Summary
3 つのモノアミン神経伝達物質の一斉分析や乳児の尿中代謝物の 2 つの (ECD) の電気化学検出高速液体クロマトグラフィー (HPLC) に結合する便利な固相抽出を提案する.脳障害の早期診断のための潜在的なバイオ マーカーとして代謝物 MHPG を識別するも幼児のため。
Abstract
神経系機能と関連疾患を評価する上で非常に重要なは、抽出と体液中のカテコールアミン神経伝達物質の分析が、その精密測定、まだ挑戦。多くのプロトコルは、各種機器、高圧液体クロマトグラフィー (HPLC) を含む神経伝達物質測定について記載されています。しかし、避けられない複数のターゲット検出ハードや複雑な操作などの欠点があり、現在、支配的な解析手法がまだために敏感な電気化学的または蛍光検出と相まって高速液体クロマトグラフィーその高い感度と優れた選択性。作曲エレクトロスピニング複合ナノファイバーを用いた幼児の実際の尿サンプルの前処理と電気化学検出高速液体クロマトグラフィー ECD) 高圧液体クロマトグラフィーによるカテコールアミンの検出のための詳しいプロトコルの説明ここでは、高分子吸着剤としてポリスチレンとクラウン エーテル繊維充填固相抽出 (PFSPE) 法とも呼ばれます。尿サンプルはナノファイバー満載固相カラムとどのようにサンプルの分析が急速に濃縮することができます、簡単に precleaned することができますが、脱着し、ECD システム上で検出された方法を紹介しています。PFSPE 大幅減少し、時間、経費、およびターゲットの損失の削減を可能にする生物学的サンプル前処理手順を簡素化します。
全体的にみて、この作品は 3 つ (ノルエピネフリン (NE)、(e)、ドーパミン (DA)) モノアミン神経伝達物質の一斉分析法との 2 つの高速液体クロマトグラフィー ECD システムと結合した固相抽出のためのシンプルで便利なプロトコルを示しています乳児の尿中代謝 (3-メトキシ-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) および 3, 4-ジヒドロキシ-フェニル酢酸 (DOPAC))。確立されたプロトコルは、尿中カテコールアミンの違いとハイリスク周産期脳障害児と健常者とその代謝物の評価に適用しました。比較分析では、尿中 MHPG のカテコールアミン代謝物が乳児の脳の損傷のリスクがある場合の早期診断のための重要な候補者マーカーをかもしれないことを示す、2 つのグループ間に有意差を明らかにしました。
Introduction
カテコールアミン神経伝達物質とその代謝物内容を体液ですることができます神経機能に影響を与えるし、大部分は1に応答の刺激状態のバランスに影響を与えます。異常は、様々 な pheochromacytoma、神経、神経芽細胞腫、神経疾患1,2などの疾患を引き起こす可能性があります。抽出し、体液中のカテコールアミンの定量関連疾患の診断に有効です。ただし、生体試料中のカテコールアミンは低濃度に存在し、酸化しやすい。さらに、溶出が中3で干渉の大きい量のために非常に困難です。したがって、体液中のカテコールアミンの同時検出法はまだ挑戦です。
レビュー尿中カテコールアミンがストレスの測定をすることができ、新生児5処理触覚の刺激への応答の重要な生物学的マーカーに、自分のレベルが表示されています。調査によると脳損傷4,5,6リスクは時期尚早の事件で苦しんでいるすべての乳児と傷害は、カテコールアミンと流体に関連する事項についての異常のリリースを引き起こす可能性があります。以前のフェーズ7,8脳損傷を検出できる高度な磁気共鳴技術は存在します。ただし、最初の 48 時間以内異常発達プロセスは医療画像11で明らかにされません恒久的な脳損傷になります。その上、他の要因とともに、高コスト、乏しい計測器リソースの場合、これらの特殊なニューロ イメージング技術へのアクセスを持っているすべての新生児ユニット不可能になります。ただし、(カテコールアミンやその代謝物) など簡単に親しみやすく、実用的なバイオ マーカーの使用は、これらの欠点を克服できると人間液中バイオ マーカーのスクリーニングが脳損傷の早期診断に役立つし、要求につながる神経保護9を必要とする新生児の id。尿中のカテコールアミンは、流体と俊関数にリリースそれらの量間の直接の相関関係のため、簡単で明白なインデックスをすることができます。
体液、脳脊髄液 (CSF) と血漿中ない既存の外傷性プロシージャを介して取得する簡単とも接着タンパク質や面倒につながるその他の不純物による干渉を取り除くために非常に困難ですし、時間のかかるサンプリング プロセスが繰り返し検出に適しています。また、子供のため、外傷性ファッションのサンプルを得ることはほとんど不可能です。したがって、尿のサンプリング、サンプリングの他の形態よりだ非侵襲的、操作しやすい、繰り返し行うことができます。豊富な尿サンプルは、格納、および生体試料の他の形態上の大きな利点を表示する簡単です。
Radioenzymic 試金10、酵素免疫吸着測定法11、ボルタンメトリー12熱レンズ分光法13などの体液中のカテコールアミンを定量化するための主な方法です。しかし、欠点が存在するなど複雑な操作および検出が難しい複数のターゲット。今日では、支配的な解析手法は高速液体クロマトグラフィー (HPLC)14、その高い感度と優れた選択性のため機密性の高い電気化学15または蛍光検出16と相まっています。液体クロマトグラフィーなどのタンデム質量分析技術/質量分析法 (LC/MS) と神経伝達物質の定量化、液体クロマトグラフィー/質量分析/質量分析 (MS/LC/MS) 分析を高達成することができます正確性と特異性の17,18。ただし、高価な計測器としてメソッドを従来のほとんどの所で普遍的に適用することは困難すること大幅に修飾のマンパワー MS 技術が必要です。HPLC-ECD システムと最も慣習的および臨床的研究所の整った一般化学定量に使用する研究グループのための一般的な良い選択となっているが、導入システムにきれいに、サンプルが必要マイクロ ボリューム19。したがって、それは浄化し、解析の前にサンプルを凝縮する非常に重要なのです。浄化のステップのための古典的な方法は液液抽出14,15、20活性アルミナ列21,22 を含む、オフラインの固相抽出と diphenylborate (DPBA) 錯体23,24,25,26。
県内面ミヨンホ李ら200727以来人間の尿からカテコールアミンを個別に抽出するのに吸着剤としてクラウン エーテルで化学修飾した高分子樹脂を使用しています。また、2006 年に Haibo 彼ら。functionalizable ナノ多面体オリゴマー シルセスキオキサン (ポス) 基ナノ複合材料とカテコールアミンの濃縮に適用するボロネート親和関係抽出剤として県の簡易合成アプローチを実証尿 (ノルアドレナリン、アドレナリン、イソプレナリン)28.彼らはまたナノ エレクトロスピニングと呼ばれるナノスケールの高分子の繊維状物質を形成する技術を使用して、仕事を達成するナノ材料の利用をしました。静電紡糸プロセスは、動作電圧を制御し、他のパラメーター29と共に紡績ソリューションの内容を変更、径、形態、および製品の空間配置を調整できます。従来の SPE カートリッジと比べると、ナノファイバー エレクトロスピニングが極めて適当で抽出し、複雑なマトリックスからターゲット analytes を豊かに、検体を高効率で吸着する表面面積、体積率が高いが備わっていますし、ターゲット化合物の便利な添付ファイルを許可するより容易に制御表面物性を示します。これらの特性はそれらに SPE 吸着、固相と脱着溶剤量30,31,32,33を大幅に削減のための良い選択肢を作る。尿中カテコールアミン、エレクトロスピニング ナノファイバー PCE ポリスチレンと apolymeric クラウン エーテルから成る 3 つのカテコールアミン (NE, E、および DA)34を選択的に抽出する使用されました。紙は、NE、E、および DA は、水素結合の形成によるカテコールアミンをバインドするための正しいジオメトリに基づいていた目標をクラウン エーテルを選択的に吸着を示した。結果は効果的に生体試料に含まれている他の干渉の化合物を削除する素材のクラウン エーテルを表示されます。このレポートに触発され、手法によって開発された動物の選択的な抽出のエレクトロスピニング複合ナノファイバー PCE PS の構成の使用
本稿では、34 E、NE と DA もの MHPG および DOPAC、尿中代謝物で正常に解析するだけでなく採用し、メソッドが以前に報告しています。また吸着過程のメカニズムの新たな可能性を探ります。メソッドは、満足の抽出効率と 5 検体の選択性を示しメソッドは、周産期脳障害と健常乳児の尿の分析で検証しました。
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Protocol
親からインフォームド コンセントが得られたと研究倫理委員会の承認が得られました。人間の世界医師会 (ヘルシンキ宣言) の倫理綱領に基づき実施されました。介護提供のすべての参加者の研究に登録されての書面します。中達の病院の倫理委員会の承認は東南大学と提携、また得られました。
1 列の抽出およびカテコールアミンの定量に必要なソリューションの準備
- PFSPE 列を準備します。5-6 の因数に PCE PS ナノファイバーの 1-2 mg を分割し、それらの体積 200 μ L ピペット チップの終わりに整然とした圧縮に直径 0.5 mm の微細鋼棒を使用します。
- 2.427 g 尿素、0.034 g 尿酸、0.09 g クレアチニン、0.297 g クエン酸ナトリウム、0.634 g 塩化ナトリウム、0.45 g 塩化カリウム、塩化アンモニウム 0.161 g、0.089 g 塩化カルシウム二水和物、硫酸マグネシウム 0.1 g を秤量することにより人工尿を準備します。200 mL に上記の化学物質が脱イオン七水和物、0.034 g の重炭酸ナトリウム、シュウ酸ナトリウム 0.003 g、0.258 g ナトリウム硫酸、0.1 g ナトリウム二水素リン酸塩と 0.011 g リン酸水素溶解水。
- 化合物 2 mg を 1 mL の蒸留水に溶解して diphenylborate (DPBA) 溶液の原液を 2 mg/mL を準備します。4 ° C で暗闇の中でソリューションを格納します。
-
標準試料
注: 化学構造とカテコールアミンのプロパティ、不安定と彼らは簡単に分解です。標準の準備プロセスは非常に高速、直射日光への露出を防ぐ必要があります。- NE、E、DA、MHPG、DOPAC、内部標準の 3, 4-dihydroxybenzylamine 臭化水素酸塩 DHBA 別 1.5 mL 容マイクロ チューブでの 1.0 mg の重量を量る。DHBA ソリューションを使用する前に 100 ng/mL の水で希釈します。
- 検体を完全に溶解するまで高速で暗闇の中で準備された基準を振動させてください。これは、主な株式;数週間までの-20 ° C で保存します。
- セカンダリ 1,000 ng/mL 検体株を準備します。NE, E、DA、DOPAC と MHPG、4,975 μ L の蒸留水 5 mL の遠心管に主な検体銘柄ごとの 5 μ L を転送し、使用するまで 4 ° C で暗闇の中でそれを格納します。これらのソリューションの新鮮な毎日を準備します。DHBA、4,995 μ L の蒸留水 5 mL の遠心管に主な株式の 5 μ L を転送および 4 ° C で別々 に暗闇の中で保存
- さらに希釈標準曲線を作成する二次検体の在庫を作る (e.g。、補足表 2)。4 ° C で暗闇の中でソリューションを保存し、新鮮な毎日を準備します。
- 適切な濃度で標準的なストックを用いた ECD 検出器の最適な電圧をテストします。分析検体が最高のピーク外観をある値に電圧が異なります。
- 燐酸 30%、15% アセトニ トリルを含む溶離液を準備し、55% 蒸留水します。溶離液溶媒 10 mL、5.5 mL の蒸留水を使用し、水にアセトニ トリルの 1.5 mL とリン酸一滴ずつの 3 mL を追加します。
2. 実際の尿サンプルと移動相の調製
- 無菌尿カップを使用して彼らの幼児の最初の早朝尿を収集する母親がいます。ポリプロピレン チューブやラベルに、サンプルをすぐに転送します。その後、-20 ° C のフリーザーでサンプルを保存します。
- 渦と遠心分離機 1,510 x g で 10 分間で尿サンプル室温 (RT) ほとんどの粒子の干渉を取り除くために。堆積物を破棄し、さらに実験の培養上清を収集します。検体を効果的に抽出するために遠心分離直後後 PFSPE 前処理 (手順 3) に進みます。
-
移動相を準備します。
- きれいな瓶、少なくとも 1 l. を準備します。移動相の組成は、補足表 1に記載されて1 L 移動相、クエン酸、エチレン ジアミン四酢酸 (EDTA) ナトリウム塩、単本位ナトリウム オルトリン酸の 7.02 g 93.06 mg の 6.7242 g メジャーの 404.5 mg 1 heptanesulfonic 酸ナトリウム塩とナトリウムの 3.5 g の瓶にメタンハイド レートします。アセトニ トリル 40 mL を加えて 1,000 mL に蒸留水します。扇動し、ソリューションの問題はすべてが溶解するまで 15 分間超音波振動します。
- ガラス電極 pH メーターを使用して、水酸化ナトリウム飽和溶液を 4.21 に移動相の pH 値を調整します。
- 0.45 μ m ポリフッ化ビニリデン フッ化物微多孔性メンブレン、不純物を取り除くために真空吸引装置を含む移動相をフィルター処理します。
- 移動相を使用する前にするたびにガスを抜き、15 分間超音波振動を使用します。
3. PFSPE 抽出および HPLC 分析
- ナノファイバーをアクティブにします。押してメタノールの 100 μ L、100 μ L の水から順番にゆっくりと、滴状に 5 mL の注射器を使用して、PFSPE 列。
- ミックス 100 μ L 尿 100 μ L 2 mg/ml DPBA ソリューションと 30 μ L 100 ng/ml の DHBA 溶液 (IS、内部標準) 0.5 mL EP 管でサンプルし、PFSPE 列に混合液を転送します。空気圧の力を使って 5 mL 気密性プラスチック注射器で PFSPE の列を混合試料溶液を押します。
- SPE カラムに 100 μ L の DPBA ソリューション (2 mg/mL) を読み込むことによって列の 3 回を濾すし、気密性 5 mL プラスチック注射器を使用して空気圧でカートリッジをゆっくりとソリューションをプッシュします。
- PFSPE カラムに溶離液を 50 μ l 添加を読み込み、0.5 mL EP 管溶出液の収集の列をプッシュします。
- システム内の空気をガス抜き HLPC 脱を入れます。サンプル分析の前に移動相平衡し、ベースライン ノイズを低減すると 0.5 h 以上のシステムを実行してください。高速液体クロマトグラフィー システムのセットアップ パラメーターを示す補足の表 1を参照してください。
- 自動サンプラーを使用して溶出液 20 μ L をサンプルし、HPLC-ECD システムに注入すること。
- 実行が完了したら、検出器インターフェイスを使用して検出器セル オフにします。計測器が損傷する恐れが、検出器の背面にあるスイッチでセルを切らないでください。
- 手動で 10% と 90% のメタノール水移動相組成を変更します。少なくとも 30 分を実行します。その後、HPLC グレードのメタノールに移動相を手動で変更します。メタノール中でシステムを保護するために約 15 分間を実行します。推奨される実行時間を次のこの手順の実行に失敗した可能性があります列と検出器に損傷。流れをオフにし、脱ガス装置をオフにします。
4. フェニルボロン酸カートリッジ (PBA) 抽出
PBA カートリッジ抽出手順 Kumarらのスキームに類似していた。(2011 年)25します。 すべてのソリューションは、注射器による強制空気で PBA カートリッジ (100 mg, 1 mL) によって押されます。
- 1 mL 試しましたアセトニ トリル-水 (v/v) 1% ギ酸と 50 mM リン酸緩衝液 (10) 1 mL を順次含むとカートリッジを状態します。
- PBA カートリッジでバッファリングされた尿サンプル (1 mL 尿と 2 mL リン酸バッファー、pH 8.5) を押します。
- 1 mL 50: 50 v/アセトニ トリル-リン酸バッファー (10 mM、pH 8.5) とカートリッジを洗ってください。
- 1% ギ酸を含む 1 mL のアセトニ トリル-水 (80: 20 v/v) とカートリッジを溶出します。
5. 同定とカテコールアミンの定量
-
直線性
- 6 濃度 (1.5、3、12、25、50、および 100 ng/mL); 人工尿を二次分析株式を希釈します。人工の尿の希釈容量補足テーブル 2に従います。各濃度の校正曲線を構築するため 18 検体実験的ソリューションを取得する 3 つの並列サンプルを作る。
- DHBA 人工尿を二次在庫を 100 ng/mL 実験的なソリューションを取得する 10 倍希釈します。
- 5.1.1, から検体ソリューションのすべてを手順 3 (PFSPE 抽出手順) に従って前処理します。ステップ 3 のように、各対応する溶出液 20 μ L を HPLC クロマト グラムを得るためには、高速液体クロマトグラフィー ECD システムに注入します。
- 濃度の比に対して Y 軸としてピーク面積 (ターゲット/IS) の比をプロットすることによって 5 つの analytes の較正曲線を構築 (ターゲット/IS) X 軸として補足の図 1に示すように。
-
感度の値 LOD と LOQ
- サンプルの HPLC クロマト グラムを取得する (ステップ 3) のように HPLC-ECD システムに空の人工尿の 20 μ L を注入します。
- 5.2.1 からクロマト グラムの 11 の空信号値を収集し、b平均値 X および標準偏差 Sbを計算します。L X とL、X の信頼の特定のレベルで検出することができます物質の最小の信号を計算する X =b+ K * Sb (K は、信頼レベルによって決定係数、Sbの騒音レベルを反映して、測定法と機械騒音レベル)。したがって、LOD = (XLXb)/S = (K * Sb)/S (S 作業曲線の勾配値の略)。
- 3:1 (K = 3) 検出 (LOD) の制限としての S/N と S/N 10:1 (K = 10) 数量 (LOQ) の制限として定義します。
-
回収率を評価します。
- 現実とスパイクの尿サンプルを準備します。3 つの濃度を実際の尿が付いている二次検体在庫を希釈 (5、50、100 ng/mL) スパイクの尿サンプルを入手します。各試料のソリューションの 3 つの並列の例を準備します。尿サンプルにスパイク対象化合物の量とスパイクの濃度をカウントします。Sとしてこの値を定義します。
- 100 ng/ml、5.1.2 の手順と DHBA 株式を希釈します。
- ステップ 3 に従って 5.3.1 からそれぞれのサンプルのソリューション (PFSPE 抽出手順) を処理し、クロマト グラムの結果を得るため HPLC-ECD システムにそれぞれ対応する溶離液 20 μ L を注入します。分析値は、スパイクの尿サンプルの対象化合物の量としてカウントされます。Tとしてこの値を定義します。
- クロマト グラムの結果を取得する (ステップ 3) のように HPLC-ECD システムに尿サンプルの 20 μ L を注入します。分析値は、尿サンプルのターゲット化合物の初期量としてカウントされます。私としては、この値を定義します。
- 標準曲線の方程式から試料中の対象物質の量を計算します。割合回復方法論的回復 % と推定される (t - Aは私) = × 100/(s)。平均値は表 1のとおりです。
-
不確かさ評価します。
- 5、50、およびステップ 5.3.1 のように 100 ng/mL の濃度にスパイク人工尿を準備します。ソリューションごとに検体 6 並列サンプルを準備します。毎日新鮮な試料を準備します。
- 5.1.2 のステップのように 100 ng/mL に DHBA ストックを希釈します。
- 日中精度の評価 (n = 6)。5.4.1 ステップ 3 によると、各サンプル ソリューションを処理し、クロマト グラムを得るためには、高速液体クロマトグラフィー ECD システムに各特派員の溶離液 20 μ L を注入します。同じ日に 6 回同じ操作を行います。
- 標準曲線の方程式から試料中の対象物質の量を計算します。同じ化合物の同じ濃度、1 日で六つの試金の相対標準偏差 (RSD) は、日中精度で決まります。平均値は表 1のとおりです。
- 間日精度の評価 (n = 6)。同時に六つの連続した日の毎日、5、50、100 の 3 つの濃度のスパイク人工尿を準備 ng/mL、5.4.1 と 5.4.2。、および手順 3 に従って各試料溶液を処理。
- 毎日クロマト グラムの結果を得るため HPLC-ECD システムに 5.4.5 各対応する溶出液 20 μ L を注入します。標準曲線の方程式から試料中の対象物質の量を計算します。間日精度は、六つの連続した日の 3 つの濃度でスパイク人工尿サンプルからの試金量の RSD によって表されます。平均値は表 1のとおりです。
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Representative Results
このプロトコルは、尿サンプルを前処理し、HPLC-ECD システムを介して検出のための 5 つのカテコールアミンを豊かに簡便な PFSPE 法プロセスの図を図 1に示します。プロトコルは、主に 4 ステップ活性化、読み込み、洗浄、および溶出 - PCE PS ナノファイバーと単純な固相抽出装置の少量と相まって含まれています。PCE PS ナノファイバーの形態は表面および気孔率アナライザーを使用して評価された (材料の表を参照してください)。テクスチャのプロパティの賭け (プラス、エメットとテラー) 表面積、細孔容積と細孔径-2.8297 m2 g-1、0.009 cm3 g-112.76 され、nm、それぞれ。これらのデータは、プロトコルで使用される材料では、高吸着効率とプロトコルで下げられたバインディング pH に貢献するかもしれない表面のナノスケール細孔を示します。
このプロトコルを使用して、最適化されたボリューム、食材サンプル、浸出水、溶離液、等、および作業 pH、手順中に消費時間。陳ら、溶離液 12.0 M 酢酸溶液を酸性条件がプロトン化になる吸着剤に原因は、正荷電、CAs34,35の溶出のために好ましいです。本研究では溶離液のレシピは 30% リン酸、15% アセトニ トリルをする調整され、55% 蒸留水します。溶離液の最終 pH 値は 3.0 に調整されました。溶離液の溶媒は、溶出時の酸性の環境でも 12.0 M 酢酸、貧しいピーク出現につながるし、HPLC システムに損傷を与える可能性のあるより多くより緩やかなおきましょう。
動物の識別のため、標準液のピークを持つサンプルのピークの保持時間をクロマト グラムが比較されます。様々 なソリューションからの高速液体クロマトグラフィー ECD クロマト グラムの例を図 2に示します。プロトコルが正常に続いている場合 3 つのカテコールアミン及びその代謝物のクロマトによって取得されなければならない HPLC-ECD 明確な対称的なよく定義されたピークと最小限のバック グラウンド ノイズ、図 2 に示すよう.従来法との比較の商業 PBA カートリッジはコントロールとして選ばれました。図2(、-c)、5 (b) でターゲット ピークが thaosein (c) PFSPE メソッドが PBA カートリッジ方式よりも敏感であることを示すより有意に高かった。また、DOPAC ピークでした PBA 列が DOPAC の抽出が可能でなかったことを示す、PBA カートリッジ抽出結果に表示されません。図 2(d) 任意の前処理や尿サンプルのクロマト グラムは、PCE PS 複合ナノファイバーを使用して抽出図 2(e) ショーなし空白の尿サンプルのクロマト グラムを示しています。図 2(f) も示さない DOPAC 抽出結果に一貫した図 2(c) の PBA の列抽出後尿試料のクロマト グラムを示します。図は、PFSPE メソッドはのみ、効果のよいターゲットを抽出できませんでした、また取り除くことができればほとんどの尿、ターゲット化合物の同定を良好なピークを与える干渉を示します。
統計解析は、3 カテコールアミンおよび 2 つの代謝物の測定が確実にあったことを明らかにした (表 1) を再現します。すべてのターゲット化合物間 1.5 と 100 ng/mL, 良好な直線性 (R2> 0.99)、補助図 1各試料の標準カーブを見つけることができます。カーブと R2値良好な直線性と尿の検体の濃度の計算に適した、特定の線形範囲内で相対性理論、検体があることを示しています。〜 0.54 ng/mL、0.25 (LOD) による検出限界と定量化 (LOQ) の限界 0.83 に 1.81 ng/mL であった。信号対雑音 (S/N) 値は並ぶ 3 です。5 ターゲット化合物の方法論的回復の範囲は、アプリケーションの実際のサンプルに満足した 124.2% (DOPAC) 97.4% (MHPG) からだった。2.7 からは 4.8% (相対標準偏差として表される)、日中精度と間日精密だった 2 8.1%、良好な精度と再現性を表示します。
実際の尿サンプル中のターゲット検出のため 28 ハイリスク児と蘇州市の病院、保育児童学科で 22 の健康な乳児が募集されました。研究に 50 のすべての乳児は男の子だった。6 ヶ月の頃、彼らは 2016 年 9 月で日常の健康チェックに連行されました。すべての尿サンプルは収集され、3.1 と 3.2、プロトコルの手順に従って前処理し、ステップ 3 の残りの部分を使用してサンプルを分析しました。検量線から濃度を求めた。統計的な差異は、分散分析 (ANOVA) によって分析されました。結果は、表 2に見ることができます。カテコールアミン代謝物の 2 つのグループ間の違いを比較し、分析します。P-値表示、カテコールアミン間があったことない高リスクと健康的なグループ間に有意な代謝物 MHPG コンテンツは、これらのグループを渡って異なっていたが (p = 0.001)。ハイリスク児グループは、MHPG 尿 MHPG のレベルがハイリスク児の早期発見のための潜在的なマーカーであることを意味する制御グループ (14.8 ± 3.6 ng/mL の対 1.4 ± 0.2 ng/mL) より高い量を持っていた。
図 3および表 3モノアミン材料を決定するための古典的な定量化方法について説明、操作プロセス、関心の数字が与えられている他のメソッドと比較します。PFSPE メソッドの古典的な方法と比較して、短い期間 (5-10 分)、簡易操作プロセス、有機溶剤、満足のいく方法論的パラメーターを持つより多くの環境配慮のような利点があります。必要な溶離液量が量 (50 μ L) の低い、ターゲット濃縮のステップに蒸発、尿中の対象化合物の検出感度を大きく促進する必要ありません。従来の粒子ベースの SPE に比べると、このメソッドは効率を高めて、準備プロセスを簡素化、感度、選択度、許容できる信頼性と解析時間の短縮します。
図 1: PFSPE 紙およびそのデバイスの形式で手順の概略フローチャートです。Gastight (1) シリンジ、ピペット (2) ヒント、(3) Packed ナノファイバー。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 異なる試料のクロマト グラム。(、) スパイク水サンプル ターゲットと (100 ng/mL) では抽出なし。(b) スパイク水サンプル抽出 PFSPE 法、および (c) による商業フェニルボロン酸 (PBA) カートリッジ。(d) 実際空白尿サンプル抽出なし。(e) 実際の尿サンプルは、PFSPE メソッドによって抽出されました。(f) 実際の尿サンプル商業 PBA カートリッジによって抽出されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 定量法の分析フロー チャート。(a、b)古典的な抽出方法を報告しました。(、) 抽出によって、複雑な DPBA によるアルミナ (b) および (c) 本稿で提案する方法で。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 1: 標準曲線と方程式。5 検体の標準曲線は直線の式を使用して、サンプルの未知検体濃度を計算するために組み立てられます。(、) NE、(b) E、DA (c)、(d) MHPG、DOPAC (e)。この図をダウンロードするここをクリックしてください。
補足図 2: ボロン酸と cis-ジオール グループまたは隣接する 2 つの水酸基のボロネート親和親和性の相互作用します。(A) ボロン酸と複数フォーム 5 員環または 6 員環状エステル - オハイオ州グループの相互作用の模式図。(B) Cis-ジオール グループまたは赤い丸で隣接する 2 つの水酸基を描くボロン酸化合物への 5 つの analytes の主要な反応サイト。この図をダウンロードするここをクリックしてください。
| NE | MHPG | E | は | DOPAC | DA | |
| 線形の範囲 (ng/mL) | 1.5 400 | 1.5 200 | 1.5 100 | 1.5 100 | 1.5 400 | |
| R 二乗値 | 0.9945 | 0.995 | 0.9976 | 0.9902 | 0.9954 | |
| LOD (ng/mL) | 0.323 | 0.322 | 0.313 | 0.657 | 0.249 | 0.543 |
| LOQ (ng/mL) | 1.076 | 1.072 | 1.043 | 2.191 | 0.83 | 1.809 |
| 回復 ± RSD (%)(n=9) | 110.7±2.9 | 97.4±9.1 | 103.9±5.2 | 86.5±7.3 | 124.2±3.1 | 117.3±5.4 |
| 精度 (RSD %)(n = 9) | ||||||
| 内日 | 4.5 | 4 | 2.7 | 4.8 | 3.3 | 4.7 |
| 間日 | 4.1 | 8.1 | 2 | 6.3 | 3.2 | 5.9 |
| ネ、ノルエピネフリン;MHPG、3-メトキシ-4-hydroxyphenylglycol;E、エピネフリン;内部の標準;DOPAC、3、4 - アミン;ダ、ドーパミン。 | ||||||
表 1:3 カテコールアミン及び標準溶液と 2 種の代謝物の定量, 提案プロトコルの解析結果。
| 濃度 (ng mL-1) | コントロールのグループ (22) | 高リスクの乳児グループ (28) | P 値 |
| NE | 7.52±1.34 | 5.56±1.7 | 0.37 |
| MHPG | 1.4±0.2 | 14.8±3.6 | 0.001 |
| E | 24±15.8 | 20.9±5.87 | 0.841 |
| DOPAC | 106.36±30.1 | 72.12±18.07 | 0.312 |
| DA | 55.53±11.9 | 48.12±20.9 | 0.76 |
| P < 0.05 * * * 2 つのグループ間に有意差を示しています | |||
表 2: 3 つのカテコールアミンの健康な幼児と乳児の尿で 2 種の代謝物濃度の比較。結果は統計的に重要性レベルがpの分散分析 (ANOVA) を使用して行った = 0.05 MHPG コンテンツの違いな。平均 ± 標準偏差が表示されます。
| サンプル | 排出される溶剤 (mL) | 試料量 (mL) | 前処理時間 (分) | 線形の範囲 | LOD | 相対回復 (%) | 蒸発と 再溶解します。 |
分析法 |
| 溶剤 | ボリューム | 時間 (分) | 回復 (%) | 溶媒と | ||||
| (mL) | (mL) | 再構成 | ||||||
| 残渣 | ||||||||
| 尿 | 0.5 | 0.05 | 10 | 2.0-200 ng/mL (NE, E、DA) | 0.2 0.5 ng/mL (NE, E、DA) | 88.5 94.5 (NE, E、DA) | 違います | 高速液体クロマトグラフィー ECD (陳ら、2016) |
| 尿 | 19 | 0.7 | - | 47-167 μ g/L (DA) | 166 500 nM (DA) | 98.3 101.1 (DA) | 違います | 高速液体クロマトグラフィー-UV (ピョートル et al, 2016) |
| 尿 | 1.3 | 0.01 | - | 0.5-1250 ng/mL (NE, E、DA、NMN、ミネソタ) | 0.5 2.5 ng/mL (NE, E、DA、NMN、ミネソタ) | 74.1-97.3 (NE, E、DA、NMN、ミネソタ) | 違います | LC ・ MS/MS (Li et al., 2016) |
| 尿および血中 | 20 | 0.05 | 10 | 0.04 2.5 ng/mL (NE, E、DA) | 0.01 0.02 ng/mL (NE, E、DA) | 87.0 97.5 (NE, E、DA) | 違います | 高速液体クロマトグラフィー-UV (ムハンマドら、2016) |
| 尿 | < 0.5 | 0.1 | 5 | 1.5 400 ng/mL (ネ、MHPG、E、DOPAC、DA) | 0.249 0.543 ng/mL (ネ、MHPG、E、DOPAC、DA) | 97.4-124.2 (ネ、MHPG、E、DOPAC、DA) | 違います | この仕事 |
| -、未定義。 PBA フェニルボロン酸 |
||||||||
表 3: モノアミンやその他の前処理に関する研究でこの動作の比較関連トピック、近年。
補足表 1: HPLC-ECD 紙に検体の検出と定量のパラメーターをインストルメントします。この表をダウンロードするにはここをクリックしてください。
補足テーブル 2: 5 検体の標準曲線の準備。この表をダウンロードするにはここをクリックしてください。
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Discussion
本稿で提案された PFSPE メソッドが重要なその速さ、シンプルさと利便性に関して意味のある可能性があります。プロトコルで使用される吸着剤はナノファイバー エレクトロスピニング高表面区域の容積比と高効率で、検体を吸着します。手順だけナノファイバーの数ミリグラムと少量の溶離液の有機溶媒、必要、イオンクロマトグラフィーを集中する蒸発ステップを必要としません。ここでは、検出のための効果的な方法を確立する新しいユーザーを許可する HPLC-ECD ベース プロトコルの詳細な概要と 3 つカテコールアミンおよびその代謝物 (NE, E、ダと MHPG、DOPAC) の 2 つの定量を行いました。
このプロトコルの優位性主に由来する 4 つの重要なステップ、手続き中に図 1に示すように、: 急速な吸着につながるいくつかのミリグラムに吸着剤のサイズを減らすために目的化合物をキャプチャする PCE PS ナノファイバーを使用して/脱離・溶出液 (1); の小さいボリュームを必要とします。(2); その疎水性を改善するために検体との複合体に尿中に DPBA を追加します。分析検体を保持し、(3) の不純物を除去する DPBA を含む溶液でナノファイバーを洗浄(4) の検体の良好な感度と選択性を得るための抽出と分析条件の最適化。
ステップ (1) は、PCE PS の吸着能力の優れた性能のメカニズムが様々 な要因に起因します。ナノファイバーでドープしたクラウン エーテル ポリマーは、水素結合によって本稿でカテコールアミンなどのアミン グループを含むゲスト分子とホストゲスト複合体を形成できます。また、Hongyou 胡らと Jishun 陳らまたホウ酸 B N の相互作用によって化学構造中の窒素原子と結合できることと疎水性骨格をベンゼン環と analytes36,37の他の脂肪族基と対話できることを提案しました。また、脱離プロセス中に B N の相互作用、水素結合、非常に低い ph; 簡単に壊れてしたがって、酸性 pH と eluants は、通常脱離の探査に適しています。さらに、疎水性、イオンを含むいくつかの二次相互作用、水素結合、ボロンの化学薬品および関連化合物36,37,38の間に起こることができるがまた。これらのすべての相互作用材料への analytes の吸着に貢献するかもしれない。
ステップ (2)、追加 DPBA の助けを借りて、PCE PS ナノファイバーが急速に DPBA カテコールアミン錯体に吸着します。ボロネート親和親和性材料糖タンパク、選択的分離とヌクレオシド、糖、糖鎖などの有機化合物の分子認識のための重要な媒体として浮上していることを示した、38にする鎮劉らに。錯形成反応主にホウ酸と cis-ジオール グループ、または 2 つの隣接する水酸基間ボロネート親和親和性の相互作用からフォーム 5、6 員環の環状エステルに示す行われます補足図 2 a.補足図 2 bは、ボロン酸化合物にこの作業で 5 検体の主要な反応場を示しています。周囲が酸性になると、複雑なボロン酸-cis-ジオールが切り離されます。ボロン酸と cis-ジオール グループまたは隣接する 2 つのヒドロキシル グループ間の相互作用は広く比較的強く存在します。
手順 (3) で、検体間で形成される複合体と DPBA ことができますそれらを保持吸着に PCE PS 表面から他の不純物を洗浄しながらターゲットの最高の予約を達成します。手順 (4) で最適な pH が約 9.0 ホウ酸とカテコール化合物39の接合用であることを示すレポートがずっとあります。しかし、陳ら。DPBA カテコールアミンの錯化に最適な pH 値を探検し、pH 値が 6.0 と 7.034,35の間に変更されたとき Ca のコンポジット PS PCE ナノファイバーの吸着性能が最適であることがわかった。劉ら関与ボロネート親和酸化合物、サポート材の構造を空洞と、ナノスケール細孔反応中に形成された B N リガンドとの空間的閉じ込め特にできますも大幅に低いこと、pH を結合させ、結合親和性38。カテコールアミンの構造と同様、PCE PS 構造は-NH グループを完備です。したがって、プロパティと PCE PS (データ代表結果に示すように) として形成され、B N 配位子のナノスケール細孔に貢献するかもしれないプロトコルで下げられたバインディング pH。したがって、このプロトコルで最適な pH 値を中性を大幅に手順を簡素化し、分析検体の劣化を回避することができます。
Catcholamine 決定の主な制限は、生体試料中の濃度は非常に低く、(簡単に酸化);、その構造が安定しました。さらに、メディア中の不純物を取り除くことは困難です。したがって、生体試料中のカテコールアミンの分析、固相抽出による通常の前処理は必要。本稿で提案する PFSPE メソッドは、尿サンプルの分析のための簡単で便利な前濃度を提供します。しかし、実験の際に、実験条件を厳密に制御する必要があります、光暴露を避けることや短縮などの手段によって前処理時間可能な限り。
法の適用は、そのを使用して 3 つのカテコラミンと健康児、ハイリスク児の尿中 2 つの代謝物の濃度を決定によって評価されました。尿 MHPG の 2 つのグループ間に有意差があった。ノルアドレナリン作動性神経の調子、中央および末梢神経系40,41のカテコールアミン代謝活動を反映するように人間の体内で MHPG 量は主に報告インデックスとして以前にまとめたよう 42,、中央東北代謝43の有用なプラズマ/尿マーカー。ハイリスク児さまざまな低酸素性虚血性脳症 (HIE) などの要因によって脳外傷や脳の侮辱、小児神経発達の赤字の別の学位に 。この脳損傷につながる (MHPG 付属) 神経伝達物質放出する体液44,45に。J.W. マースによる報告によると脳、脳脊髄液、プラズマ、MHPG46,47の尿中濃度と有意な相関関係があります。尿中総 (無料 + 共役) MHPG の測定は長い中央ネブラスカの代謝と人間41,48,49周辺 NE 代謝を評価するために使用されています。したがって、健康なものと比較してノルアドレナリン作動性神経トーン ダメージをリスクの高い幼児が持っている、中央におけるカテコールアミン代謝、末梢神経系に影響を与えることを締結する可能性があります。この不一致は、尿 MHPG レベルと神経発達障害との関係にさらなる研究を行う必要がありますを示します。これらの神経伝達物質に関連する疾患を評価するための診療所で使用するための有望な見通しと尿中カテコールアミンの存在の決定のため, 提案手法が使えることが実証されています。
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Disclosures
著者は、この記事で説明の材料に関して、金融機関との利害対立がないことを証明します。
Acknowledgments
本研究は国立科学財団の中国 (No.81172720、号 81673230)、社会開発プログラムの江蘇省科学研究と技術部 (号によって支持されました。BE2016741)、科学技術プロジェクト中国品質監督、検査および検疫 (2015QK055)、子どもの発達と教育省の科学学習の主実験室のプロジェクトを開くプログラムの一般的な管理の東南大学 (CDL-2016-04)。私たちは心から元歌とくれたり、サンプル コレクション人劉平を認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 µL pipette tip | column to contain nanofibers | ||
| PCE-PS nanofibers | material for PFSPE extraction | ||
| steel rod (about 0.5 mm diameter) | fill the nanofibres into the column | ||
| gastight plastic syringe (5 ml) | compress solution into the end of the tip | ||
| methanol | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 67-56-1 | |
| diphenylborinic acid 2-aminoethyl ester(DPBA) | Sigma-Aldrich.Inc | A-106408 | complex reagent |
| norepinephrine(NE) | Sigma-Aldrich.Inc | A-9512 | analyte |
| 3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol(MHPG) | Sigma-Aldrich.Inc | H1377 | analyte |
| epinephrine(E) | Sigma-Aldrich.Inc | 100154-200503 | analyte |
| 3, 4-Dihydroxyphenylacetic acid(DOPAC) | Sigma-Aldrich.Inc | D-9128 | analyte |
| dopamine(DA) | Sigma-Aldrich.Inc | H-8502 | analyte |
| 3, 4-dihydroxybenzylamine hydrobromide(DHBA) | Sigma-Aldrich.Inc | 858781 | interior label |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich.Inc | 75-05-8 | eluriant and mobile phase |
| phosphoric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7664-38-2 | eluriant |
| uric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 69-93-2 | artifical urine |
| creatinine | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 60-27-5 | artifical urine |
| trisodium citrate | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 6132-04-3 | artifical urine |
| KCl | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7447-40-7 | artifical urine |
| NH4Cl | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 12125-02-9 | artifical urine |
| NaHCO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | SWC0140326 | artifical urine |
| C2Na2O4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 62-76-0 | artifical urine |
| NaSO4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7757-82-6 | artifical urine |
| disodium hydrogen phosphate | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10039-32-4 | artifical urine |
| urea | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 57-13-6 | artifical urine |
| NaCl | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7647-14-5 | artifical urine |
| MgSO4.7H2O | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10034-99-8 | artifical urine |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10035-04-8 | artifical urine |
| HCl | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7647-01-0 | artifical urine |
| citric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 77-92-9 | artifical urine and mobile phase |
| EDTA disodium salt | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 34124-14-6 | mobile phase |
| monometallic sodium orthophosphate | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7558-80-7 | artifical urine and mobile phase |
| 1-heptanesulfonic acid sodium salt | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 22767-50-6 | mobile phase |
| sodium hydroxide | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 1310-73-2 | mobile phase |
| phenylboronic acid column(PBA column) | Aglilent | 12102018 | PBA extraction |
| Inertsil® ODS-3 5 µm 4.6×150 mm column | Dikma | 5020-06731 | HPLC column for seperation |
| SHIMADZU SIL-20AC prominence AUTO SAMPLER | Shimadzu Corporation, Japan | SIL-20AC | auto injection for eluriant |
| SHIMADZU LC-20AD High Performance Liquid Chromatography | Shimadzu Corporation, Japan | LC-20AD | HPLC pump |
| SHIMADZU L-ECD-60A electrochemical detector | Shimadzu Corporation, Japan | L-ECD-60A | detector for the analytes |
| ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry System | Micromeritics, USA | surface and porosity analyzer |
References
- Elhwuegi, A. S. Central monoamines and their role in major depression. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 28, 435-451 (2004).
- Da, C. F., Ngoabdalla, S., Houzel, J. C., Rehen, S. K. Murine model for Parkinsons disease: From 6-OH dopamine lesion to behavioral test. J. Vis. Exp. (35), e1376 (2010).
- Varley, H., Gowenlock, A. H. The clinical chemistry of monoamines. Brit. Med. J. 2, 1330 (1963).
- Wang, X., Rousset, C. I., Hagberg, H., Mallard, C. Lipopolysaccharide-induced inflammation and perinatal brain injury. Semin. Fetal. Neonatal. Med. 11, 343-353 (2006).
- Inder, T. E., Volpe, J. J. Mechanisms of perinatal brain injury. Semin. Neonatol. 5, 3-16 (2000).
- Miller, S. P., Ferriero, D. M. From selective vulnerability to connectivity: Insights from newborn brain imaging. Trends. Neurosci. 32, 496-505 (2009).
- Barkovich, A. J., et al. Proton MR spectroscopy for the evaluation of brain injury in asphyxiated, term neonates. Am. J. Neuroradiol. 20, 1399-1405 (1999).
- Liauw, L., van Wezel-Meijler, G., Veen, S., van Buchem, M. A., van der Grond, J. Do apparent diffusion coefficient measurements predict outcome in children with neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy? Am. J. Neuroradiol. 30, 264-270 (2009).
- Varsami, M., et al. Inflammation and oxidative stress biomarkers in neonatal brain hypoxia and prediction of adverse neurological outcome: A review. J. Pediatr. Neonat. Individual. Med. 2, e020203 (2013).
- Cooper, R. L., Walker, R. F. Microradioenzymic assays for the measurement of catecholamines and serotonin. Methods. Enzymol. 103, 483-493 (1983).
- Murphy, J. F. The development of enzyme linked immunosorbent assays (ELISA) for the catecholamines adrenaline and noradrenaline. J. Immunol. Methods. 154, 89-98 (1992).
- Jones, S. R., Mickelson, G. E., Collins, L. B., Kawagoe, K. T., Wightman, R. M. Interference by pH and Ca2+ ions during measurements of catecholamine release in slices of rat amygdala with fast-scan cyclic voltammetry. J. Neurosci. Methods. 52, 1-10 (1994).
- Sanchismallols, J. M., Villanuevacamañas, R. M., Ramisramos, G. Determination of unconjugated catecholamine in urine as dopamine by thermal lens spectrometry. Analyst. 117, 1367-1371 (1992).
- Lan, C., Liu, W. Determination of catecholamines by HPLC-ECD in urine. Medical Laboratory Science and Clinics. , (2007).
- Tsunoda, M., Aoyama, C., Ota, S., Tamura, T., Funatsu, T. Extraction of catecholamines from urine using a monolithic silica disk-packed spin column and high-performance liquid chromatography-electrochemical detection. Anal. Methods. 3, 582-585 (2011).
- Bartolini, B., et al. Determination of monoamine oxidase activity by HPLC with fluorimetric detection. Neurobiology (Bp). 7, 109-121 (1999).
- Dunand, M., Gubian, D., Stauffer, M., Abid, K., Grouzmann, E. High throughput and sensitive quantitation of plasma catecholamines by ultraperformance liquid chromatography tandem mass spectrometryusing a solid phase microwell extraction plate. Anal. Chem. 85, 3539-3544 (2013).
- He, H., Carballo-Jane, E., Tong, X., Cohen, L. H. Measurement of catecholamines in rat and mini-pig plasma and urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry coupled with solid phase extraction. J. Chromatogr. B. 997, 154-161 (2015).
- Simon, N., Young, P. How to increase serotonin in the human brain without drugs. J. Psychiatry. Neurosci. 32, 394-399 (2007).
- Grossi, G., et al. Improvements in automated analysis of catecholamine and related metabolites in biological samples by column-switching high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 541, 273-284 (1991).
- Iwamot, T., Yoshiura, M., Iriyama, K. Liquid chromatographic identification of urinary catecholamine metabolites adsorbed on alumina. J. Liq. Chromatogr. R. T. 10, 1217-1235 (1987).
- Maycock, P. F., Frayn, K. N. Use of alumina columns to prepare plasma samples for liquid-chromatographic determination of catecholamines. Clin. Chem. 33, 286-287 (1987).
- Grossi, G., Bargossi, A., Lippi, A., Battistoni, R. A fully automated catecholamines analyzer based on cartridge extraction and HPLC separation. Chromatographia. 24, 842-846 (1987).
- Rondelli, I., et al. New method for the resolution of the enantiomers of 5,6-dihydroxy-2-methyl-aminotetralin by selective derivatization and HPLC analysis: Application to biological fluids. Chirality. 8, 381-389 (1996).
- Kumar, A., Hart, J. P., McCalley, D. V. Determination of catecholamines in urine using hydrophilic interaction chromatography with electrochemical detection. J. Chromatogr. A. 1218, 3854-3861 (2011).
- Sabbioni, C., et al. Simultaneous liquid chromatographic analysis of catecholamines and 4-hydroxy-3-methoxyphenylethylene glycol in human plasma: Comparison of amperometric and coulometric detection. J. Chromatogr. A. 1032, 65-71 (2004).
- Lee, M., et al. Selective solid-phase extraction of catecholamines by the chemically modified polymeric adsorbents with crown ether. J. Chromatogr. A. 1160, 340-344 (2007).
- He, H., et al. Facile synthesis of a boronate affinity sorbent from mesoporous nanomagnetic polyhedral oligomeric silsesquioxanes composite and its application for enrichment of catecholamines in human urine. Anal. Chim. Acta. 944, 1-13 (2016).
- Subbiah, T., Bhat, G. S., Tock, R. W., Parameswaran, S., Ramkumar, S. S. Electrospinning of nanofibers. J. Appl. Polym. Sci. 96, 557-569 (2005).
- Hu, W. Y., et al. Packed-fiber solid-phase extraction coupled with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry for determination of diethylstilbestrol, hexestrol, and diedestrol residues in milk. J. Chromatogr. B. 957, 7-13 (2014).
- Liu, Z., Kang, X., Fang, F. Solid phase extraction with electrospun nanofibers for determination of retinol and α-tocopherol in plasma. Microchim. Acta. 168, 59-64 (2010).
- Qi, D., Kang, X., Chen, L., Zhang, Y., Wei, H., Gu, Z. Electrospun polymer nanofibers as a solid-phase extraction sorbent for the determination of trace pollutants in environmental water. Anal. Bioanal. Chem. 390, 929-938 (2008).
- Kang, X. J., Chen, L. Q., Zhang, Y. Y., Liu, Y. W., Gu, Z. Z. Performance of electrospun nanofibers for SPE of drugs from aqueous solutions. J. Sep. Sci. 31, 3272-3278 (2008).
- Chen, L. Q., Wang, Y., Qu, J. S., Deng, J. J., Kang, X. J. Selective extraction of catecholamines by packed fiber solid-phase using composite nanofibers composing of polymeric crown ether with polystyrene. Biomed. Chromatogr. 29, 103-109 (2015).
- Chen, L. Q., Zhu, X. H., Shen, J., Zhang, W. Q. Selective solid-phase extraction of catecholamines from plasma using nanofibers doped with crown ether and their quantitation by HPLC with electrochemical detection. Anal. Bioanal. Chem. 408, 4987-4994 (2016).
- Hu, H., Zhang, Y., Zhang, Y., Huang, X., Yuan, D. Preparation of a new sorbent based on boronate affinity monolith and evaluation of its extraction performance for nitrogen-containing pollutants. J. Chromatogr. A. 1342, 8-15 (2014).
- Chen, J., et al. Sensitive determination of four camptothecins bysolid-phase microextraction-HPLC based on a boronic acid contained polymer monolithic layer. Anal. Chim. Acta. 879, 41-47 (2015).
- Li, D., Chen, Y., Liu, Z. Boronate affinity materials for separation and molecular recognition: structure, properties and applications. Chem. Soc. Rev. 44, 8097-8123 (2015).
- Yan, J., Springsteen, G., Deeter, S., Wang, B. The relationship among pKa, pH, and binding constants in the interactions between boronic acids and diols: It is not as simple as it appears. Tetrahedron. 60, 11205-11209 (2004).
- Reuster, T., Rilke, O., Oehler, J. High correlation between salivary MHPG and CSF MHPG. Psychopharmacology. 162, 415-418 (2002).
- Beckmann, H., Goodwin, F. K. Urinary MHPG in subgroups of depressed patients and normal controls. Neuropsychobiology. 6, 91-100 (1980).
- Mitoma, M., et al. Stress at work alters serum brain-derived neurotrophic factor (BDNF) levels and plasma 3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) levels in healthy volunteers: BDNF and MHPG as possible biological markers of mental stress? Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 32, 679-685 (2008).
- Ressler, K. J., Nemeroff, C. B. Role of Norepinephrine in the Pathophysiology and Treatment of Mood Disorders. Biol. Psychiatry. 46, 1219-1233 (1999).
- Alonso-Spilsbury, M., et al. Perinatal asphyxia pathophysiology in pig and human: A review. Anim. Reprod. Sci. 90, 1-30 (2005).
- Shalak, L., Perlman, J. M. Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant: Current concepts. Early. Hum. Dev. 80, 125-141 (2004).
- Maas, J. W., Leckman, J. F. relationships between central nervous system noradrenergic function and plasma and urinary MHPG and other norepinephrine metabolites. MHPG: Basic Mechanisms and Psychopathology. , Academic Press. 33-43 (1983).
- Maas, J. W. Relationships between central nervous system noradrenergic function and plasma and urinary concentrations of norepinephrine metabolites. Adv. Biochem. Psychopharmacol. 39, 45-55 (1984).
- Peyrin, L., Pequignot, J. M., Chauplannaz, G., Laurent, B., Aimard, G. Sulfate and glucuronide conjugates of 3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) in urine of depressed patients: Central and peripheral influences. J. Neural. Transm. 63, 255-269 (1985).
- Peyrin, L. Urinary MHPG sulfate as a marker of central norepinephrine metabolism: A commentary. J. Neural. Transm. 80, 51-65 (1990).
