Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

במאגר shRNA מסך עבור הפעלה מחדש של MeCP2 על כרומוזום X לא פעיל

Published: March 2, 2018 doi: 10.3791/56398
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 1,4
1Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Hematology Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 3Epigenetics Program, Department of Cell and Developmental Biology, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 4Departments of Medicine and Biochemistry, University of Washington

Summary

אנחנו ניצור קשר עם סיכת ראש קטנה RNA (shRNA) ופרוטוקול הבא הדור המבוססת על רצף לזיהוי הרגולטורים האינקטיבציה שמושרש בקו תא מאתר עם גחלילית לוציפראז ומאוחדים. גנים עמידות hygromycin עם איזה CpG מחייב חלבון 2 ( MeCP2) גנים על כרומוזום ה-X לא פעיל.

Abstract

קדימה מסכי גנטי באמצעות גנים כתב מוכנס לתוך הטרוכרומטין שימשו בהרחבה לחקור מנגנוני השליטה epigenetic דגם אורגניזמים. טכנולוגיות כולל סיכת ראש קצר RNAs (shRNAs) ו באשכולות interspaced בקביעות קצר palindromic חזרה (CRISPR) אפשרו כגון מסכי בתאים בתרבית של דיפלואידי. כאן נתאר על הרגולטורים האינקטיבציה שמושרש (XCI), מסך shRNA בקנה מידה גדול באמצעות קו תא מאתר עם גחלילית לוציפראז והפיל גנים עמידות hygromycin ב- C-הסופית של איזה CpG מחייב חלבון ג'ין (MeCP2) 2 על שמושרש לא פעיל (Xi). שהפעלה של הבונה בקו תא כתב הענקת יתרון הישרדות תחת בחירת hygromycin B, ומאפשרת לנו מסך ספרייה גדולה shRNA ולזהות סיכות זה מחדש הכתב על ידי מדידת שלהם באמצעות פוסט-בחירה העשרה הדור הבא רצפי. סיכות מועשר היו תוקף אז בנפרד על-ידי בדיקת היכולת להפעיל את הכתב לוציפראז ב- Xi.

Introduction

אחת הצורות הנפוצות ביותר של לקות נפשית תורשתי אצל נקבות, תסמונת רט, נגרמת על ידי משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים מוטציות ב- MeCP2, ג'ין שמושרש מקודד חלבון חיוני עבור תפקוד נורמלי1. גישה אפשרית לטיפול בהפרעה זו יהיה שהפעלה של אלל MeCP2 פראי-סוג ב ה-Xi, כמו שיקום של הביטוי MeCP2 הוצגה להיפוך גרעונות עצביים במודל של עכברים של מחלה זו1, 2 , 4. עם זאת, epigenetic להחרשת לאחד שני כרומוזומי בתאים הנשי X נשמר הדוק לאורך כל מחזור של3,אורגניזם4ותדרוש חזקים שהפעלה של ג'ין קי סביר רב סרן הפרעה במשעולים רגולטוריות epigenetic מרובים.

כדי לזהות גורמים הדרושים לתחזוקה של שתיקת MeCP2 , אנחנו קודם פיתח מודל העכבר הטרנסגניים נושא שילוב גנים עמידות hygromycin (MeCP2-לוק-HR) MeCP2- לוציפראז - לאחד שני כרומוזומי X (X MeCP2-LUC-HR/XMeCP2)5. למרות MeCP2 הביע של הבונה פיוז'ן הוכיחה להיות לא יציב ולא הביא לאובדן של פונקציה, phenotypically היה שווה מחיקה MeCP2 אצל זכרים hemizygous (X /YMeCP2-לוק-HR), הביטוי של הגנים כתב היה בקלות לזיהוי בתבנית עקבית עם הביטוי של MeCP2 אנדוגני5. אנחנו מכן שנוצר פיברובלסט מונצחים שיבוטים עם הבונה על שמושרש פעילה או לא פעילה, ואישר שלשעבר את ביטוי wild type MeCP2, לא כתב הבונה; ההופכי היה נכון עבור האחרון. כאשר נחשף של הדנ א. demethylating סוכן ידוע מחסלים. ג'ין להחרשת, 5-azacytidine (5-עזה), תאים עם הכתב על Xi ("תאים כתב") צבר פעילות assay ביולומינסנציה, המציין כי לבנות שלנו יכול להפעיל מחדש ולכן משמש עבור בדיקה גנטית.

פיתחנו הבא תפוקה גבוהה גנטי על מסך הרגולטורים של שתיקת MeCP2 . הקו תא כתב קודם היה נגוע המכיל ספריית retroviral > מיקוד shRNAs שונים 60,000 > 25,000 הגנים לאורך כל העכבר הגנום5,6, ונחשפו ואז לבחירה hygromycin B. סיכת ראש תדירות נמשל ב מראש, דוגמאות פוסט-בחירה באמצעות רצף הדור הבא, כמו כתב הפעלה מחדש הענקת יתרון צמיחה תחת hygromycin B בחירת וכתוצאה העשרה של סיכות אחראי. באמצעות גישה זו, זיהתה 30 גנים מעורבים MeCP2 להשתיק, ואנו לאחר מכן אישר את הממצאים על-ידי transducing התאים כתב עם סיכות בודדות ומדידת פעילותם לוציפראז.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל השלבים המערבות בעלי חיים בוצעו באמצעות פרוטוקולי שאושרו על ידי פרד האצ'ינסון סרטן מחקר מרכז מוסדי חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה (IACUC). אין ריאגנטים המשמש כאן ידועים להוות סיכון בריאותי משמעותי האנושי מלבד 5-azacytidine (5-עזה).

1. יצירת קו תא כתב עם MeCP2transgene - לוק-HR ב- Xi

  1. הכנת העכבר גיד fibroblasts מ נקבה XMeCP2-לוק-HR /XMeCP2 העכבר
    1. המתת חסד יום 10-12-מהמושב XMeCP2-לוק-HR/X העכברMeCP2 .
    2. באמצעות חיתוך ישר מספריים, עושים חתך במבניו דרך העור של החלק הזנב הפרוקסימלית.
    3. מחזיק את הגווייה ליד בסיס הזנב, משוך את העור מן העכבר כדי לחשוף את החלק fibrocartilaginous של הזנב. הסר וחותכים הטרמינל 10 מ מ של הרקמה חשופה לתוך 1 מ"מ קטעים ארוכים באמצעות אזמל כירורגי.
    4. העברת רקמות מפוצלים חרוט 15 מ"ל צינור המכיל 5 מ"ל של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 1 U/mL פניצילין, סטרפטומיצין µg/mL 1 ו- collagenase 1.5 mg/mL, לסנן מראש דרך 0.45 מיקרומטר ומסננים רשת ואז 0.2 µm. תקופת דגירה של 3-4 h ב 37 ° C עם סיבוב רציף.
    5. צנטריפוגה המדגם בטמפרטורת החדר ב 500 x g עבור 10 דקות Resuspend בגדר ב 10 מ"ל של DMEM בתוספת סרום שור עוברית 10%, פניצילין 1 U/mL, ו 1 סטרפטומיצין µg/mL (DMEM-10), צלחת על צלחת תרביות רקמה 6-. טוב. המעבר את התאים פעם ולהרחיב את צלחת 10 ס מ לפני שתמשיך לשלב הבא.
    6. להנציח את התאים על ידי ביצוע של התמרה חושית עם וקטור ביטוי נושאת oncogenes נגיפי HPV-16 (E6/E7), כפי שתואר לעיל7.
  2. בחירת שיבוטים תא בודד ואפיון MeCP2 כתב ביטוי
    1. קציר תאים מן צלחת 10 ס מ. ראשית, וארוקן את המדיה, להוסיף 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA, תקופת דגירה של 2-5 דקות ב 37 º C. להרוות 9 מ של DMEM-10 ולאסוף את התאים resuspended צינור חרוטי 15 מ"ל.
    2. לדלל את התאים עם DMEM-10 כדי ריכוז סופי של התא 1/100 µL. להעביר ללוחות 96-ובכן מאת pipetting 100 µL של ההשעיה כל טוב.
    3. דגירה ב 37 ° C עד הבארות confluent, אשר יכול לקחת עד 2-3 שבועות. החלף את המדיה DMEM טריים-10 כל 3-5 ימים. כאשר confluent, לגייס את התאים עם 20 µL של 0.05% טריפסין-EDTA לכל טוב, לפצל אותם שני סטים כפולים של 96-ובכן צלחות.
    4. להשתמש assay לפעילות לוציפראז ערכה אחת של צלחות. להשתמש ערכת הומוגנית גחלילית לוציפראז assay אשר אינן דורשות הסרה מדיה. לפי התקנון המצורף לערכה.
    5. להשתמש בתוצאות משלב 1.2.4 לבחור שיבוטים עם שום פעילות לוציפראז לזיהוי הקבוצה הנותרת של צלחות. להרחיב לוחות 24-. טוב, אז טוב 6 שיבוטים אלה.
    6. לבצע את אותו הדבר עבור שיבוט עם הפעילות לוציפראז הגבוהה ביותר; זה ישמש כפקד חיובי למטרות אימות.
    7. הקציר של aliquot של כל טוב בצלחת. ובכן 6 עבור אבן חשופה המערבי. לגייס את התאים עם 200 µL של 0.05% טריפסין-EDTA. תקופת דגירה של 2-5 דקות ב 37 º C. להרוות 2 מ של DMEM-10, להעביר מחצית התאים 1.5ml צנטריפוגה שפופרת. רחץ את התאים פעם אחת עם PBS לפני lysing עבור תספיג חלבון. לחלופין, העברת מחצית התאים עוד צלחת 6-. טוב. כאשר התאים לצרף לתחתית הצלחת, לשטוף עם PBS ואת lyse עבור תספיג חלבון.
    8. לבצע מערבון כתם עם נוגדן anti-MeCP2 כדי לאשר כי תאים לוציפראז שלילי אקספרס, בעוד תאי לוציפראז-חיוביים שאינם מבטאים MeCP2 פראי-סוג של כרומוזום ה-X פעיל; בצע את פרוטוקול שתואר לעיל8. להשתמש רקמת המוח lysate מן העכבר פראי סוג כל פקד חיובי.
    9. לוחית רישוי מספר שיבוטים שלילי-עונה 2 פרק 105 תאים/טוב בצלחת 6-. טוב. להתייחס פעם אחת עם 5 מיקרומטר 10-עזה, תקופת דגירה של 72 h מבלי לשנות את התקשורת ואת assay לפעילות לוציפראז כפי שמתואר בשלב 1.2.3.
    10. לבחור אחד שלילי שיבוט (Xi שיבוט) צבר לוציפראז פעילות עם 5-עזה, להתחיל להרחיב אותו ללוחות מרובים של 10 ס מ. להקפיא שיבוטים שלילי הנותרים של חנקן נוזלי כגיבוי. שיבוט חיובי (Xa שיבוט) ניתן בהשתתפות התרבות רקמות או קפוא עד שימוש נוסף.

2. הקרנת הספרייה עבור הפעלה מחדש שהקטע hygromycin B

  1. מדביק השיבוט מבחן, החלת הבחירה, ולוקחים DNA עבור רצף
    1. להשיג תרכיזים ויראלי של retroviral בונה לבטא סיכות מספריה shRNA, או לייצר תגובת שיקוע ויראלי מרוכזת באמצעות פרוטוקול הכלולים הספרייה הרצויה.
    2. לפני שתמשיך עם המסך, titrate הספרייה (באמצעות סמן GFP, אם היא זמינה). המטרה עבור ריבוי של זיהום בין 0.3 ל- 0.5.
      הערה: לבצע לפחות ארבעה מסכי עצמאית כדי למזער את המחירים חיובי כוזב. השתמש צלחות 20 לכל מסך להשגת כיסוי 100-fold של הספרייה כדי לשמור על ייצוג הולם של סיכות ולמנוע נשירה אקראי9. עם זאת, בהינתן מסך בחירת חיובי וגודל ספרייה גדולה, סביר כי כיסוי נמוך תספיק.
    3. בבוקר, צלחת עונה 1 פרק 106 תאים האחד עשר על גבי לוחות תרביות רקמה 10 ס מ.
    4. אחר הצהריים, להדביק את הצלחות על-ידי החלפת המדיה טרי DMEM-10 המכילה תגובת שיקוע ויראלי, 5-10 µg/mL של polybrene. השתמש את כמות תגובת שיקוע ויראלי שנקבע בשלב 2.1.2.
    5. לאחר 18-24 h, תשאף התקשורת ולהוסיף 10 מ"ל של DMEM טריים-10 כל צלחת. תרבות עבור עוד 48 שעות.
    6. בבוקר, לגייס את התאים באמצעות 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA לכל צלחת, להרוות 9 מ של DMEM-10 לכל צלחת. הפעל את המתלים דרך מסנן רשת 100 מיקרומטר. מאגר של המתלים מסוננים יחד, זרע שני סטים של צלחות 10 ס מ- עונה 1 פרק 106 תאים/צלחת....
    7. אחר הצהריים, החלף את המדיה סט צלחות אחד המכיל 15 µg/mL של hygromycin B (יום 0) DMEM-10. בערכת אחרים, להחליף את המדיה טרי DMEM-10 בלבד.
    8. לאחר 48 שעות, לגייס את התאים של לא מטופל סט צלחות באמצעות 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA. תקופת דגירה של 2-5 דקות ב 37 º C. להרוות 9 מ של DMEM-10. העבר את התאים צינורות חרוט 15 מ"ל, צנטריפוגה ב 500 x g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. מחוק לגמרי את supernatants ולהמשיך מיד עם חילוץ DNA כדורי. לחלופין, בריכת התאים לתוך צינורות גדולים יותר לפני השלב צנטריפוגה.
    9. לחלץ את הדנ א באמצעות תערובת של פנול chroroform, לזרז DNA עם סודיום אצטט וקור אתנול כמו שתואר לעיל10. מאגר דגימות ה-DNA מיון מוקדם בודדים ולאחסן ב-20 ° C עד שימוש נוסף.
    10. המשך culturing hygromycin B בחירה להגדיר עוד 4 ימים. לחדש התקשורת בחירה עם DMEM-10 טריים המכילים hygromycin B לאחר יומיים.
    11. ביום 7, החלף התקשורת מבחר טרי DMEM-10 בלבד. לאפשר 2-4 ימים להתאוששות ולאחר מכן לקצור את התאים כפי שמתואר בשלב 2.1.8 תגובה על. להמשיך עם ה-DNA החילוץ כפי שמתואר בשלב 2.1.9.
  2. זיהוי סיכות מועשר הדגימות פוסט-בחירה
    1. שימוש 5' הקשר (5'-ATCGTTGCCTGCACATCTTGG-3') ו 3' תחל לולאה הפוכה (5'-ACATCTGTGGCTTCACTA-3') כדי להגביר את חצי-סיכות מדגימות הדנ א קדם ומבחר שלאחר. שימוש כל חילצה DNA בתגובות PCR נפרד עם 100-200 ng של דנ א לכל תגובה.
      הערה: אלה בהקשר פריימר 5' ו 3' לולאה הפוכה תחל תואמות את ההקשר מיר-30 רצף במעלה הזרם של הקדמי shRNA ואת הרצף על הלולאה shRNA, בהתאמה. ספריות שונות יחייבו oligos שונים. להתאים את טיהור צעדים כדי לבודד את מידות המוצר שונים לפי הצורך.
    2. שימוש חרוזים ובחירת גודל כדי להסיר תחל דנ א גנומי, ולשחזר PCR מוצרים בין 100 ו-200 bp. לפי התקנון כלל עם החרוזים.
    3. להכין ספריה רצף על רצף של החצי-סיכות ראש. צור לפחות 50 מיליון קריאות לכל מסך. בצע את הפרוטוקול המתאים רצף ערכת וציוד.
      הערה: 50 מיליון קריאות לכל מסך מספק ייצוג כל shRNA בספריה 1000-fold, כ 10-fold כיסוי של כל זיהום עצמאית (בוצעו 100-fold ייצוג כל shRNA), אשר מבטיח ייצוג הולם של כל אירוע זיהום.
    4. לספור בכל shRNA באמצעות סקריפט פרל שחשוב רצפי עם תואם מושלם. בחרה shRNAs שהיה קורא לפחות 10 בבריכה פולסים עם כיוון מוקדם לניתוח נוסף. לחשב את enrichments כמו יחסי של פוסט-כדי preselection נחשב ולקבוע שיעור גילוי שקר (פד) על בסיס 1000 צירופים. בחרה גנים ממוקד על ידי shRNAs עם < 5% פד כמו "מכה" לבדיקה נוספת.

3. אימות של סיכות מזוהה ("להיטים")

  1. Lentiviruses אריזה המכילה shRNAs זיהה במסך
    1. זרע 8 x 10 מטרים 2936 תאים לכל צלחת על צלחות 10 ס מ.
    2. למחרת, החלף את המדיה 9 מיליליטר תרופתיים DMEM-10 לכל צלחת; זה 30 דקות לפני תרביות תאים.
    3. במהלך המרווח של 30 דקות, להכין תערובות שני תקנים:
      1. להכין לערבב 1 (לכל צלחת/shRNA; קנה המידה של פי המספר הכולל של shRNAs): µL 10 של 2 מ"ג/מ"ל polyethylenimine (פיי) ב- 0.5 מ"ל של האופטימלית מדיה חיוני מינימלי. לערבב על-ידי pipetting, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
      2. להכין תערובת 2 (לכל shRNA): 4 µg של וקטור shRNA שנארז µg 1.5 של וקטור המעטפה VSV-G (pMD2.G), µg 2.5 של וקטור אריזה (psPAX2), מעורב ב- 0.5 מ"ל של האופטימלית מדיה חיוני מינימלי.
        הערה: כוללים וקטור lentiviral ריק לאריזה לשימוש מאוחר יותר זיהומים כפקד שלילי.
    4. להוסיף 0.5 מ של מיקס 1 בכל aliquot של שילוב 2 ומערבבים בעדינות על-ידי pipetting. דגירה בחושך בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
    5. החל את התערובת על כל צלחת מהשלב 3.1.2 אופנה dropwise; מערבולת את הצלחת בעדינות כדי לערבב.
    6. למחרת, להחליף את המדיה 5 מ של DMEM טריים-10.
    7. 48 שעות לאחר הראשונית תרביות תאים, לאסוף את תגובת שיקוע ולהפעיל אותו דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. טרום רטוב את המסנן עם DMEM-10 כדי למקסם את השחזור.
    8. Aliquot תגובת שיקוע שסוננו לתוך כמויות אידיאלי עבור הדבקה צלחת 6-. ובכן, ובכן.
    9. להקפיא את aliquots ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר, או פנה/י מיד עם התמרה חושית.
  2. התמרה חושית ובדיקות של סיכות בודדות לוציפראז כתב הפעלה מחדש, שהפעלה של הגן MeCP2 פראי-סוג שי.
    1. בבוקר, צלחת עונה 1 פרק 105 Xi תאים/טוב על גבי לוחות טוב 6.
    2. אחר הצהריים, להדביק את הצלחות על-ידי החלפת המדיה 2 מ"ל של טרי DMEM-10 המכילה תגובת שיקוע lentiviral, 5-10 µg/mL של polybrene. להדביק פקד היטב עם תגובת שיקוע ויראלי המופק וקטור lentiviral ריק.
    3. למחרת, החלף את המדיה 2 מ של puromycin 1 מ"ג/מ"ל המכיל DMEM-10. תרבות במשך ארבעה ימים.
    4. להחליף את התקשורת עם 2 מ"ל של DMEM טריים-10 ולאפשר 48-72 שעות להתאוששות.
    5. לגייס את התאים עם 150 µL של 0.05% טריפסין-EDTA. תקופת דגירה של 2-5 דקות ב 37 º C. להרוות 1.5 מ של DMEM-10. העבר את התאים צינורות חרוט 15 מ"ל, צנטריפוגה ב x 500 גרם ל-10 דקות בטמפרטורת החדר.
    6. הסר את המדיה, resuspend את התאים במאגר 100 µL פירוק המסופק בערכה assay לוציפראז. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. להעביר את lysates צלחת 96-ובכן לבן ו assay לפעילות לוציפראז באמצעות הפרוטוקול המצורף לערכה. כדי להשתמש Xa תאים פקד חיובי Xi תאים נגועים וקטור lentiviral ריק כפקד שלילי.
      הערה: למנוע חשיפת צלחות לבן של אור ניאון לפני וזמינותו; זה להפחית את הרקע, להגביר את הרגישות וזמינותו. פרוטוקול המסופק בערכה assay נמצאה ליעילות מרבית אם ביצע בחושך במידת האפשר.
    7. כדי לקבוע אם הסיכה היתה השפעה על רמת ביטוי MeCP2 על שמושרש פעיל, לבודד RNA מתאי Xi tranduced ולמדוד את רמת ה-mRNA MeCP2 באמצעות PCR כמותי עם תחל שנועדו להגביר את רק פראי סוג MeCP2 (f: 5'-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3', R: 5'-CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC-3').
    8. אופציונלי: להגביר את הרגישות של וזמינותו על-ידי הוספת 5-עזה ריכוז סופי של 0.2 µM לאחר התאים התאוששו מהבחירה puromycin. התרבות התאים עבור 72 h ללא החלפת המדיה ולאחר מכן assay לפעילות לוציפראז באמצעות ערכת assay לוציפראז מסחרי.
    9. למדוד שהפעלה של MeCP2 פראי-סוג המושתק. להדביק תאים Xa, אשר הנמל הסוג הפרוע MeCP2 על ה-Xi, עם וקטור שמכיל סיכות בודדות, השלבים פרוטוקול 3.2.1. -3.2.4. RNA מתאי לבודד ולמדוד את רמת MeCP2 mRNA באמצעות PCR כמותי עם תחל שנועדו להגביר את רק פראי סוג MeCP2 (f: 5 '- TTCCATGCCAAGGCCAAACAG - 3', r: 5' - CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC - 3').

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

העכבר גיד fibroblasts נבצרו מ שתואר לעיל XMeCP2-לוק-HR/X העכבר הנשיMeCP2 , מונצחים על ידי retroviral התמרה חושית של oncogenes E6, E7 מ HPV-16 virus7, שיכפל באמצעות דילול המגביל, ונבדק פעילות לוציפראז וביטוי לחלבון MeCP2 פראי-סוג (איור 1A ו 1B). פעילות לוציפראז הייתה חזקה אם הכתב הופיע Xa, בלתי מורגשת אם על Xi; הביטוי MeCP2 יליד הציג דפוס הדדיים. בחרנו שיבוט עם שום פעילות לוציפראז (Xi-8), שיבוט עם פעילות חזקה (Xa-3) לניסויים נוספים. כאשר Xi-8 תאים שטופלו 5-עזה, אינדוקציה המינון תלוי בפעילות לוציפראז נצפתה (איור 1C).

רגישות Xi-8 ו- Xa-3 תאים hygromycin B נבחנה על-ידי ביצוע בחירות יום 3 עד 6. כצפוי מהתבנית ביטוי של הכתב לוציפראז, Xi-8 תאים היו יותר רגישים hygromycin B מאשר Xa-3 תאים, אף-על-פי האחרון הציג רגישות במינונים גבוהים (איור 2 א). לאחר שילוב בטחונות של Xa-3 לתאים Xi-8 היה חשוף שונים ריכוזי נצפתה hygromycin B, עלייה תלויי-זמן פעילות לוציפראז, המציינת את תחרות מוצלחת של Xa-3 תאים תאים Xi-8 (איור 2B). המינון ומשך hygromycin B בחירה נבחרו לניסויים נוספים בהתבסס על עיכוב מועדף של קי-8 Xa-3 תאים.

ארבעה מסכים עצמאית בוצעו כדי לזהות הרגולטורים של MeCP2 שתיקת באמצעות הקו תא Xi-8 ומיר ביוסיסטמס פתוח של-30-shRNA המבוססת על הספריה המכילה 64,159 סיכות שונים משובטים לתוך MSCV-shRNA-pgk-Puro-ires-GFP retroviral וקטור. בכל מסך, צלחות 10 ס מ 20 היו נגועים shRNAs במאגר, מיקוד כ 100-fold כיסוי של הספרייה. Hygromicin B נערך 6 ימים, עד acellular כתמים קטנים נצפו; התאים המשיך למות למען נוספים 24 עד 48 שעות. כאשר התאושש, התאים נבצרו להפקת DNA באמצעות טכניקה פנול-כלורופורם. היבול DNA הכולל בכל מסך היה µg בסביבות 20/צלחת, אשר איחדו בין 100 תגובות PCR באמצעות תחל שנועדו להגביר את חצי-סיכות. המוצרים PCR היו לאחר מכן מטוהרים-חרוז, נתון רצף תפוקה גבוהה.

דוגמאות מראש ובחירת שלאחר הושוו כדי לקבוע העשרה סיכת ראש, כפי שציפינו כל מכבנה נוכח ברמות מוגברות במדגם הבחירה שלאחר ממוקד גנים מחדש Xi, ובכך הענקת ההתנגדות hygromycin. רק סיכות מועשר לפחות 2 של ארבע הרשתות נחשבו לצורך אימות. סיכות ביותר מועשר ב משכפל כל של המסך שלנו היו ארבע סיכות מיקוד XIST, בקנה אחד עם תפקידו קריטי XCI11.

החלק אימות של המסך בוצע על-ידי בדיקת בנפרד את סיכות שנרשמו כמו להיטים עבור ההפעלה של הכתב לוציפראז Xi-8 תאים. למרות המסך בוצע באמצעות ספריה retroviral מבוססי MSCV, האימות בוצעה באמצעות וקטור lentiviral (שיבוטים pGIPZ בודדים עם shRNA) כדי למנוע זיהוי אפשרי של חפצים הרטרווירוס-induced.

כל אחד הגנים המועמד סומן על ידי לפחות שני רצפים שונים סיכת ראש, נוקאאוט של הגן היעד אומתה על ידי PCR כמותי בזמן אמת (RT-qPCR). על ידי assaying עד עונה 1 פרק 106 תאים בתבנית 6-ובכן, הפחתת רקע הפריה חוץ גופית (איור 2C), היינו מסוגלים לזהות אירועים הפעלה מחדש בתדר נמוך מאוד, אשר אנחנו מוערך בטווח 1:20,000.

ניתוח נוסף באמצעות סיכות בודדות הוביל לזיהוי של 30 גנים נוקאאוט של מי הביא שהפעלה של הכתב על האחד עשר. גודל החציוני של הפריה חוץ גופית עבור הגנים 30 האלה היה 2.8-fold מעל לקו הבסיס, אשר היה עוד יותר מוגבר לטיפול 5-עזה 7.1-fold הבאים. סיכות באותו היו מחדש, בשילוב עם 5-עזה, עם תאי Xa-3 כדי לאשר מחדש ביטוי פראי סוג MeCP2 מ Xi. דבר זה הושג על-ידי ביצוע RT-qPCR באמצעות תחל שנועדו להגביר את רק פראי סוג ההעתק של MeCP2.

Figure 1
איור 1. בידוד של שיבוטים עם הגן MeCP2-לוק-HR כתב ב- Xi.
א) נציג גחלילית לוציפראז assay על גיד מונצחים fibroblasts שיבוטים (1-9). Fibroblasts ראשי מהטרנסגניים (NT) ונקבה משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים הטרנסגניים (נ) שימשו כפקדי שליליים או חיוביים, בהתאמה. ב) כתם נציג המערבי מציג MeCP2 ביטוי חלבונים מהתאים ב (א). שימו לב כי פעילות לוציפראז (איור 1 א') וביטוי MeCP2 תערוכת דפוס ביטוי הדדיים. ג) אינדוקציה של גחלילית לוציפראז פעילות Xi-8 תאים עם 5-עזה. Xa-3 תאים, גן מדווח על Xa, לשמש פקד חיובי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
באיור 2. אפיון של המחתרת hygromycin Xi-8 ו- Xa-3 תאים.
א) יחסית צמיחת תאים Xi-8 ו- Xa-3 מטופלים עם משטרי שונים hygromycin B (3D = 3 ימים; 6D = 6 ימים), לעומת תאים ללא טיפול. B) לוציפראז העשרה פעילות לאחר חשיפת סך של 10,000 Xa-3 ו- Xi-8 תאים (מעורב ביחס 1: 100) hygromicin B (25 µg/mL) עבור מספר הימים שצוין. פעילות לאחר חשיפה לוציפראז חולקה על-ידי רמת טרום חשיפה לחישוב העשרה. ג) גחלילית לוציפראז פעילות Xi-8 תאים, לבדיקה בתבנית 96 - ו 6-ובכן, עם ובלי 5-עזה (10 מיקרומטר). Non-הטרנסגניים fibroblasts (NT) שימשו כפקד שלילי. 5-עזה את לוציפראז פעילות מוגברת 7.2 - ו 86 פי מעל לקו הבסיס בתבנית 96 - ו 6-ובכן, בהתאמה. (N = 3, * p < 0.001, * * p < 0.0001 על ידי מבחן t בהשוואת 5-עזה של הסטודנטים ובא לא מטופל Xi-8 תאים.) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

האחרונים שלנו ללמוד6, יצרנו קו תא מאתר עם לוציפראז, גנים עמידות hygromycin דבוקה MeCP2 ב- Xi ולאחר transduced זה עם ספרייה של > מיקוד shRNAs 60,000 > 25,000 הגנים. מצאנו 30 גנים אשר יתרון הישרדות שהוענקו דפיקה למטה תחת בחירת hygromycin B, רומז תפקידם בשליטה של MeCP2 והשתקה שמושרש. תוצאות אלו היו אומת על-ידי transducing הקו תא המדווחת עם סיכות בודדות והערכה שהפעלה של הכתב לוציפראז שותק.

מציאת ארבע סיכות ראש העליון ב משכפל כל של המסך שלנו ממוקד XIST מספק אימות פנימית חזקה עבור השיטה שלנו, בהתחשב תפקיד מרכזי של XIST XCI11. מלבד superfamily TGFβ, שתפקידו רגולציה ב- XCI היה לא תוארה בעבר, אחרים שזוהו הגנים כל שייך למשפחות פונקציונלי עם קשרים תקנה epigenetic, ובכך לשרת כמו אימות נוסף שלנו שיטת12 , 13 , 14. יתר על כן, גם גילינו 4 מתוך 13 גנים זוהו בעבר מסך שונים, שימוש של CMV יזם מונחה-GFP מוכנס באופן אקראי על ה-Xi15.

הקמת את מינון מתאים והמשך של hygromycin B בחירה היה מכריע אופטימיזציה של התנאים ההקרנה. הרגישות של הקו הסלולרי שלנו תלויים במידה רבה זריעה צפיפות, והוא היה מושפע לרעה retroviral זיהום. במינון מוגבר או אורך הבחירה הריכוזים את הצמיחה של תאים עם הכתב-Xa, ואילו בחירה מתון יותר הוריד את הרגישות מכבנה העשרה. מרובים משטרי מינון hygromycin B ותא עיתונאי זריעה צפיפויות נבדקו לכן לפני ההקרנה הסופית. יתר על כן, למרות MSCV וקטור retroviral בספריה shRNA סיפק הזדמנות להשתמש puromycin הנבחר ולהעשיר עבור תאים transduced בהצלחה, puromycin לא שימש בניסויים שלנו, שימוש רציף puromycin hygromyin B כתוצאה רעילות מופרז, גם לאחר דה-הסלמה המינון המתאים של אנטיביוטיקה שניהם.

כל סיכות שזוהו במחקר שלנו להפעיל גם הכתבת לוציפראז שקט, אם כי במידה צנוע יותר. זיהוי של אירועים נדירים אלה התאפשרה עם רגישות גבוהה של המסך שלנו, אשר אנו מעריכים, בהתבסס על בדיקת מוספים של תאים Xi ו- Xa, להיות אירוע הפעלה מחדש אחד 2 x 104 תאים. כזה רמות נמוכות של הפעלה מחדש, גדל עם יישום שיתוף של 5-עזה מ. פ., מעידים על קשיים שתואר לעיל משבשים את מהלך שליטה הדוקה תעתיק XCI12,13,16,17, ו לרמוז כי שיבוש מנגנוני הרגולציה מרובים יהיה צורך להשיג משמעותית הפעלה מחדש.

ראוי לציין, סיכות 30 כל שזוהו המסך שלנו גם להפעיל גן כתב מונחה CMV הממוקמת על לוקוס שמושרש שונים, המציין שלהם השפעה רחבה על דה-דיכוי Xi. מחקרים נוספים נדרשים כדי לבדוק אם קיימים MeCP2 ספציפי "reactivators", כמו טיפול תרופתי או הגנטי שלהם יכול להוכיח כיעיל בטיפול בתסמונת רט.

מערכת הקרנה שלנו מציע כמה יתרונות על פני הכתבים שתואר לעיל שימשו שמושרש הפעלה מחדש מסכי12,17. במקום להיות מונחה על ידי יזם CMV, קלטת הכתב שלנו הוא דפק ב- C-הסופית של MeCP2 , ובכך מונעת על ידי האמרגן X-linked מקורית. עיצוב זה יכול לעזור לזהות MeCP2 לוקוס ספציפיים וסתים, רלוונטיים יותר בהקשר של מחקר תסמונת רט, עם אזהרה כי ממצאי fibroblasts מונצחים צריך להיות recapitulated של הנוירונים, האתר הרצוי של MeCP2 הפעלה מחדש. השימוש של גן עמידות hygromycin מאפשר בחירה חיובית של הפעלה מחדש אירועים ושל robustly מגביר את רגישות המסך. יתר על כן, בקלטת המכיל hygromycin והתנגדות גחלילית לוציפראז גנים מאפשר שניהם הקרנת שהקטע חיובית עם hygromycin B, בדיקות/הקרנה סיכות בודדות באמצעות הכתבת לוציפראז בקנה מידה גדול.

לסיכום, אנו מדווחים על שיטת בדיקה גנטית חזקים ורגיש זיהוי של הרגולטורים MeCP2 , שמושרש להשתיק בתאי יונקים. מתודולוגיה זו יכול להיות מותאם הקרנת RNAs מפריעות קטן (siRNAs), CRISPR, או מולקולות קטנות. מבחני כזה יכול להיות מועיל בהקמת גישות טיפוליות הנשענות על הפעלה מחדש אלל פונקציונלי של גנים שקטים, כמו למשל במקרה של תסמונת רט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ד ר Leko תרם מאמר זה כעובדת פרד האצ'ינסון לחקר הסרטן.  הדיעות שלו, לא בהכרח מייצגים מהנוף של מכוני הבריאות הלאומיים או ממשלת ארצות הברית

Acknowledgments

אנו מודים רוס Dickins של אוניברסיטת מלבורן למתן באדיבות הספרייה shRNA בשימוש על המסך. עבודה זו מומן על ידי רט תסמונת מחקר לבטוח (הארית).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
293FT Cell Line Invitrogen R700-07
5-Azacytidine Sigma A2385-100MG
Agencourt AMPure XP Beckman-Coulter A63881
Anti-MECP2 antibody Millipore 07-013
Collagenase Sigma C2674-1G
Corning 96-Well Solid White Polystyrene Microplates Fisher Scientific 07-200-336
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco 11965-092
Expression Arrest microRNA-adapted Retroviral Vector (pMSCV) Open Biosystems EAV4679
Expression Arrest pSM2 Retroviral shRNAmir library Open Biosystems RMM3796
Fetal Bovine Serum Fisherbrand 03-600-511
HiSeq 2500 Illumina SY–401–2501 Or equivalent
Hygromycin B Calbiochem 400051-1MU
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019
Bright-Glo Luciferase Assay System Promega E2610 Homogenous Assay for Screening Colonies
Luciferase Assay System Promega E4530 Non-Homogenous Assay for Testing Individual Hairpins
Luminometer TopCount NXT Perkin Elmer N/A Or similar luminometer
MiSeq Reagent Kit v2 Illumina MS-102-2001 Use kit compatible with your equipment
Opti-MEM Gibco 31985-070
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
pMD2.G Addgene #12259 VSV-G envelope vector
Polybrene Sigma TR-1003-G
Polyethylenimine Polysciences 23966-1
psPAX2 Addgene #12260 Packaging vector
Puromycin Gibco A11138-02
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300-054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
  2. Guy, J., Gan, J., Selfridge, J., Cobb, S., Bird, A. Reversal of neurological defects in a mouse model of Rett syndrome. Science. 315, 1143-1147 (2007).
  3. Maduro, C., de Hoon, B., Gribnau, J. Fitting the Puzzle Pieces: the Bigger Picture of XCI. Trends Biochem Sci. 41, 138-147 (2016).
  4. Disteche, C. M. Dosage compensation of the sex chromosomes and autosomes. Semin Cell Dev Biol. 56, 9-18 (2016).
  5. Wang, J., et al. Wild-type microglia do not reverse pathology in mouse models of Rett syndrome. Nature. 521, E1-E4 (2015).
  6. Sripathy, S., et al. Screen for reactivation of MeCP2 on the inactive X chromosome identifies the BMP/TGF-beta superfamily as a regulator of XIST expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 1619-1624 (2017).
  7. Foster, S. A., Galloway, D. A. Human papillomavirus type 16 E7 alleviates a proliferation block in early passage human mammary epithelial cells. Oncogene. 12, 1773-1779 (1996).
  8. Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods Mol Biol. 1318, 87-96 (2015).
  9. Strezoska, Z., et al. Optimized PCR conditions and increased shRNA fold representation improve reproducibility of pooled shRNA screens. PLoS One. 7, e42341 (2012).
  10. Green, M. R., Sambrook, J. Isolation of High-Molecular-Weight DNA from Mammalian Tissues Using Proteinase K and Phenol. Cold Spring Harb Protoc. 2017, (2017).
  11. Goto, Y., Takagi, N. Tetraploid embryos rescue embryonic lethality caused by an additional maternally inherited X chromosome in the mouse. Development. 125, 3353-3363 (1998).
  12. Csankovszki, G., Nagy, A., Jaenisch, R. Synergism of Xist RNA, DNA methylation, and histone hypoacetylation in maintaining X chromosome inactivation. J Cell Biol. 153, 773-784 (2001).
  13. Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349, (2015).
  14. McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521, 232-236 (2015).
  15. Bhatnagar, S., et al. Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 12591-12598 (2014).
  16. Minkovsky, A., et al. The Mbd1-Atf7ip-Setdb1 pathway contributes to the maintenance of X chromosome inactivation. Epigenetics Chromatin. 7, 12 (2014).
  17. Minkovsky, A., et al. A high-throughput screen of inactive X chromosome reactivation identifies the enhancement of DNA demethylation by 5-aza-2'-dC upon inhibition of ribonucleotide reductase. Epigenetics Chromatin. 8, 42 (2015).

Tags

גנטיקה גיליון 133 שמושרש איון אפיגנטיקה MeCP2 רט תסמונת XIST shRNA הקרנת
במאגר shRNA מסך עבור הפעלה מחדש של MeCP2 על כרומוזום X לא פעיל
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Leko, V., Sripathy, S., Adrianse, R. … More

Leko, V., Sripathy, S., Adrianse, R. L., Loe, T., Park, A., Lao, U., Foss, E. J., Bartolomei, M. S., Bedalov, A. Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome. J. Vis. Exp. (133), e56398, doi:10.3791/56398 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter