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Chemistry

Un método conveniente para la extracción y análisis con cromatografía líquida de alta presión de los neurotransmisores catecolaminas y sus metabolitos

Published: March 1, 2018 doi: 10.3791/56445
Automatic Translation
1, 3, 4, 1, 2
1School of Public Health of Southeast University, Laboratory of Environment and Biosafety Research Institute of Southeast University in Suzhou, 2Key Laboratory of Child Development and Learning Science (Ministry of Education), School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University, 3School of Public Health, Tianjin Medical University, 4British Columbia Academy, Nanjing Foreign Language School

Summary

Presentamos una cómoda extracción en fase sólida acoplada a cromatografía líquida de alta presión (HPLC) con detección electroquímica (ECD) para la determinación simultánea de los tres neurotransmisores monoamina y dos de sus metabolitos en la orina de los bebés. También identificamos el metabolito MHPG como un potencial biomarcador para el diagnóstico precoz de daño cerebral para los niños.

Abstract

La extracción y análisis de los neurotransmisores catecolaminas en fluidos biológicos es de gran importancia en la evaluación de la función del sistema nervioso y las enfermedades, pero su medida exacta es todavía un reto. Muchos protocolos se han descrito para la medición de neurotransmisores por una variedad de instrumentos, incluyendo la cromatografía líquida de alta presión (HPLC). Sin embargo, existen deficiencias, tales como operación complicada o difícil de detectar múltiples objetivos, que no se puede evitar, y en la actualidad, la técnica de análisis dominante sigue siendo HPLC juntada con sensible electroquímica o fluorimétrica detección, debido a su alta sensibilidad y buena selectividad. Aquí, se describe un protocolo detallado para el pretratamiento y la detección de catecolaminas con cromatografía líquida de alta presión con detección electroquímica (HPLC-ECD) en muestras de orina real de neonatos, mediante electrospun nanofibras compuesto compuesto de éter de corona poliméricos con el poliestireno como adsorbente, también conocido como el método de extracción (PFSPE) de la fase sólida de fibra lleno. Mostramos cómo orina muestras pueden ser precleaned fácilmente por una columna de fase sólida llena de nanofibras, y cómo los analitos en la muestra pueden enriquecerse rápidamente, desorbida y detectado en un sistema ECD. PFSPE simplifica notablemente los procedimientos de pretratamiento para las muestras biológicas, lo que permite disminución de tiempo, costo y reducción de la pérdida de objetivos.

En general, este trabajo ilustra un protocolo simple y conveniente para la extracción en fase sólida acoplada a un sistema de HPLC-ECD para determinación simultánea de los tres neurotransmisores monoamina (norepinefrina (NE), epinefrina (E), dopamina (DA)) y dos de sus metabolitos (3-metoxi-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) y ácido 3, 4-dihydroxy-fenilacético (DOPAC)) en la orina de los bebés. Se aplicó el protocolo establecido para evaluar las diferencias de catecolaminas urinarias y sus metabolitos entre neonatos de alto riesgo con daño cerebral perinatal y controles sanos. Análisis comparativo reveló una diferencia significativa de MHPG urinario entre los dos grupos, indicando que los metabolitos de catecolaminas pueden ser un marcador importante candidato para el diagnóstico precoz de casos en riesgo de daño cerebral en recién nacidos.

Introduction

Neurotransmisores de catecolamina y su contenido de metabolitos en los fluidos corporales puede afectan la función neuronal y afectar el equilibrio de los Estados de la respuesta a estímulo a una gran parte1. Anomalías que puede causar una variedad de enfermedades, tales como pheochromacytoma, ganglioneuroma, neuroblastoma y trastornos neurológicos1,2. La extracción y la determinación de catecolaminas en fluidos corporales es significativo para el diagnóstico de las enfermedades relevantes. Sin embargo, las catecolaminas en muestras biológicas existen en bajas concentraciones y se oxidan fácilmente. Además, son muy difíciles a fin de eluir debido a la gran cantidad de interferencias en el medio3. Por lo tanto, la detección simultánea de catecolaminas en fluidos biológicos es todavía un reto.

Ha habido comentarios demostrando que Catecolaminas urinarias pueden ser una medida de la tensión, y que sus niveles son importantes marcadores biológicos en respuesta a la estimulación táctil en los recién nacidos5. Según la investigación, todos los niños que han sufrido incidentes prematuros están en riesgo de cerebro lesión4,5,6, y lesión puede causar la liberación anormal de catecolaminas y asuntos relacionados a los fluidos. Existen técnicas avanzadas de resonancia magnética que pueden detectar daño cerebral en anteriores fases7,8. Sin embargo, en las primeras 48 h, un proceso de desarrollo neurológico anormal causará lesión cerebral permanente que no será evidente en imágenes médicas11. Además, los recursos de alto costo y escaso instrumento, junto con otros factores, hace imposible para todas las unidades neonatales tener acceso a estas técnicas de neuroimagen especializadas. Sin embargo, el uso de un biomarcador fácilmente accesible y práctico (como las catecolaminas y sus metabolitos) puede superar estas deficiencias, y la proyección de un biomarcador en los fluidos humanos puede ayudar en el diagnóstico precoz de la lesión cerebral y conducir a identificación de los bebés recién nacidos que necesitan neuroprotección9. Las catecolaminas en la orina pueden ser un índice fácil y obvio, debido a la correlación directa entre la cantidad de ellos liberados en líquidos y la función de neuroactivity.

Entre los fluidos biológicos, muestras de plasma y líquido cefalorraquídeo (LCR) no son fáciles de conseguir a través de los procedimientos traumáticos, y también es muy difícil deshacerse de interferencia debido a la proteína adhesiva y otras impurezas, conduciendo a una problemática y proceso desperdiciador de tiempo de muestreo que es inadecuado para la detección repetida. También, para los niños, es casi imposible obtener las muestras de manera traumática. Por lo tanto, muestra urinaria es mejor que las otras formas de muestreo, ya que es no invasivo, fácil de manejar y puede hacerse varias veces. Las muestras de orina son abundantes y fáciles de almacenar y mostrar grandes ventajas sobre las otras formas de muestras biológicas.

Los métodos principales para cuantificar las catecolaminas en fluidos biológicos son radioenzymic ensayos10, ensayos inmune absorbente ligado a enzima11, voltametría12 y lente termal espectrometría13. Pero existen deficiencias, tales como operaciones complicadas y difíciles de detectar múltiples objetivos. Hoy en día, la técnica de análisis dominante es cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)14, juntada con sensibles electroquímico15 o fluorimétrica detección16, debido a su alta sensibilidad y buena selectividad. Con la tecnología de espectrometría de masas tándem, como la cromatografía líquida/espectrometría de masas (LC/MS) y cromatografía de líquidos/masas espectrometría/espectrometría de masas (LC/MS/MS), el análisis y cuantificación de los neurotransmisores pueden alcanzar altos exactitud y especificidad17,18. Sin embargo, la técnica MS requiere costosa instrumentación así como mano de obra calificada considerablemente, dificultando el método a aplicarse universalmente en los laboratorios más convencionales. Sistemas de HPLC-ECD se equipan comúnmente en laboratorios clínicos y más convencionales y así se han convertido en una común y buena opción para grupos de investigación a utilizar para la determinación química, pero requieren la muestra introducida en el sistema de limpia y de microescala volumen19. Por lo tanto, es de gran importancia para purificar y condensar la muestra antes del análisis. El método clásico para el paso de la purificación es la extracción líquido-líquido14,15,20 y extracción en fase sólida off-line, incluyendo columna de alúmina activada21,22 y diphenylborate (DPBA) complejación23,24,25,26.

Myeongho Lee et al. han estado utilizando resina de polímero modificada químicamente con éter de corona como adsorbente para extraer selectivamente las catecolaminas de la orina humana desde 200727. También, en 2006, Haibo He et al. demostró un enfoque de síntesis fácil de boronate afinidad extracción solvente byutilizing un compuesto de base nanomagnetic nanomagnetic functionalizable silsesquioxane oligoméricos poliédricos (POSS) y aplicarlo en el enriquecimiento de catecolaminas en orina humana (noradrenalina y epinefrina, isoprenalina)28. También se aprovechó de los nanomateriales para cumplir con el trabajo, utilizando una tecnología llamada nano-electrospinning y formando el material fibroso del polímero en la nanoescala. El proceso de centrifugado eléctrico puede ajustar el diámetro, morfología y alineación espacial del producto controlando la tensión de trabajo y cambiar el contenido de la solución de hilatura junto con otros parámetros29. En comparación con el cartucho SPE convencional, nanofibras electrospun son altamente convenientes extraer y enriquecer analitos de una matriz compleja, ya que cuentan con alta relación superficie-área-volumen para los analitos con alta eficiencia, y exhiben más fácilmente controlado superficie propiedades químicas, permitiendo que el práctico accesorio de los compuestos objetivo. Estas propiedades hacen buenas opciones para adsorbentes SPE, reducción de la fase sólida y la desorción de solvente cantidad30,31,32,33. De catecolaminas en orina, nanofibras electrospun compuestos de éter de corona apolymeric con poliestireno (PCE-PS) se utilizan para extraer selectivamente tres catecolaminas (NE, E y DA)34. El documento indica que el éter corona selectivo adsorbe los objetivos de la NE, E y DA, que se basó en su geometría correcta para atar las catecolaminas a través de la formación de enlaces de hidrógeno. Los resultados muestran el material éter corona eficazmente, eliminar otros compuestos interferentes en las muestras biológicas. Inspirado en este informe, un nuevo método fue desarrollado para la extracción selectiva de las catecolaminas por uso de nanofibras compuesto electrospun compuesto por PCE-PS.

En este trabajo, el método divulgado previamente34 fue mejorado y se emplea no sólo para analizar con éxito E, NE y DA, sino también sus metabolitos, MHPG y DOPAC, en orina. También exploramos nuevas posibilidades para el mecanismo del proceso de adsorción. El método muestra satisfactoria eficiencia de extracción y selectividad para los cinco analitos, y el método se verificó en el análisis de orina de bebés en alto riesgo con daño cerebral perinatal y controles sanos.

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Protocol

Se obtuvo consentimiento informado de los padres, y se obtuvo la aprobación de la Junta de revisión institucional para el estudio. El estudio se realizó según el código de ética de la Asociación Médica Mundial (declaración de Helsinki) para experimentos con seres humanos. Cuidadores de todos los participantes siempre consentimiento para ser incluidos en el estudio. Aprobación del Comité ético del Hospital Zhongda, afiliado con la Universidad del sureste, también se obtuvo.

1. preparación de las soluciones necesarias para la extracción y la determinación de catecolaminas y columnas

  1. Preparar la columna PFSPE. 1-2 mg de nanofibras PCE-PS se dividen en alícuotas de 5 y 6 y utilizar una varilla fina de acero de 0,5 mm de diámetro para comprimirlos ordenada en el extremo de una punta de pipeta con un volumen de 200 μl.
  2. Preparar la orina artificial pesando urea 2,427 g 0,034 g el ácido úrico, creatinina 0,09 g, citrato trisódico 0,297 g, 0,634 g de cloruro de sodio, 0,45 g de cloruro de potasio, 0,161 g de cloruro de amonio, 0,089 g cloruro de calcio dihidratado, sulfato de magnesio 0,1 g heptahidratado, g 0,034 bicarbonato de sodio, oxalato de sodio 0,003 g, 0,258 g sulfato de sodio, dihidrogenofosfato de sodio 0,1 g y fosfato de hidrógeno disódico 0,011 g y disolver los productos químicos arriba en 200 mL desionizada agua.
  3. Prepare 2 mg/mL solución de diphenylborate (DPBA) solución disolviendo 2 mg del compuesto en 1 mL de agua destilada. Almacenar la solución en la oscuridad a 4 ° C.
  4. Estándar del analito
    Nota: La estructura química y propiedades de las catecolaminas son inestables y se descomponen fácilmente. El proceso de preparación de las normas tiene que ser muy rápido y debe evitar la exposición a luz solar directa.
    1. Pesar 1,0 mg de NE, E, DA, MHPG, DOPAC y estándar interno 3, 4-dihydroxybenzylamine bromhidrato DHBA en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL separadas. Diluir la solución DHBA en agua a 100 ng/mL antes de su uso.
    2. Oscilan los estándares dispuestos en la oscuridad a una velocidad alta hasta que los analitos se disuelven completamente. Esta es la acción principal; almacenar a-20 ° C por hasta varias semanas.
    3. Preparar a las poblaciones de analito secundario de 1.000 ng/mL. NE, E, DA, DOPAC y MHPG, transferir 5 μl de cada analito principal población a 4.975 μl de agua destilada en un tubo de centrífuga 5 mL y almacenar en la oscuridad a 4 ° C hasta su uso. Preparar diariamente de estas soluciones. Para DHBA, transfiera 5 μl de caldo primario en 4.995 μl de agua destilada en un tubo de centrífuga 5 mL y almacenar en la oscuridad por separado a 4 ° C.
    4. Hacer más diluciones con el stock de analito secundaria para crear una curva estándar (por ej., tabla 2 suplementaria). Almacene las soluciones en la oscuridad a 4 ° C y preparar todos los días.
    5. Prueba de la tensión óptima de detector ECD con los valores estándar de concentración adecuada. Variar el voltaje para encontrar un valor donde los analitos tienen el mejor aspecto de pico.
  5. Preparar el eluant con ácido fosfórico al 30%, 15% acetonitrilo, y 55% agua destilada. Para 10 mL de disolvente eluant, utilizar 5,5 mL de agua destilada y añadir 1.5 mL de acetonitrilo y 3 mL de ácido fosfórico gota a gota en el agua.

2. preparación de las muestras de orina Real y fase móvil

  1. Tienen las madres recoger la primera orina de la mañana de sus hijos usando tazas de orina aséptica. Transferir las muestras en tubos de polipropileno y etiqueta inmediatamente. A continuación, almacenar las muestras en un congelador de-20 ° C.
  2. Vortex y centrifugar las muestras urinarias en 1.510 x g durante 10 min a la temperatura (RT) para eliminar interferencias de partículas más ambiente. Deseche el sedimento y se reúnen los sobrenadantes para experimentos adicionales. Para extraer analitos con eficacia, proceder al tratamiento previo de PFSPE (paso 3) inmediatamente después de la centrifugación.
  3. Preparar la fase móvil
    1. Preparar una botella limpia, por lo menos 1 L. La composición de la fase móvil aparece en complementario tabla 1; para la fase móvil de 1 L, medida 6,7242 g de ácido cítrico, 93,06 mg de sal disódica del etileno diamina tetra acético (EDTA), 7,02 g de ortofosfato de sodio monometálicas, 404,5 mg de sal de sodio del ácido 1-heptanesulfonic y 3,5 g de sodio hidratan en la botella. Añadir 40 mL acetonitrilo y agua destilada agua a 1000 mL. Agita y vibra ultrasónicamente durante 15 min hasta que se disuelva la materia en la solución.
    2. Utilizando un medidor de pH con un electrodo de vidrio, ajustar el pH de la fase móvil a la 4.21 con una solución saturada de hidróxido de sodio.
    3. La fase móvil con un 0.45 μm del polivinilideno membrana microporosa fluoruro y un dispositivo de succión de vacío para eliminar las impurezas del filtro.
    4. Utiliza vibración ultrasónica durante 15 min a desgasificar la fase móvil cada vez que lo use.

3. PFSPE extracción y análisis de HPLC

  1. Activar las nanofibras. Prensa 100 μl de metanol y 100 μl de agua secuencialmente a la columna PFSPE utilizando una jeringa de 5 mL de forma lenta, gota a gota.
  2. Mezclar 100 μl de orina de la muestra con 100 μl de DPBA 2 mg/ml de la solución y 30 μL 100 ng/ml de solución DHBA (si, estándar interno) en un tubo 0,5 mL EP, luego transferir la solución mezclada a la columna PFSPE. Presione la solución mezclada a través de la columna PFSPE con una jeringa de plástico hermético de 5 mL usando la fuerza de la presión de aire.
  3. Lixiviación a la columna tres veces por la carga de 100 μl de solución DPBA (2 mg/mL) en la columna SPE y empuje la solución lentamente a través del cartucho con presión de aire con una jeringa de 5 mL de plástico hermético.
  4. 50 μl del eluant en la columna PFSPE de carga y empuje a través de la columna, que recoge el efluente con un tubo de 0,5 mL EP.
  5. Encienda el desgaseador de HPLC para desgasificar el aire en el sistema. Antes del análisis de las muestras, el sistema debe funcionar durante más de 0,5 h con la fase móvil para equilibrar y reducir el ruido de línea de base. Ver complementarios tabla 1 muestra los parámetros de configuración del sistema HPLC.
  6. Muestra de 20 μl de eluido con un muestreador automático y luego lo inyectan en el sistema HPLC-ECD.
  7. Una vez terminadas las carreras, apagar la celda del detector mediante la interfaz del detector. NO apague el celular con el interruptor en la parte posterior del detector, ya que podría dañar el instrumento.
  8. Cambiar manualmente la composición de la fase móvil a 10% de metanol y el 90% de agua. Duración de al menos 30 minutos. A continuación, cambiar manualmente la fase móvil metanol grado HPLC. Funcionar durante aproximadamente 15 minutos proteger el sistema en metanol. Para ejecutar este paso después del tiempo en marcha recomendado podría resultar en daños a la columna y el detector. Apague el flujo, luego apague el desgasificador.

4. ácido de Phenylboronic extracción de cartuchos (PBA)

PBA cartucho extracción procedimientos eran similares al esquema en Kumar et al. (2011) 25. todas las soluciones son empujadas a través del cartucho de la PBA (100 mg, 1 mL) con aire forzado por una jeringa.

  1. La condición del cartucho con 1 mL 80: 20 acetonitrilo-agua (v/v) que contiene 1% de ácido fórmico y 1 mL de 50 mM de tampón fosfato (pH 10) secuencialmente.
  2. Presione la muestra de orina tamponada (1 mL de orina y 2 mL de tampón fosfato, pH 8,5) a través del cartucho de la PBA.
  3. Lavar el cartucho con 1 mL 50: 50 v/v acetonitrilo-tampón de fosfato (10 mM, pH 8,5).
  4. Procederá a la elución del cartucho con 1 mL de acetonitrilo-agua (80: 20 v/v) que contiene 1% de ácido fórmico.

5. identificación y cuantificación de catecolaminas

  1. Linealidad de
    1. Diluir la acción secundaria de analitos con orina artificial a seis concentraciones (1.5, 3, 12, 25, 50 y 100 ng/mL); el volumen de dilución de la orina artificial sigue complementario tabla 2. Hacer tres muestras paralelas con cada concentración para obtener 18 analitos soluciones experimentales para construir curvas de calibración.
    2. Diluir 10 veces acción secundaria DHBA con orina artificial a 100 ng/mL de la solución experimental.
    3. Prepare todas las soluciones del analito de 5.1.1, según el paso 3 (procedimientos de extracción de PFSPE). Como en el paso 3, inyectar 20 μl de cada efluente correspondiente en el sistema HPLC-dpi para obtener un cromatograma HPLC.
    4. Construir curvas de calibración de los cinco analitos trazando la proporción del área pico (objetivos/es) como el eje Y contra la relación de concentraciones (objetivos/es) como el eje X, como se muestra en la figura 1 complementaria.
  2. LOD y LOQ el valor de la sensibilidad
    1. Inyectar 20 μl de orina artificial en blanco en el sistema HPLC-ECD (como en el paso 3), para obtener el cromatograma HPLC de la muestra.
    2. En el cromatograma de 5.2.1, recoger 11 valores de señal en blanco y calcular el valor medio Xb ybde la desviación estándar S. Calcular la mínima señal de una sustancia que puede detectarse un cierto nivel de confianza, XL, como XL = Xb+ K * Sb (K es el coeficiente determinado por el nivel de confianza, Sb refleja el nivel de ruido de la método de medición y el nivel de ruido de la máquina). Por lo tanto, LOD = (XL-Xb) / s = (K * Sb) / s (S está parado para el valor de la pendiente de la curva de trabajo).
    3. Definir un número de 3:1 (K = 3) como el límite de detección (LOD) y un número de 10:1 (K = 10) como el límite de cuantificación (LOQ).
  3. Evaluar las recuperaciones
    1. Preparar las muestras de orina real y pinchos. Diluir la acción secundaria de analitos con orina real a tres concentraciones (5, 50, 100 ng/mL) para obtener las muestras de orina con picos. Preparar tres muestras paralelas para cada solución del analito. Cuenta la concentración con picos como la cantidad de compuestos de la blanco tacon en la muestra de orina. Definir este valor como unas.
    2. Stock DHBA diluida a 100 ng/mL, como en el paso 5.1.2.
    3. Proceso de cada solución de la muestra de 5.3.1 según el paso 3 (procedimientos de extracción de PFSPE) e inyectar 20 μl de cada eluant correspondiente en el sistema HPLC-dpi para obtener el resultado del cromatograma. El valor de los analitos se contará como una cantidad de compuestos de target en la muestra de orina con picos. Definir este valor como unat.
    4. Inyectar 20 μl de muestra de orina en el sistema HPLC-ECD (como en el paso 3) para obtener el resultado del cromatograma. El valor de los analitos se contará como una cantidad inicial de blanco compuestos de cuantificado en la muestra de orina. Definir este valor como unyo.
    5. Calcular la cantidad de compuestos de la blanco en las muestras de la ecuación de la curva estándar. El porcentaje de recuperación se estima como metodológico recuperación % = (t - A) × 100 / (unas). Valores se muestran en la tabla 1.
  4. Evaluar la imprecisión
    1. Preparar las muestras de orina artificial con picos de 5, 50 y 100 concentraciones de ng/mL como en el paso 5.3.1. Preparar seis muestras paralelas para cada solución del analito. Preparar muestras experimentales frescas todos los días.
    2. Diluir el caldo DHBA a 100 ng/mL como en el paso 5.1.2.
    3. Evaluar la precisión intra-día (n = 6). Cada solución de la muestra en 5.4.1 según el paso 3 del proceso e inyectar 20 μl de cada corresponsal eluant en el sistema de HPLC-DIT para el cromatograma. Hacer la misma operación seis veces en el mismo día.
    4. Calcular la cantidad de compuestos de la blanco en las muestras de la ecuación de la curva estándar. Bajo la misma concentración del mismo compuesto, se determina la desviación estándar relativa (RSD) de los seis ensayos en un día como precisión intra-día. Valores se muestran en la tabla 1.
    5. Evaluar la precisión (n = 6). Al mismo tiempo cada día en los seis días alternativamente, preparar las muestras de orina artificial con picos para tres concentraciones de 5, 50 y 100 ng/mL, como en 5.4.1 y 5.4.2. y cada solución de analito de la muestra según el paso 3 del proceso.
    6. Inyectar 20 μl de cada efluente correspondiente de 5.4.5 en el sistema HPLC-dpi para obtener resultados de cromatograma cada día. Calcular la cantidad de compuestos de la blanco en las muestras de la ecuación de la curva estándar. Precisión interdía se expresa por el RSD de la cantidad de ensayos de las muestras de orina artificial con picos en las tres concentraciones en seis días alternativamente. Valores se muestran en la tabla 1.

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Representative Results

Este protocolo es un método simple y conveniente de PFSPE pretratar las muestras de orina y enriquecer las cinco catecolaminas para la detección mediante el sistema de HPLC-ECD; en la figura 1muestra un diagrama del proceso. El protocolo incluye principalmente cuatro pasos activación, carga, enjuague y liberador - junto con una pequeña cantidad de nanofibras PCE-PS y un dispositivo de extracción en fase sólida simple. La morfología de nanofibras PCE-PS se evaluó mediante un analizador de superficie y porosidad (véase Tabla de materiales). La apuesta la propiedades textural (Brunauer, Emmett y Teller) zona, volumen de poro y tamaño de los poros de la superficie-fueron de 2,8297 m2 g-1, cm 0,0093 g-1y 12.76 nm, respectivamente. Estos datos indican que el material utilizado en el protocolo tiene poros de nanoescala en la superficie, que puede contribuir a la eficiencia de adsorción alta y el pH baja obligatoria en el protocolo.

Este protocolo utiliza volúmenes optimizados, muestra ingredientes, lixiviados, eluant, etc., así como pH de trabajo y tiempo consumido durante los procedimientos. En Chen et al., el eluant fue una solución de ácido acético de 12,0 M debido a las condiciones ácidas causan el adsorbente a ser protonada y cargado positivamente, que es favorable para la elución de CAs34,35. En este estudio, la receta del eluant fue reacondicionada para ser ácido fosfórico al 30%, 15% acetonitrilo, y 55% agua destilada. El pH final del eluant se ajustó a la 3.0. El solvente eluant debe conservarse en un medio ácido al liberador, pero mucho más moderado que el ácido acético de 12,0 M, que puede llevar a la aparición de pico mal y dañar el sistema HPLC.

Para la identificación de las catecolaminas, se comparan los tiempos de retención de cromatograma de los picos de las muestras con picos de solución estándar. La figura 2 muestra ejemplos de cromatogramas HPLC-ECD de las distintas soluciones. Si el protocolo se sigue correctamente, los perfiles cromatográficos de las tres catecolaminas y sus metabolitos deben obtenerse por HPLC-ECD con picos simétricos claro, bien definidos y con ruido de fondo mínimo, como se ilustra en la figura 2 de . Para la comparación con el método convencional, un cartucho comercial de PBA fue seleccionado como control. En la figura 2(un–c), cinco picos blanco en (b) son significativamente mayores que thaosein (c), lo que indica que el método PFSPE es más sensible que el método del cartucho PBA. Además, el pico DOPAC no demostró en el resultado de la extracción de la cartucho PBA, indicando que la columna de la PBA no era capaz de extraer DOPAC. Figura 2 (d) muestra el cromatograma de la muestra de orina en blanco sin ningún tratamiento previo y la figura 2(e) se muestra los cromatogramas de la muestra de orina extraídos con nanofibras compuesto PCE-PS. Figura 2 (f) muestra los cromatogramas de la muestra de orina después de la extracción con la columna de la PBA, que también no muestra ninguna extracción de DOPAC consistente con el resultado en la figura 2(c). El diagrama indica que el método PFSPE no podría extraer sólo los objetivos con buen efecto, pero también podría deshacerse de la mayoría de la interferencia en la orina, pico buena identificación de los compuestos objetivo.

El análisis estadístico reveló que las mediciones para las tres catecolaminas y dos metabolitos fiable reproducido (tabla 1). El objetivo compuestos mostró buena linealidad entre 1,5 y 100 ng/mL (R2> 0.99), y la curva estándar de cada analito puede encontrarse en el suplementario figura 1. Las curvas y los valores de R2 demuestran que los analitos tienen buenas linearidades y la relatividad dentro de un cierto rango lineal, conveniente para el cálculo de las concentraciones de analitos en muestras de orina. Los límites de detección (LOD) oscilan entre 0,25 y 0.54 ng/mL, y los límites de cuantificación (LOQ) fueron de 0,83 a 1.81 ng/mL, respectivamente. El valor de señal a ruido (S/N) había igualado 3. La gama de las metodológicas recuperaciones de los compuestos cinco objetivo fue de 97,4% (MHPG) a 124.2% (DOPAC), que fue satisfactoria para la aplicación a las muestras reales. La precisión intra-día fue de 2.7 a 4.8% (expresado como desviación estándar relativa) y la precisión interdía fue 2-8.1%, mostrando buena precisión y repetibilidad.

Para la detección de blancos en las muestras de orina real, 28 bebés en alto riesgo y niños sanos 22 en la división de cuidado de niños, hospital municipal de Suzhou, fueron reclutados. Todos los 50 niños en el estudio eran niños. Cuando tenían seis meses de edad, fueron llevados a un chequeo rutinario de septiembre de 2016. Todas las muestras de orina fueron recogidas y pretratadas siguiendo los pasos de protocolo 3.1 y 3.2, y las muestras se analizaron en el resto del paso 3. Se calcularon las concentraciones contra las curvas de calibración. Las diferencias estadísticas se analizaron mediante análisis de varianza (ANOVA). Los resultados pueden verse en la tabla 2. La diferencia de las catecolaminas y metabolitos entre los dos grupos fueron comparados y analizados. P-valores muestran que las catecolaminas no fueron significativamente diferentes entre los grupos sanos y alto riesgo, mientras que el contenido MHPG metabolito fue diferente entre estos grupos (p = 0,001). El grupo de recién nacidos de alto riesgo tenía mayores cantidades de MHPG que el grupo de control (14.8 ± 3,6 ng/mL y 1,4 ± 0,2 ng/mL), que significa que el nivel de MHPG urinario puede ser un marcador potencial para la identificación temprana de los bebés de alto riesgo.

Figura 3 y tabla 3 describen el método clásico de cuantificación para determinar materiales de monoamina y comparar con otros métodos para que el proceso de la operación y datos de interés se dan. En comparación con los métodos clásicos, el método PFSPE tiene ventajas como un intervalo de tiempo corto (5-10 min), el proceso de manejo simplificado, solvente menos orgánico y más respeto al medio ambiente con los parámetros metodológicos satisfactorios. La cantidad de eluant necesaria es baja en volumen (50 μL) y el paso de enriquecimiento objetivo no requiere ninguna evaporación, que promueve enormemente la sensibilidad de detección de los compuestos de la blanco en la orina. Comparado con SPE convencional basada en partículas, este método mejora la eficiencia, simplificó el proceso de preparación y redujo el tiempo del análisis de sensibilidad, selectividad y fiabilidad aceptable.

Figure 1
Figura 1 : Diagrama de flujo esquemático del procedimiento PFSPE en el papel y una representación de su dispositivo de. (1) Gastight jeringa (2) pipeta de punta y nanofibras (3) incluido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Cromatogramas de muestras diferentes. (una) muestra de agua de Spiked con objetivos y en (100 ng/mL) sin extracción. (b) agua de Spiked muestra extraída por el método PFSPE y (c) por cartucho (PBA) el ácido de phenylboronic comercial. (d) orina Real en blanco muestra sin extracción. (e) orina Real muestra extraída por el método PFSPE. (f) orina Real muestra extraída por cartucho comercial de PBA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Diagrama de flujo análisis de métodos de determinación de. (a, b) Divulgado previamente los métodos de extracción clásicos. (a) extracción de alúmina, (b) por DPBA complejo y (c) por el método propuesto en este trabajo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Suplementario Figura 1: curvas estándar y ecuaciones. Las curvas estándar para los cinco analitos están construidas para poder utilizar la ecuación de la línea para calcular la concentración desconocida de analitos en la muestra. (a) NE, E (b), (c) DA, MHPG (d) y (e) DOPAC. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Suplementario Figura 2: interacción de Boronate afinidad entre bórico ácido y cis-diol del grupo o grupos hidroxilo de dos adyacentes. (A) esquema de la interacción entre ácidos bórico y varios grupos -OH a los ésteres cíclicos cinco o seis miembros de la forma. (B) grupo de Cis-diol o adyacentes dos grupos hidroxilo en los círculos rojos representan los sitios de reacción importante para los cinco analitos a compuesto de ácido borónico. Haga clic aquí para descargar esta figura.

NE MHPG E ES DOPAC DA
Rango lineal (ng/mL) 1.5-400 1.5-200 1.5-100 1.5-100 1.5-400
Valores de R cuadrado 0.9945 0.995 0.9976 0.9902 0.9954
LOD (ng/mL) 0.323 0.322 0.313 0.657 0.249 0.543
LOQ (ng/mL) 1.076 1.072 1.043 2.191 0,83 1.809
Recuperación ± RSD (%)(n=9) 110.7±2.9 97.4±9.1 103.9±5.2 86.5±7.3 124.2±3.1 117.3±5.4
Precisión (% RSD) (n = 9)
Intra-día 4.5 4 2.7 4.8 3.3 4.7
Inter-día 4.1 8.1 2 6.3 3.2 5.9
NE, norepinefrina; MHPG, 3-metoxi-4-hydroxyphenylglycol; E, epinefrina; ES, estándar interno; DOPAC, 3, 4-Dihydroxyphenylacetic ácido; DA, la dopamina;

Tabla 1: Resultados analíticos del protocolo propuesto para la determinación de catecolaminas en tres y dos metabolitos con soluciones estándar.

Concentración (ng mL-1) Grupo de control (22) Grupo de alto riesgo infantil (28) Valor de P
NE 7.52±1.34 5.56±1.7 0.37
MHPG 1.4±0.2 14.8±3.6 0.001
E 24±15.8 20.9±5.87 0.841
DOPAC 106.36±30.1 72.12±18.07 0.312
DA 55.53±11.9 48.12±20.9 0,76
P < 0.05 *** muestra una diferencia significativa entre dos grupos

Tabla 2: comparación de las concentraciones de catecolaminas en tres y dos metabolitos en orina entre los bebés sanos y nacidos de alto riesgo. Los resultados fueron analizados estadísticamente mediante análisis de varianza (ANOVA) con un nivel de significancia de p = 0.05 para las diferencias entre el contenido de MHPG. Medios ± desviaciones se muestran.

Muestra Disolventes agotados (mL) Volumen de muestra (mL) Tiempo de tratamiento previo (min) Rango lineal LOD Recuperación relativa (%) Se evapora y
Redisuelva		 Método analítico
solvente volumen tiempo (min) recuperación (%) solvente y
(mL) (mL) reconstitución de
residuos
Orina 0.5 0.05 10 2.0 – 200 ng/mL (NE, E, DA) 0.2-0.5 ng/mL (NE, E, DA) 88.5-94.5 (NE, E, DA) No HPLC-ECD (Chen et al., 2016)
Orina 19 0,7 — 47 – 167 μg/L (DA) 166-500 nM (DA) 98.3-101.1 (DA) No HPLC-UV (Piotr et al., 2016)
Orina 1.3 0.01 — 0.5 – 1250 ng/mL (NE, E, DA, NMN, MN) 0.5-2.5 ng/mL (NE, E, DA, NMN, MN) 74.1-97.3 (NE, E, DA, NMN, MN) No LC-MS/MS (Li et al., 2016)
Orina y plasma 20 0.05 10 0.04-2.5 ng/mL (NE, E, DA) 0.01-0.02 ng/mL (NE, E, DA) 87.0-97.5 (NE, E, DA) No HPLC-UV (Mohammad et al., 2016)
Orina < 0.5 0.1 5 1.5-400 ng/mL (NE, MHPG, E, DOPAC, DA) 0.249-0.543 ng/mL (NE, MHPG, E, DOPAC, DA) 97.4-124.2 (NE, MHPG, E, DOPAC, DA) No Este trabajo
—, Indefinido.
PBA, ácido de Phenylboronic

Tabla 3: Comparación de este trabajo con estudios sobre el tratamiento previo de monoaminas u otros temas relacionados en los últimos años.

Complementario tabla 1: parámetros para la detección y cuantificación de analitos en el papel por HPLC-ECD del instrumento. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Complementario tabla 2: preparación de la curva estándar para cinco analitos. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Discussion

El método PFSPE propuesto en este documento puede ser significativa y significativa con respecto a su rapidez, sencillez y comodidad. Los adsorbentes utilizados en el protocolo son nanofibras electrospun, que tienen una proporción de volumen de área de superficie alta y por la adsorción de los analitos con alta eficiencia. El procedimiento sólo necesita unos pocos miligramos de nanofibras y un pequeño volumen de disolvente eluant y no requiere un paso de evaporación para concentrar los analitos. Aquí, hemos presentado una descripción detallada de un protocolo de HPLC-ECD basado que permita nuevos usuarios para establecer un método eficaz para la detección y cuantificación de catecolaminas en tres y dos de sus metabolitos (NE, E, DA y MHPG, DOPAC).

La superioridad de este protocolo principalmente se deriva de los cuatro pasos críticos durante los procedimientos, como se muestra en la figura 1: uso de nanofibras PCE-PS para capturar los compuestos objetivo para reducir el tamaño del absorbente a pocos miligramos, llevando a una rápida adsorción / desorción y que sólo necesitan un pequeño volumen de eluyente de líquido (1); Añadir DPBA en la orina al complejo con los analitos, para mejorar su hidrofobicidad (2); enjuague las nanofibras con la solución que contiene DPBA para retener los analitos y quitar las impurezas (3); y optimización de la extracción y análisis de condición para obtener buena sensibilidad y selectividad para los analitos (4).

Para el paso (1), el mecanismo de funcionamiento superior de la capacidad adsorbente para PCE-PS puede atribuir a una variedad de factores. Los polímeros de éter corona dopados en las nanofibras pueden formar un complejo de host-guest con las moléculas del huésped que contiene grupos amino por H-bonos, tales como las catecolaminas en el presente trabajo. En adición, Hongyou Hu et al. y Jishun Chen et al. también propuso que el ácido bórico puede enlazar con átomos de nitrógeno en la estructura química a través de interacciones de B-N, y que el esqueleto hidrofóbico puede interactuar con anillos de benceno y otros grupos alifáticos de analitos36,37. También, durante el proceso de desorción, los enlaces del hidrógeno y las interacciones de N B se rompen fácilmente a pH muy bajo; así, eluants con pH ácido son generalmente adecuados para la exploración de desorción. Además, también hay varias interacciones secundarias, incluyendo hidrofóbico, iónica e hidrógeno de la vinculación, que puede ocurrir entre sustancias químicas Borónicos y compuestos relacionados36,37,38. Estas interacciones pueden contribuir a la adsorción de los analitos a los materiales.

Paso (2), con la ayuda de DPBA añadido, PCE-PS nanofibras adsorben complejos DPBA-catecolamina rápidamente. Zhen Liu et al demostró que los materiales de afinidad boronate han surgido como importantes medios de comunicación para la separación selectiva y reconocimiento molecular de compuestos orgánicos, tales como nucleósidos, sacáridos, glicanos, glicoproteínas y así sucesivamente38. La complejación ocurre principalmente de la interacción de boronate afinidad entre ácido borónico y grupos cis-diol o dos grupos hidroxilos adyacentes, a los ésteres cíclicos miembros forma cinco o seis, como se muestra en suplementario figura 2A. Complementario de la figura 2B muestra los sitios principales de la reacción para los cinco analitos en esta obra el compuesto de ácido borónico. Cuando el entorno se convierten en ácidos, se disocia el complejo de ácido-cis-diol borónico. La interacción entre ácido bórico y el grupo cis-diol o los dos grupos de hidroxilos adyacentes existe extensivamente y relativamente fuertemente.

Paso (3), el complejo formado entre los analitos y DPBA puede mantenerlos en el adsorbente mientras se aclaran otras impurezas de la superficie PCE-PS, logrando la mejor reserva para los objetivos. Para el paso (4), ha habido un informe que muestra que el pH óptimo fue de 9.0 para la vinculación de compuesto de ácido bórico y catecol39. Sin embargo, Chen et al. explorado el mejor pH para la formación de complejos de catecolaminas-DPBA y encontró que el rendimiento de la adsorción de las nanofibras PS-PCE compuestos para la CAs óptima cuando se cambia el valor de pH entre 6.0 y 7.034,35. Liu et al implicado que la estructura de los materiales de apoyo para boronate compuestos ácidos, especialmente con confinamiento espacial de las cavidades y los poros de la nanoescala y los ligandos B N formados durante la reacción, puede reducir también significativamente los vinculante el pH y aumentar la afinidad de enlace38. La estructura del PCE-PS, así como la estructura de catecolaminas está equipada con los grupos - NH. Así, las propiedades y los poros de nanoescala de PCE-PS (datos como se muestra en Los resultados de representante), así como ligandos B N formados, pueden contribuir al pH de bajada obligatoria en el protocolo. Así, el valor de pH óptimo en el presente Protocolo puede ser neutral, que en gran medida simplifica los procedimientos y evita la degradación de los analitos.

Las principales limitaciones de la determinación de la catcholamine son que sus concentraciones en muestras biológicas son muy bajos y que sus estructuras son inestables (fácilmente oxidado); Además, es difícil deshacerse de las impurezas en los medios de comunicación. Así, para el análisis de las catecolaminas en muestras biológicas, tratamiento previo, generalmente por extracción en fase sólida, es necesario. El método PFSPE propuesto en el presente trabajo proporciona una simple y conveniente la preconcentración de los analitos en las muestras de orina. Sin embargo, al hacer el experimento, las condiciones del experimento deben estar estrictamente controlada, por medios tales como evitar la exposición a la luz y acortamiento del tratamiento previo tiempo tanto como sea posible.

La aplicabilidad del método se evaluó por su uso para determinar las concentraciones de catecolaminas en tres y dos metabolitos en la orina de los bebés sanos y nacidos de alto riesgo. Hubo una diferencia significativa entre los dos grupos de MHPG urinario. Como resumido anteriormente, la cantidad MHPG en el cuerpo humano es principalmente presenta ahora como un índice para reflejar el tono neuronal noradrenérgico, la actividad del metabolismo de catecolaminas en la central y los sistemas nerviosos periférico40,41, 42, y es un marcador útil de plasma/orina metabolismo NE central43. Para bebés de alto riesgo, una variedad de factores tales como la encefalopatía hipóxico-isquémica (HIE) causa cerebro insultos de trauma y el cerebro, conduciendo a diferentes grados de déficit de desarrollo neurológico infantil. Este daño cerebral a su vez conduce a la liberación de neurotransmisores (MHPG incluido) en fluidos corporales44,45. Según informes de J.W. Maas, existen correlaciones significativas entre el cerebro, LCR, plasma y concentraciones urinarias de MHPG46,47. La medida del total (libre + conjugada) MHPG en orina ha sido utilizada para evaluar el metabolismo del NE central y periférica NE metabolismo en los seres humanos41,48,49. Por lo tanto, puede concluirse que recién nacidos de alto riesgo tienen tono neuronal noradrenérgico daño en comparación con las sanas, que afectan a los sistemas nerviosos periférico y el metabolismo de catecolaminas en la central. Esta discrepancia indica que debe hacerse mayor investigación sobre la relación entre los déficits de nivel y del neurodesarrollo MHPG urinarios. Se ha demostrado que el método propuesto podría ser utilizado para la determinación de la presencia de catecolaminas en orina, con una perspectiva prometedora para su uso en la clínica para la evaluación de enfermedades relevantes a estos neurotransmisores.

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Disclosures

Los autores certifican que no existe ningún conflicto de interés con cualquier entidad financiera sobre el material discutido en este artículo.

Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por la nacional ciencia Fundación de China (No.81172720, Nº 81673230), el Departamento de tecnología (Nº y Social desarrollo investigación programa de Jiangsu provincia de ciencia BE2016741), ciencia y tecnología de China la Administración General de supervisión de calidad, inspección y cuarentena (2015QK055), el programa del proyecto abierto del laboratorio clave de ciencia del Ministerio de educación, de aprendizaje y desarrollo del niño Universidad del sureste (CDL-2016-04). Reconocemos sinceramente Song Yuan y Ping Liu que nos ayudaron en la recogida de muestras.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 µL pipette tip column to contain nanofibers
PCE-PS nanofibers material for PFSPE extraction
steel rod (about 0.5 mm diameter) fill the nanofibres into the column
gastight plastic syringe (5 ml) compress solution into the end of the tip
methanol Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 67-56-1
diphenylborinic acid 2-aminoethyl ester(DPBA) Sigma-Aldrich.Inc A-106408 complex reagent
norepinephrine(NE) Sigma-Aldrich.Inc A-9512 analyte
3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol(MHPG) Sigma-Aldrich.Inc H1377 analyte
epinephrine(E) Sigma-Aldrich.Inc 100154-200503 analyte
3, 4-Dihydroxyphenylacetic acid(DOPAC) Sigma-Aldrich.Inc D-9128 analyte
dopamine(DA) Sigma-Aldrich.Inc H-8502 analyte
3, 4-dihydroxybenzylamine hydrobromide(DHBA) Sigma-Aldrich.Inc 858781 interior label
acetonitrile Sigma-Aldrich.Inc 75-05-8 eluriant and mobile phase
phosphoric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7664-38-2 eluriant
uric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 69-93-2 artifical urine
creatinine Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 60-27-5 artifical urine
trisodium citrate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 6132-04-3 artifical urine
KCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7447-40-7 artifical urine
NH4Cl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 12125-02-9 artifical urine
NaHCO3 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd SWC0140326 artifical urine
C2Na2O4 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 62-76-0 artifical urine
NaSO4 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7757-82-6 artifical urine
disodium hydrogen phosphate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10039-32-4 artifical urine
urea Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 57-13-6 artifical urine
NaCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7647-14-5 artifical urine
MgSO4.7H2O Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10034-99-8 artifical urine
CaCl2 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10035-04-8 artifical urine
HCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7647-01-0 artifical urine
citric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 77-92-9 artifical urine and mobile phase
EDTA disodium salt Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 34124-14-6 mobile phase
monometallic sodium orthophosphate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7558-80-7 artifical urine and mobile phase
1-heptanesulfonic acid sodium salt Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 22767-50-6 mobile phase
sodium hydroxide Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 1310-73-2 mobile phase
phenylboronic acid column(PBA column) Aglilent 12102018 PBA extraction
Inertsil® ODS-3 5 µm 4.6×150 mm column Dikma 5020-06731 HPLC column for seperation
SHIMADZU SIL-20AC prominence AUTO SAMPLER Shimadzu Corporation, Japan SIL-20AC auto injection for eluriant
SHIMADZU LC-20AD High Performance Liquid Chromatography Shimadzu Corporation, Japan LC-20AD HPLC pump
SHIMADZU L-ECD-60A electrochemical detector Shimadzu Corporation, Japan L-ECD-60A detector for the analytes
ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry System Micromeritics, USA surface and porosity analyzer 

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References

  1. Elhwuegi, A. S. Central monoamines and their role in major depression. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 28, 435-451 (2004).
  2. Da, C. F., Ngoabdalla, S., Houzel, J. C., Rehen, S. K. Murine model for Parkinsons disease: From 6-OH dopamine lesion to behavioral test. J. Vis. Exp. (35), e1376 (2010).
  3. Varley, H., Gowenlock, A. H. The clinical chemistry of monoamines. Brit. Med. J. 2, 1330 (1963).
  4. Wang, X., Rousset, C. I., Hagberg, H., Mallard, C. Lipopolysaccharide-induced inflammation and perinatal brain injury. Semin. Fetal. Neonatal. Med. 11, 343-353 (2006).
  5. Inder, T. E., Volpe, J. J. Mechanisms of perinatal brain injury. Semin. Neonatol. 5, 3-16 (2000).
  6. Miller, S. P., Ferriero, D. M. From selective vulnerability to connectivity: Insights from newborn brain imaging. Trends. Neurosci. 32, 496-505 (2009).
  7. Barkovich, A. J., et al. Proton MR spectroscopy for the evaluation of brain injury in asphyxiated, term neonates. Am. J. Neuroradiol. 20, 1399-1405 (1999).
  8. Liauw, L., van Wezel-Meijler, G., Veen, S., van Buchem, M. A., van der Grond, J. Do apparent diffusion coefficient measurements predict outcome in children with neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy? Am. J. Neuroradiol. 30, 264-270 (2009).
  9. Varsami, M., et al. Inflammation and oxidative stress biomarkers in neonatal brain hypoxia and prediction of adverse neurological outcome: A review. J. Pediatr. Neonat. Individual. Med. 2, e020203 (2013).
  10. Cooper, R. L., Walker, R. F. Microradioenzymic assays for the measurement of catecholamines and serotonin. Methods. Enzymol. 103, 483-493 (1983).
  11. Murphy, J. F. The development of enzyme linked immunosorbent assays (ELISA) for the catecholamines adrenaline and noradrenaline. J. Immunol. Methods. 154, 89-98 (1992).
  12. Jones, S. R., Mickelson, G. E., Collins, L. B., Kawagoe, K. T., Wightman, R. M. Interference by pH and Ca2+ ions during measurements of catecholamine release in slices of rat amygdala with fast-scan cyclic voltammetry. J. Neurosci. Methods. 52, 1-10 (1994).
  13. Sanchismallols, J. M., Villanuevacamañas, R. M., Ramisramos, G. Determination of unconjugated catecholamine in urine as dopamine by thermal lens spectrometry. Analyst. 117, 1367-1371 (1992).
  14. Lan, C., Liu, W. Determination of catecholamines by HPLC-ECD in urine. Medical Laboratory Science and Clinics. , (2007).
  15. Tsunoda, M., Aoyama, C., Ota, S., Tamura, T., Funatsu, T. Extraction of catecholamines from urine using a monolithic silica disk-packed spin column and high-performance liquid chromatography-electrochemical detection. Anal. Methods. 3, 582-585 (2011).
  16. Bartolini, B., et al. Determination of monoamine oxidase activity by HPLC with fluorimetric detection. Neurobiology (Bp). 7, 109-121 (1999).
  17. Dunand, M., Gubian, D., Stauffer, M., Abid, K., Grouzmann, E. High throughput and sensitive quantitation of plasma catecholamines by ultraperformance liquid chromatography tandem mass spectrometryusing a solid phase microwell extraction plate. Anal. Chem. 85, 3539-3544 (2013).
  18. He, H., Carballo-Jane, E., Tong, X., Cohen, L. H. Measurement of catecholamines in rat and mini-pig plasma and urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry coupled with solid phase extraction. J. Chromatogr. B. 997, 154-161 (2015).
  19. Simon, N., Young, P. How to increase serotonin in the human brain without drugs. J. Psychiatry. Neurosci. 32, 394-399 (2007).
  20. Grossi, G., et al. Improvements in automated analysis of catecholamine and related metabolites in biological samples by column-switching high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 541, 273-284 (1991).
  21. Iwamot, T., Yoshiura, M., Iriyama, K. Liquid chromatographic identification of urinary catecholamine metabolites adsorbed on alumina. J. Liq. Chromatogr. R. T. 10, 1217-1235 (1987).
  22. Maycock, P. F., Frayn, K. N. Use of alumina columns to prepare plasma samples for liquid-chromatographic determination of catecholamines. Clin. Chem. 33, 286-287 (1987).
  23. Grossi, G., Bargossi, A., Lippi, A., Battistoni, R. A fully automated catecholamines analyzer based on cartridge extraction and HPLC separation. Chromatographia. 24, 842-846 (1987).
  24. Rondelli, I., et al. New method for the resolution of the enantiomers of 5,6-dihydroxy-2-methyl-aminotetralin by selective derivatization and HPLC analysis: Application to biological fluids. Chirality. 8, 381-389 (1996).
  25. Kumar, A., Hart, J. P., McCalley, D. V. Determination of catecholamines in urine using hydrophilic interaction chromatography with electrochemical detection. J. Chromatogr. A. 1218, 3854-3861 (2011).
  26. Sabbioni, C., et al. Simultaneous liquid chromatographic analysis of catecholamines and 4-hydroxy-3-methoxyphenylethylene glycol in human plasma: Comparison of amperometric and coulometric detection. J. Chromatogr. A. 1032, 65-71 (2004).
  27. Lee, M., et al. Selective solid-phase extraction of catecholamines by the chemically modified polymeric adsorbents with crown ether. J. Chromatogr. A. 1160, 340-344 (2007).
  28. He, H., et al. Facile synthesis of a boronate affinity sorbent from mesoporous nanomagnetic polyhedral oligomeric silsesquioxanes composite and its application for enrichment of catecholamines in human urine. Anal. Chim. Acta. 944, 1-13 (2016).
  29. Subbiah, T., Bhat, G. S., Tock, R. W., Parameswaran, S., Ramkumar, S. S. Electrospinning of nanofibers. J. Appl. Polym. Sci. 96, 557-569 (2005).
  30. Hu, W. Y., et al. Packed-fiber solid-phase extraction coupled with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry for determination of diethylstilbestrol, hexestrol, and diedestrol residues in milk. J. Chromatogr. B. 957, 7-13 (2014).
  31. Liu, Z., Kang, X., Fang, F. Solid phase extraction with electrospun nanofibers for determination of retinol and α-tocopherol in plasma. Microchim. Acta. 168, 59-64 (2010).
  32. Qi, D., Kang, X., Chen, L., Zhang, Y., Wei, H., Gu, Z. Electrospun polymer nanofibers as a solid-phase extraction sorbent for the determination of trace pollutants in environmental water. Anal. Bioanal. Chem. 390, 929-938 (2008).
  33. Kang, X. J., Chen, L. Q., Zhang, Y. Y., Liu, Y. W., Gu, Z. Z. Performance of electrospun nanofibers for SPE of drugs from aqueous solutions. J. Sep. Sci. 31, 3272-3278 (2008).
  34. Chen, L. Q., Wang, Y., Qu, J. S., Deng, J. J., Kang, X. J. Selective extraction of catecholamines by packed fiber solid-phase using composite nanofibers composing of polymeric crown ether with polystyrene. Biomed. Chromatogr. 29, 103-109 (2015).
  35. Chen, L. Q., Zhu, X. H., Shen, J., Zhang, W. Q. Selective solid-phase extraction of catecholamines from plasma using nanofibers doped with crown ether and their quantitation by HPLC with electrochemical detection. Anal. Bioanal. Chem. 408, 4987-4994 (2016).
  36. Hu, H., Zhang, Y., Zhang, Y., Huang, X., Yuan, D. Preparation of a new sorbent based on boronate affinity monolith and evaluation of its extraction performance for nitrogen-containing pollutants. J. Chromatogr. A. 1342, 8-15 (2014).
  37. Chen, J., et al. Sensitive determination of four camptothecins bysolid-phase microextraction-HPLC based on a boronic acid contained polymer monolithic layer. Anal. Chim. Acta. 879, 41-47 (2015).
  38. Li, D., Chen, Y., Liu, Z. Boronate affinity materials for separation and molecular recognition: structure, properties and applications. Chem. Soc. Rev. 44, 8097-8123 (2015).
  39. Yan, J., Springsteen, G., Deeter, S., Wang, B. The relationship among pKa, pH, and binding constants in the interactions between boronic acids and diols: It is not as simple as it appears. Tetrahedron. 60, 11205-11209 (2004).
  40. Reuster, T., Rilke, O., Oehler, J. High correlation between salivary MHPG and CSF MHPG. Psychopharmacology. 162, 415-418 (2002).
  41. Beckmann, H., Goodwin, F. K. Urinary MHPG in subgroups of depressed patients and normal controls. Neuropsychobiology. 6, 91-100 (1980).
  42. Mitoma, M., et al. Stress at work alters serum brain-derived neurotrophic factor (BDNF) levels and plasma 3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) levels in healthy volunteers: BDNF and MHPG as possible biological markers of mental stress? Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 32, 679-685 (2008).
  43. Ressler, K. J., Nemeroff, C. B. Role of Norepinephrine in the Pathophysiology and Treatment of Mood Disorders. Biol. Psychiatry. 46, 1219-1233 (1999).
  44. Alonso-Spilsbury, M., et al. Perinatal asphyxia pathophysiology in pig and human: A review. Anim. Reprod. Sci. 90, 1-30 (2005).
  45. Shalak, L., Perlman, J. M. Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant: Current concepts. Early. Hum. Dev. 80, 125-141 (2004).
  46. Maas, J. W., Leckman, J. F. relationships between central nervous system noradrenergic function and plasma and urinary MHPG and other norepinephrine metabolites. MHPG: Basic Mechanisms and Psychopathology. , Academic Press. 33-43 (1983).
  47. Maas, J. W. Relationships between central nervous system noradrenergic function and plasma and urinary concentrations of norepinephrine metabolites. Adv. Biochem. Psychopharmacol. 39, 45-55 (1984).
  48. Peyrin, L., Pequignot, J. M., Chauplannaz, G., Laurent, B., Aimard, G. Sulfate and glucuronide conjugates of 3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) in urine of depressed patients: Central and peripheral influences. J. Neural. Transm. 63, 255-269 (1985).
  49. Peyrin, L. Urinary MHPG sulfate as a marker of central norepinephrine metabolism: A commentary. J. Neural. Transm. 80, 51-65 (1990).

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Química número 133 catecolaminas corona polimérico nanofibras electrospun extracción en fase sólida llena de fibra (PFSPE) cromatografía líquida de alta presión con detección electroquímica (HPLC-ECD) bebés en alto riesgo
Un método conveniente para la extracción y análisis con cromatografía líquida de alta presión de los neurotransmisores catecolaminas y sus metabolitos
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