Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Vivo में मानव वसा की ट्रैकिंग-व्युत्पंन Mesenchymal फ्लोरोसेंट Lipophilic झिल्ली डाई के साथ एक चूहे घुटने पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस मॉडल में स्टेम कोशिकाओं

Published: October 8, 2017 doi: 10.3791/56273
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 3, 4, 1,2
1Cellular Biomedicine Group, China, 2Cellular Biomedicine Group, California, 3Department of Orthopedics, Shanghai TCM-Integrated Hospital, 4Department of Orthopedics, Shanghai East Hospital, Tongji University
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल एक कुशल तरीका कोशिका हठ और मानव वसा-व्युत्पंन mesenchymal स्टेम सेल द्वारा (haMSCs) की निगरानी के लिए एक चूहा घुटने पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस (कोाा) मॉडल के माध्यम से इंट्रा-जोड़दार (IA) इंजेक्शन में लाल प्रतिदीप्ति लेबलिंग का वर्णन करता है ।

Abstract

आदेश में मानव वसा-व्युत्पंन mesenchymal स्टेम सेल (haMSC) घुटने पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस (कोाा) के लिए चिकित्सा के नैदानिक आवेदन का समर्थन करने के लिए, हम सेल हठ और पशु मॉडल में haMSCs के वितरण की प्रभावकारिता की जांच की । हम lipophilic फ्लोरोसेंट डाई के साथ haMSCs के सेल झिल्ली लेबल करने के लिए एक विधि का प्रदर्शन किया । बाद में, शल्य चिकित्सा प्रेरित कोाा के साथ चूहों में लेबल कोशिकाओं के इंट्रा जोड़दार इंजेक्शन गतिशील रूप से एक vivo इमेजिंग प्रणाली द्वारा निगरानी की गई । हम lipophilic carbocyanines (DilC18 (5)), एक सुदूर लाल फ्लोरोसेंट दिल (dialkylcarbocyanines) अनुरूप है, जो एक लाल लेजर का उपयोग करने के ऊतकों के आसपास से प्राकृतिक हरी उत्तेजना के autofluorescence से बचने के कार्यरत हैं । इसके अलावा, लाल के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के जीवित पशुओं में डीप ऊतक इमेजिंग की अनुमति दी और लेबलिंग प्रक्रिया कोई साइटोटोक्सिक प्रभाव या haMSCs को कार्यात्मक क्षति का कारण बना । यह दृष्टिकोण एक चूहे कोाा मॉडल में haMSCs के लिए एक कुशल ट्रैकिंग विधि होना दिखाया गया है । इस विधि के आवेदन भी पूर्व नैदानिक अध्ययन में अन्य स्रोतों से इष्टतम प्रशासन मार्ग और MSCs की खुराक निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Introduction

घुटने पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस (कोाा) एक अपक्षयी जोड़दार उपास्थि हानि और प्रगतिशील सूजन है, जो दुनिया भर के बुजुर्गों में एक बड़ी पुरानी बीमारी बन गया है के परिणामस्वरूप विकार है1। हालांकि, वर्तमान चिकित्सा विरोधी भड़काऊ दवाओं का उपयोग, शारीरिक खुराक, और शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं केवल रोगसूचक दर्द के लिए अस्थायी राहत प्रदान कर सकते हैं2.

मानव वसा-व्युत्पंन mesenchymal स्टेम सेल (haMSCs) घुटने पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस के लिए एक होनहार reअपक्षयी उपाय बन गए हैं, उपास्थि पुनर्जनन और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गुण के लिए उनके multipotent भेदभाव क्षमता के कारण3, 4. vivo मेंकार्रवाई के तंत्र की जांच करने के लिए औषधीय मार्गों के साथ तुलना में, छोटे कोाा पशु मॉडल में लाइव haMSCs ट्रैकिंग वर्तमान में नैदानिक आवेदन करने से पहले haMSC थेरेपी के लिए औचित्य और व्यवहार्यता स्थापित करने के लिए शिक्षाप्रद है । नैदानिक परीक्षण के लिए, औसत दर्जे का meniscectomy (मिमी) संयुक्त के यांत्रिक लोड स्थिर करने के लिए चूहों में कोाा प्रेरित है, जो लगातार reproducibility के साथ एक अपेक्षाकृत व्यवहार्य मॉडल प्रदान करता है5. MM द्वारा प्रेरित कोाा की शुरुआत पूर्वकाल cruciate बंधन अकेले transection या आंशिक औसत दर्जे का meniscectomy6के साथ संयुक्त से पहले है । इसलिए, कोाा के रोग microenvironment के साथ इंजेक्शन haMSCs के बीच दीर्घकालिक बातचीत अक्सर मिमी7,8से प्रेरित चूहों में मूल्यांकन कर रहे हैं.

हालांकि haMSCs की चिकित्सीय प्रभावकारिता बड़े पैमाने पर सूचित किया गया है, इंट्रा जोड़दार (IA) इंजेक्शन के माध्यम से प्रत्यारोपित haMSCs के वीवो में पर प्रासंगिक ज्ञान9,10दुर्लभ है । इसलिए, विभिंन सेलुलर लेबलिंग तरीकों immunohistology11, luciferase12, ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन13 अभिकर्मक, चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग के लिए आयरन ऑक्साइड लेबलिंग (एमआरआई) सहित विकसित किया गया है14 , और कई फ्लोरोसेंट सेल रंजक8,15,16. श्रम के साथ तुलना में गहन प्रोटोकॉल विश्लेषण, vivo में गैर इनवेसिव इमेजिंग वास्तविक समय वितरण और फ्लोरोसेंट संकेतों के साथ लेबल कोशिकाओं की गतिशीलता का पता लगाने के लिए ऑप्टिकल उपकरणों को रोजगार10,17. कार्यात्मक लाइव सेल इमेजिंग के लिए, cytocompatible फ्लोरोसेंट लेबलिंग एक परिष्कृत रेडियोधर्मी मुक्त ट्रैकिंग तकनीक स्टेम सेल ट्रांसप्लांटेशन18के बाद सेलुलर गतिविधियों को प्रकट करने के लिए है । इसके अलावा, बहुरंगा फ्लोरोसेंट lipophilic रंजक अमीनो-प्रतिक्रियाशील हाइड्रोफिलिक रंजक या फ्लोरोसेंट प्रोटीन उनके बेहतर सेल पारगम्यता और बढ़ाया प्रतिदीप्ति क्वांटम पैदावार19सहित, पर लाभ के अधिकारी ।

इस प्रकार, प्रोटोकॉल यहां शामिल एक लाल लेजर का उपयोग करने lipophilic carbocyanines के साथ लेबल कोशिकाओं उत्तेजित (DilC18(5)) है, जो एक दूर लाल फ्लोरोसेंट दिल (dialkylcarbocyanines) एनालॉग20है । लाल उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के परिवर्तन किया है फ्लोरोसेंट हस्तक्षेप से बचा जाता है और जीवित पशुओं में समय की एक लंबी अवधि में गहरी ऊतक इमेजिंग की अनुमति देता है8। किया था के साथ लेबल vivo में कोशिकाओं पर नज़र रखने की यह विधि की निगरानी के लिए मान्य है स्टेम सेल, ऐसे haMSCs के रूप में, पशु मॉडल में, जो समझने के लिए आवश्यक है और वर्तमान स्टेम कोशिका अपक्षयी चिकित्सा में सुधार.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

< p class = "jove_content" > पशु विषयों को शामिल करने वाली प्रक्रियाओं को स्थानीय संस्थागत पशु देखभाल और आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया, जिससे पशु दुख को कम करने के प्रयास किए जा रहे हैं । निम्नलिखित प्रोटोकॉल को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा शंघाई में नौवें लोगों के लिए अनुमोदित किया गया & #8217; एस अस्पताल शंघाई JiaoTong विश्वविद्यालय स्कूल ऑफ मेडिसिन के प्रोटोकॉल संख्या के साथ संबद्ध [2017] 063.

< p class = "jove_title" > 1. शल्य चिकित्सा प्रेरित चूहे की स्थापना के घुटने पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस मॉडल

  1. इस शल्य प्रक्रिया के लिए, का उपयोग 8-12 सप्ताह पुराने पुरुष Sprague Dawley (एसडी) चूहों के बीच एक शरीर के वजन के साथ २५० और ३०० g.
  2. Anesthetize के साथ पशुओं को ४० मिलीग्राम/केजी tiletamine और ४० मिलीग्राम/इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के जरिए zolazepam/
  3. एक गर्म मंच पर एक वाम पार्श्व स्थिति में पशु जगह है । सही घुटने एक उस्तरा के साथ अच्छी तरह से दाढ़ी । 10% providone आयोडीन समाधान के साथ शल्य क्षेत्र को संक्रमित ७०% इथेनॉल के बाद, दो बार दोहराने और फिर 10% providone-आयोडीन समाधान के साथ रंग और एक शल्य पैड के साथ गैर सर्जिकल क्षेत्र को कवर ।
  4. एक शल्य स्केलपेल का उपयोग कर, एक 2 सेमी patellar पट्टा के साथ बाद में चीरा करने के लिए jointcapsules बेनकाब ।
  5. एक शल्य स्केलपेल का उपयोग करने के लिए औसत दर्जे का संपार्श्विक बंधन transect । फीमर.
    6. की ओर meniscus को प्रतिबिंबित
  6. ड्रिप बाहर सुखाने से उपास्थि को रोकने के लिए आपरेशन के दौरान जोड़दार उपास्थि की सतह पर ०.९% सोडियम क्लोराइड समाधान ।
  7. संदंश के साथ औसत दर्जे का meniscus हड़पने के लिए और एक टिबियल के साथ स्केलपेल लगाव से अपनी संकीर्ण बिंदु पर meniscus के माध्यम से कटौती (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1a ). उपास्थि को घायल करने से बचें ।
  8. एक 4-0 अवशोषित टांका के साथ संयुक्त कैप्सूल बंद करें ।
  9. शल्य चूहों की निगरानी जब तक वे चेतना हासिल ।
  10. सुई 20 मिलीग्राम/gentamicin संक्रमण को रोकने के लिए और ०.०५ मिलीग्राम/सर्जरी के बाद दर्द को दूर करने के लिए एक इंट्रामस्क्युलर मार्ग के माध्यम से buprenorphine ।
  11. एक तापमान में चूहों को बनाए रखने-एक 12 ज प्रकाश के तहत पशु सुविधा को नियंत्रित/3-8 सप्ताह के लिए शुरुआत कोाा के लिए अंधेरे चक्र । पशु दर्द की दवा प्राप्त करने के लिए जारी, सहित, लेकिन Buprenorphine तक ही सीमित नहीं (०.०५ मिलीग्राम/किग्रा, आइएमएस) और Gentamicin (20 मिलीग्राम/kg, आइएमएस), यदि दर्द लक्षण जारी रहती है ।
< p class = "jove_title" > 2. चूहे की प्रोटोकॉल का आकलन कोाा मॉडल

  1. अत्यधिक सह 2 सांस लेना के साथ चूहों बलिदान (चैंबर में मौजूदा हवा के लिए कार्बन डाइऑक्साइड के साथ प्रति मिनट चैंबर की मात्रा के बारे में 30% की एक भरण दर जोड़ें पशु बेहोश करना 2-3 मिनट के भीतर-श्वसन रहता है के बाद 1 मिनट की एक ंयूनतम के लिए सीओ 2 प्रवाह बनाए रखें.) पर संकेत दिया समय अंक (प्रतिनिधि परिणाम 3 से 8 सप्ताह से लेकर कोाा प्रेरण के 8 सप्ताह में दिखाया गया है) सर्जरी के बाद । & #160;
  2. टुकड़े त्वचा और घुटने के जोड़ों के आसपास मांसपेशियों और एक स्केलपेल के साथ घुटने के जोड़ों में कटौती ।
  3. कमरे के तापमान पर 3 दिनों के लिए 4% paraformaldehyde (पीएफए) में घुटने के जोड़ों को ठीक करें । इसके बाद, नमूनों को 20% ethylenediaminetetraacetic अम्ल (EDTA) में decalcify 4 & #176; C पर लगभग 4 सप्ताह के लिए, और EDTA को हर 3 दिन में बदल दीजिये ।
    चेतावनी: Paraformaldehyde विषाक्त है, ऐसे दस्ताने और चश्मा के रूप में उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण (पीपीई), पहनते हैं ।
  4. एक स्वचालित ऊतक प्रोसेसर का उपयोग कर नमूने निर्जलीकरण । इस प्रकार के रूप में एक फ्लश चक्र शुरू करने के लिए मेनू सेट: ७०% 1 ज के लिए इथेनॉल; फिर 1 के लिए ८०% इथेनॉल और ९५% इथेनॉल क्रमशः; 1 ज के लिए १००% इथेनॉल के 2 चक्र द्वारा पीछा किया; बाद में, xylene के लिए दो बार 1 ज हर बार और आयल 3 बार ५८ & #176 पर 1 ज हर बार के लिए सी.
    चेतावनी: Xylene विषाक्त है, इसलिए ऐसे दस्ताने और चश्मा के रूप में उपयुक्त पीपीई, पहनते हैं ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, स्वचालित ऊतक प्रोसेसर के रूप में एक ही सेट के साथ मैनुअल निर्जलीकरण के लिए Coplin जार का उपयोग करें ।
  5. बरकरार संयुक्त चेहरे के औसत दर्जे का पहलू जगह नीचे और यह केंद्र में एंबेडेड ऊतक के साथ तेल ब्लॉक में एंबेड ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, संदंश का उपयोग करने के लिए तेल ब्लॉक में नमूने मैंयुअल रूप से एंबेड ।
  6. के लिए 5 & #181 कट शुरू; m sagittal वर्गों के लिए संयुक्त के औसत दर्जे से 30 & #181; m अंतराल के साथ 2 धारावाहिक वर्गों के साथ रोटरी microtome.
  7. ग्लास स्लाइड पर माउंट वर्गों और xylene में स्लाइड deparaffinize । 2 धारावाहिक वर्गों के बीच, Hematoxylin के साथ एक स्लाइड दाग & #38; Eosin (ज & #38; ड) सना: ०.१% 15 मिनट के लिए Hematoxylin, 10 एस के लिए 1% एसिटिक एसिड समाधान और 10 मिनट के लिए ०.५% Eosin । और Safranin ओ के साथ अंय स्लाइड दाग/तेज हरी दाग: ०.१% Hematoxylin के लिए 15 मिनट, ०.०२% तेजी से हरे रंग के लिए 3 मिनट, 1% एसिटिक एसिड समाधान के लिए 10 एस और ०.१% Safranin O 3 min.
    के लिए चेतावनी: Xylene विषाक्त है, ऐसे दस्ताने, चश्मा के रूप में उपयुक्त पीपीई, पहनते हैं ।
  8. पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस रिसर्च सोसायटी इंटरनेशनल (OARSI) का उपयोग कर दाग स्लाइड स्कोर चूहों में Histopathology आकलन प्रणाली < सुप वर्ग = "xref" > ६ .
< p class = "jove_title" > 3. मानव Mesenchymal की लेबलिंग फ्लोरोसेंट डाई के साथ स्टेम सेल था

