Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

طريقة مريحة لاستخراج وتحليل مع اللوني السائل عالي الضغط الكاتيكولامينات العصبية وعلى نواتج الأيض

Published: March 1, 2018 doi: 10.3791/56445
Automatic Translation
1, 3, 4, 1, 2
1School of Public Health of Southeast University, Laboratory of Environment and Biosafety Research Institute of Southeast University in Suzhou, 2Key Laboratory of Child Development and Learning Science (Ministry of Education), School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University, 3School of Public Health, Tianjin Medical University, 4British Columbia Academy, Nanjing Foreign Language School

Summary

ونقدم استخراج المرحلة الصلبة مريحة بالإضافة إلى الضغط العالي اللوني السائل ([هبلك]) مع كشف الكهروكيميائية (النماء) للتصميم المتزامن لثلاثة مونوأمين العصبية واثنين من بهم المستقلبات في البول الرضع. ونحن أيضا تحديد المستقلب مهبج كالعلامات البيولوجية محتملة للتشخيص المبكر لتلف الدماغ للأطفال الرضع.

Abstract

استخراج وتحليل الكاتيكولامينات العصبية في السوائل البيولوجية لها أهمية كبيرة في تقييم وظيفة الجهاز العصبي والأمراض ذات الصلة، ولكن القياس الدقيق لا يزال يمثل تحديا. وقد وصف العديد من البروتوكولات للقياس العصبي مجموعة متنوعة من الصكوك، بما في ذلك الفصل اللوني للسوائل ذات الضغط العالي ([هبلك]). ومع ذلك، هناك أوجه قصور، مثل عملية معقدة أو صعبة للكشف عن الأهداف المتعددة، التي لا يمكن تجنبها، وفي الوقت الحاضر، لا يزال أسلوب التحليل المهيمنة [هبلك] يقترن حساسة الكهروكيميائية أو الكشف عن فلوريميتريك، ونظرا حساسية عالية والانتقائية الجيدة. هنا، يرد وصف بروتوكول مفصل للمعالجة والكشف عن الكاتيشولامين مع ارتفاع الضغط اللوني السائل مع كشف الكهروكيميائية ([هبلك]-النماء) في عينات البول الحقيقية للرضع، استخدام النانو اليكتروسبون مركب مؤلفة البوليمرية التاج خماسي البروم ثنائي الفينيل مع البوليستيرين الإدمصاص، المعروف أيضا كأسلوب وجبات والألياف الصلبة مرحلة الاستخراج (بفسبي). ونحن تبين كيف البول عينات يمكن أن بريكلينيد بسهولة بعمود معبأة nanofiber مرحلة صلبة، وكيف يمكن تحليلها في العينة إثراء سريعاً، ديسوربيد، والكشف على نظام لتنمية الطفولة المبكرة. بفسبي يبسط إلى حد كبير إجراءات المعالجة المسبقة للعينات البيولوجية، مما يسمح لتقليل الوقت والنفقات والحد من الخسائر في الأهداف.

وعموما، هذا العمل يوضح بروتوكول بسيطة ومريحة لاستخراج المرحلة الصلبة بالإضافة إلى نظام [هبلك]-نماء للتصميم المتزامن من العصبية مونوأمين الثلاثة (إفراز (شمال شرق)، أدرينالين (ﻫ)، الدوبامين (DA)) واثنين من الأيض (3-ميثوكس-4-هيدروكسيفينيلجليكول (مهبج) و 3 و 4-ديهيدروكسي-فينيل الخل حمض (دوباك)) في البول الرضع. تم تطبيق البروتوكول المتبعة لتقييم اختلافات الكاتيشولامين البولية وعلى نواتج الأيض بين الرضع شديدة الخطورة مع تلف الدماغ قبل الولادة وضوابط صحية. وكشف تحليل مقارن فرقا كبيرا في مهبج البولية بين المجموعتين، مشيراً إلى أن نواتج الأيض الكاتيكولامينات قد تكون علامة مرشح مهم للتشخيص المبكر للحالات المعرضة للخطر لتلف في المخ عند الرضع.

Introduction

الكاتيكولامينات العصبية ومحتوياتها المستقلب في سوائل الجسم يمكن أن تؤثر على الوظيفة العصبية وتؤثر على التوازن بين الدول استجابة لحافز إلى حد كبير1. أبنورميتيس قد يسبب مجموعة متنوعة من الأمراض، مثل فيوتشروماسيتوما، جانجليونيوروما، نيوروبلاستوما، واضطرابات الجهاز العصبي1،2. استخراج وتحديد الكاتيشولامين في سوائل الجسم ذو معنى لتشخيص الأمراض ذات الصلة. ومع ذلك، الكاتيشولامين في عينات بيولوجية موجودة بتركيزات منخفضة وتتأكسد بسهولة. وعلاوة على ذلك، يصعب جداً الوت بسبب كمية كبيرة من التدخل في المتوسط3. وهكذا، الكشف عن واحد من الكاتيشولامين في السوائل البيولوجية لا يزال يمثل تحديا.

وهناك ملاحظات تبين أن البولي الكاتيشولامين يمكن أن تكون مقياسا للإجهاد، وأن المستويات علامات بيولوجية هامة الاستجابة للتحفيز عن طريق اللمس من المعالجة في الأطفال حديثي الولادة5. وفقا للبحوث، في خطر للدماغ إصابة4،،من56جميع الرضع الذين عانوا من حوادث سابقة لأوانها، والإصابة قد يؤدي إلى إطلاق غير طبيعي الكاتيشولامين والمسائل ذات الصلة في السوائل. وتوجد تقنيات الرنين المغناطيسي المتقدمة التي يمكن الكشف عن تلف في المخ في مراحل سابقة7،8. ومع ذلك، ضمن ح 48 الأولى، عملية النماء العصبي الشاذ سوف يسبب إصابة في الدماغ الدائمة التي لن تكون واضحة في الصور الطبية11. وإلى جانب ذلك، أداة عالية التكلفة وندرة الموارد، جنبا إلى جنب مع عوامل أخرى، يجعل من المستحيل على جميع وحدات الأطفال حديثي الولادة في الحصول على هذه التقنيات العصبية-التصوير المتخصصة. ومع ذلك، استخدام العلامات البيولوجية بسهولة ودود والعملية (مثل الكاتيشولامين وعلى نواتج الأيض) يمكن التغلب على أوجه القصور هذه، وفحص العلامات البيولوجية في السوائل البشرية قد تساعد في التشخيص المبكر لإصابة في الدماغ ويؤدي إلى موجه تعريف مولودا جديداً تحتاج إلى نيوروبروتيكشن9. ويمكن الكاتيشولامين في البول مؤشر سهل وواضح، بسبب الارتباط المباشر بين المبلغ منها صدر في السوائل والدالة نيورواكتيفيتي.

بين السوائل البيولوجية، عينات البلازما والسائل الدماغي النخاعي (CSF) ليست سهلة للحصول على عن طريق الإجراءات المؤلمة القائمة، ومن الصعب جداً أيضا للتخلص من التدخل بسبب البروتين لاصقة وغيرها من الشوائب، مما يؤدي إلى مزعجة و وكرر عملية أخذ العينات مضيعة للوقت الذي للكشف. أيضا، للأطفال، من المستحيل تقريبا الحصول على العينات بطريقة مؤلمة. ولذلك، أخذ العينات البولية أفضل من الأشكال الأخرى لأخذ العينات، كما غير الغازية، وسهل التشغيل، ويمكن القيام به مرارا وتكرارا. عينات البول وفيرة وسهلة لتخزين، وإظهار مزايا كبيرة على أشكال أخرى من العينات البيولوجية.

وتشمل الأساليب الرئيسية لقياس الكاتيشولامين في السوائل البيولوجية فحوصات راديونزيميك10وفحوصات مسيل المناعي المرتبط بالانزيم11، فولتاميتري12 والعدسة الحرارية قياس الطيف الكتلي13. ولكن أوجه القصور الموجودة، مثل عمليات معقدة وصعبة للكشف عن أهداف متعددة. اليوم، هو أسلوب التحليل المهيمنة كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك])14، مقترنة بحساسية الكهروكيميائية15 أو فلوريميتريك الكشف عن16، بسبب حساسية عالية والانتقائية الجيدة. مع تكنولوجيا الكتلي جنبا إلى جنب، مثل كروماتوغرافيا سائلة/الطيف الكتلي (LC/MS) والسائل اللوني/قياس الطيف الكتلي/وسائل قياس الطيف الكتلي (LC/MS/MS) والتحليل الكمي للعصبية يمكن تحقيق عالية الدقة والتحديد17،18. ومع ذلك، يتطلب الأسلوب MS أجهزة مكلفة، فضلا عن القوى العاملة المؤهلة إلى حد كبير، مما يجعل من الصعب على تطبيقها عالمياً في المختبرات الأكثر تقليدية الأسلوب. نظم [هبلك]-النماء مجهزة عادة في المختبرات السريرية والأكثر تقليدية، وهكذا أصبحت خياراً جيدا والمشتركة لمجموعات بحثية لاستخدامها لتحديد المواد الكيميائية، ولكنها تتطلب العينة أدخلت في النظام أن تكون نظيفة ومن عبارة المجلد19. وهكذا، أنها ذات أهمية كبيرة لتنقية وتتكثف العينة قبل التحليل. هو الأسلوب الكلاسيكي لتنقية خطوة استخراج سائل14،،من1520 واستخراج المرحلة الصلبة دون اتصال، بما في ذلك أكسيد الألومنيوم المنشط العمود21،22 وديفينيلبوراتي (دببا) كومبليكسيشن23،24،،من2526.

لي مييونغو et al. تم استخدام الراتنج البوليمر كيميائيا تعديل مع التاج خماسي البروم ثنائي الفينيل الممتزة انتقائية استخراج الكاتيشولامين من البول البشري منذ 200727. أيضا، في عام 2006، أنه هايبو وآخرون. أظهر نهجاً توليف سهلة لاستخراج تقارب برنت بيوتيليزينج ماصة مركب استناداً إلى نانوماجنيتيك نانوماجنيتيك فونكتيوناليزابل سيلسيسكويوكساني أوليجوميريك بوليهيدرال (POSS)، وتطبيقه في إثراء الكاتيشولامين في البول البشري (نورادرينالين وادرينالين والايزوبرينالين)28. كما أخذوا الاستفادة من المواد النانوية إنجاز هذا العمل، باستخدام تقنية تسمى نانو-اليكتروسبينينج وتشكيل المواد الليفية البوليمر في النانو. يمكن ضبط عملية اليكتروسبينينج القطر ومورفولوجيا، والمحاذاة المكانية للمنتج بالتحكم في الجهد العامل وتغيير مضمون الحل الغزل جنبا إلى جنب مع معلمات أخرى29. وبالمقارنة مع خرطوشة الدائرة التقليدية، النانو اليكتروسبون مناسبة جداً لاستخراج وإثراء تحليلها المستهدفة من مصفوفة معقدة، كما أنها مجهزة بارتفاع سطح المنطقة إلى حجم نسب الجسميات تحليلها بكفاءة عالية، و يحمل أكثر تسيطر بسهولة السطحية الخصائص الكيميائية، السماح بالمرفقات مفيد من المركبات المستهدفة. هذه الخصائص تجعل منها خيارات جيدة لجمعية مهندسي البترول الممتزات، يقلل إلى حد كبير في المرحلة الصلبة والامتزاز كمية المذيب30،31،،من3233. الكاتيشولامين في عينات البول، استخدمت النانو اليكتروسبون تتألف من الاثير التاج أبوليميريك مع البوليستيرين (PCE-PS) لاستخراج ثلاثة (ني وه ودا) الكاتيشولامين34بشكل انتقائي. الصحيفة أشارت إلى أن الاثير التاج انتقائية تمتز أهداف ني وه دا، التي تستند إلى الهندسة الصحيحة لملزمة الكاتيشولامين عن طريق تشكيل السندات الهيدروجين. النتائج عرض الاثير التاج مادية فعالة، إزالة المركبات التدخل الأخرى الواردة في العينات البيولوجية. مستوحاة من هذا التقرير، طريقة جديدة وضعت لاستخراج انتقائية الكاتيشولامين باستخدام النانو اليكتروسبون مركب يتألف من PCE-س.

في هذه الورقة، الأسلوب الذي ذكرت سابقا34 قد تحسنت ويعمل ليس فقط لنجاح تحليل ه، ني، ودا، ولكن أيضا على والايضات، مهبج ودوباك، في البول. ونحن أيضا استكشاف إمكانيات جديدة لآلية عملية الامتزاز. يبين الطريقة مرضية كفاءة الاستخراج والانتقائية لتحليلها الخمسة، وتم التحقق من الأسلوب في تحليل البول من الرضع شديدة الخطورة مع تلف الدماغ قبل الولادة وضوابط صحية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم الحصول على موافقة مستنيرة من الآباء والأمهات، وتم الحصول على موافقة مجلس المراجعة المؤسساتية للدراسة. وأجريت الدراسة وفقا لمدونة الأخلاقيات "الرابطة الطبية العالمية" (إعلان هلسنكي) للتجارب التي تنطوي على البشر. مقدمي الرعاية لجميع المشاركين في تقديم كتب موافقة ليجري الملتحقين بالدراسة. موافقة اللجنة الأخلاقية من مستشفى تشونغدا، انضم مع جامعة جنوب شرق، كما تم الحصول على.

1. إعداد الأعمدة والحلول اللازمة لاستخراج وتحديد الكاتيشولامين

  1. إعداد العمود بفسبي. تقسيم 1-2 مغ النانو PCE-PS إلى مختبرين 5-6، واستخدام قضيب معدني ما يرام مع 0.5 مم لضغطها المنظم في نهاية طرف الماصة بحجم 200 ميليلتر.
  2. إعداد البول المصطنعة التي تزن ز 2.427 اليوريا، حمض اليوريك ز 0.034، كرياتينين ز 0.09، سترات صوديوم 0.297 ز، كلوريد الصوديوم 0.634 ز، ز 0.45 كلوريد البوتاسيوم، كلوريد الأمونيوم 0.161 ز، 0.089 غ كلوريد الكالسيوم ثنائي هيدرات، 0.1 غ سلفات المغنزيوم هيبتاهيدراتي وبيكربونات الصوديوم 0.034 ز، ز 0.003 أكسالات الصوديوم، كبريتات الصوديوم 0.258 ز، فوسفات هيدروجين الصوديوم 0.1 غ، وز 0.011 ثنائي فوسفات هيدروجين وتذوب المواد الكيميائية المذكورة أعلاه إلى 200 مل منزوع الماء.
  3. إعداد 2 مغ/مل الحل الأسهم لحل ديفينيلبوراتي (دببا) بإذابة 2 مغ المجمع في 1 مل ماء المقطر. مخزن الحل في الظلام في 4 درجات مئوية.
  4. معيار أكثر
    ملاحظة: يتم التركيب الكيميائي وخصائص الكاتيشولامين غير مستقرة، وهي تتحلل بسهولة. عملية إعداد معايير يجب أن تكون سريعة جداً، ويجب تجنب التعرض لأشعة الشمس المباشرة.
    1. وزن 1.0 مغ ني، ه، دا، مهبج، دوباك والداخلية الموحدة 3، 4-ديهيدروكسيبينزيلاميني هيدروبروميد دبا في أنابيب ميكروسينتريفوجي مل 1.5 منفصلة. تمييع الحل دبا في المياه إلى 100 نانوغرام/مليلتر قبل الاستخدام.
    2. يتذبذب بالمعايير المعدة في الظلام بسرعة عالية حتى يحل تحليلها تماما. وهذا هو الرصيد الابتدائي؛ تخزين في-20 درجة مئوية لتصل إلى عدة أسابيع.
    3. إعداد الأرصدة أكثر نانوغرام/مليلتر 1,000 الثانوية. ني والإلكتروني، دا، دوباك ومهبج، نقل 5 ميليلتر من كل الأوراق المالية الأولية أكثر إلى 4,975 ميليلتر من الماء المقطر في أنبوب الطرد مركزي 5 مل، وتخزينها في الظلام في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. تعد هذه الحلول اليومية الطازجة. دبا، نقل 5 ميليلتر من الأسهم الرئيسية في 4,995 ميليلتر من الماء المقطر في أنبوب الطرد مركزي 5 مل، وتخزينها في الظلام بشكل منفصل في 4 درجات مئوية.
    4. جعل تخفيف المزيد مع الأسهم الثانوية أكثر لإنشاء منحنى قياسي (على سبيل المثال-، التكميلية الجدول 2). تخزين الحلول في الظلام في 4 درجات مئوية وإعداد يومية جديدة.
    5. اختبار الجهد الأمثل لتنمية الطفولة المبكرة للكشف عن استخدام الأسهم القياسية مع التركيز السليم. تختلف الجهد العثور على قيمة أفضل مظهر الذروة فيها تحليلها.
  5. إعداد الوانت التي تحتوي على 30% حامض الفوسفوريك، الاسيتو الانيتريل 15 في المائة، ونسبة 55% ماء مقطر. 10 مل من المذيب الوانت، استخدم 5.5 مل ماء المقطر، وإضافة 1.5 مل من الاسيتو الانيتريل و 3 مل من حامض الفوسفوريك قطره قطره في الماء.

