Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Celle-fri biokemiske fluorometriske enzymatisk Assay for høj overførselshastighed måling af Lipid fedtstoffer i High Density Lipoprotein

Published: October 12, 2017 doi: 10.3791/56325
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 2, 1,4, 2,4, 1
1University of California, Los Angeles, 2Centre for Biomedical Research, Burnet Institute, 3School of Health and Biomedical Sciences, RMIT University, 4Department of Infectious Diseases, Monash University

Summary

Vi beskriver her en fluorometriske celle-fri biokemiske assay for bestemmelse af HDL-lipid fedtstoffer. Denne hurtige og reproducerbare assay kan bruges til at bestemme HDL funktion i stor skala undersøgelser og kan bidrage til vores forståelse af HDL funktion i menneskelige sygdom.

Abstract

Lav high-density lipoprotein kolesterol (HDL-C) niveauer er en af de mest magtfulde uafhængige negative prædiktorer af aterosklerotisk hjerte-kar-sygdom (CVD). Struktur og funktion af HDL snarere end HDL-C kan mere præcist at forudsige åreforkalkning. Flere HDL proteiner og lipid kompositoriske ændringer at forringer HDL funktion forekommer i inflammatoriske stater som åreforkalkning. HDL funktion bestemmes normalt af celle-baserede assays såsom cholesterol efflux assay, men disse analyser har talrige ulemper mangel på standardisering. Celle-fri assays kan give mere robust foranstaltninger af HDL funktion i forhold til celle-baserede assays. HDL oxidation forringer HDL funktion. HDL har en vigtig rolle i lipid peroxid transport og høj mængde af lipid peroxider er relateret til unormal HDL funktion. Lipid-sonde interaktioner bør overvejes når fortolkningen af ikke-enzymatiske fluorescens undersøgelser til måling af lipid oxidativt tilstand. Dette motiverede os til at udvikle en celle-fri biokemiske enzymatisk metode til at vurdere HDL lipid peroxid indhold (HDLox), bidrager til HDL dysfunktion. Denne metode er baseret på enzymet peberrodsperoxidase (HRP) og fluorokrom Amplex Red, der kan kvantificere (uden kolesterol oxidase) lipid peroxid indhold pr. mg af HDL-C. Her er en protokol describedfor bestemmelse af HDL-lipid fedtstoffer ved hjælp af fluorokrom reagenset. Assay variation kan reduceres ved strenge standardisering af forsøgsbetingelser. Højere HDLox værdier er forbundet med nedsat HDL antioxidant funktion. Udlæsning af denne analyse er forbundet med udlæsninger af validerede celle-baserede assays, erstatningsmålinger af hjerte-kar-sygdom, systemisk inflammation, immune dysfunktion og tilknyttede kardiovaskulære og metaboliske risiko fænotyper. Denne tekniske tilgang er en robust metode til at vurdere HDL funktion i menneskelige sygdom hvor systemisk inflammation, oxidativ stress og oxiderede lipider har en central rolle (som åreforkalkning).

Introduction

Aterosklerotisk hjerte-kar-sygdom (CVD) er den hyppigste årsag til dødsfald på verdensplan1,2. Epidemiologiske undersøgelser har vist, at lave niveauer af high-density lipoprotein (HDL) kolesterol er generelt omvendt forbundet med risiko for udvikling af åreforkalkning1,2. Selv om flere undersøgelser støtter en atheroprotective rolle for HDL1,2, er den mekanisme, hvormed HDL dæmper indledningen og progression af aterosklerose komplekse 3,4. Således, det er blevet foreslået, at den komplekse struktur og funktion af HDL i stedet for absolutte niveau kan mere præcist at forudsige åreforkalkning 5,6,7,8. Flere HDL proteiner og lipid kompositoriske ændringer at forringer HDL funktion forekommer i inflammatoriske stater som åreforkalkning. Disse i) reducere dens cholesterol efflux potentielle 9, ii) mindske anti-inflammatorisk og øge HDL-associerede pro-inflammatoriske proteiner 6,7, iii) faldet antioxidant faktor niveauer og aktivitet og HDLs evne til at hæmme oxidation af Low Density Lipoprotein (LDLox)10 og iv) øge lipid hydroperoxyd indhold og redox aktivitet (HDLox)9,11. Robust assays, der evaluerer pleotropic funktionerne af HDL (såsom cholesterol efflux, antioxidant funktion) kan supplere bestemmelse af HDL-HDL-C i klinikken.

HDL funktion vurderes normalt af celle-baseret metoder såsom cholesterol efflux assay8,12,13,14. Disse metoder har store begrænsninger herunder betydelige uensartethed med hensyn til typer af celler, der bruges, type af udlæsning rapporteret, mangel på standardisering og forstyrrende virkninger af triglycerider 7,15. Disse ulemper frembyde vanskeligheder for store kliniske studier16. Celle-fri assays kan give mere robust foranstaltninger af HDL funktion i forhold til celle-baserede assays. Cholesterol efflux er en af de vigtigste funktioner af HDL, men det kan kun afgøres ved celle-baserede assays. Andre metoder til at bestemme HDL funktion såsom proteomics17,18,19,20,21,22,23, 24 og cellebaserede monocyt chemotaxis assays af HDL funktion 17,22,25 er ikke blevet standardiseret og kan ikke bruges i stor skala humane undersøgelser.

HDL har betydelig antioxidant atheroprotective virkning5,6,7,8. Funktionen antioxidant af HDL er fastslået i overværelse af LDL i forrige celle gratis fluorometriske assays 26. Disse biokemiske fluorometriske metoder af HDL antioxidant funktion blev oprindeligt udviklet af Mohamad Navab og Alan Fogelman og deres kolleger26. Selv om mange humane undersøgelser har brugt disse metoder til at bestemme HDL funktion 17,18,19,20,21,22,23 ,24, lipid (HDL)-lipid (LDL) og lipid-fluorokrom interaktioner kan begrænse reproducerbarhed af disse celle gratis ikke-enzymatiske biokemiske assays af HDL funktion27,28.

Nylige interesse har fokuseret på de funktionelle konsekvenser af HDL oxidation, der er resultatet af oxidation af lipider og proteiner i HDL 27,29,30. Tidligere undersøgelser har vist, at oxidation af HDL forringer HDL funktion 27,29,30. HDL har en vigtig rolle i lipid peroxid transport og høj mængde af lipid peroxider er relateret til unormal HDL funktion. Dermed kan HDL lipid peroxid indhold bruges til at bestemme HDL funktion 9,17,20,31 og givet de kendte begrænsninger af forudgående assays af HDL funktion7, 15,27,32, vi udviklet alternative fluorometriske metoder der kvantificerer HDL lipid peroxid indhold (HDLox) 32. Denne metode er baseret på enzymet peberrodsperoxidase (HRP) og fluorokrom Amplex Red, der kan kvantificere (uden kolesterol oxidase) lipid peroxid indhold pr. mg af HDL-C 32. Det biokemiske princip i analysen er vist i figur 1. Vi har vist, at denne fluorescens-baserede tilgang ikke har begrænsninger af forudgående HDL funktion assays27,28. Denne analyse har været yderligere raffineret og standardiseret i vores laboratorium, således at det kan pålideligt anvendes i stor skala humane undersøgelser selv med befrugtede plasma 32,33,34, 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. udlæsning af denne analyse er forbundet med udlæsninger af validerede celle-baserede assays, erstatningsmålinger af hjerte-kar-sygdom, systemisk inflammation, immune dysfunktion og tilknyttede kardiovaskulære og metaboliske risiko fænotyper 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. her, vi beskriver denne enkle, men alligevel robust metode til at måle HDL lipid peroxid indhold (HDLox). Denne analyse kan bruges som et redskab til at besvare vigtige forskningsspørgsmål vedrørende rollen af HDL funktion i menneskelige sygdom hvor systemisk inflammation, oxidativ stress og oxiderede lipider har en central rolle (som åreforkalkning)32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

alle eksperimenter ved hjælp af menneskelige biologiske prøver blev udført med etik godkendelse fra universitetet California Los Angeles, Los Angeles og Alfred Hospital menneskelige etiske komité, Melbourne.

NOTE: der er mange variationer af funktionen fluorokrom HDL Assay (Se diskussion) 32. Nedenfor vil vi beskrive den protokol, som giver de mest konsekvente og reproducerbare resultater. Et overblik over analysen er vist i figur 2.

1. behandling af modellen

  1. Brug friske, ikke-hemolyzed serum (kan afhentes i serum separator rør) eller citrat plasma opnås efter 12-14 timers fastende. Hvis brug af kryopræserverede prøver, omfatte passende kontrol som beskrevet i denne protokol.

2. Dag 0-forberedelse til analysen

  1. Forbered arbejder layout af eksperiment med de passende kontrol, prøver og replikater. Kør hver prøve mindst i tre. En repræsentant 96 godt layout er vist i figur 3.
  2. Beregne alle mængder reagenser, der vil blive anvendt til analysen baseret på antallet af prøver og replikater.
    Bemærk: Omfatter en yderligere 10% volumen i hver arbejdsgruppe bestand til at sørge for der er nok volumen for hver reagens for den specifikke eksperiment.
  3. Mærke alle nødvendige rør for alle forskellige trin af analysen f.eks. adskillelse af HDL, måling af HDL-C (valgfrit) og fluorochromeassay.

3. Dag 1-forberedelse af kontrol

  1. forberedelse af undersøgelsesspecifikke poolede kontrol
    1. Opret en kontrolprøve fra poolede plasma eller serum af alle undersøgelse prøver. Hvis kører 20 prøver i hver plade i tre eksemplarer, kombinere 10 µL af hver prøve i en 200 µL samlet kontrol. Give en separat alikvot af denne poolede kontrol til den kliniske laboratorium til at bestemme HDL-C af dette kontrolelement.
      Bemærk: Brug denne poolede kontrol at standardisere analysen og højde for alle mulige kendt (f.eks. type matrix serum versus plasma, fryse-tø cykler, kryopræservering) og ukendt konfoundere, der kan påvirke eksperimentel variation 27 , 28.
  2. Forberedelse af laboratorium-specifik kvalitetskontrol (QCs)
    1. forberede et stort lager af HDL i hvert laboratorium (f.eks HDL isoleret fra 5 mL af plasma fra 10 raske donorer) og cryopreserve flere delprøver af dette materiel, der skal minimere fryse-tø cykler.
    2. Brug mindst 10 forskellige replikerer fra denne bestand til at bestemme den gennemsnitlige værdi af HDLox. Et acceptabelt interval af målte HDLox værdier for hver QC prøve inkluderet i hvert assay er inden for < 15% af variationskoefficienten for denne gennemsnitsværdi.
    3. Give et separat alikvot af denne poolede kontrol til den kliniske laboratorium til at bestemme HDL-C af dette kontrolelement (f.eks. 40 mg/dL).
      Bemærk: En detaljeret tilgang Sådan bruges blod fra blodet banker til at oprette disse kontrolelementer har tidligere været beskrevet 27 , 28 , 32. Bruge yderligere QCs efter behov (f.eks. en fra raske donorer kendt for at have normale HDL funktion og en fra en donor, der er kendt for at have stort set unormal HDL funktion.
  3. Optimering af baggrunden signal og tomme værdier (valgfri)
    1. for at minimere baggrund, tilføje den passende mængde af katalase (1-4 U/mL) i inkubation medium hurtigt fjerne de dannede H 2 O 2 på grund af spontane luft oxidation af buffere.
      Bemærk: Da værdierne fra de blanke brønde (ingen HDL) trækkes fra værdierne for HDL prøver og resultaterne er rapporteret i forhold til en samlet kontrol, (der er inkluderet i den samme 96 godt plade), vi har fundet at dette trin er ikke praktisk affec t resultaterne. Således, optimering af baggrunden signal med katalase kan udelades, hvis det er nødvendigt.

4. Dag 1-adskillelse af HDL kolesterol ved hjælp af HDL nedbør

Bemærk: Brug et kommercielt tilgængelige standardiseret HDL kolesterol fældningen reagens for at isolere apoB forarmet serum ifølge producenten ' Sørensen instruktioner. Disse reagenser er meget udbredt i kolorimetriske assays til at bestemme HDL kolesterolniveauer.

  1. Bruger friske (eller tø) plasma eller serum prøve.
  2. Blande lige store mængder (f.eks. 80 µL) af plasma og HDL kolesterol fældningen reagens (20% w/v polyethylen glycol i glycin buffer til pH 10,0 (25 ° C)).
  3. Blanding af pipettering op og ned.
  4. Centrifugeres ved 1000-2000 x g i 10 min.
  5. Opsug supernatanten (HDL brøkdel).
  6. Ideelt bruge straks de isoleret HDL for fluorochromeassay af HDL lipid fedtstoffer. Men hvis flere prøver køres i samme dag og andre foranstaltninger såsom måling af HDL-kolesterol koncentration er også færdig, derefter gemme den isoleret HDL ved 4 ° C og bruge det den næste dag til funktionen fluorochromeHDL Assay.

5. Dag 1-bestemmelse af HDL-C i isoleret HDL

NOTE: Dette er obligatorisk, hvis værdien af HDL-C fra den kliniske laboratorium bruges til at normalisere HDLox af HDL-C beløb.

  1. Tal HDL-kolesterol fra plasma, ved hjælp af standard kolorimetriske undersøgelser, 27. Der tilsættes 50 µL af kolesterol reagens i hver brønd og kolesterol koncentration ved hjælp af en kolorimetrisk Pladelæser og en kolesterol standard findes i hvert kit.

6. Dag 2-forberedelse af reagenser

  1. forberede HRP og kolesterol løsninger HRP 5 U/mL opløsning (Range 1-10 U/mL).
  2. Forberede 20 mM fluorokrom (fx Amplex rød) løsninger: optø et hætteglas med fluorokrom reagens og DMSO til stuetemperatur. Før brug, opløses fluorokrom reagens (1 mg) i 200 µL af DMSO. Gemme stamopløsning fastfrosset på ≤-20 ° C, beskyttet mod lys.
  3. Forberede positive og negative kontroller: Brug 1 X ' reaktion buffer ' uden kolesterol og 20 mM H 2 O 2 arbejder løsning som en negativ og positiv kontrol, hhv.

7. Dag 2-fluorokrom analyse

  1. tilsættes 50 µL 1 x reaktion buffer som blank (negativ kontrol).
  2. Valgfrit: Tilføj 20 mM brugsopløsning H 2 O 2 som positiv kontrol i hver plade.
  3. Til at minimere eksperimentel variation og sikre, at tilsætning af reagenser og prøver er udført konsekvent og i tide, udføre alle tilføjelser af prøver i en separat 96 godt runde-bund, klar, polystyren eller polypropylen plade (plade 1). Så brug en multikanalpipette til at overføre bestemte mængder til 3 96-brønd plader (plader 2-4: polypropylen, flad botTom, sort) (der har identiske layout) ( figur 2, figur 3).
    1. For eksempel først tilføje 160 µL af isoleret HDL i hver brønd/prøve af plade 1 og derefter med brug af multikanalpipette overføre 50 µL af HDL-kolesterol fra hver brønd/prøve på de 96-brønd sorte plader. Ændre tips mellem hver række/kolonne og bruge ikke-filtreret tips for alle overførsler.
  4. Forlade prøver i brøndene. Smid ikke. Der er ingen wash skridt mellem tilsætning af reagenserne.
  5. Tilsættes 50 µL af HRP løsning 5 U/mL (0,25 U) til hver brønd.
    Bemærk: Brug HRP før tilføjelsen af fluorokrom reagenset.
  6. Inkubér i 30 minutter ved 37 ° C. Smid ikke prøver efter inkubation (ingen wash skridt mellem tilføjelser af reagenser).
  7. Tilsættes 50 µL af fluorochromereagent til en endelig koncentration på 300 µM. På dette tidspunkt, samlede reaktion volumen er 150 µL. Bland godt og beskytte mod lys.
  8. Vurdere den fluorescerende udlæsning (i mørke) hvert minut over 120 minutter ved 37 ° C med en fluorescerende Pladelæser (530/590 nm filtre).
    Bemærk: Brug en kortere 60-minutters interval med friske prøver. Vi har fundet, at 120 minutters assay giver mere reproducerbare data ved brug af kryopræserverede prøver.
  9. Registrere data ved hjælp af passende software.

8. Dag 3-Data analyse

  1. optage fluorescens enheder (arbitrære enheder) på 120 minutter efter tilsætning af fluorokrom reagens for alle de prøver, herunder tomme brønde og alle kontrolelementer.
  2. Beregne gennemsnitsværdien af fluorescens enheder (baseret på mindst triplicates) (HDL ox_sample). Tag ikke outliers (> 2 SDs fra den gennemsnitlige værdi) i betragtning.
  3. Trækker baggrund fluorescens ved hjælp af følgende ligning:
    Equation 1
  4. normalisering for HDL kolesterol mængden (HDL-C): normalisere HDLox lipid fedtstoffer værdi for hver prøve (herunder poolede kontrol) af HDL-C) (mg/dl). Hele afsnittet resultater præsenteres HDL ox som n (HDL-C) HDLox foranstaltning at afspejle justering for HDL-C. Bruge følgende ligning:
    Equation 2
  5. standardisere udtryk for HDLox lipid fedtstoffer værdien af hver prøve mod værdien af en samlet kontrol. Normalisere Nielsen (HDL-C) HDLox lipid fedtstoffer værdi for hver prøve (justeret for HDL-C) af n (HDL-C) HDLox lipid fedtstoffer værdien i kontrolelementet puljeproces. Hele afsnittet resultater præsenteres HDL ox som nHDL ox foranstaltning at afspejle justering for eksperimentel variation og HDL-C. Bruge følgende ligning:
    Equation 3
    NOTE: denne tilgang er magen til andre etablerede eksperimenterende tilgange til at reducere eksperimentel variation af målinger såsom International normaliseret ratio (INR) 44 , 45. Denne tilgang er blevet valideret i kliniske studier 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39.
  6. udføre kvalitetskontrol af eksperimentelle resultater ved hjælp af standard kvalitet kontrolprøver. Hvert laboratorium bør etablere deres egen kvalitetskontrol (QCs). Ideelt set er der et QC for nHDLox fra en prøve med kendte dysfunktionelle HDL og en QC for nHDLox fra en prøve fra raske donorer [f.eks. Brug poolet prøve af unge voksne, der er etableret blodbank donorer og har ingen kendte komorbiditet og risikofaktorer for hjerte-kar-sygdom herunder rygning]. Den sidstnævnte kontrol standardiserer resultaterne blandt forskellige laboratorier. De gennemsnitlige værdier af disse QCs er etableret baseret på mindst 5 flergangsbestemmelser (typisk vi bruge 10 flergangsbestemmelser for dette vigtige skridt).
    1. Kontrol om målt QCs i hvert assay har værdier inden for det forventede interval af værdier. Antager en acceptabel maksimale eksperimentel variation på 15%, skal alle de målte eksperimentelle værdier falde inden for 15% af de kendte gennemsnitlige værdier af etablerede QC. Brug følgende ligninger:
      Equation 4
      Equation 5
      NOTE: Hvis enten af den inkluderet kvalitetskontrol prøver () normal versus dysfunktionelle HDL) giver HDLox værdier uden for forventede interval (etableret i hvert laboratorium) derefter gentage eksperimentet.
  7. Udføre kvalitetskontrol af eksperimentelle resultater ved hjælp af variationskoefficienten (CV) for at kvantificere eksperimentel variation: Gentag alle prøver med CV % > 15%. Bruge følgende ligning:
    Equation 6
    NOTE: et typisk intra-assay (inden for den samme plade) og Inter assay (blandt forskellige plader) eksperimentel variation er < 15%. 2) et typisk intra-assay CV er mellem 1-7% og en typisk kitstandarder CV er mellem 3-10%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

50 µL af hver prøve, HDL er tilføjet i hver brønd i trin 7.3. 50 µL af HRP løsning 5 U/mL (0,25 U) føjes derefter til hver brønd i skridt 7,5. Prøverne inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C i skridt 7,6. 50 µL fluorokrom reagens føjes derefter til hver brønd i trin 7,7 (endelig koncentration af 300 µM). Den fluorescerende udlæsning (i mørke) vurderes derefter hvert minut over 120 minutter ved 37 ° C med en fluorescerende Pladelæser (530/590 nm filtre). Repræsentative fluorescens data til tom, samlet kontrol, prøve med kendte dysfunktionelle HDL og prøve med normal HDL er vist i figur 4. Repræsentative rådata og trin for trin analyse af resultater ved hjælp af de ligninger, der er beskrevet i afsnit 8 i protokollen er vist i tabel 1. I dette eksempel, friske HDL prøver blev brugt og højere HDLox værdier er generelt opnået med friske HDL. For eksempel, havde HDL kendt for at være dysfunktionel baseret på uafhængige assays af HDL funktion og fra HIV-smittet person ca 2-fold relativt højere mængde af lipid peroxid sammenlignet med poolede HDL fra raske deltagere. Figur 5 viser repræsentative resultater fra en undersøgelse med fag kendt for at have nedsat HDL funktion28,32. De HIV-smittede personer havde ca 60% højere: HDL-lipid peroxid indhold (pr. mg af HDL-C) i forhold til de ikke-inficerede personer. I vores tidligere offentliggjorte undersøgelser med befrugtede HDL kunne denne metode dokumentere mindst 10% relative forskelle i HDLox i forhold til HDL fra kontrol grupper (uden sygdomme f.eks kronisk hivinfektion)36,37, 38.

Figure 1
Figur 1: Bestemmelse af HDL lipid peroxid indhold pr. specifikke mængde af HDL-C.
I stater af systemisk inflammation og oxidativ stress steget HDL lipid peroxider (LOOH) (HDLox), der er forbundet med nedsat HDL funktion. HRP katalyserer oxidation af ikke-fluorescerende fluorokrom til fluorescerende resorufin rød. Denne oxidation kan være drevet af både endogene peroxider stede i reaktion (OH-) og HDL-lipid peroxider (LOOH-). Uden kolesterol oxidase, kan resorufin (med HRP) kvantificere den iboende HDL lipid peroxid indhold af en bestemt mængde af HDL-kolesterol. Baggrund produktion af OH - grund af luft oxidation af bufferen er trukket fra de fluorescerende udlæsning af hver brønd. Resorufin har minimal autofluorescence i de fleste prøver. Dette tal er blevet modificeret 32. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Oversigt over arbejdsgangen for fluorochromeassay af HDL lipid fedtstoffer.
Dag 0: Forberedelse til analysen: A) design 96 godt plade layouts, vurdere omfanget af nødvendige prøver (plasma/serum) og reagenser (HRP enzym, fluorokrom reagens, buffere, PIND reagens), label rør
Dag 1: Forberedelse til analyse og HDL isolation: A) forberedelse af kontrolelementer (undersøgelse specifikke-samlet kontrol, kvalitetskontrol, positive og negative kontroller) B) HDL nedbør ved hjælp af PIND reagens.
Dag 2: Forberedelse til analysen (hvis ikke skakmat dag 1) og fluorokrom analyse: A) forberedelse af kontrolelementer (undersøgelse specifikke-samlet kontrol, kvalitetskontrol, positive og negative kontroller) A) tilsætning af HDL prøver: at minimere eksperimentel variation og sikre, at tilsætning af reagenser og prøver gennemføres konsekvent og rettidigt anbefales det, at alle tilføjelser af prøver (f.eks. 160 µL) er først færdig i en separat 96 godt runde-bund, klar, polystyren eller polypropylen plade (plade 1). Så en multikanalpipette kan anvendes til at overføre bestemte mængder (f.eks. 50 µL) til 3 96-brønd plader (plader 2-4: polypropylen, flad bund, sorte plader) (der har identiske layout). B) tilsætning af HRP: tilsættes 50 µL af 5 U/mL (0,25 U) til hver brønd med en multikanalpipette C) Incubate ved 37 ° C i 30 min D) tilsættes 50 µL af 300 µM/godt af fluorokrom reagens til hver brønd med en multikanalpipette E) vurdere de fluorescerende udlæsning (i mørke) hvert minut over 120 minutter ved 37 ° C med en fluorescerende Pladelæser (530/590 nm filtre).
Dag 3: Dataanalyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Repræsentant layout af 96 godt plader, der typisk bruges i funktionen fluorokrom HDL Assay.
Forskelle i timing af tilsætning af HDL prøver i wells af en plade kan føre til forskelle i spontan oxidation mellem forskellige brønde. For at minimere eksperimentel variation, undgå variable spontan oxidation mellem forskellige brønde og sikre, at tilsætning af reagenser og prøver gennemføres konsekvent og i tide, anbefales det, at alle tilføjelser af prøver (f.eks. 160 µL) er først gjort i en separat 96 godt runde-bund, klar, polystyren eller polypropylen plade (plade 1). Så en multikanalpipette kan anvendes til at overføre bestemte mængder (f.eks. 50 µL) til 3 96-brønd plader (plader 2-4: polypropylen, flad bund, sorte plader) (der har identiske layout). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative data af HDL lipid fedtstoffer assay.
Den fluorescerende udlæsning (i mørke) vurderes derefter hvert minut over 120 minutter ved 37 ° C med en fluorescerende Pladelæser (530/590 nm filtre). Repræsentative data (arbitrære enheder) er vist for blank (ingen HDL; negative kontroller), positiv kontrol (H2O2), samles HDL kontrol og HDL fra patienten kendt for at have dysfunktionelle HDL (baseret på to uafhængige HDL funktion assays-cholesterol efflux og monocyt chemotaxis assay). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Lipid peroxid analysen af HDL funktion kan afsløre høj lipid peroxid indhold pr. specifikke mængde af HDL-C in vivo.
HDL blev isoleret og HDLox blev fastsat som beskrevet i protokollen i 50 raske forsøgspersoner og 100 patienter med HIV-infektion. De HIV-smittede personer havde højere HDLox (1.59±0.53) i forhold til kontrol (1.01±0.31) (p < 0,001). Dette tal er blevet modificeret 32. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen beskrevet her tilbyder en robust værktøj for at besvare vigtige forskningsspørgsmål vedrørende rollen af HDL funktion i åreforkalkning og sygdom hos mennesker. Analysen kvantificerer HDL lipid peroxid indhold pr. mg af HDL-C ved hjælp af enzymatiske forstærkning (HRP). Denne metode undgår kendte begrænsninger af forudgående HDL funktion assays (fx cholesterol efflux assayet) herunder betydelige uensartethed med hensyn til typer af celler, der bruges, type af udlæsning rapporteret, mangel på standardisering og forstyrrende virkninger af triglycerider7,15,32. Bestemmelse af biokemiske i stedet for biologiske egenskaber (f.eks. cholesterol efflux) af HDL kan være mere reproducerbare. Inter assay eksperimentelle variabilitet i < 10% sammenligner positivt med de celle-baserede assays af HDL funktion, hvor Inter-assay eksperimentel variation er ofte > 15% (eller ikke rapporteret). Desuden, denne tilgang kan begrænse biokemiske samspil mellem lipider og fluorescerende sonder32. Bestemmelse af HDL oxidation er relevante i forbindelse med hjerte-kar-sygdomme på grund af oxidative stress i arterievæggen centrale rolle i patogenesen af atherogenesis 46. Vi har brugt fluorokrom HDL funktion assay til påvisning nedsat HDL funktion i stater af kronisk oxidativ stress som åreforkalkning og Human immundefekt Virus Infektion (HIV)32. Brug af biokemiske assay af HDL funktion, har flere undersøgelser bekræftet sammenslutningen af HDLox med fedme og hjerte-kar-sygdom 19,21,27,34,35 ,36,47. Væsentligt, i menneskelige pilotundersøgelser vi vist sammenslutninger af HDLox med validerede celle-baserede assays, rugemor foranstaltninger af hjerte-kar-sygdom, systemisk inflammation, immune dysfunktion og tilhørende kardiovaskulære og metaboliske risiko fænotyper32,36. Selvom denne analyse har været brugt i flere studier at tage fat på rolle HDL funktion i forskellige sygdomme som kronisk HIV infektion32,38, åreforkalkning 32 og fedme36, det er fortsat for at være valideret i stor skala undersøgelser med tilgængelige kliniske endepunkter for CVD (f.eks. hjerteanfald).

Reaktion af fluorokrom med peroxider i HRP at producere stærkt fluorescerende resorufin er veletableret 48,49. HRP katalyserer oxidation af ikke-fluorescerende fluorokrom-fluorescerende resorufin røde50,51. Denne oxidation kan være drevet af både endogene peroxider stede i reaktion (OH-) og HDL-lipid peroxider (LOOH-). Uden kolesterol oxidase, kan resorufin (med HRP) kvantificere den iboende HDL lipid peroxid indhold af en bestemt mængde af HDL-kolesterol. Baggrund produktion af OH - grund af luft oxidation af bufferen er trukket fra de fluorescerende udlæsning af hver brønd. Resorufin har minimal autofluorescence i de fleste prøver. Tilsætning af katalase (1-4 U/mL) i reaktion buffer kan hurtigt dæmpe endogene peroxider, således at stigningen i den fluorescerende udlæsning over tid er drevet af HDL lipid peroxider. Analysen er alsidige og kan vurdere lipid peroxid indhold i HDL cholesteryl estere versus frie HDL kolesterol32,48,49 .

Der er mange variationer af funktionen fluorokrom HDL Assay32. Kort der er mindst 3 store tilgange: en) tilføje en bestemt mængde af HDL (f.eks. 50 µL) pr. brønd og senere normalisere HDL lipid fedtstoffer værdi af niveauet af HDL-C som fastsat i den kliniske laboratorium; b) bestemme koncentrationen af HDL-C i hver prøve, baseret på standard kolorimetriske kolesterol assays og derefter tilføje en bestemt mængde af HDL-C (f.eks. 1 µg) pr. brønd; og c) normalisere HDL funktion udlæsning af HDL eller apoA-jeg protein indhold32. Der er også mindst 3 store strategier på hvordan at isolere HDL for HDL lipid fedtstoffer assays: a) HDL kolesterol nedbør fx med polyethylen glycol; b) Immunoaffinity capture; og c) andre standardmetoder ikke høj overførselshastighed for HDL isolation som µLtracentrifugation32. Derudover analysen er alsidige og kan vurdere lipid peroxid indhold i HDL cholesteryl estere versus frie HDL kolesterol 32. Der er flere måder at rapportere resultater f.eks. vilkårlige fluorescens enheder, standardiseret resorufin fluorescens enheder, normaliseret forholdet til en samlet kontrol32. Heri præsenterer vi de mest reproducerbare tilgang.

Hvis plasma er brugt er det vigtigt at forberede plasma i rør, der har natriumcitrat som antikoagulerende 27,28. EDTA40 og heparin sulfat kan interferere med oxidation reaktioner 41,42. Heparin sulfat kan forstyrre biokemiske assays af HDL funktion 27,28. Selvom befrugtede serum og plasma er suboptimal til bestemmelse af lipider, HDL funktion og HDL lipid fedtstoffer, kan befrugtede prøver kvantificere relative forskelle i HDL lipid fedtstoffer pr. mg af HDL. Det er vigtigt at behandle alle prøver inden for en specifik undersøgelse på nøjagtig samme måde (f.eks. samme fryse-tø cykler) og omfatter en samlet kontrol i hver plade for at tage højde for potentielle konfoundere relateret til forskelle i prøve behandling blandt forskellige undersøgelser. Langsigtet kryopræservering kan kompromittere resultatet af HDL funktion assays43 men relative forskelle i HDL lipid fedtstoffer blandt prøver inden for en undersøgelse kan stadig vurderes, hvis en passende samlet kontrol er brugt 27, 28.

Vigtigere, er forudgående HDL funktion assays ikke standardiseret. Her beskriver vi en tilgang, hvor brugen af passende kontrol sikrer standardisering af udlæsningen. Mere specifikt er der flere kendte parametre, der kan påvirke udlæsning af biokemiske assays af HDL fungere som matrixeffekter (serum vs metode af plasma forberedelse), tilstedeværelsen af albumin og andre proteiner, kryopræservering, fryse-optøning 32. the HDL funktion fluorokrom assay kan være standardiseret med brug af kommercielt tilgængelige standarder og eksperimenterende reagenser32. Men der er ogsåflere ukendte (eller dårligt karakteriseret) konfoundere i hver undersøgelse og blandt forskellige personer, der kan påvirke bestemmelse af HDL fungere resultater. Således i hver plade bruger vi en samlet HDL kontrol forberedt fra de specifikke enheder af interesse inden for en given undersøgelse, (der er blevet behandlet ens), der minimerer artefakter og konfoundere32. Brug af plasmaprøver blodbank og HDL-C værdier fra den kliniske laboratorium kan yderligere standardisere assay32.

Vi har tidligere vist, at forskellige metoder af HDL isolation har væsentlig indflydelse på udlæsning af biokemiske assays af HDL funktion 27,28,32 , men fluorokrom kan pålideligt måle HDLox uanset af HDL isolation 32. HDL isolation metoder er en væsentlig begrænsende faktor for høj overførselshastighed undersøgelser af HDL funktion. Ultracentrifugering anses referencemetoden i dag, men er fortsat en tidskrævende metode52. Elektroforese er upræcise og standardiseret ikke 53. HDL nedbør metoder indebærer brug af polyanions som polyethylenglycol (PEG) at udfælde low density lipoproteiner forlader HDL i den supernatanten 54. Selv om disse metoder vises visse ulemper såsom variable resultater med lipemic sera og interferens med enzymatisk kolesterol procedurer 55 forudgående ændringer på standardiseret den oprindelige procedure ved hjælp af kommercielt tilgængelige reagenser give en enkel, pålidelig og præcis procedure56. Selv om PIND nedbør er almindeligt anvendte metode til at isolere HDL21,57 fra patientens serum, er et stort problem tilstedeværelsen af ikke-HDL proteiner såsom albumin58. Immunoaffinity isolation kan bruges til at minimere effekten af albumin på HDL funktion 32. Selv om relative forskelle i HDLox for en bestemt fange metode kan vurderes, kan specifikke antistoffer mod HDL ikke fuldt fange komplekse HDL strukturer. Ved hjælp af passende kontrol, som beskrevet i denne protokol, kan relative forskelle i HDLox mellem HDL prøver (isoleret af PIND nedbør) pålideligt bestemmes.

Denne analyse, ligesom alle andre assays af HDL funktion, har vigtige begrænsninger. In vivo oxidation af HDL i arterievæggen er ganske kompleks og heterogen og lipid peroxid indhold afspejler måske kun delvis HDLox46. HDL struktur og funktion ændringer løbende i vivo og måling af HDL funktion på et tidspunkt måske ikke afspejler virkningen af HDL dysfunktion i slutningen orgel sygdomme over tid59. Det vides ikke om HDLox udlæsning bør være normaliseret af HDL-C eller HDL protein 22. Fremtidige kliniske undersøgelser bør validere betydningen af udlæsning af assay (HDL lipid peroxid indhold pr. mg af HDL-C).

Sammenfattende er fluorokrom HDL funktion assay en pålidelig metode til bestemmelse af HDL lipid peroxid indhold pr. specifikke mængde af HDL (HDLox). Højere HDLox værdier er forbundet med nedsat HDL antioxidant funktion. Udlæsning af denne analyse er forbundet med validerede celle-baserede assays, erstatningsmålinger af hjerte-kar-sygdom, systemisk inflammation, immune dysfunktion og tilknyttede kardiovaskulære og metaboliske risiko fænotyper 19, 21,27,32,34,35,36,37,38,39, 47. denne metode giver en bekvem, men robust værktøj til udvandrere fra HDL funktion i menneskelige sygdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Denne protokol og assay er relevante for den patent PCT/US2015/018147.

Acknowledgments

Forfatterne parlamentsarbejdet Dr Mohamad Navab, Alan Fogelman og Srinivasa Reddy arbejde for deres centrale rolle i udviklingen af tidligere gentagelser af denne model. T.A.A. understøttes af en RMIT University Vice-kansler postdoc stipendium. AJ og AH understøttes af NHMRC project grant 1108792. TK er støttet af NIH tilskud NIH K08AI08272, NIH/NCATS Grant # µL1TR000124.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Experimental Reagents
HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating Reagent Pointe Scientific H7511
Amplex Red reagent. Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
DMSO. Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
Horse Radish Peroxidase (HRP) Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
Cholesterol Esterase. Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
Cholesterol Reference standard Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
Resorufin fluorescense Reference standard Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
5x Reaction Buffer. Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
HDL Cholesterol Automated Reagent ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. TR39601
Name Company Catalog Number Comments
Plasticware
96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear). Sigma Aldrich M0687
96-well plates (polypropylene, flat bottom, black). Sigma Aldrich M9936
1.5 mL Eppendorf tubes Eppendorf 0030 125.150
ClipTip 200, sterile ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. 14-488-058
Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125  ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.  14-387--955
Name Company Catalog Number Comments
Software
Gen5 2.01 software Biotek, Vermont, USA NA
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Gen5 Plate reader Biotek, Vermont, USA NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gordon, D. J., Rifkind, B. M. High-density lipoprotein--the clinical implications of recent studies. N Engl J Med. 321, 1311-1316 (1989).
  2. Rubins, H. B., et al. Gemfibrozil for the secondary prevention of coronary heart disease in men with low levels of high-density lipoprotein cholesterol. Veterans Affairs High-Density Lipoprotein Cholesterol Intervention Trial Study Group. N Engl J Med. 341, 410-418 (1999).
  3. Voight, B. F., et al. Plasma HDL cholesterol and risk of myocardial infarction: a mendelian randomisation study. Lancet. 380, 572-580 (2012).
  4. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat.Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
  5. Navab, M., et al. The double jeopardy of HDL. Ann Med. 37, 173-178 (2005).
  6. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Anantharamaiah, G. M., Fogelman, A. M. The role of dysfunctional HDL in atherosclerosis. J Lipid Res. 50, Suppl . S145-S149 (2009).
  7. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
  8. Patel, S., et al. Reconstituted high-density lipoprotein increases plasma high-density lipoprotein anti-inflammatory properties and cholesterol efflux capacity in patients with type 2 diabetes. J Am Coll Cardiol. 53, 962-971 (2009).
  9. Navab, M., et al. HDL and the inflammatory response induced by LDL-derived oxidized phospholipids. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21, 481-488 (2001).
  10. Hayek, T., Oiknine, J., Brook, J. G., Aviram, M. Role of HDL apolipoprotein E in cellular cholesterol efflux: studies in apo E knockout transgenic mice. Biochem Biophys Res Commun. 205, 1072-1078 (1994).
  11. Van Lenten, B. J., et al. Anti-inflammatory HDL becomes pro-inflammatory during the acute phase response. Loss of protective effect of HDL against LDL oxidation in aortic wall cell cocultures. J Clin Invest. 96, 2758-2767 (1995).
  12. Undurti, A., et al. Modification of high density lipoprotein by myeloperoxidase generates a pro-inflammatory particle. J Biol Chem. 284, 30825-30835 (2009).
  13. Van Lenten, B. J., et al. Lipoprotein inflammatory properties and serum amyloid A levels but not cholesterol levels predict lesion area in cholesterol-fed rabbits. J Lipid Res. 48, 2344-2353 (2007).
  14. Watson, C. E., et al. Treatment of patients with cardiovascular disease with L-4F, an apo-A1 mimetic, did not improve select biomarkers of HDL function. J Lipid Res. 52, 361-373 (2011).
  15. Annema, W., et al. Impaired HDL cholesterol efflux in metabolic syndrome is unrelated to glucose tolerance status: the CODAM study. Sci Rep. 6, 27367 (2016).
  16. Movva, R., Rader, D. J. Laboratory assessment of HDL heterogeneity and function. Clin Chem. 54, 788-800 (2008).
  17. Charles-Schoeman, C., et al. Abnormal function of high-density lipoprotein is associated with poor disease control and an altered protein cargo in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 60, 2870-2879 (2009).
  18. Imaizumi, S., et al. L-4F differentially alters plasma levels of oxidized fatty acids resulting in more anti-inflammatory HDL in mice. Drug Metab Lett. 4, 139-148 (2010).
  19. Khera, A. V., et al. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364, 127-135 (2011).
  20. Morgantini, C., et al. Anti-inflammatory and antioxidant properties of HDLs are impaired in type 2 diabetes. Diabetes. 60, 2617-2623 (2011).
  21. Patel, P. J., Khera, A. V., Jafri, K., Wilensky, R. L., Rader, D. J. The anti-oxidative capacity of high-density lipoprotein is reduced in acute coronary syndrome but not in stable coronary artery disease. J Am Coll Cardiol. 58, 2068-2075 (2011).
  22. Watanabe, J., et al. Proteomic profiling following immunoaffinity capture of high-density lipoprotein: association of acute-phase proteins and complement factors with proinflammatory high-density lipoprotein in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 64, 1828-1837 (2012).
  23. Watanabe, J., et al. Differential association of hemoglobin with proinflammatory high density lipoproteins in atherogenic/hyperlipidemic mice. A novel biomarker of atherosclerosis. J Biol Chem. 282, 23698-23707 (2007).
  24. Watanabe, J., et al. Hemoglobin and its scavenger protein haptoglobin associate with apoA-1-containing particles and influence the inflammatory properties and function of high density lipoprotein. J Biol Chem. 284, 18292-18301 (2009).
  25. Wang, X. S., et al. A sensitive and specific ELISA detects methionine sulfoxide-containing apolipoprotein A-I in HDL. J Lipid Res. 50, 586-594 (2009).
  26. Navab, M., et al. A cell-free assay for detecting HDL that is dysfunctional in preventing the formation of or inactivating oxidized phospholipids. J Lipid Res. 42, 1308-1317 (2001).
  27. Kelesidis, T., et al. A biochemical fluorometric method for assessing the oxidative properties of HDL. J Lipid Res. 52, 2341-2351 (2011).
  28. Kelesidis, T., et al. Effects of lipid-probe interactions in biochemical fluorometric methods that assess HDL redox activity. Lipids Health Dis. 11, 87 (2012).
  29. Navab, M., et al. Mechanisms of disease: proatherogenic HDL--an evolving field. Nat Clin Pract Endocrinol Metab. 2, 504-511 (2006).
  30. Navab, M., et al. The oxidation hypothesis of atherogenesis: the role of oxidized phospholipids and HDL. J Lipid Res. 45, 993-1007 (2004).
  31. Morgantini, C., et al. HDL lipid composition is profoundly altered in patients with type 2 diabetes and atherosclerotic vascular disease. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 24, 594-599 (2014).
  32. Kelesidis, T., et al. A high throughput biochemical fluorometric method for measuring lipid peroxidation in HDL. PLoS One. 9, e111716 (2014).
  33. Kelesidis, T., Yang, O. O., Kendall, M. A., Hodis, H. N., Currier, J. S. Dysfunctional HDL and progression of atherosclerosis in HIV-1-infected and -uninfected adults. Lipids Health Dis. 12, 23 (2013).
  34. Zanni, M. V., et al. HDL redox activity is increased in HIV-infected men in association with macrophage activation and non-calcified coronary atherosclerotic plaque. Antivir Ther. 19, 805-811 (2014).
  35. Roberts, C. K., Katiraie, M., Croymans, D. M., Yang, O. O., Kelesidis, T. Untrained young men have dysfunctional HDL compared with strength-trained men irrespective of body weight status. J Appl Physiol (1985). , 1043-1049 (2013).
  36. Davidson, W. S., et al. Weight loss surgery in adolescents corrects high-density lipoprotein subspecies and their function. Int J Obes (Lond). 41, 83-89 (2017).
  37. Kelesidis, T., et al. Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals. J Acquir Immune Defic Syndr. , (2017).
  38. Kelesidis, T., et al. Oxidized lipoproteins are associated with markers of inflammation and immune activation in HIV-1 infection. AIDS. 30, 2625-2633 (2016).
  39. Kelesidis, T., et al. Changes in plasma levels of oxidized lipoproteins and lipoprotein subfractions with atazanavir-, raltegravir-, darunavir-based initial antiviral therapy and associations with common carotid artery intima-media thickness: ACTG 5260s. Antivir Ther. , (2016).
  40. Bhattacharyya, D. K., Adak, S., Bandyopadhyay, U., Banerjee, R. K. Mechanism of inhibition of horseradish peroxidase-catalysed iodide oxidation by EDTA. Biochem J. 295 (Pt 2), 281-288 (1994).
  41. Rees, M. D., Pattison, D. I., Davies, M. J. Oxidation of heparan sulphate by hypochlorite: role of N-chloro derivatives and dichloramine-dependent fragmentation. Biochem J. 391, 125-134 (2005).
  42. Mani, K., Cheng, F., Fransson, L. A. Heparan sulfate degradation products can associate with oxidized proteins and proteasomes. J Biol Chem. 282, 21934-21944 (2007).
  43. Finley, P. R., Schifman, R. B., Williams, R. J., Lichti, D. A. Cholesterol in high-density lipoprotein: use of Mg2+/dextran sulfate in its enzymic measurement. Clin Chem. 24, 931-933 (1978).
  44. von Schenck, H., Jacobsson, M. L. Prothrombin assay standardized with an international normalization ratio (INR): goal and reality. Clin Chem. 33, 342 (1987).
  45. de Kok, J. B., et al. Normalization of gene expression measurements in tumor tissues: comparison of 13 endogenous control genes. Lab Invest. 85, 154-159 (2005).
  46. Stocker, R., Keaney, J. F. Jr Role of oxidative modifications in atherosclerosis. Physiol Rev. 84, 1381-1478 (2004).
  47. Holzer, M., et al. Aging affects high-density lipoprotein composition and function. Biochim Biophys Acta. 1831, 1442-1448 (2013).
  48. Amundson, D. M., Zhou, M. Fluorometric method for the enzymatic determination of cholesterol. J Biochem Biophys Methods. 38, 43-52 (1999).
  49. Mishin, V., Gray, J. P., Heck, D. E., Laskin, D. L., Laskin, J. D. Application of the Amplex red/horseradish peroxidase assay to measure hydrogen peroxide generation by recombinant microsomal enzymes. Free Radic Biol Med. 48, 1485-1491 (2010).
  50. Lombardi, A., et al. UCP3 translocates lipid hydroperoxide and mediates lipid hydroperoxide-dependent mitochondrial uncoupling. J Biol Chem. 285, 16599-16605 (2010).
  51. Bhattacharya, A., et al. Denervation induces cytosolic phospholipase A2-mediated fatty acid hydroperoxide generation by muscle mitochondria. J Biol Chem. 284, 46-55 (2009).
  52. Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of µLtracentrifugally separated lipoproteins in human serum. J Clin Invest. 34, 1345-1353 (1955).
  53. Dyerberg, J. Comments on the quantitation of lipoproteins by agarose-gel electrophoresis. Clin Chim Acta. 61, 103-104 (1975).
  54. Warnick, G. R., Cheung, M. C., Albers, J. J. Comparison of current methods for high-density lipoprotein cholesterol quantitation. Clin Chem. 25, 596-604 (1979).
  55. Demacker, P. N., Hijmans, A. G., Vos-Janssen, H. E., van't Laar, A., Jansen, A. P. A study of the use of polyethylene glycol in estimating cholesterol in high-density lipoprotein. Clin Chem. 26, 1775-1779 (1980).
  56. Izzo, C., Grillo, F., Murador, E. Improved method for determination of high-density-lipoprotein cholesterol I. Isolation of high-density lipoproteins by use of polyethylene glycol 6000. Clin Chem. 27, 371-374 (1981).
  57. Patel, P. J., Khera, A. V., Wilensky, R. L., Rader, D. J. Anti-oxidative and cholesterol efflux capacities of high-density lipoprotein are reduced in ischaemic cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 15, 1215-1219 (2013).
  58. Roche, M., Rondeau, P., Singh, N. R., Tarnus, E., Bourdon, E. The antioxidant properties of serum albumin. FEBS Lett. 582, 1783-1787 (2008).
  59. Panzenbock, U., Kritharides, L., Raftery, M., Rye, K. A., Stocker, R. Oxidation of methionine residues to methionine sulfoxides does not decrease potential antiatherogenic properties of apolipoprotein A-I. J Biol Chem. 275, 19536-19544 (2000).

Tags

Immunologi spørgsmålet 128 HDL funktion oxideret HDL lipid fedtstoffer celle-fri assay fluorometriske metode Amplex rød
Celle-fri biokemiske fluorometriske enzymatisk Assay for høj overførselshastighed måling af Lipid fedtstoffer i High Density Lipoprotein
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sen Roy, S., Nguyen, H. C. X.,… More

Sen Roy, S., Nguyen, H. C. X., Angelovich, T. A., Hearps, A. C., Huynh, D., Jaworowski, A., Kelesidis, T. Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein. J. Vis. Exp. (128), e56325, doi:10.3791/56325 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter