成像在活体动物和标记程序没有造成细胞毒作用或功能损害 haMSCs。这种方法已被证明是一种有效的跟踪方法的 haMSCs 在大鼠 KOA 模型。该方法的应用也可用于确定临床前研究中其他来源的骨髓间充质干细胞的最佳用药路线和剂量。
Introduction
膝关节骨关节炎 (KOA) 是一种退行性疾病, 由关节软骨丧失和渐进炎症, 这已成为一个主要的慢性病在世界各地的老年人1。然而, 目前的治疗使用抗炎药物, 物理补充剂和手术程序可能只提供暂时缓解症状性疼痛2。
人脂肪源性间充质干细胞 (haMSCs) 已成为一种有希望的再生治疗膝关节骨性关节炎, 由于其多能分化潜能的软骨再生和免疫调节特性3, 4。与药理学途径, 以研究的作用机制的行为在体内, 跟踪活 haMSCs 在小 KOA 动物模型目前是有益的建立的理由和可行性 haMSC 治疗前的临床应用。在临床前测试中, 内侧切除 (MM) 破坏关节的机械负荷诱导大鼠 KOA, 提供了一个相对可行的模型, 具有一致的重现性5。KOA 诱发的早于前十字韧带横断, 或与部分内侧切除6相结合。因此, 在由 MM7、8引起的大鼠中, 通常会对注射 haMSCs 与 KOA 的病理微环境之间的长期相互作用进行评估。
虽然 haMSCs 的治疗效果已被广泛报道, 有关知识的体内持续的植入 haMSCs 通过关节内 (IA) 注射是稀缺的9,10。因此, 已经开发了各种细胞标记方法, 包括 immunohistology11、荧光12、绿色荧光蛋白13转染、氧化铁标记为磁共振成像 (MRI)14和众多荧光细胞染料8、15、16。与 labor-intensive 组织学分析相比,在体内非侵入性成像采用光学器件来检测标记有荧光信号的细胞的 real-time 分布和动态,1017。对于功能性活细胞成像, cytocompatible 荧光标记是一种先进的无放射性跟踪技术, 以揭示细胞活动后, 干细胞移植18。此外, 多色荧光亲油性染料具有相对于氨基活性亲水染料或荧光蛋白的优势, 包括其改进的细胞通透性和增强的荧光量子产率19。
因此, 这里所包含的协议使用红色激光激发带有亲油性 carbocyanines 的细胞 (DilC18(5)), 这是一个远红色荧光 Dil (dialkylcarbocyanines) 模拟20。红移激发和发射光谱的确有避免 autofluorescent 干扰, 并允许深层成像在很长一段时间的活动物8。这种跟踪细胞在体内的方法是有效的监测移植的干细胞, 如 haMSCs, 在动物模型, 这是必不可少的了解和改善现有的干细胞再生疗法。
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Protocol
涉及动物的程序由当地机构动物保育和伦理委员会批准, 以尽量减少动物的痛苦。本协议由上海市交通大学医学院附属机构动物护理与使用委员会 (IACUC) 批准, 并与本协议编号 [2017] 063.
1. 手术诱发大鼠膝骨关节炎模型的建立
- 为此外科手术, 使用 8-12 周老雄性大 (SD) 大鼠, 体重介于250和300克之间。
- 麻醉40毫克/千克 tiletamine 和40毫克/千克唑通过肌肉注射的动物.
- 将动物置于处于加热阶段的左侧面位置。用剃刀把右膝彻底剃掉。用 10% providone 碘溶液和70% 乙醇进行消毒, 再重复两次, 再涂上 10% providone 碘溶液, 用手术垫覆盖非手术区.
- 使用外科手术刀, 沿髌腱侧向2厘米切口以暴露 jointcapsules.
- 使用外科手术刀将内侧副韧带横断面。反映股骨半月板.
- 在手术过程中, 在关节软骨表面滴入无菌0.9% 氯化钠溶液, 防止软骨干燥.
- 用镊子抓住内侧半月板, 用手术刀从胫骨附件的最窄点切开半月板 ( 图 1A )。避免损伤软骨.
- 用 4-0 的可吸收缝合线关闭关节囊.
- 监控手术鼠, 直到他们恢复知觉.
- 注射20毫克/千克庆大霉素, 以防止感染和0.05 毫克/千克丁丙诺啡通过肌肉注射的途径, 以减轻疼痛后手术.
- 在一个温度控制的动物设施中, 在12小时的光照/暗循环下维持 3-8 周的大鼠 KOA。动物继续接受止痛药, 包括但不限于丁丙诺啡 (0.05 毫克/千克, 贝聿铭) 和庆大霉素 (20 毫克/千克, 贝聿铭), 如果疼痛症状持续.
2。大鼠 KOA 模型的组织学评价
- 牺牲过量 CO 的大鼠 2 吸入 (在腔室中增加每分钟容积约30% 的填充率与二氧化碳到现有空气中, 使动物失去知觉在呼吸停止后2-3 分钟内维持 CO2 流至少1分钟。在指定的时间点 (代表性的结果显示在8周的 KOA 诱导范围从3到8周) 后, 手术. 和 #160;
- 解剖膝盖关节周围的皮肤和肌肉, 用手术刀切断膝关节.
- 将4% 甲醛 (粉煤灰) 的膝关节固定在室温下3天。然后, decalcify 20% 乙酸乙酸 (edta) 中的样品, 在4和 #176 ° C 下进行约4周, 每3天更换一次 edta.
警告: 甲醛是有毒的, 穿戴适当的个人防护设备 (PPE), 如手套和眼镜. - 使用自动组织处理器脱水样品。设置菜单开始一个冲洗周期如下: 70% 乙醇为 1 h;80% 乙醇和95% 乙醇分别为 1 h;其次2循环100% 乙醇为 1 h;随后, 二甲苯每次两次1小时, 石蜡3次在58和 #176; C 每次1小时.
注意: 二甲苯是有毒的, 所以佩戴适当的 PPE, 如手套和眼镜.
注: (可选) 使用 Coplin 罐进行手动脱水, 其设置与自动组织处理器相同. - 将完整的关节面的内侧部分向下放置, 并将其嵌入到中心的石蜡块中.
注: 可选择使用镊子手动将样品嵌入石蜡块中. - 开始切割5和 #181; 从关节内侧缘的矢状段到30和 #181; m 间隔, 由旋转切片2个连续部分.
- 在玻璃幻灯片上安装剖面并 deparaffinize 二甲苯中的幻灯片。在2个连续部分之间, 染色一张幻灯片与苏木精和 #38; 曙红 (H 和 #38; E) 染色: 0.1% 苏木精为 15 min, 1% 乙酸溶液为十年代和0.5% 次曙红为 10 min。和染色的其他幻灯片与红 o/快速绿色染色: 0.1% 苏木精为15分钟, 0.02% 快速绿色为3分钟, 1% 醋酸溶液为十年代和0.1% 红 O 为 3 min.
注意: 二甲苯有毒, 佩戴适当的 PPE, 如手套、眼镜. - 使用骨关节炎研究协会国际 (OARSI) 大鼠组织病理学评估系统对彩色幻灯片进行评分 6 .
3。人骨髓间充质干细胞与荧光染料的标签做了
- 准备在100% 乙醇浓度为1毫米的细胞标记溶液。保护细胞标签的解决方案从光和存储在室温下6月.
- 在 Dulbecco 和 #39 中使用标准的单元格培养程序扩展 haMSCs; s 修饰的鹰和 #39; s 培养基 (DMEM), 辅以1% 青霉素和链霉素和10% 胎小牛血清 (FCS) 在10厘米的 petri 皿中.
- 分离 haMSCs 与2毫升0.25% 胰蛋白酶与1毫米 EDTA 在大约80% 汇合之前.
- 中和胰蛋白酶与4毫升培养基和旋转的细胞在 800 x g 在室温下3分钟.
- 在5毫升无血清培养基中, 以 1 x 10 6 细胞/毫升的密度将细胞挂起.
- 通过添加50和 #181 对单元格进行标记; 我在37和 #176 的5毫升无血清培养基中做了细胞标记液; C 为 50 min.
- 将标记的单元格在 800 x g 处旋转3分钟.
- 用5毫升磷酸酯缓冲盐水 (PBS) 在 800 x g 上再清洗两次电池, 每次3分钟.
- 使用 Cy5 过滤器设置的荧光显微镜检查标签 haMSCs.
- 将台盼蓝染色的单元格计数并获得 2.5 x 10 6 100 和 #181 中的活细胞; L PBS 注射.
4。 在体内 荧光成像跟踪 haMSCs
- 手术后八周 (步骤 1), 麻醉 KOA 鼠肌肉注射25毫克/千克 tiletamine 和25毫克/千克唑.
- 用剃刀彻底剃掉右膝, 露出关节区域。用70% 乙醇对关节区域进行消毒.
- 使用 26 G 注射器针, 注入 2.5 x 10 6 标记的单元格在100和 #181 中挂起; L PBS 位于由髌韧带内侧侧、股骨内侧髁和胫骨内侧髁形成的三角形区域中心 ( 图 1B ).
- 打开图像软件并初始化 在体内的 生物发光成像系统.
- 将大鼠置于成像系统中央阶段的仰卧位, 并关闭室的门.
- 检查 #34; 荧光 #34; 复选框, 然后选择 640 nm 的荧光滤光片进行励磁, 680 nm 发射 ( 图 2A ).
- 选择视野到 d. 设置像素分到中 (8), F/停止到2和曝光时间自动。保持最佳在整个研究中获得可比较结果的曝光时间 ( 图 2A ).
- 将动物从舞台上移除, 并从麻醉中恢复.
注意: 将动物放在覆盖着2-3 层毛巾的加热垫上. - 选择荧光测量的辐射效率单位 ( 图 2B )。选择感兴趣的区域 (ROI) 分析和量化每个图像的荧光信号 ( 图 2C ).
- 重复此过程 在体内 依次对每只老鼠进行成像, 以研究 haMSCs 在关节中的纵向保留.
注: 和 #160; 我们建议成像动物和 #39; 荧光信号的活体成像系统每两天一次注射后第一周和每周一次, 直到信号无法检测.
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Representative Results
为了诱导 KOA 模型, MM 在 SD 大鼠的右膝关节中进行 (图 3)。术后八周, 对大鼠进行了牺牲, 并用 H 和 #38 对膝关节的连续段进行了评价; E 和红 O/快速绿色染色 (图 4)。对于 H 和 #38; E 染色, 关节软骨的表面在手术膝部比正常关节表现出更粗糙的边界而不进行手术。对于红/快速绿色染色, 我们观察到在手术关节中, 与正常对照组相比, 蛋白多糖 (红染色) 和增加 fibrillated 胶原 (绿色染色) 的减少, 表明退行性 KOA 表型的进展由手术引起的。像人类 KOA 的进展, 大鼠牺牲在3周, 6 周, 8 周后, MM 评估发病机制和确定治疗干预的时间。
在 KOA 大鼠模型中, 用光学在体内成像系统对 haMSCs 进行了可视化。1小时后标签, 没有标记 haMSCs 展出圆形的形状体外。标签效率达到约95%。24小时后, 培养的标记 haMSCs 显示长纺锤形, 表明没有改变 haMSCs体外(图 5) 的粘附能力。手术后八周, 2.5 x 106有标记的 haMSCs 被注射到关节与 KOA。在这里, 没有标记 haMSCs 被观察到在地方联合从天 0 (8 星期在手术以后) 直到天70后射入 (18 星期在手术以后) 通过使用一个在体内成像系统 (图 6)。
图 1: MM 手术和注射区的示意图外科手术场.(A)此示意图描述的是由蓝色突出显示的手术区域。(B)此示意图指示红色圆圈区域内的注入位置。缩写定义如下: 毫米, 内侧半月板;MCL, 内侧副韧带;侧半月板;拼箱, 侧副韧带;髌韧带请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 活体成像软件的屏幕截图(A)用于荧光图像采集的参数的关键设置用红色正方形突出显示。(B)辐射效率被选作荧光测量的单位。(C)在工具调色板中, 感兴趣的区域 (ROI) 被环绕以进行荧光效率测量。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 手术诱发的 KOA 的过程.(A)膝关节间隙的暴露。(B)膝关节内结构, 用黑色箭头表示内侧半月板。(C)解剖内侧半月板。(D)关节间隙和皮肤闭合。
图 4: 膝关节的代表性组织学图片和 KOA OARSI 评分的统计分析.(A)八周后在大鼠手术中, 用 H 和 #38 对膝关节的连续段进行评价; E 和红 O/快速绿色染色。H 和 #38; E 染色显示手术膝关节软骨厚度降低。红 O/快速绿色染色显示, 与正常膝关节相比, 手术膝的蛋白多糖 (红染色) 和增加的 fibrillated 胶原蛋白 (绿色染色) 减少。缩放条 = 500 µm. (B)正常关节和 KOA 关节骨关节炎评分的统计分析 (n = 3)。数据被表示为 mean±SEM. * 表示 p 和 #60; 0.05。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 已标记的 haMSCs 的形态学.亮场, 荧光和合并图像的 haMSCs 在1小时后, 标签显示在顶部面板。明亮的领域, fluorescentand 合并图像的 haMSCs at24 h 后, 标签显示在底部面板。缩放栏 = 50 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 6:在体内已标记为 haMSCs 的图像.在注射 2.5 x 106标记 haMSCs 后, 显示了 KOA 大鼠的代表性图像。在 KOA 大鼠的关节局部检测到了长达9周的标签 haMSCs。这个数字是从出版的李 M et al8中复制的。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
我们迫切需要干细胞治疗的安全标准和分布研究, 才能将再生干细胞治疗 KOA 从长凳到床边。然而, 疾病的病理环境在移植 haMSCs 的持续和分布中起着重要作用10。最近, 我们的小组表明, 关节内注射 haMSCs 在病理 KOA 环境中的持续时间比正常情况下注射在8。炎症和退行性微环境可能会招募骨髓间充质干细胞进行修复, 随后有利于保留注入的 haMSCs1,21。此外, haMSCs 的安全性和功效分布可能受细胞交付时间的影响, KOA 的严重性, 以便优化的进展 KOA 在实验室动物将提供有价值的数据, 以支持临床试验。以轻度到中等程度的人 KOA 为目的, 由 MM 诱导的大鼠可在3至8周的范围内发育 KOA。本研究通过术后8周的组织病理学评分对软骨形态学变化进行评估, 为 KOA haMSCs 的有效性和安全性提供了一个比较可行的模型, 并对其进行了适度程度的观察.我们在这里演示了一种简单可行的方法来标记 haMSCs 与远红色荧光亲油性膜染料长期临床疗效评价。
这项技术的缺点是, 影像组织应接近皮肤和大量的标签 haMSCs 是需要足够的信号获取, 由于适度的量子产量从做。虽然一个体内光学成像系统能够对 KOA 模型中的 haMSCs 分布进行无侵入的纵向研究, 但在一般情况下, 只能看出细胞数量和位置的趋势。分析干细胞的命运, 特别是细胞增殖和分化, 也将通过利用命运图和高分辨率显微成像来解决。
目前, 各种标签技术可用于体内干细胞跟踪, 包括放射性标签, 纳米颗粒和病毒转导的报告基因22,23,24。然而, 放射性标记以及干细胞的病毒转导可能会干扰细胞的遗传特性, 进而可能影响干细胞的增殖和存活在体内16。此外, 通过吸收纳米粒子作为收缩剂来追踪干细胞, 需要通过强磁场提高空间分辨率, 这可能引起人们对这种技术的灵敏度的担忧25。荧光细胞染料, 如 PKH26, CM-DiI 和 CFSE 表现出不同程度的细胞毒性, 并提供相对有限的时间 (最多4周) 标记脂肪组织衍生细胞15。相比之下, 在水溶液中表现出微弱的荧光。一旦加入了脂质膜, 就会在细胞膜内均匀扩散, 并表达稳定的远红光荧光19。标记了可行的细胞, 不影响它们的增殖和功能18。更重要的是, 染料不会从标记的细胞转移到未标记的细胞, 除非这些细胞之间有直接的膜相互作用26。远红光激发和发射光谱的确有防止 autofluorescent 干扰的周围组织和提供深层成像的活动物。这些功能使标签作为一个理想的长期跟踪技术, 研究植入 haMSCs 关节的命运。因此, 我们已经证明了一个可靠的方法来监测的标签 haMSCs 在63天的大鼠模型8。
在 KOA 大鼠模型的 haMSCs 跟踪的协议中, 获得可靠和可行结果的关键步骤是确保: 1) 对股骨的半月板完全贯穿于每一个鼠模型中, KOA, 2) 有优选的比率10μ l 染料反对 106 haMSC 细胞为50极小的染色, 3) 被标记的 haMSCs 的体内检测门限在 104和 105细胞之间, 而在 106细胞推荐在本协议中。
一旦掌握了这一技术, 该方法的应用可用于确定临床前研究中 MSCs 的最佳用药路线或剂量。该协议可以很容易地适应的长期临床前评估的在体内的分布间充质干细胞 (MSCs) 从其他来源, 包括骨髓和脐带血。鉴于干细胞命运的前瞻性为 KOA 动物模型, immunohistology 研究异种 haMSCs, 如 Ki67 增殖8和 II. 型胶原对关节软骨分化的27, 可与此结合技术.
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Disclosures
孟里、明浩和文王是目前的员工和细胞生物医学组的股票期权持有者 (纳斯达克: CBMG)。其他作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
本研究由上海市科技委员会 (CN) 赞助的上海创新基金 (1402H294300) 资助, Dr.。感谢 Dr. 广东周 (中国国家组织工程中心) 对本论文的技术支持和科学建议。我们还要感谢 Mr. 矿泉夏 (上海第九人民医院) 在动物福利方面的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrx VMR animal anesthesia system | Midmark | VIP3000 | |
| 4-0 suture | Shanghai Jinhuan | KC439 | |
| Razor | Pritech | LD-9987 | |
| Gentamicin | Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd. | None | |
| 0.9% Sodium chloride solution | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd. | H43020455 | |
| Penicillin | Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Buprenorphine | Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Dilute to final concentration of 10% in PBS |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Dilute to final concentration of 20% in PBS |
| 0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s | Sigma-Aldrich | MHS16 | |
| 0.5% Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110116 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor | Thermo Fisher | A78400006 | |
| Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center | Thermo Fisher | B64100010 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
| DiD | Molecular Probes, Life Technologies |
V-22887 | |
| D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| PBS | GIBCO, Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-114 | |
| 10 cm Petri Dish | Corning | V118877 | |
| Centrifuge | Beckman | Optima MAX-TL | |
| Fluorescent microscope | Olympus | BX53 | |
| 0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Titetamme | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Zolazepam | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Sterile hyposermic syringe for single use 26G | Shanghai Misawa Medical Industry | None | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| Living Imaging 4.0 software | PerkinElmer | None |
References
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