Summary
선물이 3 monoamine 신경 전달 물질의 동시 결정 하 고 두 유아 소변에 그들의 대사 산물의 전기 화학 검출 (ECD) 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 결합 하 여 편리한 고체 상 추출. 우리 또한 유아에 대 한 뇌 손상의 조기 진단에 대 한 잠재적인 biomarker로 대사 산물 MHPG를 식별합니다.
Abstract
추출 및 생물 학적 체액에서 카 테 콜 아민 신경 전달 물질의 분석은 신 경계 기능 및 관련된 질환 평가에 매우 중요 하지만 그들의 정확한 측정은 여전히 도전 이다. 많은 프로토콜 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 포함 하 여 악기의 다양 한 신경 전달 물질 측정에 대 한 설명 했습니다. 그러나, 단점, 복잡 한 작업 또는 감지 하드는 피할 수 없는 여러 대상 이며 현재, 지배적인 분석 기술은 여전히 HPLC로 인해 민감한 전기 또는 fluorimetric 탐지와 결합 그것의 높은 감도 그리고 좋은 선택입니다. 여기, 상세한 프로토콜에서에서 설명 하는 전처리 및 전기 화학적 검출 (HPLC-ECD) 고압 액체 크로마토그래피와 catecholamines의 검출을 위한 electrospun 복합 nanofibers 구성을 사용 하 여 유아의 실제 소변 샘플 폴리스 티 렌으로 adsorbent와 고분자 크라운 에테르의 포장 섬유 고체 상 추출 (PFSPE) 메서드 라고도합니다. 우리는 소변 샘플을 쉽게 nanofiber 포장 단단한 단계의 열을 어떻게 샘플에서 analytes는 빠르게 농축 될 수 있다, precleaned 수 있습니다 desorbed, 방법과 ECD 시스템에서 발견을 보여줍니다. PFSPE 감소 시간, 비용, 목표의 손실의 감소에 대 한 수 있도록 생물 학적 샘플에 대 한 전처리 절차를 크게 간소화 합니다.
전반적으로,이 작품에서는 세 monoamine 신경 전달 물질 (노르 (NE), (E) 피 네 프 린, 도파민 (DA))의 동시 결정 하 고 두 개의 HPLC ECD 시스템에 결합 하는 고체 상 추출에 대 한 간단 하 고 편리한 프로토콜 그들의 대사 산물 (3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) 및 3, 4-dihydroxy-phenylacetic 산 (DOPAC)) 유아의 소변에서. 설립된 프로토콜 요도 catecholamines의 차이 주 뇌 손상 위험이 높은 유아와 건강 한 컨트롤 사이의 그들의 대사 산물을 평가 하기 위해 적용 되었습니다. 비교 분석으로 카 테 콜 아민 대사 산물의 경우 유아의 뇌 손상에 대 한 위험이 조기 진단 위한 중요 한 후보 마커를 있을 수 있습니다 나타내는 두 그룹 사이의 요도 MHPG에 상당한 차이가 나타났다.
Introduction
카 테 콜 아민 신경 전달 물질과 체액에 그들의 대사 산물 내용을 신경 기능에 영향을 하 고 대부분1에 응답 자극의 균형에 영향을 미칠 수 있습니다. Abnormities는 pheochromacytoma, ganglioneuroma, 신경, 신경 성 질환1,2등 질병의 다양 한을 발생할 수 있습니다. 추출 및 체액에서 catecholamines에의 결정은 관련 질병의 진단에 의미가 있습니다. 그러나, catecholamines 생물 학적 샘플에 낮은 농도에서 존재 하 고 쉽게 산화 된다. 또한, 그들은 매우 많은 양의 중간3에서 간섭 때문에 elute 어렵다입니다. 따라서, catecholamines 생물 학적 체액에서의 동시 검출은 여전히 도전.
리뷰 요 catecholamines 스트레스, 측정 될 수 있습니다 그리고 그들의 수준은 신생아5처리 촉각 자극에 응답 하는 중요 한 생물 학적 마커 표시 되었습니다. 연구에 따르면 조 사건에서 고통을 모든 유아 뇌 부상4,,56에 대 한 위험이 있으며 부상 catecholamines 비정상적인 릴리스 체액에 관련된 문제를 발생할 수 있습니다. 고급 자기 공명 기술을 이전 단계7,8뇌 손상을 감지할 수 있는 존재 한다. 그러나, 첫 번째 48 h 내 비정상적인 neurodevelopmental 과정 하면 영구적인 뇌 손상 의료 이미지11분명 되지 않습니다. 게다가, 높은 비용 및 부족 한 악기 자원을 다른 요인 함께 인해 이러한 전문된 신경 이미징 기법에 대 한 액세스를 모든 신생아 단위에 대 한 없습니다. 그러나, (예: catecholamines 및 그들의 대사 산물) 쉽게 친근 하 고 실용적인 바이오 마커를 사용 하 여 이러한 단점을 극복할 수 고 인간의 체액에 바이오 마커 검사 수 있습니다 뇌 손상의 조기 진단에 도움이 프롬프트 이어질 신생 유아 neuroprotection9필요의 식별. 소변에서 catecholamines 체액 및 neuroactivity 기능으로 그들의 양 사이의 직접적인 상관 관계 때문에 간단 하 고 명백한 인덱스 수 있습니다.
생물 학적 체액 중 뇌 척추 액체 (CSF) 및 플라즈마 샘플 쉽지 않은 기존 외상 성 절차를 통해 얻을 수 그리고 그것은 또한 매우 어려운 접착 단백질 및 기타 불순물, 선도 하는 귀찮은 간섭 제거 하 고 시간이 걸리는 샘플링 과정 반복된 탐지를 위한 적합 하지 않습니다. 또한, 어린이 위한 아니다 거의 충격적인 패션에서 샘플을 얻을 수 있습니다. 따라서, 요 샘플링은 샘플링의 다른 형태의 보다 더 나은 그것은 비 침략 적, 간편한 작동, 그리고 반복 해 서 행 해질 수 있다. 소변 샘플은 풍부 하 고 쉽게 저장 하 고, 큰 이점이 생물 샘플의 다른 형태의 표시.
생물 학적 체액에 catecholamines 척도를 주요 방법 등 radioenzymic 분석 실험10, 면역 매 분석 실험 효소 연결 된11, voltammetry12 열 렌즈 분석13. 하지만 단점이 존재, 복잡 한 작업 등 및 감지 하드 여러 대상을. 오늘, 지배적인 분석 기술은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)14, 그것의 높은 감도 및 좋은 선택 때문에 민감한 전기15 또는 fluorimetric 검출16와 결합 이다. 같은 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 기술로 질량 분석 (LC/MS) 및 액체 크로마토그래피/질량 분석/질량 분석 (LC/MS/MS), 분석 및 정량화는 신경 전달 물질의 높은 얻을 수 있습니다 / 정확성과 특이성17,18. 그러나, MS 기술 비싼 계측 뿐만 아니라 대부분의 기존 실험실에서 보편적으로 적용 하는 방법 어렵게 실질적으로 자격 갖춘된 인력을 필요 합니다. ECD HPLC 시스템은 일반적으로 가장 전통과 임상 실험실에 있고 따라서 연구 그룹 화학 결정에 대 한 사용을 위한 일반적이 고 좋은 선택 되고있다 하지만 그들은 샘플의 청결을 시스템에 도입 해야 미 양19. 따라서, 정화 하 고 분석 하기 전에 샘플을 응축에 매우 중요 하다. 정화 단계에 대 한 고전적인 방법 이며 액체-액체 추출14,,1520 오프 라인 고체 상 추출, 활성된 알 루미나 열21,22 포함 하 여 및 diphenylborate (DPBA) complexation23,,2425,26.
명 리 외. 사용 하고있다 폴리머 수 지는 화학적으로 흡착 제는으로 크라운 에테르로 수정 인간의 소변에서 200727이후 catecholamines을 선택적으로 추출. 또한, 2006 년에, Haibo 그 외. 보여주는 boronate 선호도 추출 매 byutilizing에 대 한 손쉬운 종합 접근 functionalizable nanomagnetic 다면체 oligomeric silsesquioxane (포스) 기반된 nanomagnetic 합성, catecholamines에의 농축에 적용 인간의 소변 (더욱, 피 네 프 린 및 isoprenaline)28. 그들은 또한 나노 전기 불리고는 nanoscale 중합체 섬유 물자 형성 기술을 사용 하 여 작업을 수행 하기 위해 나노 소재 활용을 했다. 전기 프로세스는 작동 전압을 제어 하 고 다른 매개 변수29는 회전 솔루션의 내용을 변경 하 여 직경, 형태, 그리고 제품의 공간 맞춤을 조정할 수 있습니다. 기존 SPE 카트리지 비교, electrospun nanofibers는 추출 하 고 복잡 한 매트릭스에서 대상 analytes 풍부 매우 적합 한 그들은 높은 효율으로는 analytes를 adsorb 높은 표면 지역에 양 비율을 갖추고 있습니다 그리고 더 쉽게 제어 표면 화학 속성을 대상 화합물의 편리한 부착을 전시 한다. 이러한 속성을 있도록 SPE adsorbents, 크게 고체 단계와 탈 착 용 금액30,31,,3233감소에 대 한 좋은 선택. 소변 샘플에서 catecholamines에 대 한 electrospun nanofibers 폴리스 티 렌 (PCE-PS)와 apolymeric 크라운 에테르의 구성 3 catecholamines (네브라스카, E, 및 다)34를 선택적으로 추출 하 사용 되었다. 종이 선택적 크라운 에테르 흡착 네브라스카, E, 및 다, catecholamines 수소 결합을 형성을 통해 바인딩하는 정확한 기하학을 기반으로 했다 어떤의 대상 표시. 결과 표시 소재 크라운 에테르 효과적으로, 생물 학적 샘플에 포함 된 다른 간섭 화합물을 제거. 이 보고서에 의해 영감, 새로운 메서드는 catecholamines의 선택적 추출에 의해 개발 되었다 electrospun 복합 nanofibers PCE 추 구성의 사용
이 문서에 메서드를 보고 이전34 개선 되었고 성공적으로 E, 네브라스카, 고 다, 뿐만 아니라 그들의 대사 산물, MHPG 및 DOPAC, 소변에서 분석 뿐만 아니라 고용. 우리는 또한 흡착 과정의 메커니즘에 대 한 새로운 가능성을 탐험. 메서드 표시 만족 추출 효율과 5 analytes에 대 한 선택도 하 고 메서드가 perinatal 뇌 손상와 건강 한 컨트롤 위험이 높은 유아에서 소변의 분석에서 검증 되었다.
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Protocol
부모 로부터 동의 얻어, 그리고 연구에 대 한 제도적 검토 보드 승인을 얻은. 연구는 인간을 포함 하는 실험에 대 한 세계 의학 협회 (헬싱키의 선언)의 윤리 강령에 따라 수행 되었다. 연구에 등록 되 고에 대 한 동의 서 면 제공 하는 모든 참가자의 보호자. Zhongda 병원 윤리 위원회 승인을 동남 대학와 제휴도 입수 했다.
1. 열과 추출 및 Catecholamines의 결정에 필요한 솔루션의 준비
- PFSPE 열을 준비 합니다. 5-6 aliquots로 PCE PS nanofibers의 1-2 mg을 분할 하 고 0.5 m m 직경을 가진 정밀한 강철 막대를 사용 하 여 질서 200 µ L의 양으로 피 펫 팁의 끝에 그들을 압축.
- 2.427 g 우 레 아, 0.034 g 요 산, 0.09 g 크, 0.297 g trisodium 시트르산, 0.634 g 염화 나트륨, 0.45 g 염화 칼륨, 염화 암모늄 0.161 g, 0.089 g 염화 칼슘이 수화물, 황산 마그네슘 0.1 g 무게에 의해 인공 소변을 준비 heptahydrate, 0.034 g 나트륨 중 탄산염, 0.003 g 나트륨 수 산 염, 0.258 g 나트륨 황산 염, 0.1 g 나트륨 디 인산 염, 그리고 0.011 g disodium 수소 인산 염, 디졸브 200 mL에 위의 화학 이온을 제거 된 물.
- 화합물의 2 mg 1 mL의 증류수에 용 해 하 여 2 mg/mL diphenylborate (DPBA) 솔루션의 재고 솔루션을 준비 합니다. 4 ° c.에 어둠 속에서 솔루션을 저장
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분석 표준
참고: 화학 구조 및 속성 catecholamines의 불안정, 그리고 그들은 쉽게 분해. 표준의 준비 과정 매우 신속 하 고 직접적인 햇빛에 노출 되지 않도록 해야 합니다.- 네브라스카, E, 다, MHPG, DOPAC 및 별도 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 내부 표준 3, 4 dihydroxybenzylamine hydrobromide DHBA 1.0 밀리 그램 무게. DHBA 솔루션을 사용 하기 전에 100 ng/mL를 물에 희석.
- Analytes 완전히 분해 때까지 빠른 속도로 어둠 속에서 준비 된 표준 흔들 리 다. 이것은 기본 주식; 몇 주까지-20 ° C에서 저장 합니다.
- 2 차 1000 ng/mL 분석 주식을 준비 합니다. 네브라스카, E, 다, DOPAC 및 MHPG, 증류수 5 mL 원심 분리기 튜브, 4,975 µ L에 5 µ L 각 기본 분석 재고의 전송 및 사용까지 4 ° C에서 어둠 속에서 그것을 저장. 이러한 솔루션 신선한 매일을 준비 합니다. DHBA, 증류수 5 mL 원심 분리기 튜브에서 4,995 µ L로 기본 주식의 5 µ L를 전송 및 4 ° c.에서 별도로 어둠 속에서 그것을 저장합니다
- 표준 곡선을 만드는 보조 분석 재고 더 희석을 만들기 (예., 보충 표 2). 4 ° C에서 어둠 속에서 솔루션을 저장 하 고 신선한 매일 준비 합니다.
- 표준 재고를 사용 하 여 적절 한 농도로 ECD 검출기의 최적의 전압을 테스트 합니다. analytes가 가장 좋은 피크 모양의 찾을 값을 전압을 변화 한다.
- 30% 인산, 15% 이기를 포함 하는 eluant를 준비 하 고 55% 증류수. Eluant 용 매 10 ml, 5.5 mL 증류수, 사용 하 고 물에 이기의 1.5 mL 및 인산에 의해 드롭의 3 mL를 추가 합니다.
2. 실제 소변 샘플 및 모바일 단계 준비
- 어머니 무 균 소변 컵을 사용 하 여 그들의 유아의 첫 번째 아침 소변을 수집 했습니다. 폴 리 프로필 렌 튜브와 라벨 샘플을 즉시 전송 합니다. 그런 다음,-20 ° C 냉동 실에 샘플을 저장.
- 소용돌이 원심 분리기 1,510 x g에서 10 분에서 오 줌 샘플 룸 온도 (RT) 대부분 미 립 자 방해의 제거를. 퇴적 물을 버리고 고 추가 실험 supernatants 수집 합니다. Analytes를 효과적으로 추출 하기 위해 centrifuging 직후 PFSPE 전처리 (3 단계)로 이동 합니다.
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모바일 단계 준비
- 깨끗 한 병, 적어도 1 기사 준비 모바일 단계의 구성 보충 표 1;에 나열 된 1 L 모바일 단계, 구 연산 산, 에틸렌 diamine tetra 아세트산 (EDTA) disodium 소금, monometallic 나트륨 orthophosphate의 7.02 g 93.06 mg의 측정 6.7242 g에 대 한 1-heptanesulfonic 산 나트륨 소금, 404.5 마그네슘과 나트륨의 3.5 g 병으로 하이드 레이트. 40 mL 이기를 추가 하 고 1000 ml 증류수. 선동 하 고 솔루션에 문제 모두 해산 될 때까지 15 분 동안 초음파 진동.
- 유리 전극으로 pH 미터를 사용 하 여, 포화 수산화 나트륨 솔루션 4.21로 모바일 위상의 pH 값을 조정 합니다.
- 0.45 μ m polyvinylidene 불 소 미소 한 구멍이 있는 막과 불순물을 제거 하는 진공 흡입 장치 모바일 단계를 필터링 합니다.
- 15 분에 대 한 초음파 진동을 사용 하 여 모바일 단계 사용 하기 전에 각 시간을 드.
3. PFSPE 추출 및 HPLC 분석
- nanofibers를 활성화 합니다. 누르고 메탄올의 100 µ L의 물 100 µ L 순차적으로 통해 느린, dropwise 방식에서 5 mL 주사기를 사용 하 여 PFSPE 열.
- 믹스 100 µ L 소변 100 µ L 2 mg/ml DPBA 솔루션 및 30 µ L 100 ng/ml의 DHBA 솔루션 (IS, 내부 표준) 0.5 mL EP 튜브 샘플 다음 혼합된 솔루션 PFSPE 열을 전송 합니다. 5 mL 기밀 플라스틱 주사기 공기 압력의 힘을 사용 하 여 PFSPE 열 통해 혼합된 샘플 솔루션을 누릅니다.
- SPE 열에 DPBA 솔루션 (2 mg/mL)의 100 µ L을 로드 하 여 열 세 번 걸러 고 5 mL 기밀 플라스틱 주사기를 사용 하 여 공기 압력으로 천천히 카트리지를 통해 솔루션을 밀어.
- PFSPE 열에 eluant의 50 µ L을 로드 하 고 0.5 mL EP 튜브 eluate 수집 열을 통해 밀어.
- 시스템에서 공기를 드 하 HLPC degasser를 켭니다. 샘플 분석, 이전 시스템 equilibrate 및 기준선 소음 모바일 단계와 0.5 h 이상에 대 한 실행 해야 합니다. HPLC 시스템의 설치 매개 변수를 보여주는 보충 표 1 을 참조 하십시오.
- 20 µ L의 eluate 자동 샘플러를 사용 하 여 샘플 그리고 HPLC ECD 시스템에 주입.
- 실행 완료 되 면 감지기 인터페이스를 사용 하 여 검출기 셀 끕니다. 이 악기를 손상 시킬 수 있는 검출기, 뒷면 스위치 셀에서 설정 하지 마십시오.
- 모바일 단계 구성 10% 메탄올과 90% 물 수동으로 변경 합니다. 적어도 30 분 동안 실행 합니다. 그런 다음, 수동으로 HPLC 급 메탄올 모바일 위상을 변경 합니다. 메탄올에 시스템을 보호 하기 위해 약 15 분 동안 실행 합니다. 권장된 실행 시간을 다음이 단계를 실행 하는 실패는 열 및 검출기 손상 될 수 있습니다. 흐름을 끄십시오 다음에 degasser를 해제 합니다.
4. Phenylboronic 산 카트리지 (PBA) 추출
PBA 카트리지 추출 절차 쿠마 외에 계획에 유사 했다. (2011 년) 25. 모든 솔루션 PBA 카트리지 (100 mg, 1 mL)을 통해 공기를 주사기에 의해 강제로 적용 됩니다.
- 조건 1 80:20 이기-물 (v/v) 순차적으로 1% 개미 산 성 및 50 m m 인산 버퍼 (pH 10)의 1 mL를 포함 하는 카트리지.
- PBA 카트리지 통해 버퍼링된 소변 샘플 (1 mL 소변 및 2 mL 인산 염 버퍼, pH 8.5)를 누릅니다.
- 워시 1 mL 50: 50 v/v 이기 인산 버퍼 (10 m m, pH 8.5) 카트리지.
- 1 mL 이기-물 (80:20 v/v) 1% 개미 산을 포함 하는 카트리지 elute
5. 식별 및 Catecholamines의 정량화
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선형성
- 6 농도 (1.5, 3, 12, 25, 50, 그리고 100 ng/mL); 인공 소변 보조 analytes 재고 희석 인공 소변의 희석 볼륨 보충 표 2다음과 같습니다. 보정 곡선을 건설 하기 위한 18 분석 실험 솔루션을 각 농도와 세 개의 병렬 샘플을 확인 합니다.
- 100 ng/mL 실험 솔루션을 인공 소변 DHBA 보조 재고를 10 배 희석.
- 단계 3 (PFSPE 추출 절차)에 따라 5.1.1에서 모든 분석 솔루션을 pretreat. 단계 3, HPLC 크로마를 ECD HPLC 시스템으로 각 해당 eluate의 20 µ L를 주사.
- 농도의 비율에 대 한 Y 축으로 피크 지역 (대상/IS)의 비율을 그려서 5 analytes의 보정 곡선을 건설 (대상/IS) X 축으로 보충 그림 1에서 보듯이.
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감도 대 한 LOD 및 LOQ 값
- 샘플의 HPLC 크로마를 (3 단계), 마찬가지로 HPLC ECD 시스템에 빈 인공 소변의 20 µ L를 주사.
- 5.2.1에서 크로마에 11 빈 신호 값을 수집 하 고 계산 하는 평균 값 Xb 와 표준 편차 Sb. XL XL, 신뢰의 특정 수준에서 검출 될 수 있는 물질의 최소 신호를 계산 X =b+ K * Sb (K는 신뢰 수준에 의해 결정 계수의 잡음 레벨을 반영 하는 Sb 는 측정 방법 및 기계 소음 수준). 따라서, LOD = (L-Xb) X /S = (K * Sb) /S (S 스탠드 작업 곡선의 기울기 값에 대 한).
- 3:1 (K = 3) 검출 (LOD)의 제한에의 한 S/N 및 S/N 10:1 (K = 10) 정량화 (LOQ)의 제한으로 정의 합니다.
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평가 복구
- 진짜 하 고 아군 소변 샘플을 준비 합니다. 3 개의 농도를 실제 소변 보조 analytes 재고 희석 (5, 50, 100 ng/mL) 아군된 소변 샘플을 얻기 위해. 각 분석 솔루션에 대 한 3 개의 병렬 샘플을 준비 합니다. 소변 샘플으로 아군 대상의 수량으로 아군된 농도 계산 합니다. S로이 값을 정의 합니다.
- 100 ng/mL, 단계 5.1.2 에서처럼 하 희석 DHBA 주식.
- 5.3.1에 따라 3 단계에서 각 샘플 솔루션 (PFSPE 추출 절차)를 처리 하 고 크로마 결과 얻기 위해 ECD HPLC 시스템으로 각 해당 eluant의 20 µ L를 주입. Analytes의 값 아군된 소변 샘플에서 측정할 대상 화합물의 수량으로 계산 됩니다. T으로이 값을 정의 합니다.
- 크로마 결과 얻기 위해 HPLC-ECD (3 단계)로 시스템에 소변 샘플의 20 µ L를 주사. Analytes의 값 소변 샘플에서 측정할 대상 화합물의 초기 수량으로 계산 됩니다. 나는이 값을 정의 합니다.
- 표준 곡선 방정식에서 샘플에 대상 화합물의 수량을 계산 합니다. 백분율 복구 방법론 복구 %로 추정 된다 (t - Ai) = × 100 / (s). 평균 값은 표 1에 나와 있습니다.
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평가 부정확성
- 5, 50, 및 100 ng/mL 농도 단계 5.3.1 에서처럼 아군된 인공 소변 샘플을 준비 합니다. 각 분석 솔루션에 대 한 6 병렬 샘플을 준비 합니다. 매일 신선한 실험 샘플을 준비 합니다.
- DHBA 재고 단계 5.1.2 에서처럼 100 ng/mL를 희석.
- 하루 정밀 평가 (n = 6). 3 단계에 따라 5.4.1에서 각 샘플 솔루션을 처리 하 고는 크로마를 ECD HPLC 시스템으로 각 특 파 원 eluant의 20 µ L를 주입. 6 번 같은 날에에서 같은 작업을 할.
- 표준 곡선 방정식에서 샘플에 대상 화합물의 수량을 계산 합니다. 같은 화합물의 동일한 농도에서 하루에 6 개의 분석 실험의 상대 표준 편차 (RSD)-하루 정밀도로 결정 됩니다. 평균 값은 표 1에 나와 있습니다.
- 간 날 정밀 평가 (n = 6). 6 개의 순차적 일에서 매일 같은 시간에 5, 50, 100의 3 개의 농도 대 한 아군된 인공 소변 샘플을 준비 ng/mL, 5.4.1 및 5.4.2., 3 단계에 따라 각 분석 샘플 솔루션을 처리 하 고.
- 결과 얻기 위해 크로마 매일 ECD HPLC 시스템으로 각 해당 eluate 5.4.5에서 20 µ L를 주사. 표준 곡선 방정식에서 샘플에 대상 화합물의 수량을 계산 합니다. 간 날 정밀은 3 개의 농도에서 아군된 인공 소변 샘플에서 분석 실험 수량 RSD 6 순차적 일에서에 표현 됩니다. 평균 값은 표 1에 나와 있습니다.
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Representative Results
이 프로토콜은 간단 하 고 편리한 PFSPE 메서드 소변 샘플을 pretreat HPLC ECD 시스템;을 통해 탐지를 위한 5 catecholamines 풍부 하 프로세스의 다이어그램은 그림 1에 표시 됩니다. 프로토콜은 주로 4 단계 활성화, 로드, rinsing, 그리고 방출-PCE PS nanofibers 및 간단한 고체 상 추출 장치의 소량과 함께 포함 되어 있습니다. PCE PS nanofibers의 형태는 표면 및 다공성 분석기를 사용 하 여 평가 했다 ( 재료의 표참조). 텍스처 속성에 내기 (Brunauer, 모트, 텔러) 표면 지역, 기 공 볼륨 및 기 공 크기-2.8297 m2 g-1, 0.009 c m3 g-1, 그리고 12.76 nm, 각각. 이러한 데이터 프로토콜에 사용 되는 재료는 높은 흡착 효율성과 프로토콜에 낮춘된 바인딩 pH에 기여할 수 있는 표면에 나노 세공을 나타냅니다.
이 프로토콜 사용 하 여 최적화 된 볼륨, 샘플 재료, 침, eluant, 등, 일 산도 및 절차 동안 소비 하는 시간. 첸 외.에 eluant 12.0 M 초 산 솔루션 신랄 한 조건 때문에 protonated 될 adsorbent 이었고 긍정적으로 충전, CAs34,35의 차입에 대 한 유리한입니다. 이 연구에서 eluant 제조 법 인산 30%, 15% 이기 수를 회복 했다 고 55% 증류수. Eluant의 최종 pH 값 3.0으로 조정 되었다. Eluant 용 매 방출 때 산 성 환경을 하지만 가난한 피크 모양으로 이어질 수 있습니다 고 HPLC 시스템에 손상을 12.0 M 아세트산 보다 훨씬 더 온건한 유지 되어야 한다.
catecholamines의 식별에 대 한 표준 솔루션 봉우리 샘플에서 봉우리의 크로마 보존 시간 비교 됩니다. 그림 2 는 다양 한 솔루션에서 HPLC ECD chromatograms의 예를 보여줍니다. 프로토콜 성공적으로 다음 3 catecholamines 및 그들의 대사 산물의 컬럼에 프로필 받아야 HPLC ECD에 의해 명확한 대칭, 잘 정의 된 봉우리와 최소한의 배경 잡음, 그림 2에서에서 볼 수 있듯이 . 기존의 방법으로 비교, 대 한 상업 PBA 카트리지 제어로 선정 됐다. 그림 2에서(는-c), 5 대상 봉우리 (b) thaosein (c), PFSPE 메서드는 PBA 카트리지 방법 보다 더 민감한 나타내는 보다 크게 높다. 또한, DOPAC 피크 PBA 열 DOPAC를 추출 할 수 없음을 나타내는 PBA 카트리지 추출 결과에 표시 하지 않았습니다. 그림 2 (d) 어떤 전처리 및 소변 샘플의 chromatograms 복합 nanofibers PCE PS를 사용 하 여 추출 하는 그림 2(e) 표시 없이 빈 소변 샘플의 크로마 묘사. 그림 2 (f) 표시 없음 DOPAC 추출 결과와 일치 그림 2(c)에서 PBA 열 추출 후 소변 샘플의 chromatograms를 보여 줍니다. 다이어그램은 PFSPE 메서드만 좋은 효과 함께 목표를 추출 하지 수 있지만 또한 대상 화합물에 대 한 좋은 피크 식별 주는 소변에 방해의 대부분의 제거 수를 나타냅니다.
통계 분석 3 catecholamines와 두 대사 산물에 대 한 측정은 안정적으로 공개 재현 (표 1). 모든 대상 화합물 1.5, 100 ng/mL 사이 좋은 선형성을 보였다 (R2> 0.99), 각 분석의 표준 곡선 보 그림 1에서 찾을 수 있습니다. 커브와 R2 값은 analytes는 좋은 선형성 및 특정 선형 범위 내 소변 샘플에서 analytes의 농도의 계산에 대 한 적합 한 상대성 보여줍니다. 0.54 ng/mL, 0.25에서 배열 했다 감지 (LOD)의 한계 그리고 정량화 (LOQ)의 한계는 0.83 1.81 ng/mL, 각각. 신호 대 잡음비 (S/N) 값 3 equalled. 5 대상 화합물의 방법론 복구의 범위에서에서 이었다 97.4% (MHPG) 124.2% (DOPAC), 실제 샘플 응용 프로그램에 대 한 만족 했다. 하루 정밀 4.8% (상대 표준 편차로 표시)에 2.7에서 이었고 간 날 정밀 2-8.1%, 좋은 정밀도 반복성을 표시 했다.
실제 소변 샘플에서 대상의 검출, 28 위험이 높은 유아와 22 건강 한 유아 보육, 소 주 시립 병원의 부문에서 채용 했다. 연구로 모든 50 유아 소년 했다. 6 개월 때, 그들은 일상적인 건강 체크 9 월 2016 년에 촬영 했다. 모든 소변 샘플 수집 되었고 3.1, 3.2, 프로토콜 단계 다음 청소용 고 샘플 단계 3의 나머지를 사용 하 여 분석 했다. 농도 보정 곡선에 대 한 계산 했다. 통계적 인 차이 분산 분석 (ANOVA)에 의해 분석 되었다. 결과 표 2에서 볼 수 있습니다. 두 그룹 사이 catecholamines 및 대사 산물의 차이 비교 하 고 분석 했다. P-값 표시는 catecholamines 되었음을 크게 높은 위험과 건강 한 그룹 사이 다른 대사 산물 MHPG 콘텐츠 이러한 그룹 다른 동안 (p = 0.001). 위험이 높은 유아 그룹 제어 그룹 (14.8 ± 3.6 ng/mL 1.4 ± 0.2 ng/mL 대), 오 줌 MHPG의 수준 높은 유아의 조기 식별에 대 한 잠재적인 표식 수 있습니다 즉 보다 MHPG의 더 높은 금액을 했다.
그림 3 및 표 3 monoamine 재료, 결정에 대 한 고전적인 정량화 방법 설명 하 고 다른 방법으로는 작업 프로세스 및 관심의 주어진 비교. 고전적인 방법에 비해, PFSPE 메서드는 짧은 timespan (5-10 분), 단순화 된 작업 과정, 덜 유기 용 매, 그리고 만족 스러운 방법론 매개 변수가 더 환경 친화 같은 장점이 있습니다. Eluant 필요한 금액이 낮은 볼륨 (50 µ L) 하며 대상 농축 단계 소변에서 대상 화합물에 대 한 검출 감도 크게 촉진 없는 증발. 기존의 입자 기반 SPE에 비해,이 메서드는 효율성을 향상, 준비 과정을 단순화 하며 허용 신뢰성, 선택도, 감도와 분석의 시간을 감소.
그림 1 : 종이와 그것의 장치에 대 한 표현을 PFSPE 절차의 개요 순서도. (1) Gastight 주사기, (2) 피 펫 팁, 그리고 (3) 포장 nanofibers. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 다른 샘플의 chromatograms. (한) 아군 물 샘플 대상과 IS (100 ng/ml)와 추출 없이. (b) 아군 물 샘플 상업 phenylboronic 산 (PBA) 카트리지 PFSPE 방법, 그리고 (c)에 의해 추출. (d) 진짜 빈 소변 샘플 추출 없이. (e) 진짜 소변 샘플 PFSPE 방법에 의해 추출. (f) 실제 소변 샘플 상업 PBA 카트리지에 의해 추출. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 결정 방법의 분석 플로우 차트. (a, b) 이전에 고전적인 추출 방법 보고. (한) 추출 알 루미나, (b), DPBA에 의해 그리고 (c)에 의해이 문서에 제안 된 방법으로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 1: 표준 곡선 및 방정식. 5 analytes에 대 한 표준 곡선 라인의 방정식을 사용 하 여 샘플에서 알 수 없는 analytes 농도 계산 하려면 구성 됩니다. (한) 네브라스카, (b) 전자, (c) 다, (d) MHPG, 및 (e) DOPAC 이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 2: boronic 산 및 cis diol 그룹 또는 인접 한 2 개의 수 산 기 그룹 Boronate 선호도 상호작용. (A) 회로도 boronic 산 양식 5 또는 6 조화로 순환 에스테 르를 여러-오 그룹 사이 상호 작용의 (B) Cis diol 그룹 또는 빨간색 동그라미에 인접 한 두 개의 수 산 기 그룹 묘사 boronic 산 화합물 5 analytes에 대 한 주요 반응 사이트. 이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
| 네브라스카 | MHPG | E | 은 | DOPAC | 다 | |
| 선형 범위 (ng/mL) | 1.5-400을 | 1.5-200 개 | 1.5-100 개 | 1.5-100 개 | 1.5-400을 | |
| R-제곱 값 | 0.9945 | 0.995 | 0.9976 | 0.9902 | 0.9954 | |
| LOD (ng/mL) | 0.323 | 0.322 | 0.313 | 0.657 | 0.249 | 0.543 |
| LOQ (ng/mL) | 1.076 | 1.072 | 1.043 | 2.191 | 0.83 | 1.809 |
| 복구 ± RSD (%)(n=9) | 110.7±2.9 | 97.4±9.1 | 103.9±5.2 | 86.5±7.3 | 124.2±3.1 | 117.3±5.4 |
| 정밀도 (%RSD) (n = 9) | ||||||
| -하루 | 4.5 | 4 | 2.7 | 4.8 | 3.3 | 4.7 |
| 간 날 | 4.1 | 8.1 | 2 | 6.3 | 3.2 | 5.9 |
| 네브라스카, norepinephrine; MHPG, 3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol; E, 피 네 프 린; IS, 내부 표준; DOPAC, 3, 4 Dihydroxyphenylacetic 산; 다, 도파민; | ||||||
표 1: 3 catecholamines 및 표준 솔루션으로 두 가지 대사 산물에 대 한 제안 된 프로토콜의 분석 결과.
| 농도 (ng mL-1) | 제어 그룹 (22) | 높은 위험 유아 그룹 (28) | P 값 |
| 네브라스카 | 7.52±1.34 | 5.56±1.7 | 0.37 |
| MHPG | 1.4±0.2 | 14.8±3.6 | 0.001 |
| E | 24±15.8 | 20.9±5.87 | 0.841 |
| DOPAC | 106.36±30.1 | 72.12±18.07 | 0.312 |
| 다 | 55.53±11.9 | 48.12±20.9 | 0.76 |
| P < 0.05 * * * 두 그룹 사이의 중요 한 차이 보여줍니다 | |||
표 2: 3 catecholamines 및 건강 한 유아와 위험이 높은 유아 사이 urines에 두 대사 산물에 대 한 농도의 비교. 결과 통계적으로 분산 분석 (ANOVA)을 사용 하 여 p 의 의미 수준으로 분석 되었다 MHPG 콘텐츠 간의 차이 대 한 0.05 =. 수단 ± 표준 편차 표시 됩니다.
| 샘플 | 소진된 용 (mL) | 샘플 볼륨 (mL) | 전처리 시간 (분) | 선형 범위 | LOD | 상대 복구 (%) | 증발 및 redissolve |
분석 방법 |
| 용 매 | 볼륨 | 시간 (분) | 복구 (%) | 용 매와 | ||||
| (mL) | (mL) | 재구성 | ||||||
| 찌 꺼 기 | ||||||||
| 소변 | 0.5 | 0.05 | 10 | 2.0-200 ng/mL (네브라스카, E, 다) | 0.2-0.5 ng/mL (네브라스카, E, 다) | 88.5-94.5 (네브라스카, E, 다) | 아니요 | HPLC-ECD (첸 그 외 여러분, 2016) |
| 소변 | 19 | 0.7 | - | 47-167 µ g/L (다) | 166-500 nM (다) | 98.3-101.1 (다) | 아니요 | HPLC-UV (Piotr 외., 2016) |
| 소변 | 1.3 | 0.01 | - | 0.5-1250 ng/mL (네브라스카, E, 다, NMN, 미네소타) | 0.5-2.5 ng/mL (네브라스카, E, 다, NMN, 미네소타) | 74.1-97.3 (네브라스카, E, 다, NMN, 미네소타) | 아니요 | LC-MS/MS (그 외 여러분 Li, 2016) |
| 소변 및 플라즈마 | 20 | 0.05 | 10 | 0.04-2.5 ng/mL (네브라스카, E, 다) | 0.01-0.02 ng/mL (네브라스카, E, 다) | 87.0-97.5 (네브라스카, E, 다) | 아니요 | HPLC-UV (모하마드 외., 2016) |
| 소변 | < 0.5 | 0.1 | 5 | 1.5-400 ng/mL (네브라스카, MHPG, E, DOPAC, 다) | 0.249 0.543 ng/mL (네브라스카, MHPG, E, DOPAC, 다) | 97.4 124.2 (네브라스카, MHPG, E, DOPAC, 다) | 아니요 | 이 작품 |
| -, 정의 되지 않은. PBA, Phenylboronic 산 |
||||||||
표 3: monoamines 또는 기타의 전처리에 대 한 연구와 함께이 작품의 비교는 최근 몇 년 동안에 주제 관련.
보충 표 1: 매개 변수 검색 및 HPLC ECD에 의해 종이에서 analytes의 정량화를 계측. 이 테이블을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 표 2: 표준 곡선의 5 analytes에 대 한 준비. 이 테이블을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 문서에 제안 된 PFSPE 메서드는 중요 하 고 그것의 신속성, 단순성, 및 편의 의미 있을 수 있습니다. Adsorbents 프로토콜에 사용 되는 electrospun nanofibers, 높은 표면 영역 볼륨 비율, 있고 높은 효율으로는 analytes를 흡착 한. 절차만 nanofiber의 몇 밀리 그램 및 eluant 용 매, 작은 볼륨을 필요로 하 고는 analytes을 집중 하는 증발 단계를 필요 하지 않습니다. 여기, 우리 설정 검색에 대 한 효과적인 방법에 새 사용자를 허용 하는 HPLC ECD 기반 프로토콜에 대 한 자세한 개요와 3 catecholamines의 2 (네브라스카, E, 다, 고 MHPG, DOPAC) 그들의 대사 산물의 정량화를 제시 했습니다.
이 프로토콜의 우수성 주로에서 유래 4 개의 중요 한 단계는 절차 동안, 그림 1에서 보듯이: PCE PS nanofibers 매 빠른 흡수로 이어지는 몇 밀리 그램의 크기를 줄이기 대상 화합물을 캡처를 사용 하 여 / 탈 착, 그리고만 액체 (1); 방출의 작은 볼륨을 필요 (2); 그들의 hydrophobicity를 개선 하기 위해 analytes와 복잡 한 소변으로 DPBA를 추가 DPBA는 analytes를 유지 하 고 (3); 불순물 제거를 포함 하는 솔루션은 nanofibers rinsing 그리고 analytes (4)에 대 한 좋은 감도 및 선택도를 추출 및 분석 조건의 최적화.
(1) 단계, PCE PS에 대 한 adsorbent 능력의 성능의 메커니즘은 다양 한 요인에 표시 수 있습니다. 크라운 에테르 중합체는 nanofibers에 실수로이 신문에 catecholamines 같은 H-채권, 아민 그룹을 포함 하는 게스트 분자와 복잡 한 호스트-게스트를 형성할 수 있습니다. 또한, Hongyou 호 외. , Jishun 첸 외. 또한 제안 boronic 산 B N 상호 작용을 통해 화학 구조에서 질소 원자와 접착 시킬 수 있다 그리고 소수 성 골격 벤젠 고리와 analytes36,37의 다른 지방 족 그룹 상호 작용할 수 있습니다. 또한, 탈 착 과정에서 수소 결합 및 B N 상호 작용 깨집니다 쉽게 매우 낮은 pH;에 따라서, 산 성 ph eluants는 일반적으로 탈 착에 대 한 탐사에 적합 합니다. 또한, 있다 또한 여러 보조 상호 작용, 소수 성, 이온를 포함 하 여 그리고 수소 결합, boronic 화학 물질 및 관련된 화합물36,37,38사이 발생할 수 있는. 이러한 모든 상호이 작용은 자료를 analytes의 흡착에 기여할 수 있습니다.
단계 (2), 추가 된 DPBA의 도움으로, PCE PS nanofibers adsorb DPBA-카 테 콜 아민 단지 빠르게. 젠 리 우 외. boronate 선호도 자료 glycoproteins, nucleosides, saccharides, glycans, 유기 화합물의 분자 인식 하 고 선택적 분리에 대 한 중요 한 미디어로 등장 하 고38에 보여주었다. complexation 주로 발생 boronic 산 및 cis diol 그룹, 또는 두 개의 인접 한 수 산 기 그룹 간의 boronate 선호도 상호 작용 양식 5 또는 6 조화로 순환 에스테 르에서 같이 보조 그림 2A. 보충 그림 2B boronic 산 화합물을이 작품에서 5 analytes에 대 한 주요 반응 사이트를 보여 줍니다. 주변 될 때 산 성, boronic 산-cis-diol 복잡 한 dissociates. Boronic 산와 cis diol 그룹 또는 인접 한 두 개의 수 산 기 그룹 사이 상호 작용 광범위 하 게, 상대적으로 강력 하 게 존재 한다.
(3) 단계에 대 한 복잡 한 analytes 사이 형성 하 고 DPBA 저장할 수 있는 그들은 흡착 제에 다른 불순물 PCE PS 표면에서 씻어 서는 하는 동안 대상에 대 한 최고의 예약을 달성. (4) 단계, 최적 pH는 약 9.0 붕과 catechol 복합39의 결합에 대 한 보여 주는 보고서 되었습니다 합니다. 그러나, 첸 외. 카 테 콜 아민-DPBA의 complexing 최고의 pH 값을 탐색 하 고 발견 CAs에 대 한 복합 PS PCE nanofibers의 흡착 성능을 최적의 pH 값이 6.0과 7.034,35사이 변경 되었다. 리 우 외. 충 치 및 nanoscale 공과 반응 동안에 형성 하는 B-N ligands의 공간 감으로 특히 boronate 산 성 화합물에 대 한 지원 자료의 구조 또한 크게 낮출 수 있는 연루는 pH를 바인딩 및 바인딩 선호도38를 강화. 카 테 콜 아민 구조 뿐만 아니라 PCE PS 구조-NH 그룹 갖추고 있습니다. 따라서, 속성 및 PCE-PS (데이터 대표 결과에서 같이), 형성, B N ligands의 나노 세공 프로토콜에 낮춘된 바인딩 pH에 기여할 수 있습니다. 따라서,이 프로토콜에 최적의 pH 값을 크게 절차를 간소화 하 고는 analytes의 저하 방지 중립, 수 있습니다.
Catcholamine 결정의 주요 한계는 생물학 견본에서 그들의 농도 매우 낮은 하 고 그들의 구조는 안정 (쉽게 산화 하는); 또한, 미디어에서 불순물의 제거 하기가 어렵습니다. 따라서, 생물 학적 샘플에서 카 테 콜 아민의 분석, 고체 상 추출에 의해 일반적으로 전처리가 필요 합니다. 이 문서에 제안 된 PFSPE 메서드는 소변 샘플에서 analytes에 대 한 간단 하 고 편리한 사전 농도 제공. 하지만, 실험을 하 고, 실험 상태를 엄격 하 게 제어 해야 합니다, 빛 노출 방지 등 단축 방법으로 전처리 시간 가능한.
방법의 적용 3 catecholamines와 건강 한 유아와 위험이 높은 유아의 소변에서 두 대사 산물의 농도 결정 하기 위해 사용에 의해 평가 되었습니다. 오 줌 MHPG의 두 그룹 사이 상당한 차이가 있었다. 이전 요약, 인간의 신체에서 MHPG 금액은 지금 주로 보고 한 noradrenergic 신경 톤, 카 테 콜 아민 대사 활동 중앙 및 주변 신경 시스템40,41에서 맞게 42, 중앙 북동 대사43에 대 한 유용한 플라즈마/소변 표식입니다. 위험도 높은 유아, hypoxic-허 혈 성 뇌 (히) 같은 요인의 다양 한 두뇌 외상 및 뇌 모욕, 어린 시절 neurodevelopmental 적자의 다른도로 이어지는 발생 합니다. 이 뇌 손상에 체액44,45로 신경 전달 물질 (MHPG 포함)의 출시를 끌 것입니다. 보고서에 따르면 jw 메리어트 Maas에 의해, 뇌, CSF, 플라즈마, MHPG46,47의 요도 농도 사이의 중요 한 상관 관계 있다. 소변에 총 (무료 + 활용) MHPG의 측정 긴 중앙 네브라스카의 물질 대사 및 인간41,,4849에 주변 NE 대사를 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 따라서, 그것은 위험이 높은 유아는 건강 한 사람과 비교 하는 noradrenergic 신경 톤 손상 중앙에서 카 테 콜 아민 대사 주변 신경 시스템에 영향을 미치는 체결 될 수 있습니다. 이 차이 나타냅니다 추가 연구 요 MHPG 수준과 neurodevelopmental 적자 사이의 관계에 이루어져야 한다. 그것은 이러한 신경 전달이 물질에 관련 된 질병을 평가 하기 위한 병원에서 사용 하기 위해 유망한 장래성으로 제안된 된 방법 소변에 카 테 콜 아민 존재의 결심을 위해 사용 될 수 증명 되었습니다.
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Disclosures
저자는이 문서에서 설명 하는 자료에 관한 모든 금융 조직과 충돌의 관심을 증명 합니다.
Acknowledgments
이 연구는 국립 과학 재단의 중국 (No.81172720, No. 81673230), 사회 개발 연구 프로그램의 장쑤 성 과학 및 기술 부 (제에 의해 지원 되었다 BE2016741), 과학 및 중국의 질 감독, 검사 및 검역 (2015QK055), 아동 발달 및 교육 과학기술부의 과학 학습의 주요 연구소의 오픈 프로젝트 프로그램 일반 관리의 기술 프로젝트 남동 대학 (CDLS-2016-04). 우리는 진심으 원 노래와 Ping Liu 샘플 컬렉션에 우리 지원 인정 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 µL pipette tip | column to contain nanofibers | ||
| PCE-PS nanofibers | material for PFSPE extraction | ||
| steel rod (about 0.5 mm diameter) | fill the nanofibres into the column | ||
| gastight plastic syringe (5 ml) | compress solution into the end of the tip | ||
| methanol | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 67-56-1 | |
| diphenylborinic acid 2-aminoethyl ester(DPBA) | Sigma-Aldrich.Inc | A-106408 | complex reagent |
| norepinephrine(NE) | Sigma-Aldrich.Inc | A-9512 | analyte |
| 3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol(MHPG) | Sigma-Aldrich.Inc | H1377 | analyte |
| epinephrine(E) | Sigma-Aldrich.Inc | 100154-200503 | analyte |
| 3, 4-Dihydroxyphenylacetic acid(DOPAC) | Sigma-Aldrich.Inc | D-9128 | analyte |
| dopamine(DA) | Sigma-Aldrich.Inc | H-8502 | analyte |
| 3, 4-dihydroxybenzylamine hydrobromide(DHBA) | Sigma-Aldrich.Inc | 858781 | interior label |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich.Inc | 75-05-8 | eluriant and mobile phase |
| phosphoric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7664-38-2 | eluriant |
| uric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 69-93-2 | artifical urine |
| creatinine | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 60-27-5 | artifical urine |
| trisodium citrate | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 6132-04-3 | artifical urine |
| KCl | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7447-40-7 | artifical urine |
| NH4Cl | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 12125-02-9 | artifical urine |
| NaHCO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | SWC0140326 | artifical urine |
| C2Na2O4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 62-76-0 | artifical urine |
| NaSO4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7757-82-6 | artifical urine |
| disodium hydrogen phosphate | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10039-32-4 | artifical urine |
| urea | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 57-13-6 | artifical urine |
| NaCl | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7647-14-5 | artifical urine |
| MgSO4.7H2O | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10034-99-8 | artifical urine |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10035-04-8 | artifical urine |
| HCl | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7647-01-0 | artifical urine |
| citric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 77-92-9 | artifical urine and mobile phase |
| EDTA disodium salt | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 34124-14-6 | mobile phase |
| monometallic sodium orthophosphate | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7558-80-7 | artifical urine and mobile phase |
| 1-heptanesulfonic acid sodium salt | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 22767-50-6 | mobile phase |
| sodium hydroxide | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 1310-73-2 | mobile phase |
| phenylboronic acid column(PBA column) | Aglilent | 12102018 | PBA extraction |
| Inertsil® ODS-3 5 µm 4.6×150 mm column | Dikma | 5020-06731 | HPLC column for seperation |
| SHIMADZU SIL-20AC prominence AUTO SAMPLER | Shimadzu Corporation, Japan | SIL-20AC | auto injection for eluriant |
| SHIMADZU LC-20AD High Performance Liquid Chromatography | Shimadzu Corporation, Japan | LC-20AD | HPLC pump |
| SHIMADZU L-ECD-60A electrochemical detector | Shimadzu Corporation, Japan | L-ECD-60A | detector for the analytes |
| ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry System | Micromeritics, USA | surface and porosity analyzer |
References
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