2-إعداد عينات البول الحقيقية والمرحلة المتنقلة

  1. وقد جمع البول صباح اليوم الأول لأطفالهن الرضع باستخدام أكواب البول العقيم الأمهات. نقل العينات في أنابيب البولي بروبيلين وتسمية فورا. ثم تخزين العينات في ثلاجة-20 درجة مئوية.
  2. دوامة والطرد المركزي غرفة العينات البولية في س 1,510 ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة (RT) للتخلص من معظم الجسيمات التدخل. تجاهل الرواسب وجمع سوبيرناتانتس لإجراء مزيد من التجارب. من أجل استخراج تحليلها على نحو فعال، الشروع في المعالجة بفسبي (الخطوة 3) مباشرة بعد سينتريفوجينج.
  3. التحضير لمرحلة الجوال
    1. تحضير زجاجة نظيفة، لعلي الأقل 1. يتم سرد تكوين المرحلة المتنقلة في التكميلية الجدول 1؛ 1 L المرحلة المتنقلة، تدبير ز 6.7242 من حامض الستريك، مغ 93.06 الإثيلين ديامينى تترا حمض الخليك (يدتا) ثنائية الصوديوم الملح، ز 7.02 من الديامونيوم الصوديوم مونوميتاليك، هيدرات 404.5 ملغ ملح الصوديوم حمض 1-هيبتانيسولفونيك، و 3.5 g الصوديوم إلى القمقم. إضافة 40 مل الاسيتو الانيتريل والماء لمل 1,000 المقطر. تحرض ويهتز يتم لمدة 15 دقيقة حتى يذوب الجميع في الحل هذه المسألة.
    2. باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني بقطب زجاج، ضبط قيمة pH المرحلة المتنقلة إلى 4.21 بمحلول هيدروكسيد الصوديوم مشبعة.
    3. تصفية المرحلة المتنقلة مع 0.45 ميكرومتر غشاء microporous فلوريد الفينيليدن وجهاز شفط فراغ للتخلص من الشوائب.
    4. استخدام الموجات فوق الصوتية الاهتزاز لمدة 15 دقيقة ديغا المرحلة المتنقلة في كل مرة قبل الاستخدام.

3-بفسبي استخراج وتحليل [هبلك]

  1. تنشيط النانو. اضغط 100 ميليلتر من الميثانول و 100 ميليلتر من الماء من خلال التسلسل العمود بفسبي باستخدام حقنه 5 مل بطريقة بطيئة، دروبويسي.
  2. مزيج 100 ميليلتر البول العينة مع 100 ميليلتر 2 مغ/مل دببا الحل و 30 ميليلتر 100 نانوغرام/مليلتر من دهبا الحل (هو، المعايير الداخلية) في أنبوب 0.5 مل الجيش الشعبي، ثم نقل الحل المختلط للعمود بفسبي. اضغط الحل عينة مختلطة من خلال العمود بفسبي بحقنه بلاستيكية جاستايت 5 مل باستخدام قوة ضغط الهواء.
  3. ليتش العمود ثلاث مرات بتحميل 100 ميليلتر من دببا الحل (2 مغ/مل) في العمود جمعية مهندسي البترول، ودفع الحل ببطء من خلال الخرطوشة مع ضغط الهواء باستخدام المحاقن بلاستيكية جاستايت 5 مل.
  4. تحميل 50 ميليلتر من الوانت على العمود بفسبي، ويدفع به عن طريق العمود، جمع النذرة مع أنبوب 0.5 مل الجيش الشعبي.
  5. قم بتشغيل ديجاسير لجنة البرنامج الرفيعة المستوى ديغا الهواء في النظام. قبل تحليل عينة، يجب تشغيل النظام لأكثر من 0.5 ح مع المرحلة المتنقلة حجته، والحد من الضوضاء خط الأساس. انظر التكميلية الجدول 1 عرض معلمات الإعداد للنظام [هبلك].
  6. العينة 20 ميليلتر من النذرة عينات تلقائي باستخدام، وحقن ثم النظام [هبلك]-نماء الطفولة المبكرة.
  7. عندما تكتمل التشغيل، إيقاف الخلية للكشف عن استخدام واجهة كاشف. عدم إيقاف تشغيل الخلية مع رمز التبديل في الجزء الخلفي من الجهاز، كما أن هذا يمكن أن يلحق الضرر الصك.
  8. يدوياً تغيير تكوين المرحلة المتنقلة للمياه الميثانول و 90% 10%. تشغيل لمدة 30 دقيقة على الأقل. ثم، يدوياً تغيير المرحلة المتنقلة إلى الميثانول الصف [هبلك]. تشغيل لمدة حوالي 15 دقيقة لحماية النظام في الميثانول. يمكن أن يؤدي الفشل في تشغيل هذه الخطوة التالية الموصى بها إدارة الوقت الأضرار للعمود والكاشف. إيقاف التدفق، ثم إيقاف تشغيل في ديجاسير.

4. استخراج خراطيش (PBA) حمض فينيلبورونيك

PBA خرطوشة استخراج إجراءات مماثلة للخطة في كومار وآخرون. (2011) 25-يتم دفع جميع الحلول من خلال الخرطوشة PBA (100 ملغ، 1 مل) مع الهواء القسري بحقنه.

  1. شرط الخرطوشة مع 1 مل 80:20 الاسيتو الانيتريل-الماء (v/v) الذي يحتوي على 1% حمض الفورميك و 1 مل من المخزن المؤقت للفوسفات 50 مم (الرقم الهيدروجيني 10) التتابع.
  2. اضغط على عينة البول المخزن (المخزن فوسفات البول ومل 2 مل 1، الرقم الهيدروجيني 8.5) من خلال الخرطوشة PBA.
  3. أغسل الخرطوشة مع 1 مل 50: 50 v/v الاسيتو الانيتريل-الفوسفات المخزن المؤقت (10 مم، الرقم الهيدروجيني 8.5).
  4. الوتي الخرطوشة مع 1 مل الاسيتو الانيتريل-المياه (80:20 v/v) الذي يحتوي على 1% حمض الفورميك.