  1. 1 मिमी की एकाग्रता में १००% इथेनॉल में सेल लेबलिंग समाधान तैयार किया । प्रकाश से सेल लेबलिंग समाधान की रक्षा और यह कमरे के तापमान पर 6 महीने के लिए दुकान ।
  2. मानक सेल संस्कृति प्रक्रियाओं के साथ haMSCs Dulbecco & #39; s संशोधित ईगल & #39; एस मध्यम (DMEM) 1% पेनिसिलिन और streptomycin और 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) एक 10 सेमी पेट्री डिश में के साथ पूरक ।
  3. haMSCs के साथ 2 मिलीलीटर ०.२५% trypsin के साथ 1 मिमी EDTA से पहले लगभग ८०% संगम.
  4. 4 एमएल संस्कृति माध्यम के साथ trypsin बेअसर और कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए ८०० x g पर कोशिकाओं स्पिन ।
  5. 1 x 10 6 कोशिकाओं/एमएल में 5 मिलीलीटर सीरम मुक्त संस्कृति माध्यम के एक घनत्व पर कोशिकाओं को निलंबित.
  6. लेबल कोशिकाओं को जोड़कर ५० & #181; L क्या सेल-लेबलिंग सॉल्यूशन 5 एमएल सीरम मुक्त संस्कृति माध्यम में ३७ & #176; C for ५० min.
  7. 3 min.
    8. के लिए ८०० x g पर लेबल कोशिकाओं स्पिन
  8. धो कोशिकाओं को दो बार 5 मिलीलीटर फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के साथ 3 मिनट के लिए ८०० x g पर प्रत्येक.
  9. एक Cy5 फिल्टर सेट के साथ एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर लेबल haMSCs की जाँच करें.
  10. trypan नीले दाग के साथ कोशिकाओं की गणना और १०० & #181 में २.५ x 10 6 व्यवहार्य कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए; L पंजाब इंजेक्शन के लिए.
< p class = "jove_title" > 4. में Vivo फ्लोरोसेंट इमेजिंग ट्रैक करने के लिए haMSCs

  1. आठ सप्ताह सर्जरी के बाद (चरण 1), anesthetize कोाा चूहों के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन द्वारा 25 मिलीग्राम/किलो tiletamine और 25 मिलीग्राम/zolazepam
  2. एक उस्तरा के साथ सही घुटने अच्छी तरह से दाढ़ी के लिए संयुक्त क्षेत्र का पर्दाफाश । ७०% इथेनॉल के साथ संयुक्त क्षेत्र को संक्रमित.
  3. एक 26 जी सिरिंज सुई का उपयोग कर, २.५ x 10 6 लेबल कोशिकाओं में निलंबित १०० & #181; एल पंजाबियों patellar बंधन, औसत दर्जे का ऊरु condyle के औसत पक्ष द्वारा गठित त्रिकोण क्षेत्र के केंद्र में, और औसत दर्जे का टिबियल condyle ( < सबल वर्ग = "xfig" > चित्र 1b ).
  4. इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलने के लिए और vivo bioluminescence इमेजिंग प्रणाली में शुरू.
    5. इमेजिंग सिस्टम के केंद्रीय चरण में लापरवाह स्थिति में
  5. स्थिति चूहों और चैंबर के दरवाजे बंद.
  6. चेक द & #34; फ्लोरोसेंट & #34; चेकबॉक्स और उत्तेजना के लिए ६४० एनएम के फ्लोरोसेंट फिल्टर सेट का चयन करें, और उत्सर्जन के लिए ६८० एनएम (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2a ).
  7. का चयन करें फ़ील्ड को देखने के लिए डी. सेट पिक्सेल बिन्नी को मध्यम (8), ऑटो को 2 और एक्सपोज़र समय के लिए F/ इष्टतम बनाए रखने पूरे अध्ययन में तुलनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए संगत एक्सपोज़र समय (< सशक्त वर्ग = "xfig" > चित्र 2a ).
  8. मंच से पशु निकालें और संज्ञाहरण से वसूली के लिए निगरानी ।
    नोट: एक हीटिंग पैड पर प्लेस पशु तौलिया के 2-3 परतों के साथ कवर किया ।
  9. प्रतिदीप्ति की माप के लिए दीप्तिमान दक्षता की इकाइयों का चयन (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा बी ). प्रत्येक छवि (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्र 2c ) से फ्लोरोसेंट संकेतों के विश्लेषण के लिए ब्याज (ROI) के क्षेत्रों का चयन करें.
  10. प्रत्येक चूहे के लिए vivo इमेजिंग में की प्रक्रिया को दोहराने क्रमिक रूप से संयुक्त में haMSCs अनुदैर्ध्य प्रतिधारण का अध्ययन करने के लिए.
    NOTE: & #160; हम सुझाएं इमेजिंग पशु & #39; vivo इमेजिंग सिस्टम में एक बार हर दो दिन इंजेक्शन के बाद पहले हफ्ते के लिए और एक बार हर हफ्ते जब तक संकेत नहीं पाया जा सकता है द्वारा फ्लोरोसेंट संकेतों ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

आदेश में कोाा मॉडल प्रेरित करने के लिए, मिमी एसडी चूहों (चित्रा 3) के सही घुटने के संयुक्त में प्रदर्शन किया गया था । आठ सप्ताह सर्जरी के बाद, चूहों की बलि दी गई और घुटने के जोड़ों के धारावाहिक वर्गों दोनों के साथ मूल्यांकन किया गया ज & #38; ई और Safranin ओ/तेज हरी दाग (चित्रा 4) । के लिए ज & #38; ई धुंधला, जोड़दार उपास्थि की सतह सर्जरी के बिना सामान्य संयुक्त की तुलना में शल्य चिकित्सा घुटनों में किसी न किसी सीमा का प्रदर्शन किया. के लिए Safranin-O/तेजी से हरी धुंधला, हम मनाया proteoglycan (लाल दाग) और वृद्धि हुई fibrillated कोलेजन सर्जरी संयुक्त में (हरी धुंधला) सामांय एक है, जो अपक्षयी कोाा की प्रगति के संकेत के साथ तुलना में phenotypes सर्जरी से प्रेरित । मानव कोाा की प्रगति सदृश करने के लिए, चूहों 3 सप्ताह, 6 सप्ताह, और 8 सप्ताह के बाद मिमी रोगजनन का आकलन करने के लिए और चिकित्सीय हस्तक्षेप के समय का निर्धारण करने में बलिदान दिया गया ।

क्या लेबल haMSCs vivo इमेजिंग प्रणाली में एक ऑप्टिकल द्वारा कोाा चूहा मॉडल में visualized था । लेबलिंग के बाद 1 ज, haMSCs इन विट्रो मेंगोल आकार का प्रदर्शन लेबल किया । लेबलिंग दक्षता के बारे में ९५% तक पहुंच गया । 24 ज के बाद, प्रसंस्कृत किया लेबल haMSCs लंबी धुरी आकार का प्रदर्शन किया, का संकेत था haMSCs के पालन की क्षमता में परिवर्तन नहीं किया इन विट्रो (चित्रा 5) । आठ सप्ताह सर्जरी के बाद, २.५ x 106 किया-लेबल haMSCs जोड़ों में कोाा के साथ इंजेक्शन थे । यहां, लेबल haMSCs दिन से स्थानीय संयुक्त में मनाया गया 0 (सर्जरी के बाद 8 सप्ताह) दिन तक ७० पोस्ट इंजेक्शन (सर्जरी के बाद 18 सप्ताह) एक vivo इमेजिंग प्रणाली (चित्रा 6) का उपयोग करके ।

Figure 1
चित्रा 1: सेल डिलीवरी के लिए मिमी सर्जरी और इंजेक्शन क्षेत्र के लिए योजनाबद्ध सर्जिकल क्षेत्र । (क) इस योजनाबद्ध आरेख में सर्जिकल क्षेत्र का चित्रण किया गया है, जो नीले रंग से प्रकाश में आई है. (ख) यह योजनाबद्ध आरेख लाल वृत्तीय क्षेत्र के भीतर इंजेक्शन साइट इंगित करता है. संक्षिप्त परिभाषा निंनानुसार हैं: MM, औसत दर्जे का meniscus; MCL, औसत दर्जे का जमानती बंध; एलएम, पार्श्व meniscus; LCL, पार्श्व संपार्श्विक बंध; पीएल, patellar बंध. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: vivo इमेजिंग सॉफ्टवेयर में स्क्रीन शॉट्स. (क) फ्लोरोसेंट छवि अधिग्रहण के लिए मानकों की कुंजी सेटिंग्स लाल चौकों के साथ उजागर कर रहे हैं । (ख) दीप्तिमान दक्षता प्रतिदीप्ति की माप के लिए इकाई के रूप में चुना जाता है । (C) उपकरण पट्टिका में, ब्याज के क्षेत्र (ROI) प्रतिदीप्ति क्षमता मापन के लिए घेरे जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: शल्य चिकित्सा प्रेरित कोाा की प्रक्रिया । घुटने के संयुक्त अंतरिक्ष के (क) एक्सपोजर । (ख) घुटने के संयुक्त की भीतरी संरचना, एक काले औसत दर्जे का meniscus का संकेत तीर के साथ । (ग) विदारक औसत दर्जे का meniscus । (घ) संयुक्त अंतरिक्ष और त्वचा बंद कर रहे हैं ।

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि ऊतकीय घुटने के जोड़ों और सांख्यिकीय विश्लेषण के चित्र OARSI कोाा के स्कोर के लिए । (क) आठ सप्ताह की पोस्ट एमएम सर्जरी चूहों में, घुटने के जोड़ों के धारावाहिक वर्गों के साथ मूल्यांकन किया गया ज & #38; इ आणि Safranin हे/तेज हरी दाग. ज & #38; ई धुंधला दिखा सर्जरी के घुटने में उपास्थि की मोटाई कम हो गई । Safranin O/तेजी से हरी दाग दिखाया कम proteoglycan (लाल दाग) और शल्य चिकित्सा घुटने में वृद्धि हुई fibrillated कोलेजन (हरी धुंधला) सामांय घुटने के साथ तुलना में । स्केल बार = ५०० µm. (B) सामांय जोड़ों और कोाा जोड़ों में पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस के स्कोर के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण (n = 3) । डाटा अर्थ ± SEM के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । * इंगित करता है p & #60; ०.०५. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5: के रूप में किया गया-लेबल haMSCs. उज्ज्वल क्षेत्र, फ्लोरोसेंट और विलय 1 ज में haMSCs के चित्र लेबलिंग के बाद शीर्ष पैनल में दिखाए जाते हैं । ब्राइट फील्ड, fluorescentand haMSCs at24 एच के चित्र विलय के बाद लेबलिंग नीचे पैनल में दिखाए जाते हैं । स्केल बार = ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: vivo इमेजिंग में किया गया-लेबल haMSCs. २.५ x 106 -लेबल haMSCs के इंजेक्शन के बाद, कोाा चूहों के प्रतिनिधि छवियों को दिखाया जाता है । क्या बला haMSCs को 9 हफ्तों तक स्थानीय रूप से कोाा चूहों के जोड़ों में पाया गया. यह आंकड़ा ली एम एट अल8के प्रकाशन से reproduced किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

सुरक्षा मानकों और स्टेम सेल थेरेपी के वितरण के अध्ययन की तत्काल जरूरत है इससे पहले कि हम पीठ से बेडसाइड के लिए कोाा के लिए अपक्षयी स्टेम सेल उपचार ला सकते हैं । हालांकि, रोग पर्यावरण के हठ और प्रत्यारोपण haMSCs के वितरण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है10। हाल ही में, हमारे समूह का प्रदर्शन किया है कि haMSCs के इंट्रा जोड़दार इंजेक्शन एक रोग कोाा वातावरण में लंबे समय तक बनी सामांय परिस्थितियों के तहत इंजेक्शन से8। यह संभव है कि भड़काऊ और अपक्षयी microenvironment मरंमत के लिए स्टेम सेल mesenchymal भर्ती कर सकते है और बाद में इंजेक्शन haMSCs1,21के प्रतिधारण एहसान । इसके अलावा, haMSCs की सुरक्षा और प्रभावकारिता प्रोफाइल कोाा की गंभीरता के बारे में सेल डिलीवरी के समय से प्रभावित हो सकता है, ताकि प्रयोगशाला पशुओं में कोाा की प्रगति का अनुकूलन नैदानिक परीक्षणों के समर्थन के लिए बहुमूल्य डेटा प्रदान करेगा । मानव कोाा के उदारवादी गंभीरता को हल्के जैसी के उद्देश्य के साथ, MM द्वारा प्रेरित चूहों को 3 से 8 सप्ताह से लेकर कोाा विकसित करने की अनुमति दी जाती है । इस अध्ययन में, उपास्थि के रूपात्मक परिवर्तन की सर्जरी के बाद 8 सप्ताह histopathological स्कोरिंग द्वारा मूल्यांकन किया गया था, जो कोाा की प्रभावकारिता और haMSCs की सुरक्षा की जांच करने के लिए एक उदारवादी डिग्री के साथ एक अपेक्षाकृत व्यावहारिक मॉडल प्रदान करता है8. हम यहां एक सरल और व्यवहार्य विधि का प्रदर्शन के लिए दूर के साथ haMSCs लेबल लंबी अवधि के पूर्व नैदानिक प्रभावकारिता मूल्यांकन के लिए लाल फ्लोरोसेंट lipophilic झिल्ली डाई ।

इस तकनीक की कमियां है कि छवि वाले ऊतक त्वचा के पास होना चाहिए और बला haMSCs की एक पर्याप्त राशि के लिए पर्याप्त संकेत अधिग्रहण से मामूली मात्रा की पैदावार के कारण के लिए आवश्यक हैं । हालांकि एक vivo में ऑप्टिकल इमेजिंग प्रणाली सक्षम बनाता है गैर इनवेसिव कोाा मॉडल में haMSCs वितरण के अनुदैर्ध्य अध्ययन, सेल संख्या और स्थान में प्रवृत्तियों केवल सामांय में समझदार हो सकता है । स्टेम सेल भाग्य का विश्लेषण, विशेष रूप से सेल प्रसार और भेदभाव में, भी भाग्य मानचित्रण और उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी इमेजिंग का उपयोग करके संबोधित किया जाएगा ।

वर्तमान में, लेबलिंग तकनीक की एक विस्तृत विविधता vivo में स्टेम सेल ट्रैकिंग, रेडियोधर्मी लेबल, नैनोकणों और रिपोर्टर जीन22,23,24के वायरल transduction सहित के लिए उपलब्ध हैं । हालांकि, रेडियोधर्मी लेबलिंग के साथ ही वायरल स्टेम कोशिकाओं के transduction कोशिकाओं के आनुवंशिक गुणों के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, जो बाद में स्टेम सेल प्रसार और vivo मेंअस्तित्व को प्रभावित कर सकते हैं16. इसके अलावा, स्टेम सेल ट्रेसिंग द्वारा एमआरआई का उपयोग कर नैनोकणों के रूप में अनुबंध एजेंट एक मजबूत चुंबकीय क्षेत्र है, जो इस तकनीक की संवेदनशीलता के बारे में चिंताओं को बढ़ा सकते है द्वारा स्थानिक संकल्प सुधार की आवश्यकता है25। इस तरह के PKH26 के रूप में फ्लोरोसेंट कोशिका रंजक, सेमी-दिी और CFSE प्रदर्शन cytotoxicity की डिग्री बदलती है और एक अपेक्षाकृत सीमित अवधि की पेशकश (4 सप्ताह तक) वसा ऊतक व्युत्पंन कोशिकाओं के लेबल के15। इसके विपरीत, जलीय समाधान में कमजोर प्रतिदीप्ति प्रदर्शित किया । एक बार एक लिपिड झिल्ली के साथ शामिल किया, सेल झिल्ली और एक्सप्रेस स्थिर दूर-लाल प्रतिदीप्ति19में समान रूप से फैलाना था । क्या व्यावहारिक कोशिकाओं लेबल और उनके प्रसार और समारोह18को प्रभावित नहीं करता है । इससे भी महत्वपूर्ण बात, रंजक लेबल किए गए कक्षों से अनलेबल्स कक्षों तक स्थानांतरित नहीं होते हैं, जब तक कि उन कक्षों26के बीच सीधी झिल्ली सहभागिता नहीं होती । दूर लाल उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के आसपास के ऊतकों से फ्लोरोसेंट हस्तक्षेप रोकता है और जीवित पशुओं में गहरी ऊतक इमेजिंग प्रदान करता है । इन सुविधाओं के एक आदर्श दीर्घकालिक ट्रैकिंग तकनीक प्रत्यारोपित haMSCs इंट्रा articularly के भाग्य का अध्ययन करने के रूप में लेबलिंग किया सक्षम । इसलिए, हम एक विश्वसनीय पद्धति का प्रदर्शन किया है एक चूहा मॉडल8में ६३ दिनों की अवधि में haMSCs लेबल पर नजर रखी.

के लिए प्रोटोकॉल के भीतर किया-लेबल haMSCs ट्रैकिंग एक कोाा चूहा मॉडल में, महत्वपूर्ण कदम विश्वसनीय और व्यवहार्य परिणाम प्राप्त करने के लिए सुनिश्चित करें कि: 1) फीमर की ओर meniscus पूरी तरह से कोाा की लगातार शुरुआत के लिए प्रत्येक चूहे मॉडल में कटौती के माध्यम से कर रहे हैं, 2) वहां है 10 μL के एक अनुकूलित अनुपात एक ५० मिनट धुंधला के लिए 106 haMSC कोशिकाओं के खिलाफ डाई किया, 3) के लिए vivo पता लगाने सीमा में किया-लेबल haMSCs 104 और 105 कोशिकाओं के बीच है, जबकि ऊपर 106 कोशिकाओं की सिफारिश की है इस प्रोटोकॉल में ।

एक बार इस तकनीक में महारत हासिल है, इस विधि के आवेदन के लिए इष्टतम मार्ग या खुराक पूर्व नैदानिक अध्ययन में MSCs के प्रशासन के लिए निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल को आसानी से के लिए अनुकूलित किया जा सकता है दीर्घकालिक पूर्व नैदानिक मूल्यांकन के लिए vivo में mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) के अंय स्रोतों से, अस्थि मज्जा और गर्भनाल रक्त सहित । कोाा पशु मॉडल में स्टेम सेल भाग्य के लिए भावी के प्रकाश में, xenogeneic haMSCs के immunohistology अध्ययन, ऐसे प्रसार के लिए Ki67 के रूप में8 और कोलेजन द्वितीय जोड़दार उपास्थि भेदभाव27के लिए, इस के साथ जोड़ा जा सकता है तकनीक.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

मेंग ली, मिंग Hao और वेन वांग वर्तमान कर्मचारियों और सेलुलर (Nasdaq: CBMG) समूह के शेयर विकल्प धारकों हैं । दूसरे लेखकों ने हितों का टकराव नहीं होने की घोषणा की ।

Acknowledgments

वर्तमान अध्ययन शंघाई अभिनव वित्त पोषण (1402H294300) शंघाई नगर पालिका के विज्ञान और प्रौद्योगिकी आयोग (CN) डॉ वेन वांग को द्वारा प्रायोजित द्वारा समर्थित किया गया था । हम इस पांडुलिपि के लिए अपनी तकनीकी सहायता और वैज्ञानिक सलाह के लिए डॉ गुआंग्डोंग झोउ (चीन के नेशनल टिशू इंजीनियरिंग सेंटर) का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । हम भी पशु कल्याण में उनकी मदद के लिए श्री Huitang ज़िया (शंघाई नौवें लोगों के अस्पताल) का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Matrx VMR animal anesthesia system Midmark VIP3000
4-0 suture Shanghai Jinhuan KC439
Razor Pritech LD-9987
Gentamicin Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd. None
0.9% Sodium chloride solution Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd. H43020455
Penicillin Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd. None
Buprenorphine Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd. None
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 16005 Dilute to final concentration of 10% in PBS
EDTA Sigma-Aldrich E9884 Dilute to final concentration of 20% in PBS
0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s Sigma-Aldrich MHS16
0.5% Eosin Y solution, alcoholic Sigma-Aldrich HT110116
Safranin O Sigma-Aldrich S8884
Fast Green Sigma-Aldrich F7258
Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor Thermo Fisher A78400006
Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center Thermo Fisher B64100010
Fully Automated Rotary Microtome Leica RM2255
DiD Molecular Probes, Life
Technologies		 V-22887
D-MEM High Glucose Sigma-Aldrich D5648
PBS GIBCO, Life Technologies 14190-144
0.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200-114
10 cm Petri Dish Corning V118877
Centrifuge Beckman Optima MAX-TL
Fluorescent microscope Olympus BX53
0.4% Trypan Blue solution Sigma-Aldrich 93595
Titetamme Virbac (Zoletil 50) 1000000188
Zolazepam Virbac (Zoletil 50) 1000000188
Sterile hyposermic syringe for single use 26G Shanghai Misawa Medical Industry None
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System PerkinElmer 124262
Living Imaging 4.0 software PerkinElmer None

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis Rheum. 64 (6), 1697-1707 (2012).
  2. Lane, N. E., Shidara, K., Wise, B. L. Osteoarthritis year in review 2016: clinical. Osteoarthritis Cartilage. 25 (2), 209-215 (2017).
  3. Wang, W., Cao, W. Treatment of osteoarthritis with mesenchymal stem cells. Sci China Life Sci. 57 (6), 586-595 (2014).
  4. Burke, J., et al. Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clin Transl Med. 5 (1), 27 (2016).
  5. Bendele, A. M. Animal models of osteoarthritis. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1 (4), 363-376 (2001).
  6. Gerwin, N., Bendele, A. M., Glasson, S., Carlson, C. S. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the rat. Osteoarthritis Cartilage. 18, Suppl 3. S24-S34 (2010).
  7. Janusz, M. J., et al. Induction of osteoarthritis in the rat by surgical tear of the meniscus: Inhibition of joint damage by a matrix metalloproteinase inhibitor. Osteoarthritis Cartilage. 10 (10), 785-791 (2002).
  8. Li, M., et al. In vivo human adipose-derived mesenchymal stem cell tracking after intra-articular delivery in a rat osteoarthritis model. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 160 (2016).
  9. Zhou, B., et al. Administering human adipose-derived mesenchymal stem cells to prevent and treat experimental arthritis. Clin Immunol. 141 (3), 328-337 (2011).
  10. Desando, G., et al. Intra-articular delivery of adipose derived stromal cells attenuates osteoarthritis progression in an experimental rabbit model. Arthritis Res Ther. 15 (1), 22 (2013).
  11. Riester, S. M., et al. Safety Studies for Use of Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stromal/Stem Cells in a Rabbit Model for Osteoarthritis to Support a Phase I Clinical Trial. Stem Cells Transl Med. 6 (3), 910-922 (2017).
  12. Bai, X., et al. Tracking long-term survival of intramyocardially delivered human adipose tissue-derived stem cells using bioluminescence imaging. Mol Imaging Biol. 13 (4), 633-645 (2011).
  13. Wolbank, S., et al. Labelling of human adipose-derived stem cells for non-invasive in vivo cell tracking. Cell Tissue Bank. 8 (3), 163-177 (2007).
  14. Heymer, A., et al. Iron oxide labelling of human mesenchymal stem cells in collagen hydrogels for articular cartilage repair. Biomaterials. 29 (10), 1473-1483 (2008).
  15. Hemmrich, K., Meersch, M., von Heimburg, D., Pallua, N. Applicability of the dyes CFSE, CM-DiI and PKH26 for tracking of human preadipocytes to evaluate adipose tissue engineering. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 117-127 (2006).
  16. Shim, G., et al. Pharmacokinetics and in vivo fate of intra-articularly transplanted human bone marrow-derived clonal mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 24 (9), 1124-1132 (2015).
  17. Chen, B. K., et al. A safety study on intrathecal delivery of autologous mesenchymal stromal cells in rabbits directly supporting Phase I human trials. Transfusion. 55 (5), 1013-1020 (2015).
  18. Chan, M. M., Gray, B. D., Pak, K. Y., Fong, D. Non-invasive in vivo imaging of arthritis in a collagen-induced murine model with phosphatidylserine-binding near-infrared (NIR) dye. Arthritis Res Ther. 17, 50 (2015).
  19. Texier, I., et al. Cyanine-loaded lipid nanoparticles for improved in vivo fluorescence imaging. J Biomed Opt. 14 (5), 054005 (2009).
  20. Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).
  21. Rahmati, M., Mobasheri, A., Mozafari, M. Inflammatory mediators in osteoarthritis: A critical review of the state-of-the-art, current prospects, and future challenges. Bone. 85, 81-90 (2016).
  22. Detante, O., et al. Intravenous administration of 99mTc-HMPAO-labeled human mesenchymal stem cells after stroke: in vivo imaging and biodistribution. Cell Transplant. 18 (12), 1369-1379 (2009).
  23. Hu, S. L., et al. In vivo magnetic resonance imaging tracking of SPIO-labeled human umbilical cord mesenchymal stem cells. J Cell Biochem. 113 (3), 1005-1012 (2012).
  24. Xia, Q., et al. Intra-articular transplantation of atsttrin-transduced mesenchymal stem cells ameliorate osteoarthritis development. Stem Cells Transl Med. 4 (5), 523-531 (2015).
  25. Jasmin,, et al. Optimized labeling of bone marrow mesenchymal cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles and in vivo visualization by magnetic resonance imaging. J Nanobiotechnology. 9, 4 (2011).
  26. Lehmann, T. P., et al. Coculture of human nucleus pulposus cells with multipotent mesenchymal stromal cells from human bone marrow reveals formation of tunnelling nanotubes. Mol Med Rep. 9 (2), 574-582 (2014).
  27. Wang, W., et al. Human adipose-derived mesenchymal progenitor cells engraft into rabbit articular cartilage. Int J Mol Sci. 16 (6), 12076-12091 (2015).

Tags

विकास जीवविज्ञान अंक १२८ Mesenchymal स्टेम सेल जैव वितरण इंट्रा-जोड़दार इंजेक्शन प्रतिदीप्ति रंजक vivo में इमेजिंग घुटने पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस औसत दर्जे का meniscectomy
<em>Vivo में</em> मानव वसा की ट्रैकिंग-व्युत्पंन Mesenchymal फ्लोरोसेंट Lipophilic झिल्ली डाई के साथ एक चूहे घुटने पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस मॉडल में स्टेम कोशिकाओं
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, M., Hao, M., Jiang, D., Chen,… More

Li, M., Hao, M., Jiang, D., Chen, Y., Wang, W. In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye. J. Vis. Exp. (128), e56273, doi:10.3791/56273 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter