نحن تقرير الحمض النووي الريبي دبوس صغير (شرنا) والبروتوكول على أساس تسلسل الجيل القادم لتحديد الجهات التنظيمية للمنظمة إكستشروموسومي في خط خلية مورين مع لوسيفراس اليراع وتنصهر فيها جينات مقاومة هيجروميسين الميثيل البد ملزمة البروتين 2 ( MeCP2) الجينات على كروموسوم X غير نشط.
شاشات الجينية إلى الأمام باستخدام الجينات مراسل إدراجها في هيتيروتشروماتين قد استخدمت على نطاق واسع للتحقيق وآليات الرقابة جينية في نموذج الكائنات الحية. وقد مكنت التكنولوجيات بما في ذلك الكشف دبوس الشعر القصير (شرناس) ومجمع إينتيرسباسيد بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر) هذه الشاشات في خلايا الثدييات مثنوية. هنا يمكننا وصف شاشة شرنا على نطاق واسع للمنظمين للمنظمة إكستشروموسومي (إكسسي)، باستخدام خط خلية مورين مع لوسيفراس اليراع وطرقت جينات مقاومة هيجروميسين في ج-محطة الميثيل البد البروتين الجيني (MeCP2) 2 على إكستشروموسومي غير نشط (الحادي عشر). إعادة تنشيط بناء في خط الخلية مراسل تمنح ميزة البقاء على قيد الحياة تحت هيجروميسين ب التحديد، مما مكننا من شاشة مكتبة كبيرة شرنا وتحديد دبابيس الشعر التي أعادت تنشيط المراسل بقياس التحديد بعد تخصيب اليورانيوم باستخدام تسلسل الجيل القادم. ثم التحقق من دبابيس الشعر المخصب على حدة عن طريق اختبار قدرتها على تنشيط لوسيفراس المراسل في الحادي عشر.
أحد الأشكال الأكثر شيوعاً للإعاقة العقلية وراثية في الإناث، ومتلازمة ريت، بسبب الطفرات متخالف في MeCP2، جينات إكستشروموسومي الذي يقوم بترميز بروتين ضروري لوظيفة الخلايا العصبية الطبيعية1. اتباع نهج محتمل لعلاج هذا الاضطراب سيكون تنشيط اليل MeCP2 البرية من نوع الحادي عشر، كما تبين ذلك استعادة التعبير MeCP2 لعكس العجز العصبية في نموذج الفأر من هذا المرض1، 2 , 4-بيد إسكات جينية من واحد من اثنين من الكروموزومات في خلايا الإناث العاشر هو الإبقاء على أحكام طوال العمر الافتراضي لكائن حي3،4، والمرجح أن تتطلب تنشيط قوية من الجينات الحادي عشر رئيسية اضطراب في مسارات تنظيمية جينية متعددة.
تحديد العوامل اللازمة للصيانة لإسكات MeCP2 ، وضعنا أول نموذج ماوس المحورة وراثيا تحمل MeCP2-لوسيفراس-هيجروميسين مقاومة جينات انصهار (MeCP2-لوك-الموارد البشرية) على واحد من اثنين من الكروموزومات العاشر (س MeCP2-LUC-HRسMeCP2)5. على الرغم من أن MeCP2 أعرب عن بناء الانصهار أثبتت أنها غير مستقرة، وأسفرت عن فقدان وظيفة، محاكاة phenotypically MeCP2 الحذف في الذكور هيميزيجوس (X/YMeCP2-لوك-الموارد البشرية)، والتعبير عن الجينات مراسل كان من الممكن اكتشاف سهولة في نمط متسق مع التعبير عن الذاتية MeCP25. نحن ثم ولدت الحيوانات المستنسخة مخلدة تنتجها الخلايا الليفية مع البناء على إكستشروموسومي نشطة أو غير نشطة، وأكدت أن السابق أعرب عن نوع البرية MeCP2 ولا في بناء مراسل؛ معكوس كان صحيحاً لهذا الأخير. عندما تتعرض للحمض النووي ديميثيلاتينج عامل معروف أن تلغي إسكات الجينات، 5-أزاسيتيديني (5-عزة)، الخلايا مع المراسل في الحادي عشر (“خلايا مراسل”) اكتسب النشاط في مقايسة الإضاءة الحيوية، مشيراً إلى أن لدينا بناء يمكن أن يعاد تنشيط وبالتالي وتستخدم للفحص الوراثي.
لقد طورنا التالية شاشة وراثية الفائق للمنظمين لإسكات MeCP2 . خط الخلية مراسل أول مصاب بالفيروس المكتبة التي تحتوي على > 60,000 شرناس مختلفة تستهدف > الجينات 25,000 طوال5،الماوس الجينوم6، وبعد ذلك تعرض لاختيار هيجروميسين ب. مقارنة تواتر دبوس في مرحلة ما قبل وما بعد اختيار العينات باستخدام تسلسل الجيل القادم، كمراسل تنشيط تمنح ميزة النمو ضمن التحديد هيجروميسين ب وأدت إلى إثراء المسؤولين دبابيس الشعر. باستخدام هذا النهج، حددنا 30 الجينات المتورطين في MeCP2 إسكات، وأكدت في وقت لاحق النتائج ترانسدوسينج الخلايا مراسل مع دبابيس الشعر الفردية وقياس نشاطها لوسيفراس.
في مؤخرا دراسة6ونحن إنشاء خط خلية مورين مع لوسيفراس وجينات مقاومة هيجروميسين تنصهر فيها MeCP2 في الحادي عشر، وترانسدوسيد أنه مع مكتبة > استهداف شرناس 60,000 > 25,000 الجينات. وجدنا 30 الجينات التي ميزة تدق لأسفل الممنوحة للبقاء على قيد الحياة تحت هيجروميسين ب التحديد، مما يوحي بدو?…
The authors have nothing to disclose.
ونحن نشكر ديكينس روس من جامعة ملبورن تكرم توفير مكتبة شرنا المستخدمة في الشاشة. تم تمويل هذا العمل من ريت متلازمة البحوث الثقة (أتال بيهاري).
293FT Cell Line | Invitrogen | R700-07 | |
5-Azacytidine | Sigma | A2385-100MG | |
Agencourt AMPure XP | Beckman-Coulter | A63881 | |
Anti-MECP2 antibody | Millipore | 07-013 | |
Collagenase | Sigma | C2674-1G | |
Corning 96-Well Solid White Polystyrene Microplates | Fisher Scientific | 07-200-336 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11965-092 | |
Expression Arrest microRNA-adapted Retroviral Vector (pMSCV) | Open Biosystems | EAV4679 | |
Expression Arrest pSM2 Retroviral shRNAmir library | Open Biosystems | RMM3796 | |
Fetal Bovine Serum | Fisherbrand | 03-600-511 | |
HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | Or equivalent |
Hygromycin B | Calbiochem | 400051-1MU | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Homogenous Assay for Screening Colonies |
Luciferase Assay System | Promega | E4530 | Non-Homogenous Assay for Testing Individual Hairpins |
Luminometer TopCount NXT | Perkin Elmer | N/A | Or similar luminometer |
MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2001 | Use kit compatible with your equipment |
Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
pMD2.G | Addgene | #12259 | VSV-G envelope vector |
Polybrene | Sigma | TR-1003-G | |
Polyethylenimine | Polysciences | 23966-1 | |
psPAX2 | Addgene | #12260 | Packaging vector |
Puromycin | Gibco | A11138-02 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 |