5-تحديد وتقدير حجم الكاتيشولامين

  1. الخطي
    1. تمييع الأسهم تحليلها الثانوي مع البول مصطنعة لتركيزات ستة (1.5، 3، 12، 25، 50، و 100 نانوغرام/مل)؛ إضعاف حجم البول اصطناعية يتبع التكميلية الجدول 2. تقديم ثلاث عينات متوازية مع كل تركيز للحصول على 18 أكثر الحلول التجريبية لإنشاء منحنيات المعايرة.
    2. تمييع دهبا الأسهم الثانوية مع البول اصطناعية 10 إضعاف للحصول على 100 نانوغرام/مل الحل التجريبي.
    3. بريتريت جميع الحلول أكثر من 5.1.1، طبقاً للخطوة 3 (إجراءات استخراج بفسبي). كما هو الحال في الخطوة 3، ضخ 20 ميليلتر من كل النذرة المقابلة في النظام [هبلك]-نماء الطفولة المبكرة للحصول تشروماتوجرام [هبلك].
    4. إنشاء منحنيات المعايرة لتحليلها خمسة بالتآمر النسبة من منطقة الذروة (الغايات/IS) كمحور ص ضد نسبة تركيزات (الأهداف/IS) كمحور س، كما هو مبين في التكميلية الرقم 1.
  2. قيمة اللد ولوق للحساسية
    1. حقن 20 ميليلتر من البول اصطناعية فارغة في النظام [هبلك]-النماء (كما هو الحال في الخطوة 3)، للحصول على تشروماتوجرام [هبلك] للعينة.
    2. في chromatogram من 5.2.1، جمع 11 إشارة فارغة القيم، وحساب متوسط قيمة Xب والانحراف المعياري Sب. حساب إشارة الحد الأدنى من مادة يمكن الكشف عنها عند مستوى معين من الثقة، سلام، كما سلام = Xب+ K * Sب (Sب تعكس مستوى الضوضاء، K هو معامل يحدده مستوى الثقة أسلوب قياس ومستوى الضجيج الإله). اللد وهكذا = (XL-Xب)/ق = (K * Sب)/S (S لتقف على قيمة انحدار منحنى العامل).
    3. تعريف S/N 3:1 (K = 3) كحد للكشف (اللد)، و S/N من 10:1 (K = 10) كحد للقياس الكمي (لوك).
  3. تقييم المبالغ المستردة
    1. إعداد عينات البول الحقيقية وارتفعت. تمييع الأسهم تحليلها الثانوي مع البول الحقيقية لتركيزات ثلاث (5، 50، 100 نانوغرام/مل) للحصول على عينات البول ارتفعت. تحضير ثلاث عينات موازية لكل حل أكثر. عد تركيز ارتفعت كمية المركبات المستهدفة التي ارتفعت في عينة البول. تحدد هذه القيمة s.
    2. تمييع الأسهم دهبا إلى 100 نانوغرام/ملليلتر، كما هو الحال في الخطوة 5.1.2.
    3. عملية حل كل عينة من 5.3.1 وفقا للخطوة 3 (إجراءات استخراج بفسبي) وضخ 20 ميليلتر من كل الوانت المقابلة في النظام [هبلك]-نماء الطفولة المبكرة للحصول على نتيجة تشروماتوجرام. سوف تحسب قيمة تحليلها ككمية من مركبات هدفا كمياً في عينة البول ارتفعت. تحدد هذه القيمة كt.
    4. حقن 20 ميكروليتر من عينة البول في النظام [هبلك]-النماء (كما هو الحال في الخطوة 3) للحصول على نتيجة تشروماتوجرام. وسوف تحسب قيمة التحاليل ككمية أولية للمركبات هدفا كمياً في عينة البول. تحدد هذه القيمة أنا.
    5. حساب كمية المركبات المستهدفة في العينات المأخوذة من معادلة المنحنى المعياري. يقدر استرداد نسبة مئوية كمنهجية استرداد % = (t - أنا) × 100/(s). وترد في الجدول 1القيم الوسطية.
  4. تقييم عدم الدقة
    1. إعداد عينات البول الاصطناعي ارتفعت إلى 5 و 50 و 100 نانوغرام/مليلتر تركيزات كما في الخطوة 5.3.1. إعداد ست عينات موازية لكل حل أكثر. إعداد عينات تجريبية جديدة كل يوم.
    2. تمييع الأسهم دبا إلى 100 نانوغرام/مليلتر كما في الخطوة 5.1.2.
    3. تقييم دقة اليوم داخل (n = 6). عملية حل كل عينة في 5.4.1 وفقا للخطوة 3 وضخ 20 ميليلتر من كل الوانت المراسل في النظام [هبلك]-نماء الطفولة المبكرة للحصول تشروماتوجرام. القيام بنفس العملية ست مرات في اليوم نفسه.
    4. حساب كمية المركبات المستهدفة في العينات المأخوذة من معادلة المنحنى المعياري. تحت نفس تركيز المجمع نفسه، يتحدد الانحراف المعياري النسبي (RSD) لفحوصات الستة في يوم واحد بالدقة داخل أيام. وترد في الجدول 1القيم الوسطية.
    5. تقييم دقة اليوم بين الوكالات (n = 6). في نفس الوقت كل يوم في ستة أيام متتالية، إعداد عينات البول الاصطناعي ارتفعت لثلاثة تركيزات 5، 50، 100 نانوغرام/ملليلتر، كما هو الحال في 5.4.1 و 5.4.2.، ومعالجة كل حل نموذج أكثر وفقا للخطوة 3.
    6. حقن 20 ميليلتر من كل النذرة المقابلة من 5.4.5 في النظام [هبلك]-نماء الطفولة المبكرة للحصول على نتائج تشروماتوجرام كل يوم. حساب كمية المركبات المستهدفة في العينات المأخوذة من معادلة المنحنى المعياري. أعرب عن تحديد مركز اللاجئ لفحوصات كمية من عينات البول الاصطناعي ارتفعت تركيزات ثلاث اليوم بين الدقة في ستة أيام متتالية. وترد في الجدول 1القيم الوسطية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هذا البروتوكول طريقة بسيطة ومريحة بفسبي بريتريات عينات البول وإثراء الكاتيشولامين الخمسة للكشف عن طريق نظام [هبلك]-نماء الطفولة المبكرة؛ ويرد رسم تخطيطي للعملية في الشكل 1. ويتضمن البروتوكول أساسا أربع خطوات-تفعيل، تحميل، الشطف، والتينج-مقترنة بكمية صغيرة من النانو PCE-PS وجهاز بسيط الصلبة-مرحلة استخراج. مورفولوجية النانو PCE-PS تم تقييم استخدام محلل السطحية والمساميه (انظر الجدول للمواد). المساحة الرهان، الخصائص التكوينية (برنار وأميت، والراوي)، وحجم المسام وحجم المسام-2.8297 m2 ز-1، 0.009 سم3 ز-1و 12.76 شمال البحر الأبيض المتوسط، على التوالي. هذه البيانات تشير إلى أن المواد المستخدمة في البروتوكول قد نانوية المسام على السطح، والتي قد تسهم في كفاءة امتزاز عالية وربط خفض درجة الحموضة في البروتوكول.

هذا البروتوكول يستخدم وحدات التخزين الأمثل، المكونات العينة، المادة المرتشحة، الوانت، إلخ، فضلا عن الرقم الهيدروجيني العامل والوقت المستغرق أثناء الإجراءات. في تشن وآخرون، الوانت حل حامض الخليك 12.0 م نظراً للظروف الحمضية تسبب في الممتزة لتصبح البروتونية ومشحونة بشكل إيجابي، وهو ملائم شطف CAs34،35. في هذه الدراسة، وصفه الوانت كان مجددة لتكون 30% حامض الفوسفوريك، الاسيتو الانيتريل 15 في المائة، ونسبة 55% ماء مقطر. تم تعديل قيمة pH النهائي الوانت إلى 3.0. ينبغي أن تظل المذيب الوانت في بيئة حمضية عند الوتينج، ولكن معتدلاً أكثر بكثير من حمض الخليك 12.0 متر، مما قد يؤدي إلى ظهور ذروة الفقراء وإلحاق الضرر بالنظام [هبلك].

للتعرف الكاتيشولامين، تتم مقارنة مرات الاحتفاظ chromatogram من القمم في العينات مع قمم الحل القياسية. ويبين الشكل 2 أمثلة من تشروماتوجرامس [هبلك]-النماء من الحلول المختلفة. إذا تم اتباع البروتوكول بنجاح، الكروماتوغرافي ملامح الكاتيشولامين الثلاثة وعلى نواتج الأيض ينبغي الحصول على طريق النماء [هبلك] مع قمم متناظرة واضحة، ومحددة تحديداً جيدا والضوضاء الخلفية الحد الأدنى، كما هو مبين في الشكل 2 . للمقارنة مع الطريقة التقليدية، تم اختيار خرطوشة PBA تجاري كعنصر تحكم. في الشكل 2(–ج)، وخمس قمم المستهدفة في (ب) أعلى بكثير من ثاوسين (ج)، مما يشير إلى أن الأسلوب بفسبي أكثر حساسية من الأسلوب خرطوشة PBA. أيضا، لم تظهر ذروة دوباك في PBA خرطوشة استخراج النتيجة، مشيراً إلى أنه غير قادر على استخراج دوباك العمود PBA. الشكل 2 (د) يصور chromatogram عينة البول فارغة دون أي معالجة مسبقة، ويبين الشكل 2(ﻫ) استخراج تشروماتوجرامس عينة البول استخدام PCE-PS مركب النانو. الشكل 2 (و) يظهر تشروماتوجرامس عينة البول بعد الاستخراج مع العمود PBA، الذي يظهر أيضا استخراج دوباك لا يتفق مع النتيجة في الشكل 2(ج). الرسم التخطيطي يشير إلى أن الأسلوب بفسبي لا يمكن استخراج فقط بأهداف مع تأثير جيد، ولكن أيضا يمكن التخلص من معظم من التدخل في البول، مما يتيح تحديد ذروة جيدة للمركبات المستهدفة.

كشفت التحليل الإحصائي أن قياسات الكاتيشولامين الثلاثة ونواتج الأيض اثنين كانوا موثوق المستنسخة (الجدول 1). كل هدف المركبات أظهرت الخطي الجيدة بين 1.5 و 100 نانوغرام/مليلتر (ص2> 0.99)، ويمكن الاطلاع على المنحنى المعياري لكل أكثر في الملحق رقم 1. المنحنيات وقيم R2 إثبات تحليلها الخطي الجيدة والنسبية في خطي نطاق معين، مناسبة لحساب تركيزات لتحليلها في عينات البول. حدود الكشف (اللد) تتراوح من 0.25 إلى 0.54 نانوغرام/ملليلتر، وحدود القياس الكمي (لوك) 0.83 إلى 1.81 نانوغرام/ملليلتر، على التوالي. القيمة (S/N) إشارة إلى ضجيج عادلت 3. كانت المجموعة من المبالغ المستردة المنهجية من المركبات الخمس المستهدفة من 97.4% (مهبج) إلى 124.2% (دوباك)، الذي كان مرضيا للتطبيق للعينات الفعلية. الدقة داخل أيام كان من 2.7 إلى 4.8 في المائة (معبراً عنها كانحراف معياري نسبي) ودقة اليوم بين 2-8.1 في المائة، عرض جيد من الدقة والتكرار.

للكشف عن أهداف في عينات البول الحقيقية، تم توظيف 28 الرضع عالية الخطورة والرضع صحية 22 في الشعبة لرعاية الأطفال، مستشفى البلدية سوتشو،. وكانت جميع الرضع 50 تؤخذ في الدراسة الأولاد. عندما كانت ستة أشهر من العمر، قد اقتيدوا إلى إجراء فحص صحي روتينية في أيلول/سبتمبر عام 2016. جميع عينات البول تم جمعها pretreated اتباع خطوات البروتوكول 3.1 و 3.2 وتم تحليل العينات باستخدام ما تبقى الخطوة 3. وقد حسبت التركيزات ضد منحنيات المعايرة. وجرى تحليل الاختلافات الإحصائية بتحليل التباين (ANOVA). يمكن رؤية النتائج في الجدول 2. الفرق بين المجموعتين الكاتيشولامين ونواتج الأيض مقارنة وتحليل. فاظهار القيم أن الكاتيشولامين لم تكن تختلف اختلافاً كبيرا بين المخاطر العالية ومجموعات صحية، بينما كان محتوى مهبج المستقلب مختلفة عبر هذه المجموعات (p = 0.001). وكان الفريق الرضع عاليي كميات أعلى من مهبج من مجموعة التحكم (14.8 ± 3.6 نانوغرام/مل مقابل 1.4 ± 0.2 نانوغرام/مليلتر)، مما يعني أن مستوى مهبج البولية قد تكون علامة محتملة للكشف المبكر عن الأطفال المعرضة للخطر.

الشكل 3 و الجدول 3 تصف الأسلوب الكمي الكلاسيكية لتحديد المواد مونوأمين، ومقارنة مع الأساليب الأخرى التي ترد في عملية تشغيل والأرقام من مصلحة. بالمقارنة مع الأساليب الكلاسيكية، والأسلوب بفسبي مزايا مثل مسافة زمنية قصيرة (5-10 دقيقة)، عملية عملية مبسطة والمذيبات العضوية أقل وأكثر الملاءمة البيئية مع معلمات المنهجية مرضية. الوانت المبلغ المطلوب انخفاض في حجم (50 ميليلتر) ويتطلب خطوة تخصيب المستهدفة لا التبخر، مما يعزز إلى حد كبير حساسية الكشف عن المركبات المستهدفة في البول. بالمقارنة مع التقليدية المستندة إلى الجسيمات جمعية مهندسي البترول، هذا الأسلوب تعزيز الكفاءة وتبسيط عملية إعداد وتخفيض وقت التحليل مع موثوقية مقبولة، والانتقائية، وحساسية.

Figure 1
الشكل 1 : الرسم البياني التخطيطي الداخلي بفسبي في الورقة وتمثيل للجهاز الخاص به. (1) جاستايت حقنه ونصيحة (2) ماصة والنانو (3) معبأة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : تشروماتوجرامس عينات مختلفة. () ارتفعت المياه عينة مع الأهداف وهو في (100 نانوغرام/ملليلتر) دون الاستخراج. (ب) المياه ارتفعت العينة المستخرجة بواسطة الأسلوب بفسبي، و (ج) بخرطوشة حمض (PBA) فينيلبورونيك التجارية. (د) البول حقيقية فارغة عينة دون الاستخراج. (ﻫ) الحقيقي البول العينة المستخرجة بواسطة الأسلوب بفسبي. (و) البول الحقيقي العينة المستخرجة بواسطة التجارية PBA خرطوشة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : المخطط الانسيابي التحليلية لتحديد أساليب. (أ، ب) وذكرت سابقا أساليب الاستخراج الكلاسيكية. () استخراج من الألومينا، (ب) قبل دببا معقدة، و (ج) بواسطة الأسلوب المقترح في هذه الورقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

التكميلية الرقم 1: المعادلات والمنحنيات القياسية. المنحنيات القياسية لتحليلها الخمسة هي التي شيدت من أجل استخدام معادلة الخط لحساب تركيز تحليلها غير معروف في العينة. () ني وه (ب)، (ج) دا، مهبج (د) و (e) دوباك. اضغط هنا لتحميل هذا الرقم-

التكميلية الرقم 2: برنت تقارب التفاعل بين مجموعة حمض ورابطة الدول المستقلة-ديول برونك أو المتاخمة مجموعتين هيدروكسيل. (أ) التخطيطي للتفاعل بين الأحماض برونك والعديد من المجموعات-يا للنموذج استرات دوري وايبوكسي خمسة أو ستة. (ب) مجموعة رابطة الدول المستقلة-ديول أو المتاخمة مجموعتين هيدروكسيل في دوائر حمراء تصور المواقع الرئيسية من رد فعل لتحليلها الخمسة إلى مجمع برونك حمض. اضغط هنا لتحميل هذا الرقم-

ني مهبج ه هو دوباك دا
مجموعة الخطي (ng/mL) 1.5-400 1.5-200 1.5-100 1.5-100 1.5-400
قيم التربيعي 0.9945 0.995 0.9976 0.9902 0.9954
اللد (ng/mL) 0.323 0.322 0.313 0.657 0.249 0.543
لوك (ng/mL) 1.076 1.072 1.043 2.191 0.83 1.809
استرداد ± تحديد مركز اللاجئ (%)(n=9) 110.7±2.9 97.4±9.1 103.9±5.2 86.5±7.3 124.2±3.1 117.3±5.4
الدقة (RSD %) (n = 9)
أيام داخل 4.5 4 2.7 4.8 3.3 4.7
اليوم بين الوكالات 4.1 8.1 2 6.3 3.2 5.9
ني، إفراز؛ مهبج، 3-ميثوكس-4-هيدروكسيفينيلجليكول؛ ﻫ، أدرينالين؛ هو معيار الداخلية؛ دوباك، 3، 4-ديهيدروكسيفينيلاسيتيك حامض؛ دا، الدوبامين؛

الجدول 1: النتائج التحليلية للبروتوكول المقترح لتحديد الكاتيشولامين الثلاثة واثنان من الأيض مع الحلول القياسية.

تركيز (نانوغرام مل-1) مجموعة المراقبة (22) مجموعة "الرضع مخاطر" عالية (28) قيمة P
ني 7.52±1.34 5.56±1.7 0.37
مهبج 1.4±0.2 14.8±3.6 0.001
ه 24±15.8 20.9±5.87 0.841
دوباك 106.36±30.1 72.12±18.07 0.312
دا 55.53±11.9 48.12±20.9 0.76
ف < 0.05 * * * يبين فرقا كبيرا بين الفريقين

الجدول 2: مقارنة تركيزات الكاتيشولامين الثلاثة واثنان من الأيض في يتبول بين صحة الرضع والأطفال المعرضة للخطر. تم تحليل النتائج إحصائيا باستخدام تحليل التباين (ANOVA) مع مستوى الأهمية ف = 0.05 للاختلافات بين محتوى مهبج. وترد وسائل ± الانحرافات المعيارية.

عينة استنفدت المذيبات (mL) حجم العينة (mL) المعالجة المسبقة الوقت (دقيقة) مجموعة الخطي اللد الانتعاش النسبي (%) تتبخر و
ريديسولفي		 الأسلوب التحليلي
المذيبات وحدة التخزين الوقت (دقيقة) الاسترداد (%) مذيب و
(mL) (mL) إعادة تشكيل
بقايا
البول 0.5 0.05 10 2.0 – 200 نانوغرام/مليلتر (ني ه، دا) 0.2-0.5 نانوغرام/مليلتر (ني ه، دا) 88.5-94.5 (ني ه، دا) لا [هبلك]-نماء الطفولة المبكرة (تشن et al., 2016)
البول 19 0.7 - 47 – 167 ميكروغرام/لتر (دا) 166-500 نانومتر (دا) 98.3-101.1 (دا) لا [هبلك]-الأشعة فوق البنفسجية (بيوتر et al., 2016)
البول 1.3 0.01 - 1250-0.5 نانوغرام/مليلتر (ني ه دا،، NMN، مينيسوتا) 0.5-2.5 نانوغرام/مليلتر (ني ه دا،، NMN، مينيسوتا) 74.1 – 97.3 (ني ه دا،، NMN، مينيسوتا) لا LC-MS/MS (لي وآخرون، 2016)
البول والبلازما 20 0.05 10 0.04-2.5 نانوغرام/مليلتر (ني ه، دا) 0.01-0.02 نانوغرام/مليلتر (ني ه، دا) 87.0-97.5 (ني ه، دا) لا [هبلك]-الأشعة فوق البنفسجية (محمد وآخرون، 2016)
البول < 0.5 0.1 5 1.5-400 نانوغرام/مليلتر (ني مهبج ه، دوباك،، دا) 0.249-0.543 نانوغرام/مليلتر (ني مهبج ه، دوباك،، دا) 97.4 124.2 (ني مهبج ه، دوباك،، دا) لا هذا العمل
—، غير معروف.
PBA, حمض فينيلبورونيك

الجدول 3: مقارنة هذا العمل بدراسات بشأن المعالجة مونوامينيس أو غيرها من المواضيع ذات الصلة في السنوات الأخيرة.

التكميلية الجدول 1: صك المعلمات للكشف والتحديد الكمي لتحليلها في الورقة المقدمة من [هبلك]-النماء- اضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

التكميلية الجدول 2: إعداد المنحنى المعياري لتحليلها الخمسة- اضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الأسلوب بفسبي المقترحة في هذه الورقة قد تكون كبيرة وذات مغزى فيما يتعلق السرعة والبساطة والراحة. الممتزات المستخدمة في البروتوكول هي النانو اليكتروسبون، وارتفاع نسب مساحة للتخزين السطحي، والجسميات تحليلها بكفاءة عالية. الإجراء يحتاج ملليغرام عدد قليل من نانوفيبير وكمية صغيرة من المذيب الوانت فقط، ولا تتطلب خطوة تبخر التركيز تحليلها. وهنا، وقد قدمنا عرضاً مفصلاً لوضع بروتوكول [هبلك]-تنمية الطفولة المبكرة على أساس سوف تسمح للمستخدمين الجدد إنشاء وسيلة فعالة للكشف والتحديد الكمي لثلاثة الكاتيشولامين وهما من نواتج الأيض بهم (ني، ه، دا، ومهبج، دوباك).

تفوق هذا البروتوكول أساسا تنبع من أربع خطوات حاسمة خلال الإجراءات، كما هو مبين في الشكل رقم 1: استخدام النانو PCE-PS لالتقاط المركبات المستهدفة للحد من حجم مسيل إلى ملليغرام قليلة، مما يؤدي إلى امتزاز سريع/ الامتزاز، وفقط تحتاج إلى كمية صغيرة من التينج السائل (1)؛ إضافة دببا في البول المعقدة مع تحليلها لتحسين هيدروفوبيسيتي بهم (2)؛ الشطف النانو مع الحل الذي يحتوي على دببا الاحتفاظ تحليلها وإزالة الشوائب (3)؛ والأمثل لحالة استخراج وتحليل للحصول على حساسية جيدة والانتقائية لتحليلها (4).

للخطوة (1)، وقد يعزى إليه الأداء المتفوق للقدرة الممتصة ل PCE-PS إلى مجموعة متنوعة من العوامل. يمكن أن تشكل البوليمرات الاثير التاج يخدر في النانو مجمع الضيف المضيف مع ضيفه الجزيئات التي تحتوي على مجموعات أمين من ح-السندات، مثل الكاتيشولامين في هذه الورقة. بالإضافة، وهو جين تاو هونجيو et al. وتشن جيشون et al. واقترح أيضا أن برونك حمض يمكن السندات مع ذرات النيتروجين في التركيب الكيميائي عن طريق التفاعلات ب-ن، وأن هيكل عظمى مسعور يمكن أن تتفاعل مع البنزين ومجموعات أخرى الاليفاتيه لتحليلها36،37. أيضا، أثناء عملية الامتزاز، السندات الهيدروجين والتفاعلات ب ن كسر بسهولة على درجة الحموضة منخفضة جداً؛ وهكذا، الوانتس مع الأس الهيدروجيني الحمضية عادة مناسبة لاستكشاف الامتزاز. وعلاوة على ذلك، هناك أيضا عدة التفاعلات الثانوية، بما في ذلك الماء، والأيونية، والهيدروجين الرابطة، التي يمكن أن تحدث بين المواد الكيميائية برونك والمركبات ذات الصلة36،3738. قد تسهم جميع هذه التفاعلات امتزاز تحليلها لهذه المواد.

للخطوة (2)، مع مساعدة دببا المضافة، الجسميات النانو PCE-PS مجمعات دببا الكاتيكولامينات سريعاً. ليو تشن وآخرون أظهرت أن المواد التي تقارب برنت قد برزت بوصفها وسائل الإعلام الهامة لفصل انتقائية والتعرف الجزيئي للمركبات العضوية، مثل نوكليوسدس، والسكريات، جليكانس، جليكوبروتينس، وهكذا38. Complexation أساسا يحدث من تقارب بوروناتي تفاعل حمض بورونيك ورابطة الدول المستقلة-ديول مجموعات أو مجموعتين هيدروكسيل المتاخمة، استرات دوري وايبوكسي النموذج خمسة أو ستة، كما هو موضح في "تكميلية الشكل" 2 أ. يصور "الشكل التكميلية" 2B المواقع الرئيسية من رد فعل لتحليلها الخمسة في هذا العمل إلى مجمع حمض بورونيك. عندما تصبح المنطقة المحيطة الحمضية، تنأى بالمجمع حمض--رابطة الدول المستقلة-ديول برونك. التفاعل بين حمض برونك ومجموعة رابطة الدول المستقلة-ديول أو مجموعتين هيدروكسيل المتاخمة موجود نسبيا بقوة وعلى نطاق واسع.

الخطوة (3)، شكلت المعقدة بين تحليلها ودببا يمكن تحميلهم في الممتزة بينما هي تشطف غيرها من الشوائب من على سطح الأرض PCE-PS، تحقيق حجز أفضل للأهداف. الخطوة (4)، كان هناك تقرير يظهر أن الرقم الهيدروجيني الأمثل نحو 9.0 للرابطة ل مجمع الماء المقطر والكاتيتشول39. ومع ذلك، تشن وآخرون. استكشاف أفضل قيمة pH إلى من الكاتيكولامينات دببا ووجد أن أداء الامتزاز النانو PS-PCE المركب للأكاديمية الصينية للعلوم الأمثل عندما تم تغيير قيمة pH بين 6.0 و 7.034،35. تورط ليو et al. أن هيكل المواد الداعمة لمركبات حمض برنت، خاصة مع العزل المكاني تجاويف والمسام النانو يغاندس ب-N تشكلت خلال رد الفعل، يمكن أن تخفض إلى حد كبير أيضا ربط الأس الهيدروجيني وتعزيز الربط تقارب38. PCE-PS بنية، فضلا عن هيكل الكاتيكولامينات مجهزة بجميع مع-NH-مجموعات. وهكذا، قد تسهم الخصائص والمسام النانو PCE-PS (البيانات كما هو موضح في نتائج الممثل)، فضلا عن يغاندس ب ن شكلت، ملزمة خفض درجة الحموضة في البروتوكول. وهكذا، يمكن أن تكون قيمة الرقم الهيدروجيني الأمثل في هذا البروتوكول محايدة، الذي يبسط الإجراءات إلى حد كبير، وتجنب تدهور تحليلها.

هي القيود الرئيسية لتصميم كاتشولاميني أن هذه التركيزات في العينات البيولوجية منخفضة جداً وأن هياكلها غير مستقرة (تتأكسد بسهولة)؛ وعلاوة على ذلك، من الصعب التخلص من الشوائب في وسائل الإعلام. وبالتالي، لتحليل الكاتيكولامينات في العينات البيولوجية، المعالجة المسبقة، عادة عن طريق استخراج المرحلة الصلبة، ضروري. بفسبي الأسلوب المقترح في هذه الورقة المقدمة تركيز قبل بسيطة ومريحة لتحليلها في عينات البول. ولكن، عند القيام بالتجربة، شرط التجربة يجب أن تسيطر تماما، بوسائل مثل تجنب التعرض للضوء وتقصير الوقت قبل العلاج بقدر الإمكان.

تم تقييم مدى انطباق الأسلوب باستخدامه في تحديد تركيزات الكاتيشولامين الثلاثة واثنان من الأيض في البول من صحة الرضع والأطفال المعرضة للخطر. وكان هناك فارق كبير بين المجموعتين في مهبج البولية. كما لخص سابقا، مبلغ مهبج في جسم الإنسان أساسا أفيد الآن كمؤشر تعكس لهجة العصبية نورادرينيرجيك، نشاط الأيض الكاتيكولامينات في المركزية وأنظمة العصبي المحيطي40،41، 42، وعلامة مفيدة بلازما/بول الأيض NE الوسطى43. للرضع شديدة الخطورة، يسبب مجموعة متنوعة من العوامل مثل التاكسج الاقفاري بنقص الاكسجة (HIE) الدماغ الشتائم الصدمة والدماغ، مما يؤدي إلى درجات مختلفة من العجز العصبي النمائي في مرحلة الطفولة. تلف المخ هذا بدوره سيؤدي إلى الإفراج عن العصبية (شملت مهبج) في سوائل الجسم44،45. ووفقا لتقارير من ماس فولفجانج، هناك الارتباطات الهامة بين الدماغ والسائل النخاعي، والبلازما، وتركيزات البولي مهبج46،47. طالما استخدمت قياس مجموع مهبج (مجاناً + مترافق) في البول لتقييم أيض ني المركزية والطرفية الأيض NE في البشر41،،من4849. وهكذا، يمكن الاستنتاج أن الرضع عالية المخاطر قد لهجة العصبية نورادرينيرجيك الضرر بالمقارنة مع الأصحاء، التي تؤثر على الأيض الكاتيكولامينات في المركزية ونظم الجهاز العصبي المحيطي. هذا التناقض يشير إلى أنه ينبغي أن يتم إجراء المزيد من البحوث عن العلاقة بين العجز مستوى والنماء العصبي مهبج البولية. وقد ثبت أنه يمكن استخدام الطريقة المقترحة لتحديد وجود الكاتيكولامينات في البول، مع آفاق واعدة للاستخدام في العيادة لتقييم الأمراض ذات الصلة بهذه العصبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يشهد الكتاب أن هناك أي تعارض في المصالح مع أي منظمة مالية فيما يتعلق بالمواد التي تمت مناقشتها في هذه المقالة.

Acknowledgments

هذه الدراسة وأيده "الوطنية مؤسسة العلوم الصينية" (No.81172720، رقم 81673230)، الاجتماعية التنمية البحث البرنامج من جيانغسو مقاطعة إدارة العلوم والتكنولوجيا (رقم BE2016741)، العلوم والتكنولوجيا المشروع من الإدارة العامة الصينية للرقابة على الجودة والتفتيش والحجر الصحي (2015QK055)، برنامج فتح المشروع من المختبرات الرئيسية لتنمية الطفل، وتعلم العلوم في وزارة التربية والتعليم، جامعة جنوب شرق (كدلس-2016-04). ونعترف إخلاص سونغ يوان وليو بينغ الذي ساعدنا في جمع العينات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 µL pipette tip column to contain nanofibers
PCE-PS nanofibers material for PFSPE extraction
steel rod (about 0.5 mm diameter) fill the nanofibres into the column
gastight plastic syringe (5 ml) compress solution into the end of the tip
methanol Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 67-56-1
diphenylborinic acid 2-aminoethyl ester(DPBA) Sigma-Aldrich.Inc A-106408 complex reagent
norepinephrine(NE) Sigma-Aldrich.Inc A-9512 analyte
3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol(MHPG) Sigma-Aldrich.Inc H1377 analyte
epinephrine(E) Sigma-Aldrich.Inc 100154-200503 analyte
3, 4-Dihydroxyphenylacetic acid(DOPAC) Sigma-Aldrich.Inc D-9128 analyte
dopamine(DA) Sigma-Aldrich.Inc H-8502 analyte
3, 4-dihydroxybenzylamine hydrobromide(DHBA) Sigma-Aldrich.Inc 858781 interior label
acetonitrile Sigma-Aldrich.Inc 75-05-8 eluriant and mobile phase
phosphoric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7664-38-2 eluriant
uric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 69-93-2 artifical urine
creatinine Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 60-27-5 artifical urine
trisodium citrate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 6132-04-3 artifical urine
KCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7447-40-7 artifical urine
NH4Cl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 12125-02-9 artifical urine
NaHCO3 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd SWC0140326 artifical urine
C2Na2O4 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 62-76-0 artifical urine
NaSO4 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7757-82-6 artifical urine
disodium hydrogen phosphate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10039-32-4 artifical urine
urea Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 57-13-6 artifical urine
NaCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7647-14-5 artifical urine
MgSO4.7H2O Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10034-99-8 artifical urine
CaCl2 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10035-04-8 artifical urine
HCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7647-01-0 artifical urine
citric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 77-92-9 artifical urine and mobile phase
EDTA disodium salt Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 34124-14-6 mobile phase
monometallic sodium orthophosphate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7558-80-7 artifical urine and mobile phase
1-heptanesulfonic acid sodium salt Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 22767-50-6 mobile phase
sodium hydroxide Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 1310-73-2 mobile phase
phenylboronic acid column(PBA column) Aglilent 12102018 PBA extraction
Inertsil® ODS-3 5 µm 4.6×150 mm column Dikma 5020-06731 HPLC column for seperation
SHIMADZU SIL-20AC prominence AUTO SAMPLER Shimadzu Corporation, Japan SIL-20AC auto injection for eluriant
SHIMADZU LC-20AD High Performance Liquid Chromatography Shimadzu Corporation, Japan LC-20AD HPLC pump
SHIMADZU L-ECD-60A electrochemical detector Shimadzu Corporation, Japan L-ECD-60A detector for the analytes
ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry System Micromeritics, USA surface and porosity analyzer 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elhwuegi, A. S. Central monoamines and their role in major depression. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 28, 435-451 (2004).
  2. Da, C. F., Ngoabdalla, S., Houzel, J. C., Rehen, S. K. Murine model for Parkinsons disease: From 6-OH dopamine lesion to behavioral test. J. Vis. Exp. (35), e1376 (2010).
  3. Varley, H., Gowenlock, A. H. The clinical chemistry of monoamines. Brit. Med. J. 2, 1330 (1963).
  4. Wang, X., Rousset, C. I., Hagberg, H., Mallard, C. Lipopolysaccharide-induced inflammation and perinatal brain injury. Semin. Fetal. Neonatal. Med. 11, 343-353 (2006).
  5. Inder, T. E., Volpe, J. J. Mechanisms of perinatal brain injury. Semin. Neonatol. 5, 3-16 (2000).
  6. Miller, S. P., Ferriero, D. M. From selective vulnerability to connectivity: Insights from newborn brain imaging. Trends. Neurosci. 32, 496-505 (2009).
  7. Barkovich, A. J., et al. Proton MR spectroscopy for the evaluation of brain injury in asphyxiated, term neonates. Am. J. Neuroradiol. 20, 1399-1405 (1999).
  8. Liauw, L., van Wezel-Meijler, G., Veen, S., van Buchem, M. A., van der Grond, J. Do apparent diffusion coefficient measurements predict outcome in children with neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy? Am. J. Neuroradiol. 30, 264-270 (2009).
  9. Varsami, M., et al. Inflammation and oxidative stress biomarkers in neonatal brain hypoxia and prediction of adverse neurological outcome: A review. J. Pediatr. Neonat. Individual. Med. 2, e020203 (2013).
  10. Cooper, R. L., Walker, R. F. Microradioenzymic assays for the measurement of catecholamines and serotonin. Methods. Enzymol. 103, 483-493 (1983).
  11. Murphy, J. F. The development of enzyme linked immunosorbent assays (ELISA) for the catecholamines adrenaline and noradrenaline. J. Immunol. Methods. 154, 89-98 (1992).
  12. Jones, S. R., Mickelson, G. E., Collins, L. B., Kawagoe, K. T., Wightman, R. M. Interference by pH and Ca2+ ions during measurements of catecholamine release in slices of rat amygdala with fast-scan cyclic voltammetry. J. Neurosci. Methods. 52, 1-10 (1994).
  13. Sanchismallols, J. M., Villanuevacamañas, R. M., Ramisramos, G. Determination of unconjugated catecholamine in urine as dopamine by thermal lens spectrometry. Analyst. 117, 1367-1371 (1992).
  14. Lan, C., Liu, W. Determination of catecholamines by HPLC-ECD in urine. Medical Laboratory Science and Clinics. , (2007).
  15. Tsunoda, M., Aoyama, C., Ota, S., Tamura, T., Funatsu, T. Extraction of catecholamines from urine using a monolithic silica disk-packed spin column and high-performance liquid chromatography-electrochemical detection. Anal. Methods. 3, 582-585 (2011).
  16. Bartolini, B., et al. Determination of monoamine oxidase activity by HPLC with fluorimetric detection. Neurobiology (Bp). 7, 109-121 (1999).
  17. Dunand, M., Gubian, D., Stauffer, M., Abid, K., Grouzmann, E. High throughput and sensitive quantitation of plasma catecholamines by ultraperformance liquid chromatography tandem mass spectrometryusing a solid phase microwell extraction plate. Anal. Chem. 85, 3539-3544 (2013).
  18. He, H., Carballo-Jane, E., Tong, X., Cohen, L. H. Measurement of catecholamines in rat and mini-pig plasma and urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry coupled with solid phase extraction. J. Chromatogr. B. 997, 154-161 (2015).
  19. Simon, N., Young, P. How to increase serotonin in the human brain without drugs. J. Psychiatry. Neurosci. 32, 394-399 (2007).
  20. Grossi, G., et al. Improvements in automated analysis of catecholamine and related metabolites in biological samples by column-switching high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 541, 273-284 (1991).
  21. Iwamot, T., Yoshiura, M., Iriyama, K. Liquid chromatographic identification of urinary catecholamine metabolites adsorbed on alumina. J. Liq. Chromatogr. R. T. 10, 1217-1235 (1987).
  22. Maycock, P. F., Frayn, K. N. Use of alumina columns to prepare plasma samples for liquid-chromatographic determination of catecholamines. Clin. Chem. 33, 286-287 (1987).
  23. Grossi, G., Bargossi, A., Lippi, A., Battistoni, R. A fully automated catecholamines analyzer based on cartridge extraction and HPLC separation. Chromatographia. 24, 842-846 (1987).
  24. Rondelli, I., et al. New method for the resolution of the enantiomers of 5,6-dihydroxy-2-methyl-aminotetralin by selective derivatization and HPLC analysis: Application to biological fluids. Chirality. 8, 381-389 (1996).
  25. Kumar, A., Hart, J. P., McCalley, D. V. Determination of catecholamines in urine using hydrophilic interaction chromatography with electrochemical detection. J. Chromatogr. A. 1218, 3854-3861 (2011).
  26. Sabbioni, C., et al. Simultaneous liquid chromatographic analysis of catecholamines and 4-hydroxy-3-methoxyphenylethylene glycol in human plasma: Comparison of amperometric and coulometric detection. J. Chromatogr. A. 1032, 65-71 (2004).
  27. Lee, M., et al. Selective solid-phase extraction of catecholamines by the chemically modified polymeric adsorbents with crown ether. J. Chromatogr. A. 1160, 340-344 (2007).
  28. He, H., et al. Facile synthesis of a boronate affinity sorbent from mesoporous nanomagnetic polyhedral oligomeric silsesquioxanes composite and its application for enrichment of catecholamines in human urine. Anal. Chim. Acta. 944, 1-13 (2016).
  29. Subbiah, T., Bhat, G. S., Tock, R. W., Parameswaran, S., Ramkumar, S. S. Electrospinning of nanofibers. J. Appl. Polym. Sci. 96, 557-569 (2005).
  30. Hu, W. Y., et al. Packed-fiber solid-phase extraction coupled with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry for determination of diethylstilbestrol, hexestrol, and diedestrol residues in milk. J. Chromatogr. B. 957, 7-13 (2014).
  31. Liu, Z., Kang, X., Fang, F. Solid phase extraction with electrospun nanofibers for determination of retinol and α-tocopherol in plasma. Microchim. Acta. 168, 59-64 (2010).
  32. Qi, D., Kang, X., Chen, L., Zhang, Y., Wei, H., Gu, Z. Electrospun polymer nanofibers as a solid-phase extraction sorbent for the determination of trace pollutants in environmental water. Anal. Bioanal. Chem. 390, 929-938 (2008).
  33. Kang, X. J., Chen, L. Q., Zhang, Y. Y., Liu, Y. W., Gu, Z. Z. Performance of electrospun nanofibers for SPE of drugs from aqueous solutions. J. Sep. Sci. 31, 3272-3278 (2008).
  34. Chen, L. Q., Wang, Y., Qu, J. S., Deng, J. J., Kang, X. J. Selective extraction of catecholamines by packed fiber solid-phase using composite nanofibers composing of polymeric crown ether with polystyrene. Biomed. Chromatogr. 29, 103-109 (2015).
  35. Chen, L. Q., Zhu, X. H., Shen, J., Zhang, W. Q. Selective solid-phase extraction of catecholamines from plasma using nanofibers doped with crown ether and their quantitation by HPLC with electrochemical detection. Anal. Bioanal. Chem. 408, 4987-4994 (2016).
  36. Hu, H., Zhang, Y., Zhang, Y., Huang, X., Yuan, D. Preparation of a new sorbent based on boronate affinity monolith and evaluation of its extraction performance for nitrogen-containing pollutants. J. Chromatogr. A. 1342, 8-15 (2014).
  37. Chen, J., et al. Sensitive determination of four camptothecins bysolid-phase microextraction-HPLC based on a boronic acid contained polymer monolithic layer. Anal. Chim. Acta. 879, 41-47 (2015).
  38. Li, D., Chen, Y., Liu, Z. Boronate affinity materials for separation and molecular recognition: structure, properties and applications. Chem. Soc. Rev. 44, 8097-8123 (2015).
  39. Yan, J., Springsteen, G., Deeter, S., Wang, B. The relationship among pKa, pH, and binding constants in the interactions between boronic acids and diols: It is not as simple as it appears. Tetrahedron. 60, 11205-11209 (2004).
  40. Reuster, T., Rilke, O., Oehler, J. High correlation between salivary MHPG and CSF MHPG. Psychopharmacology. 162, 415-418 (2002).
  41. Beckmann, H., Goodwin, F. K. Urinary MHPG in subgroups of depressed patients and normal controls. Neuropsychobiology. 6, 91-100 (1980).
  42. Mitoma, M., et al. Stress at work alters serum brain-derived neurotrophic factor (BDNF) levels and plasma 3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) levels in healthy volunteers: BDNF and MHPG as possible biological markers of mental stress? Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 32, 679-685 (2008).
  43. Ressler, K. J., Nemeroff, C. B. Role of Norepinephrine in the Pathophysiology and Treatment of Mood Disorders. Biol. Psychiatry. 46, 1219-1233 (1999).
  44. Alonso-Spilsbury, M., et al. Perinatal asphyxia pathophysiology in pig and human: A review. Anim. Reprod. Sci. 90, 1-30 (2005).
  45. Shalak, L., Perlman, J. M. Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant: Current concepts. Early. Hum. Dev. 80, 125-141 (2004).
  46. Maas, J. W., Leckman, J. F. relationships between central nervous system noradrenergic function and plasma and urinary MHPG and other norepinephrine metabolites. MHPG: Basic Mechanisms and Psychopathology. , Academic Press. 33-43 (1983).
  47. Maas, J. W. Relationships between central nervous system noradrenergic function and plasma and urinary concentrations of norepinephrine metabolites. Adv. Biochem. Psychopharmacol. 39, 45-55 (1984).
  48. Peyrin, L., Pequignot, J. M., Chauplannaz, G., Laurent, B., Aimard, G. Sulfate and glucuronide conjugates of 3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) in urine of depressed patients: Central and peripheral influences. J. Neural. Transm. 63, 255-269 (1985).
  49. Peyrin, L. Urinary MHPG sulfate as a marker of central norepinephrine metabolism: A commentary. J. Neural. Transm. 80, 51-65 (1990).

Tags

الكيمياء، مسألة 133، الكاتيشولامين، التاج البوليمرية، نانوفيبير اليكتروسبون، وجبات والألياف الصلبة-مرحلة الاستخراج (بفسبي)، اللوني السائل ذات الضغط العالي مع كشف الكهروكيميائية ([هبلك]-النماء)، الرضع شديدة الخطورة
طريقة مريحة لاستخراج وتحليل مع اللوني السائل عالي الضغط الكاتيكولامينات العصبية وعلى نواتج الأيض
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xie, L., Chen, L., Gu, P., Wei, L.,… More

Xie, L., Chen, L., Gu, P., Wei, L., Kang, X. A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites. J. Vis. Exp. (133), e56445, doi:10.3791/56445 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter