We presenteren een handige solid-phase extraction gekoppeld aan hogedruk-vloeistofchromatografie (HPLC) met elektrochemische detectie (ECD) voor gelijktijdige bepaling van drie monoamino neurotransmitters en twee van hun metabolieten in de urine van zuigelingen. Wij identificeren ook de metaboliet MHPG als een potentiële biomarker voor de vroege diagnose van hersenschade voor zuigelingen.
De extractie en analyse van catecholamine neurotransmitters in biologische vloeistoffen is van groot belang bij de beoordeling van de functie van het zenuwstelsel en de verwante ziekten, maar hun nauwkeurige meting is nog steeds een uitdaging. Vele protocollen zijn beschreven voor de meting van de neurotransmitter door een scala aan instrumenten, met inbegrip van hogedruk-vloeistofchromatografie (HPLC). Echter, er zijn tekortkomingen, zoals gecompliceerde operatie of hard-to-detect meerdere doelen, die niet kunnen worden voorkomen, en op dit moment de dominante analysetechniek is nog steeds HPLC gekoppeld aan gevoelige elektrochemische of fluorimetrische detectie, wijten aan de hoge gevoeligheid en goede selectiviteit. Hier, wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor de voorbehandeling en de opsporing van catecholamines met hogedruk-vloeistofchromatografie met elektrochemische detection (HPLC-ECD) in echte urine monsters van zuigelingen, met behulp van samengestelde nanofibers electrospun samengesteld van polymere kroon ether met polystyreen als adsorberende, ook bekend als de methode verpakt-vezel vaste fase extractie (PFSPE). We laten zien hoe urine monsters kunnen gemakkelijk worden precleaned door een nanofiber boordevol solid phase-kolom, en hoe de analyten in de steekproef kan snel worden verrijkt, gedesorbeerde, en ontdekt op een ECD-systeem. PFSPE vereenvoudigt de voorbehandeling procedures voor biologische monsters, waardoor minder tijd, kosten, en vermindering van het verlies van doelen.
Globaal, dit werk illustreert een eenvoudige en handige protocol voor solid-phase extraction gekoppeld aan een systeem van HPLC-ECD voor gelijktijdige bepaling van drie monoamino neurotransmitters (epinefrine (E), noradrenaline (NE), dopamine (DA)) en twee van hun metabolieten (3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) en 3,4-dihydroxy-Fenylazijnzuur (DOPAC)) in urine van zuigelingen. De gangbaar protocol werd toegepast voor de beoordeling van de verschillen van urine catecholamines en hun metabolieten tussen risicovolle zuigelingen met perinatale hersenbeschadiging en gezonde controles. Vergelijkende analyse bleek een significant verschil in urine MHPG tussen de twee groepen, waaruit blijkt dat de catecholamine metabolieten mogelijk een belangrijke kandidaat-marker voor vroegtijdige diagnose van gevallen in gevaar voor schade aan de hersenen bij zuigelingen.
Catecholamine neurotransmitters kunnen hun metaboliet inhoud in lichaamsvloeistoffen neurale functioneren aantasten en invloed hebben op het saldo van de reactie-naar-stimulans Staten op een groot deel1. Abnormities kan leiden tot allerlei ziekten, zoals pheochromacytoma, ganglioneuroma, neuroblastoom en neurologische aandoeningen1,2. De extractie en de vastberadenheid van catecholamines in lichaamsvloeistoffen is zinvol voor de diagnose van de relevante ziekten. Echter catecholamines in biologische monsters bestaan in lage concentraties en gemakkelijk worden geoxideerd. Bovendien zijn ze zeer moeilijk te elueren vanwege de grote hoeveelheid inmenging in de middelgrote3. Simultane detectie van catecholamines in biologische vloeistoffen is dus nog steeds een uitdaging.
Zijn er beoordelingen aantonen dat urine catecholaminen kan een maatregel van stress, en dat hun niveaus zijn belangrijke biologische markers reageren op tactiele stimulatie verwerking in pasgeborenen5. Volgens het onderzoek, alle zuigelingen die hebben geleden onder voorbarig incidenten in gevaar voor hersenen letsel4,5,6, en schade kan veroorzaken abnormale vrijkomen van catecholamines en aanverwante zaken in de vloeistoffen. Er bestaan technieken van geavanceerde magnetische resonantie dat schade aan de hersenen in eerdere fasen7,8 detecteren kunnen. Echter binnen de eerste 48 uur, zal een abnormale neurodevelopmental proces veroorzaken permanente hersenletsel die niet zal in medische beelden11 blijken. Bovendien, het instrument van de hoge kosten en schaarse middelen, samen met andere factoren, maakt het onmogelijk voor alle neonatale eenheden toegang hebben tot deze gespecialiseerde neuro-imaging technieken. Echter, het gebruik van een gemakkelijk toegankelijke en praktische biomerker (zoals catecholamines en hun metabolieten) kon deze tekortkomingen verhelpen en de screening van een biomarker in menselijke vloeistoffen kan helpen in de vroege diagnose van hersenletsel en leiden tot vragen identificatie van pasgeboren zuigelingen neuroprotectie9nodig. De catecholaminen in urine kan een eenvoudig en duidelijk-index, vanwege de directe correlatie tussen de hoeveelheid ze vrijkomen van vloeistoffen en neuroactivity functie.
Onder biologische vloeistoffen, cerebrospinale vloeistof (CSF) en plasma monsters zijn niet gemakkelijk te bereiken via bestaande traumatische procedures, en het is ook zeer moeilijk om zich te ontdoen van interferentie als gevolg van zelfklevende eiwitten en andere onzuiverheden, wat leidt tot een storend en de bemonstering van de tijdrovende proces dat is niet geschikt voor herhaald detectie. Ook voor kinderen is het bijna onmogelijk om de monsters in een traumatische manier. Daarom urine bemonstering is beter dan de andere vormen van monsterneming, als het niet-invasieve, eenvoudig te bedienen, en herhaaldelijk kan worden gedaan. Urine monsters zijn overvloedig en makkelijk om te slaan, en Toon grote voordelen ten opzichte van de andere vormen van biologische monsters.
De belangrijkste methoden te kwantificeren catecholamines in biologische vloeistoffen zijn radioenzymic assays10, immuun-sorptiemiddel assays enzyme-linked11, voltammetrie12 en thermische lens spectrometrie13. Maar tekortkomingen bestaan, zoals de ingewikkelde operaties en hard-aan-detect meerdere doelen. Vandaag, is de dominante analysetechniek krachtige vloeibare chromatografie (HPLC)14, in combinatie met gevoelige elektrochemische15 of fluorimetrische detectie16, vanwege de hoge gevoeligheid en goede selectiviteit. Met tandem massaspectrometrie technologie, zoals vloeibare chromatografie/massaspectrometrie (LC/MS) en vloeibare chromatografie/massa spectrometrie/massaspectrometrie (LC/MS/MS), de analyse en de kwantificering van de neurotransmitters hoog kunnen bereiken nauwkeurigheid en specificiteit17,18. De MS-techniek verlangt echter duur instrumentatie evenals aanzienlijk gekwalificeerde arbeidskrachten, waardoor de methode moeilijk universeel toepasbaar in de meeste conventionele laboratoria. HPLC-ECD systemen zijn meestal voorzien in de meest conventionele en klinische laboratoria, en zijn verworden tot een gemeenschappelijk en goede keuze voor onderzoeksgroepen moeten worden gebruikt voor chemische bepaling, maar zij vereisen het monster geïntroduceerd in het systeem te reinigen en van Microscale volume19. Het is dus van groot belang om te zuiveren en het monster vóór de analyse te laten condenseren. De klassieke methode voor de zuivering is vloeistof-vloeistof extractie14,15,20 en off-line solid-phase extraction, met inbegrip van de kolom geactiveerd aluminiumoxide kolom21,22 en diphenylborate (DPBA) kleurverandering23,24,25,26.
Myeongho Lee et al. zijn geweest using polymeer hars, chemisch gewijzigd met kroon ether als de absorberend selectief catecholamines extraheren uit menselijke urine sinds 200727. Ook in 2006, hij Haibo et al. aangetoond van een benadering van de facile synthese voor boronate affiniteit extractie sorptiemiddel byutilizing een functionalizable nanomagnetic polyedrale oligomere silsesquioxane (POSS) gebaseerde nanomagnetic composiet, en toe te passen op de verrijking van catecholamines in menselijke urine (adrenaline, noradrenaline en isoprenaline)28. Ze maakte ook gebruik van de nanomaterialen aan het werk, met behulp van een technologie genaamd nano-electrospinning en de vorming van het polymeer materiaal in nanoschaal te vervullen. Het electrospinning-proces kunt aanpassen de diameter, morfologie en ruimtelijke uitlijning van het product door de werkende spanning beheersen en veranderen van de inhoud van de spinnen-oplossing samen met andere parameters29. Vergeleken met de conventionele SPE cartridge, electrospun nanofibers zijn zeer geschikt om te halen en verrijken van doel analyten uit een complexe matrix, zoals ze zijn uitgerust met hoge oppervlakte-gebied-te-volume verhoudingen te adsorberen van de analyten met hoog rendement, en vertonen meer gemakkelijk-gecontroleerde oppervlakte chemische eigenschappen, handige beslag op de doel-verbindingen toe te staan. Deze eigenschappen maken hen goede keuzen voor SPE adsorbents, sterk verminderen van de vaste fase en desorptie oplosmiddel bedrag30,31,32,33. Voor catecholamines in urine monsters, werden electrospun nanofibers, samengesteld uit apolymeric kroon ether met polystyreen (PCE-PS) gebruikt om selectief uitpakken drie catecholamines (NE E en DA)34. Het papier aangegeven dat de selectieve kroon ether de doelstellingen van NE, E en DA, die was gebaseerd op de juiste geometrie geadsorbeerde voor bindende catecholamines via vorming van waterstofbruggen. De resultaten weergegeven de materiële kroon ether effectief, het verwijderen van andere storende stoffen bevatte in biologische monsters. Geïnspireerd door dit verslag, een nieuwe methode is ontwikkeld voor de selectieve extractie van de catecholaminen door gebruik van electrospun samengestelde nanofibers samengesteld uit PCE-PS.
In deze paper gemelde de methode eerder34 was verbeterd en gebruikt niet alleen om succesvol te analyseren E, NE, en DA, maar ook hun metabolieten, MHPG en DOPAC, in de urine. Ook onderzoeken we nieuwe mogelijkheden voor het mechanisme van de adsorptie-proces. De methode geeft bevredigende extractie-efficiëntie en selectiviteit voor de vijf analyten, en de methode werd gecontroleerd in de analyse van de urine van risicovolle zuigelingen met perinatale hersenbeschadiging en gezonde controles.
De voorgestelde methode PFSPE in dit document mogelijk belangrijke en zinvolle ten aanzien van zijn snelheid, eenvoud en gemak. De adsorbents gebruikt in het protocol zijn electrospun nanofibers, die hebben hoge oppervlakte gebied-te-volume verhoudingen en de analyten adsorberen met een hoog rendement. De procedure alleen moet een paar milligram van nanofiber en een klein volume van eluant oplosmiddel, en hoeft niet een stap van de verdamping te concentreren van de analyten. Wij hebben hier een gedetailleerd overzicht va…
The authors have nothing to disclose.
Deze studie werd ondersteund door de National Science Foundation of China (No.81172720, nr. 81673230), de sociale ontwikkeling onderzoek programma van Jiangsu provincie wetenschap en technologie afdeling (nr. BE2016741), Science & technologieproject van China General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine (2015QK055), het Open Project programma van belangrijke laboratorium voor de ontwikkeling van het kind en het leren van de wetenschap van het ministerie van onderwijs, Zuidoost-Universiteit (CDLS-2016-04). Wij erkennen oprecht Yuan lied en Ping Liu die ons in monsters collectie geholpen.
200 µL pipette tip | column to contain nanofibers | ||
PCE-PS nanofibers | material for PFSPE extraction | ||
steel rod (about 0.5 mm diameter) | fill the nanofibres into the column | ||
gastight plastic syringe (5 ml) | compress solution into the end of the tip | ||
methanol | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 67-56-1 | |
diphenylborinic acid 2-aminoethyl ester(DPBA) | Sigma-Aldrich.Inc | A-106408 | complex reagent |
norepinephrine(NE) | Sigma-Aldrich.Inc | A-9512 | analyte |
3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol(MHPG) | Sigma-Aldrich.Inc | H1377 | analyte |
epinephrine(E) | Sigma-Aldrich.Inc | 100154-200503 | analyte |
3, 4-Dihydroxyphenylacetic acid(DOPAC) | Sigma-Aldrich.Inc | D-9128 | analyte |
dopamine(DA) | Sigma-Aldrich.Inc | H-8502 | analyte |
3, 4-dihydroxybenzylamine hydrobromide(DHBA) | Sigma-Aldrich.Inc | 858781 | interior label |
acetonitrile | Sigma-Aldrich.Inc | 75-05-8 | eluriant and mobile phase |
phosphoric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7664-38-2 | eluriant |
uric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 69-93-2 | artifical urine |
creatinine | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 60-27-5 | artifical urine |
trisodium citrate | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 6132-04-3 | artifical urine |
KCl | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7447-40-7 | artifical urine |
NH4Cl | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 12125-02-9 | artifical urine |
NaHCO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | SWC0140326 | artifical urine |
C2Na2O4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 62-76-0 | artifical urine |
NaSO4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7757-82-6 | artifical urine |
disodium hydrogen phosphate | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10039-32-4 | artifical urine |
urea | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 57-13-6 | artifical urine |
NaCl | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7647-14-5 | artifical urine |
MgSO4.7H2O | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10034-99-8 | artifical urine |
CaCl2 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10035-04-8 | artifical urine |
HCl | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7647-01-0 | artifical urine |
citric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 77-92-9 | artifical urine and mobile phase |
EDTA disodium salt | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 34124-14-6 | mobile phase |
monometallic sodium orthophosphate | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7558-80-7 | artifical urine and mobile phase |
1-heptanesulfonic acid sodium salt | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 22767-50-6 | mobile phase |
sodium hydroxide | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 1310-73-2 | mobile phase |
phenylboronic acid column(PBA column) | Aglilent | 12102018 | PBA extraction |
Inertsil® ODS-3 5 µm 4.6×150 mm column | Dikma | 5020-06731 | HPLC column for seperation |
SHIMADZU SIL-20AC prominence AUTO SAMPLER | Shimadzu Corporation, Japan | SIL-20AC | auto injection for eluriant |
SHIMADZU LC-20AD High Performance Liquid Chromatography | Shimadzu Corporation, Japan | LC-20AD | HPLC pump |
SHIMADZU L-ECD-60A electrochemical detector | Shimadzu Corporation, Japan | L-ECD-60A | detector for the analytes |
ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry System | Micromeritics, USA | surface and porosity analyzer |