Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Удобный метод для извлечения и анализа с высокого давления жидкостной хроматографии и их метаболитов катехоламинов нейротрансмиттеров

Published: March 1, 2018 doi: 10.3791/56445
Automatic Translation
1, 3, 4, 1, 2
1School of Public Health of Southeast University, Laboratory of Environment and Biosafety Research Institute of Southeast University in Suzhou, 2Key Laboratory of Child Development and Learning Science (Ministry of Education), School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University, 3School of Public Health, Tianjin Medical University, 4British Columbia Academy, Nanjing Foreign Language School

Summary

Мы представляем удобный твердофазный извлечения для высокого давления жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в сочетании с электрохимической обнаружения (ECD) для одновременного определения трех моноаминооксидазы нейротрансмиттеров и два их метаболитов в моче новорожденных. Мы также определить метаболит MHPG как потенциального biomarker для ранней диагностики повреждения головного мозга для младенцев.

Abstract

Извлечение и анализ катехоламинов нейротрансмиттеров в биологических жидкостях имеет большое значение при оценке функции нервной системы и сопутствующих заболеваний, но их точное измерение по-прежнему является проблемой. Многие протоколы были описаны для измерения нейромедиатора целого ряда инструментов, включая высокого давления жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Однако есть недостатки, такие сложные операции или трудно обнаружить несколько целей, которых нельзя избежать, и в настоящее время доминирующей анализа техника все еще ВЭЖХ, в сочетании с чувствительной электрохимических или обнаружения Флуориметрическое, из-за его высокая чувствительность и хорошей селективности. Здесь подробный протокол описан для предварительной очистки и обнаружения катехоламинов с жидкостной хроматографии высокого давления с электрохимической обнаружения (ВЭЖХ-ECD) в реальные мочи младенцев, с использованием композитного нановолокон electrospun состоит полимерных Корона эфира с полистирола как адсорбент также известный как метод экстракции (PFSPE) Упакованные волокна твердой фазы. Мы показываем как мочи которые образцы могут быть легко precleaned столбец нановолокно Упакованные твердой фазы, и как можно быстро обогащенный аналитов в образце, десорбированного и обнаруженных на систему РДРВ. PFSPE значительно упрощает предварительной процедуры для биологических образцов, позволяя сокращение времени, расходов и сокращение потерь целей.

В целом это работа иллюстрирует простой и удобный протокол для извлечения твердофазный сочетании ВЭЖХ-ECD системы для одновременного определения трех моноаминооксидазы нейромедиаторов (норадреналина (NE), эпинефрина (E), допамин (да)) и два их метаболитов (3-метокси-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) и 3,4-дигидрокси фенилуксусной кислоты (DOPAC)) в моче новорожденных. Протокол был применен к оценить различия мочевых катехоламинов и их метаболитов между риска младенцев с перинатальной повреждения головного мозга и здорового контроля. Сравнительный анализ показал значительную разницу в мочевыводящих путей MHPG между двумя группами, указав, что метаболитов катехоламинов может быть важным кандидат маркер для ранней диагностики случаев риску повреждения мозга у детей.

Introduction

Медиаторы катехоламинов и их содержание метаболитов в жидкостях организма может повлиять на нервные функции и влияют на баланс ответ на стимул государств в значительной степени1. Аномалии может вызвать целый ряд заболеваний, таких как pheochromacytoma, ganglioneuroma, нейробластомы и неврологических расстройств1,2. Добыча и определения катехоламинов в жидкостях организма имеет смысл для диагностики соответствующих заболеваний. Однако катехоламинов в биологических образцах существует в низких концентрациях и легко окисляются. Кроме того они являются очень трудно элюировать вследствие большого объема вмешательства в средний3. Таким образом одновременное выявление катехоламинов в биологических жидкостях по-прежнему является проблемой.

Там были показаны что мочевых катехоламинов может быть мерой стресса, и что их уровни важных биологических маркеров, отвечая на тактильной стимуляции обработки новорожденных5отзывов. Согласно исследованиям все дети, которые страдают от преждевременной инцидентов подвергаются риску для мозга травмы4,5,6, и травмы может привести к ненормальной выпуска катехоламинов и связанные с этим вопросы в жидкости. Существуют расширенные магнитного резонанса методы, которые может обнаружить повреждение мозга в ранних фазах7,8. Однако в течение первых 48 часов, Аномальные нервной процесс приведет к постоянной мозговой травмой, что будет очевидным в медицинских изображений11. Кроме того инструмент высокая стоимость и ограниченные ресурсы, наряду с другими факторами, делает невозможным для всех отделениях неонатологии иметь доступ к эти специализированные методы нейро изображений. Однако использование легко доступным и практических биомаркеров (например катехоламинов и их метаболитов) может преодолеть эти недостатки, и показ биомаркера в жидкостей человека могут помочь в ранней диагностике черепно-мозговой травмы и привести к запрос Идентификация новорожденных нуждающихся нейропротекции9. Катехоламинов в моче может быть простой и очевидной индекса, из-за прямой корреляции между количество из них выпущены в жидкости и neuroactivity функции.

Среди биологических жидкостях, спинномозговой жидкости (CSF) и образцы плазмы не легко получить через существующие травматических процедуры, и это также очень трудно избавиться от вмешательства из-за клея белков и других примесей, ведущих к хлопотно и процесс времени выборки, который подходит для повторного обнаружения. Кроме того для детей, это практически невозможно получить образцы в травматических моды. Таким образом, мочеполовых выборки лучше, чем другие формы выборки, как это неинвазивный, легко работать и может быть повторно сделано. Обильные и легко хранить и показать большие преимущества над другими формами биологических образцов мочи.

Основные методы для количественного определения катехоламинов в биологических жидкостях включают radioenzymic анализов10, энзим соединенный иммунной сорбент анализов11,12 вольтамперометрии и тепловой линзы спектрометрии13. Но недостатки существуют, такие сложные операции и трудно обнаружить несколько целей. Сегодня техника доминирующей анализа является высокой производительности жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)14, в сочетании с чувствительной электрохимических15 или Флуориметрическое обнаружения16, из-за его высокой чувствительностью и хорошей селективности. С технологией тандем масс-спектрометрии, например жидкостной хроматографии/масс-спектрометрия (LC/МС) и жидких хроматография/масс спектрометрии/масс-спектрометрии (LC/МС/МС), анализ и количественной оценки нейротрансмиттеров можно достичь высокого точности и конкретности17,18. Однако MS техника требует дорогостоящей аппаратуры, а также существенно квалифицированной рабочей силы, делая метод трудно применять повсеместно в большинстве обычных лабораторий. ВЭЖХ-ECD систем обычно есть в самых обычных и клинических лабораториях и таким образом стать общей и хороший выбор для исследовательских групп для определения химических, но они требуют образца введены в систему, чтобы быть чистым и из микромасштабной объем19. Таким образом она имеет большое значение для очищения и уплотняют образца до анализа. Классический метод для очистки шаг — экстракции жидкости жидкостью14,,1520 и off-line твердофазный добычи, включая активированные глинозема столбец21,22 и diphenylborate (DPBA) комплексообразованию23,24,25,26.

Myeongho ли и др. использую полимерной смолы, химически модифицированных Корона эфира как адсорбент выборочно извлекать катехоламинов из мочи человека начиная с 2007 года27. Кроме того, в 2006 году он Haibo и др. продемонстрировал снисходительный синтеза подход для boronate сходства извлечения сорбент byutilizing композита на основе nanomagnetic functionalizable nanomagnetic олигомерных полиэдральных силсесквиоксанов (ПОСС) и применяя его к обогащению катехоламинов в мочи человека (норадреналина, адреналина и изопреналин)28. Они также воспользовались наноматериалов для выполнения работы, используя технологию под названием нано electrospinning и формирования полимерных волокнистых материалов в пределах нанометровых размеров элементов. Процесс electrospinning можно настроить диаметр, морфология и пространственной выравнивание продукта, управляя рабочее напряжение и изменения содержания спиннинг решения наряду с другими параметрами29. По сравнению с обычными картриджа SPE, electrospun nanofibers хорошо подходит для извлечения и обогатить целевой аналитов с сложной матрицы, как они оборудованы с высоким соотношением площадь поверхности и объем адсорбировать аналитов с высокой эффективностью, и проявляют более легко контролировать химических свойств поверхности, позволяет удобно прикрепление целевых соединений. Эти свойства делают их хорошим выбором для SPE адсорбентов, значительно снижает твердой фазы и десорбции растворителей сумма30,31,,32-33. Для катехоламинов в образцах мочи electrospun нановолокон, состоящий из apolymeric короны эфира с полистирола (PCE-PS) были использованы выборочно извлекать три катехоламинов ("NE", "E" и "Да")34. В документе отмечается, селективный эфира Корона адсорбированные целей NE, E и да, которая была основана на ее правильной геометрии для привязки катехоламинов через формирование водородных связей. Результаты отображаются материала эфира Корона эффективно, удаление других мешающих соединений, содержащихся в биологических образцах. Вдохновленный настоящего доклада, Роман был разработан метод для селективного извлечения катехоламинов с использованием electrospun композитный нановолокон, состоящий из PCE-ПС

В этом документе метод сообщалось ранее34 была улучшена и работают не только для анализа успешно E, NE и да, но и их метаболитов, MHPG и DOPAC, в моче. Мы также исследовать новые возможности для механизма процесса адсорбции. Метод показывает удовлетворяющих эффективности добычи и избирательности для пяти аналитов, и этот метод был проверен в анализе мочи от риска младенцев с перинатальной повреждения головного мозга и здорового контроля.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Было получено информированное согласие от родителей, и было получено одобрение Советом институциональный обзор для изучения. Исследование было проведено в соответствии с кодексом этики Всемирной медицинской ассоциации (Хельсинкской декларации) для экспериментов с участием людей. Уход всех участников условии письменного согласия для обучающихся в исследовании. Этический Комитет одобрения от Zhongda больнице, Партнерская с Юго-Восточный университет, было также получено.

1. Подготовка решения, необходимые для извлечения и определения катехоламинов и столбцы

  1. Подготовьте столбце PFSPE. Разделить на аликвоты 5-6 мг 1-2 PCE-PS нановолокон и использование тонкой стальной стержень диаметром 0,5 мм для сжатия их упорядоченного в конце кончика пипетки с объемом 200 мкл.
  2. Подготовьте искусственного мочи, весом 2.427 г мочевины, 0,034 г мочевой кислоты, 0,09 г креатинина, 0,297 г тринатрия цитрат, 0.634 г натрия хлорида, 0,45 г калия хлорида, 0.161 г, аммония хлорида, 0,089 г кальция хлорид дигидрат, магния сульфат 0,1 г деионизированная гептогидрата, 0,034 г натрия бикарбоната, 0,003 г оксалат натрия, сульфат натрия 0,258 g, 0,1 г натрия дигидрогенфосфат и 0,011 g динатрия гидрогенфосфат и растворить вышеуказанных химикатов в 200 мл воды.
  3. Готовить 2 мг/мл Стоковый раствор diphenylborate (DPBA) решения путем растворения соединения 2 мг в 1 мл дистиллированной воды. Хранят раствор в темноте при 4 ° C.
  4. Исследуемое вещество стандарт
    Примечание: Химической структуры и свойств катехоламинов нестабильных, и они легко разлагаются. Процесс подготовки стандартов должна быть очень быстро и не должны допустить воздействия прямых солнечных лучей.
    1. Весят 1,0 мг NE, E, да, MHPG, DOPAC и внутренние стандартные 3,4-dihydroxybenzylamine гидробромид DHBA в отдельных 1.5 мл пробирок microcentrifuge. Разбавьте раствор DHBA в воде до 100 нг/мл перед использованием.
    2. Осциллируйте подготовленный стандартов в темноте на высокой скорости до тех пор, пока аналитов раствориться полностью. Это основной запас; хранить при-20 ° C до нескольких недель.
    3. Подготовка среднего 1000 нг/мл аналита запасов. NE, E, да, DOPAC и MHPG передача 5 мкл акций каждого основного аналита в 4975 мкл дистиллированной воды в 5 мл пластиковых пробирок и хранить его в темноте при температуре 4 ° C до использования. Подготовьте эти решения свежий ежедневно. Для DHBA передача 5 мкл начального запаса в 4,995 мкл дистиллированной воды в 5 мл пластиковых пробирок и хранить его в темноте отдельно при 4 ° C.
    4. Сделать дальнейшего разведения с вторичной аналита акций для создания стандартной кривой (например., Дополнительная таблица 2). Хранить в темноте при температуре 4 ° C решения и готовить свежий ежедневно.
    5. Протестируйте оптимального напряжения детектора РДРВ, используя стандартные складе с надлежащей концентрации. Изменять напряжение найти значение где аналитов имеют лучший внешний вид пик.
  5. Подготовка элюанта, содержащий 30% фосфорной кислоты, Ацетонитрил 15%, и 55% дистиллированной воды. 10 мл растворителя элюанта используйте 5,5 мл дистиллированной воды и добавить 1,5 мл ацетонитриле и 3 мл раствора фосфорной кислоты по капле в воду.

2. Подготовка реальных мочи и подвижная фаза

  1. У матерей собрать первую мочу утра их младенцев, с помощью асептического мочи чашки. Передача образцов в полипропиленовых труб и метки сразу. Затем Храните образцы в морозильной камере-20 ° С.
  2. Вортекс и центрифуги мочевыводящих образцы в 1510 x g 10 мин на комнатной температуре (RT) избавиться от большинства твердых вмешательства. Отказаться от осадков и собирать supernatants для дальнейших экспериментов. Для того, чтобы эффективно извлекать аналитов, переходите к предварительной PFSPE (шаг 3) сразу же после центрифугирования.
  3. Подготовка этапа мобильных
    1. Подготовьте чистую бутылку, по крайней мере 1 л. Состав мобильных фазы приведен в дополнительной таблице 1; для мобильных фазы 1 Л, мера 6.7242 г лимонной кислоты, 93.06 мг этилена диамин тетра уксусной кислоты (ЭДТА) динатриевая соль, 7.02 г ортофосфата монометаллических натрия, 404.5 мг 1-heptanesulfonic кислота натриевая соль и 3.5 g натрия гидрат в бутылку. Добавьте 40 мл ацетонитриле и дистиллированной воды до 1000 мл. Агитировать и вибрировать ультразвуковую за 15 мин до тех пор, пока вопрос в растворе распускается.
    2. С помощью рН метр с Стеклянный электрод, отрегулируйте значение пэ-аша мобильных фазы равным 4.21 с насыщенными натрия гидроксида раствор.
    3. Фильтр подвижная фаза с 0,45 мкм винилидена фторида микропористая мембрана и устройство вакуумного всасывания избавиться от примесей.
    4. Использование ультразвуковой вибрации для 15 мин Дега мобильных фазы каждый раз перед использованием.

3. PFSPE извлечение и анализ ВЭЖХ

  1. Активируйте нановолокон. Нажмите 100 мкл метанола и 100 мкл воды последовательно через столбец PFSPE, используя шприц 5 мл в виде медленной, прикапывают.
  2. Смесь 100 мкл мочи образца с 100 мкл 2 мг/мл DPBA раствора и 30 µL 100 нг/мл DHBA раствора (IS, внутренний стандарт) в 0,5 мл EP, а затем передавать смешанного решения в столбце PFSPE. Нажмите смешанный образец решения через колонку PFSPE с 5 мл герметичные пластиковые шприц, используя силу давления воздуха.
  3. Лич столбце три раза путем загрузки 100 мкл раствора DPBA (2 мг/мл) в столбце SPE и нажимаем раствор медленно через картридж с давлением воздуха с помощью герметичные пластиковые шприц 5 мл.
  4. Загрузить 50 мкл элюанта на столбце PFSPE и нажать ее через колонку, собирая элюата с 0,5 мл РД.
  5. Включите КВУП дегазатор Дега воздуха в системе. До анализа образцов система должны работать на более чем 0,5 ч с этапа мобильных макроэкономическую и уменьшить исходный шум. Смотрите Дополнительные в таблице 1 показаны параметры настройки ВЭЖХ системы.
  6. Пример 20 мкл элюата, используя Автоматический пробоотборник и затем внедрить его в системе ВЭЖХ-ECD.
  7. Когда проходит полный, выключите детектор ячейки, используя интерфейс для детектора. НЕ выключить клетки с переключателем на задней части детектора, как это может повредить прибор.
  8. Вручную измените мобильных фазового состава на 10% метанола и 90% воды. Запустите по крайней мере 30 минут. Затем вручную измените мобильные фазы ВЭЖХ класс метанола. Запуск около 15 мин для защиты системы в метаноле. Неспособность выполнить этот шаг после Рекомендуемое время может привести к повреждению столбце и детектор. Выключить поток, а затем выключить дегазатор.

4. Phenylboronic кислота картриджи (PBA) добыча

PBA картриджа извлечения процедуры были похожи на схеме в Кумар и др. (2011) 25. все решения передаются через картридж PBA (100 мг, 1 мл) с воздухом с помощью шприца.

  1. Условие патрон с 1 мл 80: 20 Ацетонитрил воды (v/v) содержащий 1% муравьиной кислоты и 1 мл раствора фосфатного буфера 50 мм (рН 10) последовательно.
  2. Нажмите буферизации мочи (1 мл мочи и 2 мл фосфатного буфера, рН 8,5) через картридж PBA.
  3. Вымойте патрон с 1 мл 50: 50 v/v Ацетонитрил фосфатного буфера (10 мм, рН 8,5).
  4. Элюировать патрон с 1 мл Ацетонитрил воды (80: 20 v/v), содержащей 1% муравьиной кислоты.

5. Идентификация и количественная оценка катехоламинов

  1. Линейность
    1. Разбавленных вторичных аналитов акций с искусственным мочи до шести концентрации (1,5, 3, 12, 25, 50 и 100 нг/мл); Разбавление объем искусственных мочи следует Дополнительная таблица 2. Сделайте три параллельных образцов с каждой концентрации, чтобы получить 18 аналита экспериментальных решений для построения калибровочной кривой.
    2. Разбавленных вторичных фондовых DHBA с искусственным мочи 10 раз чтобы получить 100 нг/мл экспериментальной решения.
    3. Предварительной обработки всех решений исследуемое вещество от 5.1.1, согласно шаг 3 (PFSPE добыча процедур). Как и в шаге 3 придать 20 мкл каждого соответствующего элюата ВЭЖХ-ECD систему, чтобы получить хроматограммы ВЭЖХ.
    4. Строить калибровочные кривые пяти аналитов путем построения соотношение площади пика (цели/IS) по оси Y против соотношение концентрации (цели/IS) по оси X, как показано на рисунке 1 дополнительный.
  2. LOD и LOQ значение чувствительности
    1. Inject 20 мкл пустые искусственные мочи в системе ВЭЖХ-ECD (как в шаге 3), чтобы получить хроматограммы ВЭЖХ образца.
    2. В хроматограммы с 5.2.1 собирать 11 пустых сигнала ценностей и вычислить среднее значение Xb иbстандартное отклонение S. Рассчитать минимальный сигнал вещества, которые могут быть обнаружены на определенном уровне доверия, XLXL = Xb+ K * Sb (K — коэффициент определяется уровнем доверия, Sb отражает уровень шума метод измерения и уровня шума машин). Таким образом, уд = (X -XLb) / s = (K * Sb) / s (S обозначает значение уклона рабочей кривой).
    3. Определите, S/N 3:1 (K = 3) как предел обнаружения (LOD) и S/N 10:1 (K = 10) как предел квантификации (LOQ).
  3. Оценка возмещения
    1. Подготовьте реальные и шипами мочи. Разбавленных вторичных аналитов акций с реальным мочи до трех концентраций (5, 50, 100 нг/мл) для получения шипами мочи. Подготовка трех параллельных образцов для каждого решения исследуемое вещество. Граф шипами концентрация как количество целевых соединений, шипами в мочи. Определите это значение как s.
    2. Развести DHBA складе до 100 нг/мл, что и в шаге 5.1.2.
    3. Процесс для каждого образца решения 5.3.1 согласно шаг 3 (PFSPE добыча процедур) и вставляют 20 мкл каждого соответствующего элюанта ВЭЖХ-ECD систему, чтобы получить хроматограммы результат. Значение аналитов будут учитываться как количество целевых соединений, количественно шипами мочи. Определите это значение какt.
    4. Inject 20 мкл мочи в систему ВЭЖХ-ECD (как в шаге 3), чтобы получить хроматограммы результат. Значение аналитов будет учитываться как начальное количество целевых соединений, количественно в мочи. Определите это значение как я.
    5. Рассчитайте количество целевых соединений в образцах из уравнения стандартной кривой. Процент возмещения оценивается как методологические восстановления % = (t - Aя) × 100 / (s). Средние значения приведены в таблице 1.
  4. Оценивать неточность
    1. Подготовьте шипами искусственных мочи 5, 50 и 100 нг/мл концентрация как шаг 5.3.1. Подготовьте шесть параллельных проб для каждого решения исследуемое вещество. Подготовьте свежие экспериментальных образцов каждый день.
    2. Развести DHBA складе до 100 нг/мл как шаг 5.1.2.
    3. Оценки точности внутри дневной (n = 6). Обрабатывать каждый пример решения в разделе 5.4.1 согласно п.3 и вставляют 20 мкл каждого корреспондент элюанта ВЭЖХ-ECD систему, чтобы получить хроматограммы. Проделать те же операции в тот же день в шесть раз.
    4. Рассчитайте количество целевых соединений в образцах из уравнения стандартной кривой. Согласно же концентрация же соединения относительной стандартное отклонение (RSD) шесть анализов в один день определяется как внутри дневной точности. Средние значения приведены в таблице 1.
    5. Оценки точности между день (n = 6). В то же время каждый день в течение шести последовательных дней подготовить шипами искусственных мочи для трех концентрациях 5, 50, 100 нг/мл, 5.4.1 и 5.4.2. и обрабатывать каждое решение образец исследуемое вещество согласно шаг 3.
    6. Inject 20 мкл каждого соответствующего элюата от 5.4.5 в системе ВЭЖХ-ECD получить хроматограммы результаты каждый день. Рассчитайте количество целевых соединений в образцах из уравнения стандартной кривой. Точность между день выражается RSD количество анализов с шипами искусственных мочи в трех концентрациях в течение шести последовательных дней. Средние значения приведены в таблице 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Этот протокол является простой и удобный метод PFSPE для предварительной обработки образцов мочи и обогащать пять катехоламинов для обнаружения через систему ВЭЖХ-ECD; Диаграмма процесса показан на рисунке 1. Протокол главным образом включает в себя четыре шаги Активация, погрузка, полоскание и элюирующие - в сочетании с небольшим количеством PCE-PS нановолокон и простой твердофазный извлечения устройства. Морфология nanofibers PCE-PS была оценена с помощью анализатора в поверхность и пористость (см. Таблицу материалы). Текстурные свойства BET (Brunauer Эмметт и рассказчик), поверхности, площадь, объем пор и размер пор-2.8297 m2 g-1, 0,009 см3 g-1и 12.76 Нм, соответственно. Эти данные указывают, что материал, используемый в протоколе имеет наноразмерных поры на поверхности, которые могут способствовать эффективности высокой адсорбции и опустил привязки pH в протоколе.

Этот протокол использует оптимизированные томов, образец ингредиенты, фильтрата, элюанта, и т.д., а также рабочие рН и время, затраченное в ходе процедуры. В Chen et al.элюанта был 12,0 М раствор уксусной кислоты, потому что кислых условиях вызывают адсорбента стать протонированных и положительно заряженными, который является благоприятным для элюции CAs34,35. В этом исследовании элюанта рецепт был reconditioned быть 30% фосфорной кислоты, Ацетонитрил 15% и 55% дистиллированной воды. Окончательный рН элюанта была скорректирована до 3.0. Растворитель элюанта должны храниться в кислой среде, когда элюирующие, но гораздо более умеренный, чем 12,0 М уксусной кислоты, которая может привести к плохой пик внешний вид и ущерб для ВЭЖХ системы.

Для идентификации катехоламинов сравниваются Хроматограмма раз удержания пиков в образцах с вершины стандартным решением. На рисунке 2 показаны примеры ВЭЖХ-ECD хроматограммы от различных решений. Если протокол после успешно, хроматографические профили три катехоламинов и их метаболитов должны быть получены путем ВЭЖХ-ECD, с пиками ясно симметрично, четко и с минимальными шумы, как показано в Рисунок 2 . Для сравнения с обычным методом коммерческие PBA патрон был выбран в качестве элемента управления. На рисунке 2(–c), пять целевых пиков в (b) значительно выше, чем thaosein (c), указывающее, что метод PFSPE является более чувствительным, чем метод картридж PBA. Кроме того пик DOPAC не показали в PBA картридж извлечения результат, указывающий, что столбец PBA был не способен извлечения DOPAC. Рисунок 2 (d) изображает Хроматограмма пустой мочи без каких-либо предварительной обработки и Рисунок 2(e) показывает хроматограммы мочи извлечены с помощью составного nanofibers PCE-PS. Рисунок 2 (f) показывает хроматограммы мочи после экстракции с PBA столбец, который показывает не DOPAC экстракции в соответствии с результатом в рисунке 2(c). Диаграмма показывает, что метод PFSPE не может извлечь только цели с хорошим эффектом, но также можно избавиться от большинства вмешательства в моче, давая хороший пик идентификации для целевых соединений.

Статистический анализ показал, что измерения для трех катехоламинов и двух метаболитов достоверно воспроизводится (Таблица 1). Всех целевых соединений показал хорошей линейностью между 1,5 и 100 нг/мл (R2> 0,99), и стандартной кривой каждого исследуемое вещество можно найти в дополнительных Рисунок 1. Кривых и значения R2 показывают, что аналитов обладают хорошей линейностью и относительности в пределах определенного диапазона линейной, подходит для расчета концентраций аналитов в образцах мочи. Пределы обнаружения (LOD) варьировались от 0,25 до 0,54 нг/мл, и пределы количественной оценки (LOQ) были 0,83 до 1,81 нг/мл, соответственно. Сигнал шум (S/N) значение равняется 3. Спектр методологических восстановление пяти целевых соединений был от 97,4% (MHPG) 124.2% (DOPAC), который был удовлетворительным для приложения реальные образцы. Внутри дневной точность была от 2,7 до 4,8% (в виде относительного стандартное отклонение) и точности между день был 2-8,1%, отображение хорошая точность и повторяемость.

Для обнаружения целей в реальные мочи 28 риска младенцев и 22 здоровых младенцев в отделе ухода за детьми, Сучжоу городской больницы, были набраны. Все 50 младенцев, учтены в исследовании были мальчики. Когда они были шесть месяцев, они были доставлены к рутинной здравоохранения проверки в сентябре 2016. Все образцы мочи были собраны и предварительно обработанных следующие шаги протокол 3.1 и 3.2, и образцы были проанализированы с помощью оставшейся части шага 3. Концентрации были рассчитаны против калибровочных кривых. Статистические различия были проанализированы дисперсионный анализ (ANOVA). Результаты можно увидеть в таблице 2. Разница между двумя группами катехоламинов и метаболитов были по сравнению и проанализированы. P-значения показывают, что катехоламинов не различались между высоким риском и здорового группами, в то время как метаболит MHPG содержание отличается в этих группах (p = 0,001). Группа высокого риска новорожденных было большее количество MHPG, чем в контрольной группе (14,8 ± 3,6 нг/мл против 1.4 ± 0,2 нг/мл), что означает, что уровень мочевой MHPG может быть потенциальным маркера для раннего выявления риска младенцев.

Рисунок 3 и таблицу 3 описывают классические количественного определения метода определения моноаминооксидазы материалы и сравнение с другими методами, для которых даны процесс эксплуатации и фигур, представляющих интерес. По сравнению с классическими методами, PFSPE метод имеет преимущества как короткий timespan (5-10 мин), упрощенный процесс, меньше органических растворителей и более экологичности с удовлетворительным методологических параметров. Необходимое количество элюанта низка в объеме (50 мкл) и цели обогащения шаг требует не испарения, который значительно повышает чувствительность обнаружения для целевых соединений в моче. По сравнению с обычными на основе частиц SPE, этот метод повысить эффективность, упрощенный процесс подготовки и сократили время анализа с приемлемым надежности, избирательности и чувствительность.

Figure 1
Рисунок 1 : Принципиальная схема процедуры PFSPE в бумагу и представление его устройства. (1) Gastight шприц, наконечник (2) пипетки и (3) Упакованные нановолокон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Хроматограммы различных образцов. () Spiked пробы воды с целями и в (100 нг/мл) без добычи. (b) Spiked воды образец извлечено методом PFSPE и (c), коммерческих phenylboronic кислоты (PBA) картриджа. (d) реальный пустой мочи образца без добычи. (e) реальные мочи образец извлечено методом PFSPE. (f) реальные мочи образец добытых коммерческих PBA картриджа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Аналитическая схема методов определения. (a, b) Ранее сообщалось классические извлечения методы. () Извлечение глинозема, (b), DPBA комплекс, и (c) методом, предложенные в этом документе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительный рисунок 1: стандартные кривые и уравнений. Стандартные кривые для пяти аналитов построены для того, чтобы использовать уравнение линии для вычисления неизвестных аналитов концентрация в образце. NE (), E (b), (c) Да, MHPG (d) и (e) DOPAC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.

Дополнительный рисунок 2: Boronate сродства взаимодействие между борных кислот и СНГ диол группы или прилегающих двух гидроксильных групп. (A) схема взаимодействия между борных кислот и несколькими группами -OH формы или шести пятичленных циклических эфиров. (B) группа СНГ диол или прилегающих двух гидроксильных групп в красные круги изображают основные реакции сайты для пяти аналитов в борных кислот соединения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.

NE MHPG E ЭТО DOPAC DA
Линейный диапазон (нг/мл) 1.5-400 1.5-200 1.5-100 1.5-100 1.5-400
Значения R-квадрат 0.9945 0.995 0,9976 0.9902 0.9954
LOD (нг/мл) 0.323 0.322 0.313 0.657 0.249 0.543
LOQ (нг/мл) 1.076 1.072 1,043 2.191 0,83 1.809
Восстановления ± RSD (%)(n=9) 110.7±2.9 97.4±9.1 103.9±5.2 86.5±7.3 124.2±3.1 117.3±5.4
Точность (RSD %) (n = 9)
Внутри дня 4.5 4 2.7 4.8 3.3 4.7
Интер день 4.1 8.1 2 6.3 3.2 5.9
NE, норадреналина; MHPG, 3-метокси-4-hydroxyphenylglycol; E, эпинефрина; IS, внутренний стандарт; DOPAC, 3, 4-Dihydroxyphenylacetic кислота; Да, допамина;

Таблица 1: Результаты анализа предлагаемого протокола для определения трех катехоламинов и двух метаболитов с стандартными решениями.

Концентрация (нг мл-1) Группа контроля (22) Группы высокого риска младенца (28) Значение P
NE 7.52±1.34 5.56±1.7 0,37
MHPG 1.4±0.2 14.8±3.6 0.001
E 24±15.8 20.9±5.87 0,841
DOPAC 106.36±30.1 72.12±18.07 0.312
DA 55.53±11.9 48.12±20.9 0,76
P < 0,05 *** показывает существенное различие между двумя группами

Таблица 2: Сравнение концентраций для трех катехоламинов и двух метаболитов в мочи между здоровых младенцев и высокого риска младенцев. Результаты были статистически проанализированы с использованием дисперсионный анализ (ANOVA) с уровнем значимости p = 0,05 различий между MHPG содержание. Показаны средства ± стандартных отклонений.

Пример Растворителем в исчерпаны (мл) Объем образца (мл) Предварительной обработки время (мин) Линейный ряд ЛОД Относительно восстановления (%) Испарится и
растворяться		 Аналитический метод
Растворитель объем время (мин) восстановление (%) растворителя и
(мл) (мл) воссоздание
остаток
Моча 0.5 0.05 10 2.0-200 нг/мл (NE, E, DA) 0,2-0,5 нг/мл (NE, E, DA) 88,5-94,5 (NE, E, DA) Нет ВЭЖХ ECD (Chen et al., 2016)
Моча 19 0,7 — 47 – 167 мкг/Л (DA) 166-500 Нм (DA) 98.3-101,1 (DA) Нет ВЭЖХ UV (Петр et al., 2016)
Моча 1.3 0.01 — 0,5 – 1250 нг/мл (NE, E, да, NMN, MN) 0.5-2.5 нг/мл (NE, E, да, NMN, MN) 74.1 – 97,3 (NE, E, ДА, NMN, MN) Нет LC-MS/MS (Li et al., 2016)
Мочи и плазмы 20 0.05 10 0,04-2,5 нг/мл (NE, E, DA) 0.01-0.02 нг/мл (NE, E, DA) 87.0-97,5 (NE, E, DA) Нет ВЭЖХ UV (Мохаммад et al., 2016)
Моча < 0,5 0.1 5 1.5-400 нг/мл (NE, MHPG, E, DOPAC, да) 0.249 0.543 нг/мл (NE, MHPG, E, DOPAC, да) 97.4-124.2 (NE, MHPG, E, DOPAC, ДА) Нет Эта работа
—, Неопределенным.
PBA, Phenylboronic кислота

Таблица 3: Сравнение этой работы с исследования по предварительной моноаминов, или другие связанные разделы в последние годы.

Дополнительная таблица 1: документа параметры для обнаружения и количественного определения аналитов в документе, ВЭЖХ-ECD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительная таблица 2: подготовка стандартной кривой для пяти аналитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Предложенный метод PFSPE в этом документе может быть значительным и значимые связи его скорость, простота и удобство. Адсорбенты, используемые в протоколе, electrospun нановолокон, имеют высокие коэффициенты поверхности площадь и объем, который адсорбирует аналитов с высокой эффективностью. Процедура только необходимо несколько миллиграммов нановолокно и небольшой объем растворителя элюанта и не требуют испарения шаг сконцентрировать аналитов. Здесь мы представили подробный обзор ВЭЖХ-ECD на основе протокола, который позволит новым пользователям установить эффективный метод для обнаружения и количественного определения трех катехоламинов и два их метаболитов (NE, E, да и MHPG, DOPAC).

Превосходство этого протокола главным образом проистекает из четырех важнейших шагов во время процедуры, как показано на рисунке 1: использование PCE-PS нановолокна для захвата целевых соединений для уменьшения размера сорбент несколько миллиграммов, приводит к быстрому адсорбции / Десорбция и только нуждающихся небольшой объем элюирующие жидкости (1); Добавление DPBA в моче в комплексе с аналитов улучшить их гидрофобность (2); ополаскивание nanofibers раствора, содержащего DPBA сохранить аналитов и удаления примесей (3); и оптимизации извлечения и анализа состояния получить хорошую чувствительность и селективность для аналитов (4).

Для шага (1) может объяснить механизм превосходную производительность для PCE-PS адсорбента способности целый ряд факторов. Корона эфира полимеров, легированных в nanofibers может сформировать хост гостевой комплекс с гостевой молекулы, содержащие амины группы H-Облигации, например катехоламинов в настоящем документе. Кроме того, Hongyou Hu et al. и Jishun Chen et al. также предложил что борных кислот может скрепление с атомами азота в химической структуре через B-N взаимодействия, и что гидрофобные скелета могут взаимодействовать с бензоловых кольца и другие алифатических групп аналитов36,37. Кроме того во время процесса десорбции, скрепления водопода и B-N взаимодействия легко ломаются на очень низких значениях рН; Таким образом eluants с кислой рН обычно подходят для разведки для десорбции. Кроме того есть также несколько вторичных взаимодействия, включая гидрофобная, ионных и водородных связей, который может возникнуть между борных химических веществ и связанных с ними соединений36,37,38. Все эти взаимодействия может способствовать адсорбции аналитов с материалами.

Для шага (2), с помощью добавлен DPBA PCE-PS nanofibers адсорбируют DPBA-катехоламинов комплексов быстро. Лю Чжэнь et al. показали, что материалы сродства boronate появились как важных средств массовой информации для селективного разделения и молекулярного распознавания органических соединений, таких как нуклеозидов, углеводов, гликаны, гликопротеинов и так далее38. Комплексообразование главным образом происходит от взаимодействия boronate сходства между борных кислот и группы СНГ диол или двух смежных гидроксильных групп, формы пять или шесть membered циклических эфиры, как показано в дополнительного рисунок 2A. Дополнительные рисунок 2B изображает сайты крупных реакции для пяти аналитов в этой работе борных кислот соединения. Когда окружение стать кислой, разъединяет борных кислот СНГ диол комплекс. Взаимодействие между борных кислот и группе СНГ диол или прилегающих двух гидроксильных групп существует широко и довольно сильно.

Для шага (3) комплекс образуются между аналитов и DPBA могут держать их на адсорбента в то время как другие примеси промывают от поверхности PCE-PS, достижения лучших отелей для целей. Для шага (4) был отчет, показывающий, что оптимальный рН около 9.0 для склеивания борной кислоты и катехол составные39. Однако Чэнь и др. исследовал самое лучшее значение рН для комплексообразующие катехоламинов DPBA и обнаружил, что адсорбции производительность составного PS-PCE нановолокна для CAs является оптимальным решением, когда было изменено значение рН между 6.0 и 7.034,35. Лю et al. замешан, что структура вспомогательных материалов для boronate кислотных соединений, особенно с пространственной изоляции полостей и наноразмерных поры, и B-N лигандов, сформированные во время реакции, может также существенно снизить Привязка рН и расширения привязки сродство38. Все оборудованы - NH-групп PCE-PS структуры, а также структура катехоламинов. Таким образом свойства и наноразмерных поры PCE-ПС (данные, как показано в Результатах представитель), а также B-N лигандов сформирован, может способствовать опустил привязки pH в протоколе. Таким образом оптимальный рН в этот протокол может быть нейтральными, который значительно упрощает процедуры и избежать деградации аналитов.

Основные ограничения определения catcholamine, что их концентрации в биологических образцах являются очень низкими и что их структуры нестабильны (легко окисляется); Кроме того трудно избавиться от примесей в средствах массовой информации. Таким образом для анализа катехоламинов в биологических образцах, предварительной обработки, обычно путем экстракции твердофазный, является необходимым. PFSPE метод, предложенный в этом документе предоставляет простой и удобный предварительным концентрированием для аналитов в образцах мочи. Но, при выполнении эксперимента, состояние эксперимента должны строго контролироваться, средствами например, избегая воздействия света и укорочение предварительной обработки времени насколько это возможно.

Применимость метода была оценена его использования для определения концентрации три катехоламинов и двух метаболитов в моче здоровых младенцев и высокого риска младенцев. Существует значительная разница между двумя группами в мочевыводящих путей MHPG. Как кратко ранее, MHPG сумму в теле человека теперь главным образом сообщается как индекс отражает норадренергической нейрональных тон, деятельность метаболизма катехоламинов в Центральной и периферической нервной систем40,41, 42, и является полезным плазмы/мочи маркера для Центральной СВ метаболизм43. Для высокого риска младенцев целый ряд факторов, таких как гипоксически ишемическая энцефалопатия (ГИЭ) вызывает мозга травмы и мозг оскорбления, ведущих к разной степени детства неврологического дефицита. Это повреждение мозга, в свою очередь, приведет к освобождению нейромедиаторов (MHPG Интернет) в жидкостях организма44,45. Согласно сообщениям J.W. Маас существуют значимые корреляции между мозга, ФГО, плазме и моче концентрации, MHPG46,47. Измерение всего (бесплатно + конъюгированная) MHPG в моче уже давно используется для оценки метаболизм NE Центральной и периферической СВ метаболизм в людей41,,4849. Таким образом может сделать вывод о том, что высокий риск у новорожденных норадренергической нейрональных тон повреждения по сравнению со здоровыми, влияющих на метаболизм катехоламинов в Центральной и периферической нервной системы. Это несоответствие означает, что дальнейшие исследования должно быть сделано на отношения между мочевого MHPG уровня и неврологического дефицита. Было продемонстрировано, что предложенный метод может использоваться для определения наличия катехоламинов в моче, с многообещающие перспективы для использования в клинике для оценки заболеваний, имеющих отношение к этим нейротрансмиттеров.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы удостоверяют, что нет никакого конфликта интересов с любой финансовой организации относительно материала, обсуждаемые в этой статье.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано Национальный фонд Китая науки (No.81172720, № 81673230), социального развития исследований программа Цзянсу провинция науки и технологий Департамента (No. BE2016741), Наука и технологии проект Китая общего управления по надзору за качеством, инспекции и карантина (2015QK055), Открытый проект программы ключевых лаборатории развития ребенка и обучения министерства образования, науки Юго-Восточный университет (ДКСТ-2016-04). Мы искренне признаем Юань песню и Ping Лю, который помогал нам в коллекции образцов.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 µL pipette tip column to contain nanofibers
PCE-PS nanofibers material for PFSPE extraction
steel rod (about 0.5 mm diameter) fill the nanofibres into the column
gastight plastic syringe (5 ml) compress solution into the end of the tip
methanol Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 67-56-1
diphenylborinic acid 2-aminoethyl ester(DPBA) Sigma-Aldrich.Inc A-106408 complex reagent
norepinephrine(NE) Sigma-Aldrich.Inc A-9512 analyte
3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol(MHPG) Sigma-Aldrich.Inc H1377 analyte
epinephrine(E) Sigma-Aldrich.Inc 100154-200503 analyte
3, 4-Dihydroxyphenylacetic acid(DOPAC) Sigma-Aldrich.Inc D-9128 analyte
dopamine(DA) Sigma-Aldrich.Inc H-8502 analyte
3, 4-dihydroxybenzylamine hydrobromide(DHBA) Sigma-Aldrich.Inc 858781 interior label
acetonitrile Sigma-Aldrich.Inc 75-05-8 eluriant and mobile phase
phosphoric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7664-38-2 eluriant
uric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 69-93-2 artifical urine
creatinine Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 60-27-5 artifical urine
trisodium citrate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 6132-04-3 artifical urine
KCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7447-40-7 artifical urine
NH4Cl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 12125-02-9 artifical urine
NaHCO3 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd SWC0140326 artifical urine
C2Na2O4 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 62-76-0 artifical urine
NaSO4 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7757-82-6 artifical urine
disodium hydrogen phosphate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10039-32-4 artifical urine
urea Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 57-13-6 artifical urine
NaCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7647-14-5 artifical urine
MgSO4.7H2O Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10034-99-8 artifical urine
CaCl2 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10035-04-8 artifical urine
HCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7647-01-0 artifical urine
citric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 77-92-9 artifical urine and mobile phase
EDTA disodium salt Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 34124-14-6 mobile phase
monometallic sodium orthophosphate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7558-80-7 artifical urine and mobile phase
1-heptanesulfonic acid sodium salt Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 22767-50-6 mobile phase
sodium hydroxide Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 1310-73-2 mobile phase
phenylboronic acid column(PBA column) Aglilent 12102018 PBA extraction
Inertsil® ODS-3 5 µm 4.6×150 mm column Dikma 5020-06731 HPLC column for seperation
SHIMADZU SIL-20AC prominence AUTO SAMPLER Shimadzu Corporation, Japan SIL-20AC auto injection for eluriant
SHIMADZU LC-20AD High Performance Liquid Chromatography Shimadzu Corporation, Japan LC-20AD HPLC pump
SHIMADZU L-ECD-60A electrochemical detector Shimadzu Corporation, Japan L-ECD-60A detector for the analytes
ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry System Micromeritics, USA surface and porosity analyzer 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elhwuegi, A. S. Central monoamines and their role in major depression. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 28, 435-451 (2004).
  2. Da, C. F., Ngoabdalla, S., Houzel, J. C., Rehen, S. K. Murine model for Parkinsons disease: From 6-OH dopamine lesion to behavioral test. J. Vis. Exp. (35), e1376 (2010).
  3. Varley, H., Gowenlock, A. H. The clinical chemistry of monoamines. Brit. Med. J. 2, 1330 (1963).
  4. Wang, X., Rousset, C. I., Hagberg, H., Mallard, C. Lipopolysaccharide-induced inflammation and perinatal brain injury. Semin. Fetal. Neonatal. Med. 11, 343-353 (2006).
  5. Inder, T. E., Volpe, J. J. Mechanisms of perinatal brain injury. Semin. Neonatol. 5, 3-16 (2000).
  6. Miller, S. P., Ferriero, D. M. From selective vulnerability to connectivity: Insights from newborn brain imaging. Trends. Neurosci. 32, 496-505 (2009).
  7. Barkovich, A. J., et al. Proton MR spectroscopy for the evaluation of brain injury in asphyxiated, term neonates. Am. J. Neuroradiol. 20, 1399-1405 (1999).
  8. Liauw, L., van Wezel-Meijler, G., Veen, S., van Buchem, M. A., van der Grond, J. Do apparent diffusion coefficient measurements predict outcome in children with neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy? Am. J. Neuroradiol. 30, 264-270 (2009).
  9. Varsami, M., et al. Inflammation and oxidative stress biomarkers in neonatal brain hypoxia and prediction of adverse neurological outcome: A review. J. Pediatr. Neonat. Individual. Med. 2, e020203 (2013).
  10. Cooper, R. L., Walker, R. F. Microradioenzymic assays for the measurement of catecholamines and serotonin. Methods. Enzymol. 103, 483-493 (1983).
  11. Murphy, J. F. The development of enzyme linked immunosorbent assays (ELISA) for the catecholamines adrenaline and noradrenaline. J. Immunol. Methods. 154, 89-98 (1992).
  12. Jones, S. R., Mickelson, G. E., Collins, L. B., Kawagoe, K. T., Wightman, R. M. Interference by pH and Ca2+ ions during measurements of catecholamine release in slices of rat amygdala with fast-scan cyclic voltammetry. J. Neurosci. Methods. 52, 1-10 (1994).
  13. Sanchismallols, J. M., Villanuevacamañas, R. M., Ramisramos, G. Determination of unconjugated catecholamine in urine as dopamine by thermal lens spectrometry. Analyst. 117, 1367-1371 (1992).
  14. Lan, C., Liu, W. Determination of catecholamines by HPLC-ECD in urine. Medical Laboratory Science and Clinics. , (2007).
  15. Tsunoda, M., Aoyama, C., Ota, S., Tamura, T., Funatsu, T. Extraction of catecholamines from urine using a monolithic silica disk-packed spin column and high-performance liquid chromatography-electrochemical detection. Anal. Methods. 3, 582-585 (2011).
  16. Bartolini, B., et al. Determination of monoamine oxidase activity by HPLC with fluorimetric detection. Neurobiology (Bp). 7, 109-121 (1999).
  17. Dunand, M., Gubian, D., Stauffer, M., Abid, K., Grouzmann, E. High throughput and sensitive quantitation of plasma catecholamines by ultraperformance liquid chromatography tandem mass spectrometryusing a solid phase microwell extraction plate. Anal. Chem. 85, 3539-3544 (2013).
  18. He, H., Carballo-Jane, E., Tong, X., Cohen, L. H. Measurement of catecholamines in rat and mini-pig plasma and urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry coupled with solid phase extraction. J. Chromatogr. B. 997, 154-161 (2015).
  19. Simon, N., Young, P. How to increase serotonin in the human brain without drugs. J. Psychiatry. Neurosci. 32, 394-399 (2007).
  20. Grossi, G., et al. Improvements in automated analysis of catecholamine and related metabolites in biological samples by column-switching high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 541, 273-284 (1991).
  21. Iwamot, T., Yoshiura, M., Iriyama, K. Liquid chromatographic identification of urinary catecholamine metabolites adsorbed on alumina. J. Liq. Chromatogr. R. T. 10, 1217-1235 (1987).
  22. Maycock, P. F., Frayn, K. N. Use of alumina columns to prepare plasma samples for liquid-chromatographic determination of catecholamines. Clin. Chem. 33, 286-287 (1987).
  23. Grossi, G., Bargossi, A., Lippi, A., Battistoni, R. A fully automated catecholamines analyzer based on cartridge extraction and HPLC separation. Chromatographia. 24, 842-846 (1987).
  24. Rondelli, I., et al. New method for the resolution of the enantiomers of 5,6-dihydroxy-2-methyl-aminotetralin by selective derivatization and HPLC analysis: Application to biological fluids. Chirality. 8, 381-389 (1996).
  25. Kumar, A., Hart, J. P., McCalley, D. V. Determination of catecholamines in urine using hydrophilic interaction chromatography with electrochemical detection. J. Chromatogr. A. 1218, 3854-3861 (2011).
  26. Sabbioni, C., et al. Simultaneous liquid chromatographic analysis of catecholamines and 4-hydroxy-3-methoxyphenylethylene glycol in human plasma: Comparison of amperometric and coulometric detection. J. Chromatogr. A. 1032, 65-71 (2004).
  27. Lee, M., et al. Selective solid-phase extraction of catecholamines by the chemically modified polymeric adsorbents with crown ether. J. Chromatogr. A. 1160, 340-344 (2007).
  28. He, H., et al. Facile synthesis of a boronate affinity sorbent from mesoporous nanomagnetic polyhedral oligomeric silsesquioxanes composite and its application for enrichment of catecholamines in human urine. Anal. Chim. Acta. 944, 1-13 (2016).
  29. Subbiah, T., Bhat, G. S., Tock, R. W., Parameswaran, S., Ramkumar, S. S. Electrospinning of nanofibers. J. Appl. Polym. Sci. 96, 557-569 (2005).
  30. Hu, W. Y., et al. Packed-fiber solid-phase extraction coupled with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry for determination of diethylstilbestrol, hexestrol, and diedestrol residues in milk. J. Chromatogr. B. 957, 7-13 (2014).
  31. Liu, Z., Kang, X., Fang, F. Solid phase extraction with electrospun nanofibers for determination of retinol and α-tocopherol in plasma. Microchim. Acta. 168, 59-64 (2010).
  32. Qi, D., Kang, X., Chen, L., Zhang, Y., Wei, H., Gu, Z. Electrospun polymer nanofibers as a solid-phase extraction sorbent for the determination of trace pollutants in environmental water. Anal. Bioanal. Chem. 390, 929-938 (2008).
  33. Kang, X. J., Chen, L. Q., Zhang, Y. Y., Liu, Y. W., Gu, Z. Z. Performance of electrospun nanofibers for SPE of drugs from aqueous solutions. J. Sep. Sci. 31, 3272-3278 (2008).
  34. Chen, L. Q., Wang, Y., Qu, J. S., Deng, J. J., Kang, X. J. Selective extraction of catecholamines by packed fiber solid-phase using composite nanofibers composing of polymeric crown ether with polystyrene. Biomed. Chromatogr. 29, 103-109 (2015).
  35. Chen, L. Q., Zhu, X. H., Shen, J., Zhang, W. Q. Selective solid-phase extraction of catecholamines from plasma using nanofibers doped with crown ether and their quantitation by HPLC with electrochemical detection. Anal. Bioanal. Chem. 408, 4987-4994 (2016).
  36. Hu, H., Zhang, Y., Zhang, Y., Huang, X., Yuan, D. Preparation of a new sorbent based on boronate affinity monolith and evaluation of its extraction performance for nitrogen-containing pollutants. J. Chromatogr. A. 1342, 8-15 (2014).
  37. Chen, J., et al. Sensitive determination of four camptothecins bysolid-phase microextraction-HPLC based on a boronic acid contained polymer monolithic layer. Anal. Chim. Acta. 879, 41-47 (2015).
  38. Li, D., Chen, Y., Liu, Z. Boronate affinity materials for separation and molecular recognition: structure, properties and applications. Chem. Soc. Rev. 44, 8097-8123 (2015).
  39. Yan, J., Springsteen, G., Deeter, S., Wang, B. The relationship among pKa, pH, and binding constants in the interactions between boronic acids and diols: It is not as simple as it appears. Tetrahedron. 60, 11205-11209 (2004).
  40. Reuster, T., Rilke, O., Oehler, J. High correlation between salivary MHPG and CSF MHPG. Psychopharmacology. 162, 415-418 (2002).
  41. Beckmann, H., Goodwin, F. K. Urinary MHPG in subgroups of depressed patients and normal controls. Neuropsychobiology. 6, 91-100 (1980).
  42. Mitoma, M., et al. Stress at work alters serum brain-derived neurotrophic factor (BDNF) levels and plasma 3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) levels in healthy volunteers: BDNF and MHPG as possible biological markers of mental stress? Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 32, 679-685 (2008).
  43. Ressler, K. J., Nemeroff, C. B. Role of Norepinephrine in the Pathophysiology and Treatment of Mood Disorders. Biol. Psychiatry. 46, 1219-1233 (1999).
  44. Alonso-Spilsbury, M., et al. Perinatal asphyxia pathophysiology in pig and human: A review. Anim. Reprod. Sci. 90, 1-30 (2005).
  45. Shalak, L., Perlman, J. M. Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant: Current concepts. Early. Hum. Dev. 80, 125-141 (2004).
  46. Maas, J. W., Leckman, J. F. relationships between central nervous system noradrenergic function and plasma and urinary MHPG and other norepinephrine metabolites. MHPG: Basic Mechanisms and Psychopathology. , Academic Press. 33-43 (1983).
  47. Maas, J. W. Relationships between central nervous system noradrenergic function and plasma and urinary concentrations of norepinephrine metabolites. Adv. Biochem. Psychopharmacol. 39, 45-55 (1984).
  48. Peyrin, L., Pequignot, J. M., Chauplannaz, G., Laurent, B., Aimard, G. Sulfate and glucuronide conjugates of 3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) in urine of depressed patients: Central and peripheral influences. J. Neural. Transm. 63, 255-269 (1985).
  49. Peyrin, L. Urinary MHPG sulfate as a marker of central norepinephrine metabolism: A commentary. J. Neural. Transm. 80, 51-65 (1990).

Tags

Химия выпуск 133 катехоламинов полимерные Корона electrospun нановолокно Упакованные волокна твердофазный добыча (PFSPE) высокого давления жидкостной хроматографии с электрохимической обнаружения (ВЭЖХ-ECD) повышенного риска младенцев
Удобный метод для извлечения и анализа с высокого давления жидкостной хроматографии и их метаболитов катехоламинов нейротрансмиттеров
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xie, L., Chen, L., Gu, P., Wei, L.,… More

Xie, L., Chen, L., Gu, P., Wei, L., Kang, X. A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites. J. Vis. Exp. (133), e56445, doi:10.3791/56445 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter