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Chemistry

Une méthode pratique pour l’Extraction et analyse par chromatographie liquide à haute pression des neurotransmetteurs catécholamines et de leurs métabolites

Published: March 1, 2018 doi: 10.3791/56445
Automatic Translation
1, 3, 4, 1, 2
1School of Public Health of Southeast University, Laboratory of Environment and Biosafety Research Institute of Southeast University in Suzhou, 2Key Laboratory of Child Development and Learning Science (Ministry of Education), School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University, 3School of Public Health, Tianjin Medical University, 4British Columbia Academy, Nanjing Foreign Language School

Summary

Nous présentons une commode extraction en phase solide couplée à la chromatographie liquide à haute pression (CLHP) avec détection électrochimique (DCE) pour la détermination simultanée de trois neurotransmetteurs de monoamine et deux de leurs métabolites dans les urines des enfants en bas âge. Nous identifions également le métabolite MHPG comme un biomarqueur potentiel pour le diagnostic précoce des lésions cérébrales chez les nourrissons.

Abstract

L’extraction et l’analyse des neurotransmetteurs catécholamines dans les liquides biologiques est d’une grande importance pour évaluer le fonctionnement du système nerveux et les maladies apparentées, mais leur mesure précise est toujours un défi. De nombreux protocoles ont été décrites pour la mesure de la neurotransmetteur par une variété d’instruments, y compris la chromatographie liquide à haute pression (HPLC). Cependant, il existe des lacunes, comme l’opération compliquée ou difficile à détecter des cibles multiples, qui ne peuvent être évités, et actuellement, la technique d’analyse dominant est toujours HPLC couplé avec électrochimiques sensibles ou détection fluorimétrique, due à sa sensibilité élevée et bonne sélectivité. Ici, un protocole détaillé est décrit pour le prétraitement et la détection des catécholamines par chromatographie liquide à haute pression avec détection électrochimique (HPLC-DPE) dans les échantillons d’urine réelle des nourrissons, à l’aide de nanofibres composite électrofilées composé des polymères éther couronne avec du polystyrène comme adsorbant, également connu comme la méthode d’extraction (PFSPE) emballé-fibre en phase solide. Nous montrons comment urine échantillons peuvent être facilement precleaned par une colonne de nanofibres-emballés en phase solide, et comment l’analyser dans l’échantillon peut être rapidement enrichi, désorbés et détecté sur un système de développement du jeune enfant. PFSPE simplifie considérablement les procédures de prétraitement des échantillons biologiques, permettant une diminution de temps, frais et réduction de la perte de cibles.

Dans l’ensemble, cet ouvrage illustre un protocole simple et commode pour l’extraction en phase solide couplée à un système HPLC-DCE pour la détermination simultanée de trois neurotransmetteurs monoamines (noradrénaline (Na), épinéphrine (E), dopamine (DA)) et deux de leurs métabolites (3-méthoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) et l’acide 3, 4-dihydroxy-phénylacétique (DOPAC)) dans les urines des enfants en bas âge. Le protocole établi a été appliqué pour évaluer les différences des catécholamines urinaires et leurs métabolites entre les nourrissons à haut risque avec des lésions cérébrales périnatales et témoins sains. Analyse comparative révèle une différence significative dans le MHPG urinaire entre les deux groupes, ce qui indique que les métabolites des catécholamines peuvent être un marqueur important de candidats pour un diagnostic précoce des cas à risque de lésions cérébrales chez le nourrisson.

Introduction

Neurotransmetteurs catécholamines et leur contenu de métabolites dans les fluides corporels peut affecter la fonction neurale et affecter l’équilibre des États aux stimuli-réponse à une grande partie1. Anormales peut causer une variété de maladies, telles que pheochromacytoma, SURRENALIEN, neuroblastome et troubles neurologiques1,2. L’extraction et le dosage des catécholamines dans les fluides corporels est significatif pour le diagnostic des maladies concernées. Cependant, les catécholamines dans des échantillons biologiques existent en faibles concentrations et sont facilement oxydés. En outre, ils sont très difficiles à éluer à cause de la grande quantité d’interférence en moyenne3. Ainsi, la détection simultanée des catécholamines dans les liquides biologiques est toujours un défi.

Il y a eu des commentaires montrant que les catécholamines urinaires peuvent être une mesure de contrainte, et que leurs niveaux sont des marqueurs biologiques importantes répondant à la stimulation tactile, traitement des nouveaux-nés5. Selon les recherches, tous les nourrissons qui ont subi des incidents prématurées sont à risque de blessures de cerveau pour4,5,6, et blessure peut provoquer la libération anormale des catécholamines et des questions connexes dans les fluides. Il existe des techniques avancées de résonance magnétique capable de détecter des lésions cérébrales dans les précédentes phases7,8. Toutefois, dans les premières 48 h, un processus de développement neurologique anormal provoque crânien permanent qui ne sera pas évident dans des images médicales11. En outre, les ressources de l’instrument haut coût et rares, ainsi que d’autres facteurs, le rend impossible pour toutes les unités néonatales d’avoir accès à ces techniques spécialisées de neuro-imagerie. Cependant, l’utilisation d’un biomarqueur facilement accessible et pratique (tels que les catécholamines et leurs métabolites) pourrait surmonter ces lacunes, et la projection d’un biomarqueur dans les fluides humains peut aider dans le diagnostic précoce des lésions cérébrales et prendre rapidement des identification des nouveau-nés qui ont besoin de neuroprotection9. Les catécholamines dans l’urine peuvent être un indice simple et évident, en raison de la corrélation directe entre le montant de leur libération dans les fluides et la fonction neuroactivity.

Parmi les liquides biologiques, le liquide céphalorachidien (LCR) et des échantillons de plasma ne sont pas faciles à obtenir par l’intermédiaire de procédures traumatisantes existantes, et il est aussi très difficile de se débarrasser des perturbations dues à la protéine adhésive et d’autres impuretés, conduisant à une pénible et processus fastidieux d’échantillonnage qui ne convient pas pour la détection répétée. Aussi, pour les enfants, il est presque impossible d’obtenir les échantillons de façon traumatique. Prélèvement urinaire est donc mieux que les autres formes d’échantillonnage, car il est non invasif, facile à utiliser et peut être fait à plusieurs reprises. Les échantillons d’urine sont abondants et faciles à stocker et montrent de grands avantages sur les autres formes d’échantillons biologiques.

Les principales méthodes pour quantifier des catécholamines dans les liquides biologiques comprennent les radioenzymic dosages10dosages immunitaire-sorbent-enzymatique11, voltamétrie12 et lentille thermique spectrométrie13. Mais lacunes existent, telles que des opérations complexes et difficiles à détecter des cibles multiples. Aujourd'hui, la technique d’analyse dominante est de chromatographie liquide à haute performance (HPLC)14, couplé avec sensible électrochimique15 ou fluorimétrique détection16, en raison de sa grande sensibilité et une bonne sélectivité. Avec la technologie de spectrométrie de masse en tandem, comme la chromatographie en phase liquide/spectrométrie de masse (LC/MS) et liquid chromatography/mass spectrometry/spectrométrie de masse (LC/MS/MS), l’analyse et la quantification des neurotransmetteurs peuvent atteindre de haut précision et la spécificité de17,18. Cependant, la technique MS nécessite instrumentation coûteuse comme main-d'œuvre largement qualifiée, rendant la méthode difficilement applicable universellement dans les laboratoires plus classiques. Systèmes HPLC-DCE sont équipés généralement dans les laboratoires cliniques et plus classiques et sont ainsi devenus un choix commun et bon pour les groupes de recherche à utiliser pour le dosage chimique, mais elles nécessitent l’échantillon introduit dans le système pour être propre et de a petite Echelle volume19. Ainsi, il est d’une grande importance pour purifier et condenser l’échantillon avant l’analyse. La méthode classique pour la purification est extraction liquide-liquide14,15,20 et off-line extraction en phase solide, y compris l’alumine activée colonne21,22 et diphenylborate (DPBA) complexation23,24,25,26.

Myeongho Lee et al. ont utilisé résine polymère modifié chimiquement avec de l’éther couronne comme l’adsorbant pour extraire sélectivement des catécholamines dans l’urine humaine depuis 200727. En outre, en 2006, Haibo He et al. fait preuve d’une approche de synthèse facile pour boronates affinité extraction sorbant byutilizing un nanomagnétiques fonctionnalisable polyédriques SILSESQUIOXANES oligomériques (POSS) selon des structures composite et appliquant à l’enrichissement des catécholamines dans l’urine humaine (noradrénaline, adrénaline et à l’isoprénaline)28. Ils ont également profité de la nanomatériaux pour accomplir le travail, en utilisant une technologie appelée nano-électrofilage et formant le matériau fibreux de polymère à l’échelle nanométrique. Le processus électrofilage peut ajuster le diamètre, la morphologie et alignement spatiale du produit en contrôlant la tension de service et de modifier le contenu de la solution de filage ainsi que d’autres paramètres29. Comparée à la cartouche SPE classique, nanofibres électrofilées sont très adaptés extraire et enrichir les analytes cibles d’une matrice complexe, car elles sont équipées des rapports élevés de surface-surface-à-volume d’adsorber les analytes à haut rendement, et pièce plus facilement contrôlée par surfaces propriétés chimiques, permettant la fixation pratique des composés cibles. Ces propriétés font le bon choix pour adsorbants SPE, qui réduit considérablement la phase solide et la désorption solvant montant30,31,32,33. Des catécholamines dans les échantillons d’urine, nanofibres électrofilées composés d’éther couronne apolymeric avec du polystyrène (PCE-PS) ont été utilisés pour extraire sélectivement trois catécholamines (NE, E et DA)34. Le document indiquait que l’éther couronne sélective adsorbés les cibles du NE, E et DA, qui reposait sur sa géométrie correcte permettant de lier les catécholamines via formant des liaisons hydrogènes. Les résultats affichés l’éther couronne matérielle efficacement, éliminer les autres composés interférents contenues dans des échantillons biologiques. Inspiré par ce rapport, une nouvelle méthode a été développée pour l’extraction sélective des catécholamines par utilisation de nanofibres composite électrofilées composé de PCE-PS.

Dans cet article, la méthode déjà rapporté34 a été améliorée et utilisée non seulement pour analyser avec succès E, NE et DA, mais aussi leurs métabolites, MHPG et DOPAC, dans l’urine. Nous explorons également de nouvelles possibilités pour le mécanisme du processus d’adsorption. La méthode montre satisfaisant de l’efficacité d’extraction et de sélectivité pour les cinq analytes, et la méthode a été vérifiée dans l’analyse de l’urine de nouveau-nés à haut risque avec des lésions cérébrales périnatales et témoins sains.

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Protocol

Le consentement éclairé des parents a été obtenu, et l’approbation du Conseil d’examen de l’établissement a été obtenue pour l’étude. L’étude a été réalisée conformément au code de déontologie de l’Association médicale mondiale (déclaration d’Helsinki) pour des expériences sur des êtres humains. Soignants de tous les participants prévus écrits préalable pour être inscrits à l’étude. Approbation du Comité d’éthique de l’hôpital Zhongda, filiale avec l’Université du sud-est, a également été obtenu.

1. préparation des colonnes et des Solutions nécessaires à l’Extraction et le dosage des catécholamines

  1. Préparer la colonne PFSPE. Diviser 1-2 mg de nanofibres PCE-PS en 5-6 portions et utiliser une fine tige d’acier avec 0,5 mm de diamètre pour les compresser ordonnée dans l’extrémité d’un embout de la pipette avec un volume de 200 µL.
  2. Préparer l’urine artificielle par pesage 2,427 g d’urée, acide urique 0,034 g, 0,09 g de créatinine, citrate trisodique 0,297 g, 0,634 g de chlorure de sodium, 0,45 g de chlorure de potassium, 0,161 g de chlorure d’ammonium, 0,089 g Chlorure de calcium dihydraté, 0,1 g de sulfate de magnésium heptahydrate, 0,034 g de bicarbonate de sodium, oxalate de sodium 0,003 g, 0,258 g de sulfate de sodium, dihydrogénophosphate de sodium 0,1 g et phosphate disodique 0,011 g et dissoudre dans 200 mL de produits chimiques ci-dessus désionisée eau.
  3. Préparer 2 mg/mL solution de diphenylborate (DPBA) solution en dissolvant 2 mg du composé dans 1 mL d’eau distillée. Conserver la solution dans l’obscurité à 4 ° C.
  4. Norme de l’analyte
    Remarque : La structure chimique et les propriétés des catécholamines sont instables, et ils se décomposent facilement. Le processus d’élaboration des normes doit être très rapide et doit prévenir l’exposition aux rayons du soleil.
    1. Peser 1,0 mg de NE, E, DA, MHPG, DOPAC et interne standard 3, 4-dihydroxybenzylamine hydrobromide DHBA dans des tubes de microcentrifuge séparée 1,5 mL. Diluer la solution benzoïque dans l’eau à 100 ng/mL avant utilisation.
    2. Osciller les normes préparées dans l’obscurité à grande vitesse jusqu'à ce que les analytes se dissoudre complètement. Il s’agit de l’étalon primaire ; conserver à-20 ° C pendant jusqu'à plusieurs semaines.
    3. Préparer des stocks secondaire 1 000 ng/mL d’analytes. Pour NE, E, DA, DOPAC et MHPG, transférer 5 µL de chaque analyte primaire stock dans 4 975 µL d’eau distillée dans un tube à centrifuger 5 mL et stockez-le dans l’obscurité à 4 ° C jusqu'à l’utilisation. Préparer ces frais du jour des solutions. Pour benzoïque, transférer 5 µL d’étalon primaire dans 4 995 µL d’eau distillée dans un tube à centrifuger 5 mL et stockez-le dans l’obscurité séparément à 4 ° C.
    4. Préparer des dilutions supplémentaires avec la crosse de l’analyte secondaire pour créer une courbe standard (p. ex.., supplémentaires Tableau 2). Stocker des solutions dans l’obscurité à 4 ° C et préparer les frais du jour.
    5. Tester la tension optimale du détecteur ECD en utilisant le stock standard avec une concentration appropriée. Varier la tension afin de trouver une valeur où les analytes ont la meilleure apparence de pointe.
  5. Préparer l’éluant contenant 30 % d’acide phosphorique, 15 % d’acétonitrile, et 55 % d’eau distillée. Pour 10 mL de solvant de l’éluant, utilisez 5,5 mL d’eau distillée et ajouter 1,5 mL d’acétonitrile et 3 mL d’acide phosphorique goutte à goutte dans l’eau.

2. préparation des échantillons d’Urine réelle et la Phase Mobile

  1. Ont les mères à recueillir les premières urines du matin de leurs enfants à l’aide de godets d’urine aseptique. Transférer les échantillons dans des tubes en polypropylène et étiquette immédiatement. Ensuite, stocker les échantillons dans un congélateur à-20 ° C.
  2. Vortex et centrifuger les échantillons urinaires à 1 510 x g pendant 10 min à la température (RT) de se débarrasser de la plupart des interférences particulaire ambiante. Jeter le sédiment et rassembler les surnageants d’autres expériences. Afin d’extraire efficacement les analytes, passez à PFSPE un prétraitement (étape 3) immédiatement après centrifugation.
  3. Préparer la phase mobile
    1. Préparer une bouteille propre, au moins 1 L. La composition de la phase mobile est répertoriée dans le Tableau complémentaire 1; pour la phase mobile 1 L, mesure 6,7242 g d’acide citrique, 93,06 mg de sel disodique d’éthylène diamine tétra acétique (EDTA), 7,02 g d’orthophosphate de sodium monométalliques, 404,5 mg de sel de sodium acide heptanesulfonique-1 et 3,5 g de sodium hydratent dans la bouteille. Ajouter 40 mL d’acétonitrile et distillée à 1 000 mL. Agiter et vibrer aux ultrasons pendant 15 min jusqu'à ce que la question de la solution se dissout.
    2. À l’aide d’un pH-mètre avec une électrode de verre, ajuster le pH de la phase mobile à 4.21 avec une solution saturée d’hydroxyde de sodium.
    3. Filtrer la phase mobile avec une membrane microporeuse des fluorure de polyvinylidène 0,45 µm et un dispositif d’aspiration à dépression pour se débarrasser des impuretés.
    4. Utilisez vibration ultrasonique pendant 15 min pour dégazer la phase mobile chaque fois avant de l’utiliser.

3. PFSPE Extraction et analyse par CLHP

  1. Activer les nanofibres. Appuyez sur 100 µL de méthanol et 100 µL d’eau séquentiellement à travers la colonne PFSPE à l’aide d’une seringue de 5 mL d’une manière lente, goutte à goutte.
  2. Mélanger 100 µL d’urine déguster avec 100 µL de solution de DPBA 2 mg/ml et 30 µL 100 ng/ml de solution de benzoïque (IS, étalon interne) dans un tube de 0,5 mL EP, puis transvaser la mélange de la solution dans la colonne PFSPE. Appuyer sur la solution d’échantillon mélangé par le biais de la colonne PFSPE avec une seringue en plastique étanche de 5 mL à l’aide de la force de la pression de l’air.
  3. Lessiver la colonne trois fois en chargeant 100 µL de solution DPBA (2 mg/mL) dans la colonne SPE et poussez la solution lentement à travers la cartouche avec la pression de l’air à l’aide d’une seringue en plastique étanche de 5 mL.
  4. 50 µL de l’éluant sur la colonne PFSPE de la charge et le pousser à travers la colonne, en recueillant l’éluat avec un tube de 0,5 mL EP.
  5. Allumez le dégazeur de fonctionnement d’une solution contenant de l’air dans le système. Avant les analyses d’échantillons, le système devrait fonctionner pendant plus de 0,5 h avec la phase mobile pour équilibrer et réduire le bruit de la ligne de base. Voir supplémentaire tableau 1 liste les paramètres de configuration du système HPLC.
  6. L’échantillon de 20 µL de l’éluat à l’aide d’un échantillonneur automatique et injecter ensuite dans le système HPLC-DCE.
  7. Lorsque les essais sont terminés, éteignez la cellule du détecteur à l’aide de l’interface détecteur. N’éteignez pas la cellule avec le commutateur à l’arrière du détecteur, car cela pourrait endommager l’instrument.
  8. Modifier manuellement la composition de la phase mobile 10 % méthanol et 90 % d’eau. Fonctionner pendant au moins 30 min. Ensuite, modifier manuellement la phase mobile au méthanol de qualité CLHP. Fonctionner pendant environ 15 min protéger le système dans le méthanol. Pour exécuter cette étape suivant la durée recommandée peut entraîner des dommages à la colonne et le détecteur. Désactiver le flux, puis éteignez le dégazeur.

4. Extraction de cartouches (PBA) de l’acide phénylboronique

PBA cartouche extraction procédures étaient similaires au régime dans Kumar et al. (2011) 25. toutes les solutions sont poussées à travers la cartouche PBA (100 mg, 1 mL) avec de l’air forcé par une seringue.

  1. Conditionner la cartouche avec du 80/20 de 1 mL acétonitrile-eau (v/v) contenant 1 % d’acide formique et 1 mL de tampon de phosphate 50 mM (pH 10) dans l’ordre.
  2. Appuyez sur l’échantillon d’urine tamponnée (mL 1 urine et 2 mL de tampon de phosphate, pH 8,5) par l’intermédiaire de la cartouche PBA.
  3. Laver la cartouche avec 1 mL 50/50 v/v d’acétonitrile-un tampon phosphate (10 mM, pH 8,5).
  4. Éluer la cartouche avec 1 mL d’acétonitrile-eau (80/20 v/v) contenant 1 % d’acide formique.

5. identification et Quantification des catécholamines

  1. Linéarité
    1. Diluer le stock d’analytes secondaire avec urine artificielle à six concentrations (1.5, 3, 12, 25, 50 et 100 ng/mL) ; le volume de dilution de l’urine artificielle suit supplémentaires Tableau 2. Faire trois échantillons parallèles avec chaque concentration d’obtenir 18 solutions expérimentales de l’analyte pour construire les courbes d’étalonnage.
    2. Diluer 10 fois étalon secondaire benzoïque avec urine artificielle pour obtenir la solution expérimentale de 100 ng/mL.
    3. Prétraitez toutes les solutions d’analyte de 5.1.1, selon l’étape 3 (procédures d’extraction de PFSPE). Comme à l’étape 3, injecter 20 µL de chaque éluat correspondante dans le système de CLHP-DCE pour obtenir un chromatogramme HPLC.
    4. Construire les courbes d’étalonnage des cinq analytes en traçant le ratio de la surface du PIC (objectifs/IS) comme l’axe des Y contre le rapport des concentrations (objectifs/IS) comme l’axe des X, comme le montre supplémentaire Figure 1.
  2. LOD et NDD valeur de sensibilité
    1. Injecter 20 µL de l’urine artificielle vide dans le système de CLHP-DCE (comme à l’étape 3), pour obtenir le chromatogramme HPLC de l’échantillon.
    2. Dans le chromatogramme de 5.2.1, recueillir 11 valeurs vides de signal et calculer la valeur moyenne Xb et l’écart type Sb. Calculer le signal minimal d’une substance qui peut être détectée à un certain niveau de confiance, XL, XL = Xb+ K * Sb (K est le coefficient déterminé selon le niveau de confiance, Sb reflète le niveau sonore de la méthode de mesure et le niveau de bruit de machine). Ainsi, LOD = (XL-Xb) / s = (K * Sb) /S (S correspond à la valeur de la pente de la courbe de travail).
    3. Définir un S/N de 3:1 (K = 3) comme la limite de détection (LD) et un S/N de 10:1 (K = 10) dans la limite de dosage (NdD).
  3. Évaluer le taux de récupération
    1. Préparer les échantillons d’urine réelle et enrichis. Diluer le stock d’analytes secondaire avec urine réel à trois concentrations (5, 50 et 100 ng/mL) afin d’obtenir les échantillons d’urine enrichis. Préparer les trois échantillons parallèles pour chaque solution d’analyte. Compter la concentration enrichie comme la quantité de composés cibles dopés dans l’échantillon d’urine. Définir cette valeur comme uns.
    2. Stock de benzoïque diluée à 100 ng/mL, comme au point 5.1.2.
    3. Traiter chaque solution d’échantillon de 5.3.1 selon l’étape 3 (procédures d’extraction de PFSPE) et injecter le 20 µL de chaque éluant correspondante dans le système de CLHP-DCE pour obtenir le résultat du chromatogramme. La valeur des analytes sera comptée comme une quantité de composés cibles quantifiées dans l’échantillon d’urine enrichis. Définir cette valeur comme unt.
    4. Injecter 20 µL de l’échantillon d’urine dans le système HPLC-DCE (comme à l’étape 3) pour obtenir le résultat du chromatogramme. La valeur des analytes sera comptée comme une quantité initiale de composés cibles quantifiées dans l’échantillon d’urine. Définir cette valeur comme unje.
    5. Calculer la quantité de composés cibles dans les échantillons provenant de l’équation de la courbe d’étalonnage. Le pourcentage de récupération est estimé à récupération méthodologiques % = (t - Ai) × 100 / (s). Valeurs moyennes sont indiquées dans le tableau 1.
  4. Évaluer l’imprécision
    1. Préparer les échantillons d’urine artificiels enrichis à 5, 50 et 100 ng/mL concentrations comme au point 5.3.1. Préparer six échantillons parallèles pour chaque solution d’analyte. Préparer les échantillons expérimentaux frais tous les jours.
    2. Diluer le stock benzoïque à 100 ng/mL comme au point 5.1.2.
    3. Évaluer la précision intra-jour (n = 6). Chaque solution d’échantillon en 5.4.1 selon l’étape 3 du processus et injecter le 20 µL de chaque éluant correspondant dans le système de CLHP-DCE pour obtenir le chromatogramme. Faire la même opération six fois dans la même journée.
    4. Calculer la quantité de composés cibles dans les échantillons provenant de l’équation de la courbe d’étalonnage. Selon la même concentration du même composé, l’écart type relatif (RSD) des six essais en une seule journée est déterminé comme précision intra-jour. Valeurs moyennes sont indiquées dans le tableau 1.
    5. Évaluer la précision inter-jour (n = 6). À la même heure chaque jour dans les six jours séquentielles, préparer les échantillons d’urine artificiels enrichis pour trois concentrations de 5, 50, 100 ng/mL, comme 5.4.1 et 5.4.2. et traiter chaque solution d’analyte échantillon selon l’étape 3.
    6. Injecter le 20 µL de chaque correspondant éluat de 5.4.5 dans le système HPLC-DCE pour obtenir des résultats de chromatogramme chaque jour. Calculer la quantité de composés cibles dans les échantillons provenant de l’équation de la courbe d’étalonnage. Inter-journée précision est exprimée par le RSD de la quantité d’essais sur des échantillons d’urine artificiels enrichis aux trois concentrations en six jours séquentielles. Valeurs moyennes sont indiquées dans le tableau 1.

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Representative Results

Ce protocole est une méthode simple et pratique de PFSPE pour prétraiter les échantillons d’urine et enrichir des cinq catécholamines pour la détection via un système HPLC-DPE ; un diagramme du processus est illustré à la Figure 1. Le protocole comprend principalement quatre étapes-activation, chargement, rinçage et élution - couplé avec une petite quantité de nanofibres PCE-PS et un dispositif d’extraction en phase solide simple. La morphologie des nanofibres de PCE-PS a été évaluée à l’aide d’un analyseur de surface et de la porosité (voir Table des matières). Le pari de propriétés-la texture (Brunauer, Emmett et Teller) superficie superficie, volume de pore et taille de pore-y m 2,82972 g-1, cm 0,0093 g-1et 12,76 nm, respectivement. Ces données indiquent que le matériau utilisé dans le protocole a pores nanométriques sur la surface, ce qui peut contribuer à l’efficacité d’adsorption élevée et le pH abaissé de liaison dans le protocole.

Ce protocole utilise des ingrédients de l’échantillon, lixiviat, éluant, volumes optimisés, etc., ainsi que le pH de travail et le temps consommé pendant les procédures. Dans Chen et al., l’éluant est une solution d’acide acétique de 12,0 M l’adsorbant devenir protoné à cause des conditions acides et chargés positivement, ce qui est favorable pour l’élution des CAs34,35. Dans cette étude, la recette de l’éluant a été remis à neuf pour être 30 % d’acide phosphorique, 15 % d’acétonitrile, et 55 % d’eau distillée. La valeur de pH final d’éluant a été ramenée à 3.0. Le solvant de l’éluant doit être conservé dans un environnement acide lors de l’élution, mais beaucoup plus modérée que l’acide acétique 12,0 M, qui peut conduire à pointe mauvaise apparition et endommager le système de CLHP.

Pour l’identification des catécholamines, temps de rétention du chromatogramme des pics dans les échantillons avec des pics de la solution étalon sont comparés. Figure 2 montre des exemples des chromatogrammes HPLC-DCE de différentes solutions. Si le protocole est suivi avec succès, les profils chromatographiques des trois catécholamines et de leurs métabolites devraient provenir par HPLC-DCE avec pics symétriques claires, bien définies et bruit de fond minimal, comme illustré dans la Figure 2 de . Pour comparaison avec la méthode conventionnelle, une cartouche PBA commerciale a été choisie comme un contrôle. Dans la Figure 2(un–c), cinq pics de cible en (b) sont nettement supérieurs à thaosein (c), ce qui indique que la méthode PFSPE est plus sensible que la méthode de cartouche PBA. En outre, le pic DOPAC ne montre pas le résultat d’extraction de cartouche PBA, indiquant que la colonne de la PBA n’était pas capable d’extraire DOPAC. Figure 2 (d) dépeint le chromatogramme de l’échantillon d’urine vierge sans aucun prétraitement et la Figure 2(e) montre les chromatogrammes de l’échantillon d’urine extraite à l’aide de nanofibres composite PCE-PS. Figure 2 (f) montre les chromatogrammes de l’échantillon d’urine après l’extraction avec la colonne PBA, qui ne montre également aucune extraction DOPAC compatible avec le résultat dans la Figure 2(c). Le diagramme indique que la méthode PFSPE impossible d’extraire uniquement les cibles avec le bon effet, mais pourrait aussi se débarrasser de la plupart de l’interférence dans l’urine, donnant l’identification de bon pic pour les composés cibles.

L’analyse statistique a révélé que les mesures pour les trois catécholamines et deux métabolites étaient fiable reproduit (tableau 1). La cible de tous les composés ont montré de bonne linéarité entre 1,5 et 100 ng/mL (R2> 0,99), et la courbe d’étalonnage de chaque analyte peut être trouvée dans supplémentaire Figure 1. Les courbes et les valeurs de2 R démontrent que les analytes bonne linéarité et la relativité dans une certaine plage linéaire, appropriée pour le calcul des concentrations d’analytes dans les échantillons d’urine. Les limites de détection (LD) variaient de 0,25 à 0.54 ng/mL, et les limites de dosage (NdD) étaient 0,83 à 1,81 ng/mL, respectivement. La valeur de signal-bruit (S/N) chiffrait à 3. La gamme des recouvrements méthodologiques des composés cinq cibles était de 97,4 % (MHPG) à 124,2 % (DOPAC), qui a été satisfaisante pour l’application aux échantillons réels. La précision intra-jour a été de 2,7 à 4,8 % (exprimé en écart-type relatif) et la précision inter-jour était de 2-8,1 %, affichant la répétabilité et précision.

Pour la détection des cibles dans les échantillons d’urine réelle, 28 nouveau-nés à haut risque et 22 enfants en bonne santé dans la division de la garde d’enfants, l’hôpital municipal de Suzhou, ont été recrutés. Tous les 50 nourrissons prises dans l’étude étaient des garçons. Quand ils étaient âgés de six mois, elles ont été prises à un bilan de santé systématique en septembre 2016. Tous les échantillons d’urine ont été recueillies et prétraitées en suivant les étapes du protocole 3.1 et 3.2, et les échantillons ont été analysés en utilisant le reste de l’étape 3. Les concentrations ont été calculées sur les courbes d’étalonnage. Des différences statistiques ont été analysés par l’analyse de variance (ANOVA). Les résultats peuvent être vus dans le tableau 2. La différence des catécholamines et métabolites entre les deux groupes ont été comparés et analysés. Les p-valeurs montrent que les catécholamines n’étaient pas significativement différents entre les risque élevé et en bonne santé, alors que le contenu MHPG métabolite est différent entre ces groupes (p = 0,001). Le groupe de nouveau-nés à haut risque a des quantités plus élevées de MHPG celui du groupe témoin (14,8 ± 3,6 ng/mL par rapport à 1,4 ± 0,2 ng/mL), ce qui signifie que le niveau de MHPG urinaire peut être un marqueur potentiel pour le dépistage précoce des nourrissons à risque élevé.

Figure 3 tableau 3 décrivent la méthode de quantification classique pour la détermination des matériaux de monoamine et comparer avec d’autres méthodes pour lesquelles les processus de fonctionnement et les chiffres d’intérêt sont donnés. Par rapport aux méthodes classiques, méthode PFSPE a des avantages comme un timespan court (5-10 min), les processus de fonctionnement simplifié, solvant organique moins et plus écologique avec les paramètres méthodologiques satisfaisantes. Le montant de l’éluant nécessaire est faible en volume (50 µL) et l’étape d’enrichissement cible ne nécessite aucune évaporation, ce qui favorise grandement la sensibilité de détection pour les composés cibles dans l’urine. Par rapport aux classique SPE axée sur les particules, cette méthode renforcé l’efficacité, simplifié le processus de préparation et réduit le temps de l’analyse avec sensibilité, sélectivité et une fiabilité acceptable.

Figure 1
Figure 1 : Diagramme schématique de procédure PFSPE dans l’étude et une représentation de son dispositif. Seringue (1), Gastight, (2), Pipette de pointe et (3), Packed nanofibres. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Chromatogrammes de différents échantillons. (un) Spiked échantillon d’eau avec des objectifs et IS dans (100 ng/mL) sans extraction. (b) l’eau Spiked échantillon extrait par la méthode PFSPE et (c) par cartouche (PBA) de l’acide phénylboronique commercial. (d), véritable vide urine échantillon sans extraction. (e) véritable urine sample extrait par la méthode PFSPE. (f), urine véritable échantillon extrait par cartouche commerciale de PBA. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Organigramme analytique des méthodes de détermination de. (a, b) Déjà signalé les méthodes d’extraction classique. (a) Extraction de l’alumine, (b) par DPBA complexe et (c) par la méthode proposée dans cet article. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplémentaire Figure 1 : courbes d’étalonnage et d’équations. Les courbes standards pour les cinq analytes sont construits afin d’utiliser l’équation de la droite pour calculer la concentration inconnue des analytes de l’échantillon. (un) NE, E (b), (c) DA, MHPG (d) et (e), DOPAC. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.

Supplémentaire Figure 2 : interaction affinité boronates entre groupe cis diol acide boronique ou adjacentes deux groupes hydroxyles. (A) schéma de l’interaction entre les acides boroniques et plusieurs groupes -OH à cinq ou six chaînons esters cycliques de forme. (B) groupe Cis-diol ou adjacentes deux groupes hydroxyles en cercles rouges représentent les sites de réaction majeure pour les cinq analytes à acide boronique composé. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.

NE MHPG E EST DOPAC DA
Gamme de linéarité (ng/mL) 1.5-400 1.5-200 1.5-100 1.5-100 1.5-400
Valeurs de R au carré 0.9945 0,995 0.9976 0.9902 0.9954
LOD (ng/mL) 0,323 0,322 0,313 0,657 0,249 0,543
Limite de dosage (ng/mL) 1,076 1.072 1.043 2.191 0,83 1.809
Récupération ± RSD (%)(n=9) 110.7±2.9 97.4±9.1 103.9±5.2 86.5±7.3 124.2±3.1 117.3±5.4
Précision (% RSD) (n = 9)
Intra-jour 4.5 4 2.7 4.8 3.3 4.7
Inter-journée 4.1 8.1 2 6.3 3.2 5.9
NE, la noradrénaline ; MHPG, 3-méthoxy-4-hydroxyphenylglycol ; E, épinéphrine ; IS, étalon interne ; DOPAC, 3, 4-dihydroxyphénylacétique acide ; DA, dopamine ;

Tableau 1 : Résultats d’analyse du protocole proposé pour la détermination des trois catécholamines et deux métabolites avec les solutions étalons.

Concentration (ng mL-1) Groupe témoin (22) Groupe à haut risque nourrisson (28) Valeur P
NE 7.52±1.34 5.56±1.7 0,37
MHPG 1.4±0.2 14.8±3.6 0,001
E 24±15.8 20.9±5.87 0,841
DOPAC 106.36±30.1 72.12±18.07 0,312
DA 55.53±11.9 48.12±20.9 0,76
P < 0,05 *** montre une différence significative entre les deux groupes

Tableau 2 : comparaison des concentrations des trois catécholamines et deux métabolites dans les urines entre enfants en bonne santé et les nourrissons à haut risque. Les résultats ont été analysés statistiquement à l’aide de l’analyse de variance (ANOVA) avec un seuil de signification de p = 0,05 pour les différences entre le contenu MHPG. ± D’écarts moyens sont indiqués.

Échantillon Solvant épuisé (mL) Volume de l’échantillon (mL) Temps de prétraitement (min) Gamme de linéarité LOD Récupération relative (%) S’évaporer et
Redissoudre		 Méthode d’analyse
solvant volume temps (min) récupération (%) solvant et
(mL) (mL) reconstitution de
résidu
Urine 0,5 0.05 10 2.0 – 200 ng/mL (NE, E, DA) 0,2 à 0,5 ng/mL (NE, E, DA) 88.5-94,5 (NE, E, DA) N° HPLC-DCE (Chen et coll., 2016)
Urine 19 0,7 — 47 – 167 µg/L (DA) 166-500 nM (DA) 98,3-101.1 (DA) N° HPLC-UV (Piotr et coll., 2016)
Urine 1.3 0,01 — 0,5 – 1250 ng/mL (NE, E, DA, NMN, MN) 0,5 à 2,5 ng/mL (NE, E, DA, NMN, MN) 74,1 – 97,3 (NE, E, DA, NMN, MN) N° LC-MS/MS (Li et al., 2016)
Urine et le plasma 20 0.05 10 0,04 à 2,5 ng/mL (NE, E, DA) 0,01-0,02 ng/mL (NE, E, DA) 87,0-97,5 (NE, E, DA) N° HPLC-UV (Mohammad al, 2016)
Urine < 0,5 0,1 5 1.5-400 ng/mL (NE, MHPG, E, DOPAC, DA) 0,249-0,543 ng/mL (NE, MHPG, E, DOPAC, DA) 97,4-124,2 (NE, MHPG, E, DOPAC, DA) N° ce travail
—, Indéfini.
PBA, acide phénylboronique

Tableau 3 : Comparaison de ce travail avec des études sur le prétraitement des monoamines ou d’autres sujets connexes au cours des dernières années.

Supplémentaire tableau 1 : Instrument de paramètres pour la détection et la quantification des analytes dans le papier par HPLC-DCE. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce tableau.

Supplémentaires Tableau 2 : préparation de la courbe d’étalonnage pour les cinq analytes. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

La méthode PFSPE proposée dans le présent document peut être importante et significative en ce qui concerne sa rapidité, simplicité et commodité. Les adsorbants utilisés dans le protocole sont nanofibres électrofilées, qui ont des rapports élevés de zone-volume surfaces et adsorbent les analytes à haut rendement. La procédure n’a besoin de quelques milligrammes de nanofibres et un faible volume de solvant de l’éluant et ne nécessite pas une étape d’évaporation se concentrer les analytes. Ici, nous avons présenté un aperçu détaillé d’un protocole de HPLC-DPE basé qui permettra aux nouveaux utilisateurs d’établir une méthode efficace pour la détection et la quantification des trois catécholamines et deux de leurs métabolites (NE, E, DA et MHPG, DOPAC).

La supériorité du présent protocole découle principalement des quatre étapes essentielles lors de la procédure, comme illustré à la Figure 1: à l’aide de nanofibres PCE-PS pour capturer les composés cibles pour réduire la taille de sorbant à quelques milligrammes, conduisant à une adsorption rapide / la désorption et ayant seulement besoin d’un petit volume d’élution fluide (1) ; Ajouter DPBA dans l’urine au complexe avec les analytes à améliorer leur hydrophobicité (2) ; les nanofibres de rinçage avec la solution contenant DPBA pour retenir les analytes et enlever les impuretés (3) ; et l’optimisation des conditions d’extraction et d’analyse à obtenir bonne sensibilité et sélectivité pour les analytes (4).

Pour l’étape (1), le mécanisme des performances supérieures de capacité adsorbante pour PCE-PS peut attribué à une variété de facteurs. Les polymères d’éther couronne dopés les nanofibres peuvent former un complexe de hôte-invité avec les molécules contenant des groupes amine par liaisons hydrogènes, tels que les catécholamines dans le présent document. En outre, Hongyou Hu et al. et Jishun Chen et al. a également proposé qu’acide boronique peut créer des liens avec des atomes d’azote dans la structure chimique grâce à des interactions de B-N, et que le squelette hydrophobe peut interagir avec les anneaux de benzène et d’autres groupes aliphatiques des analytes36,37. En outre, au cours du processus de désorption, les liaisons hydrogène et les interactions de B-N sont facilement brisées à un pH très faible ; ainsi, les macroporeuse avec un pH acide conviennent généralement pour l’exploration de désorption. En outre, il y a également plusieurs interactions secondaires, y compris hydrophobe, ioniques et la liaison hydrogène, qui peut se produire entre boroniques produits chimiques et composés apparentés36,37,38. Toutes ces interactions peuvent contribuer à l’adsorption des analytes aux matériaux.

Pour l’étape (2), avec l’aide de DPBA ajouté, PCE-PS nanofibres adsorbent complexes DPBA-catécholamines rapidement. Zhen Liu et coll. ont montré que le matériel d’affinité boronates ont émergé comme milieux de séparation sélective et reconnaissance moléculaire des composés organiques, comme les nucléosides, saccharides, glycanes, glycoprotéines et ainsi de suite38. La complexation survient principalement de l’interaction d’affinité boronates entre acide boronique et groupes cis-diol ou deux groupes hydroxyles adjacents aux esters cycliques membrée de forme cinq ou six, comme le montre supplémentaire Figure 2 a. Complémentaire de la Figure 2 b représente les sites de réaction majeure pour les cinq analytes dans cet ouvrage le composé acide boronique. Lorsque les environs deviennent acides, le complexe de diol-cis-acide boronique se dissocie. L’interaction entre l’acide boronique et le groupe cis-diol ou deux groupes hydroxyles adjacents existe abondamment et relativement fortement.

Pour l’étape (3), le complexe formé entre les analytes et DPBA peut contenir, eux sur l’adsorbant et autres impuretés sont rincées à la surface de PCE-PS, réaliser la meilleure réserve pour les cibles. Pour l’étape (4), il a été un rapport montrant que le pH optimal était environ 9.0 pour le collage de l’acide borique et le catéchol composé39. Cependant, Chen et al. a exploré la meilleure valeur de pH pour la complexation des catécholamines-DPBA et a conclu que l’exécution de l’adsorption des nanofibres PS-PCE composite pour le tas était optimale lorsque le pH est passé à se situer entre 6,0 et 7,034,35. Liu et al. , impliqué que la structure de la documentation pour le boronates des composés acides, surtout avec le confinement spatial des cavités et des pores nanométriques et les ligands de B-N formés au cours de la réaction, peut faire baisser sensiblement le liaison pH et augmenter l' affinité de liaison38. La structure de PCE-PS comme structure de catécholamines est toutes équipée de - NH-groupes. Ainsi, les propriétés et les pores nanométriques de PCE-PS (données comme indiqué dans les Résultats de représentant), ainsi que les ligands de B-N formés, peuvent contribuer au pH abaissé de liaison dans le protocole. Ainsi, la valeur de pH optimal dans le présent protocole peut être neutre, qui a grandement simplifie les procédures et évite la dégradation de l’analyser.

Les principales limites de détermination de la catcholamine sont que leurs concentrations dans les échantillons biologiques sont très faibles et que leurs structures sont instables (facilement oxydé) ; en outre, il est difficile de se débarrasser des impuretés dans les médias. Ainsi, pour l’analyse des catécholamines dans les échantillons biologiques, prétraitement, habituellement par extraction en phase solide, est nécessaire. La méthode PFSPE proposée dans le présent document a fourni une préconcentration simple et pratique pour les analytes dans les échantillons d’urine. Mais, lorsqu’on fait l’expérience, la condition d’expérience doit être strictement contrôlée, par des moyens tels qu’évitant l’exposition à la lumière et la matière grasse le prétraitement fois autant que possible.

L’applicabilité de la méthode a été évaluée par son utilisation pour déterminer les concentrations des trois catécholamines et deux métabolites dans les urines des enfants en bonne santé et les nourrissons à haut risque. Il y avait une différence significative entre les deux groupes de MHPG urinaire. Comme énoncé précédemment, le montant MHPG dans le corps humain est maintenant principalement signalé comme indice pour tenir compte de ton neurones noradrénergique, l’activité de métabolisme des catécholamines dans le central et le système nerveux périphérique40,41, 42, et est un marqueur utile plasma et l’urine pour le métabolisme NE central43. Pour les nourrissons à haut risque, une variété de facteurs tels que l’encéphalopathie hypoxique-ischémique (HIE) provoque cerveau insultes traumatisme et le cerveau, conduisant à des degrés divers des déficits de développement neurologique de l’enfance. Cette lésion cérébrale conduira à son tour à la libération de neurotransmetteurs (MHPG inclus) dans les fluides corporels44,45. Selon les rapports de J.W. Maas, il y a des corrélations significatives entre le cerveau, CSF, le plasma et les concentrations urinaires de MHPG46,47. La mesure du total MHPG (gratuit + conjuguée) dans l’urine a longtemps été utilisée pour évaluer le métabolisme de la centrale NE et périphérique NE métabolisme chez l’homme41,48,49. Ainsi, on peut conclure que les nourrissons risque élevé ont dommage ton neurones noradrénergiques comparativement à celles qui sont saines, affectant le métabolisme des catécholamines dans le central et du système nerveux périphérique. Cet écart indique que d’autres recherches devraient se faire sur la relation entre les déficits de niveau et de développement neurologique MHPG urinaires. Il a été démontré que la méthode proposée pourrait être utilisée pour la détermination de la présence des catécholamines dans les urines, avec une perspective prometteuse devant servir à la clinique pour évaluer les maladies pertinentes de ces neurotransmetteurs.

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Disclosures

Les auteurs certifient qu’il n’y a aucun conflit d’intérêts avec toute organisation financière concernant les matières abordées dans cet article.

Acknowledgments

Cette étude a été financée par le National Science Foundation de Chine (No.81172720, no 81673230), le Social Development Research Programme of Jiangsu Province Science et Technology department (no. BE2016741), Science & Technology Project de Chine Administration générale de la Supervision de la qualité, Inspection and Quarantine (2015QK055), le programme d’ouvrir un projet de laboratoire clé du développement de l’enfant et l’apprentissage de la Science du ministère de l’éducation, Université du sud-est (CDLS-2016-04). Nous saluons sincèrement Song Yuan et Ping Liu qui nous ont aidés dans la collecte d’échantillons.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 µL pipette tip column to contain nanofibers
PCE-PS nanofibers material for PFSPE extraction
steel rod (about 0.5 mm diameter) fill the nanofibres into the column
gastight plastic syringe (5 ml) compress solution into the end of the tip
methanol Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 67-56-1
diphenylborinic acid 2-aminoethyl ester(DPBA) Sigma-Aldrich.Inc A-106408 complex reagent
norepinephrine(NE) Sigma-Aldrich.Inc A-9512 analyte
3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol(MHPG) Sigma-Aldrich.Inc H1377 analyte
epinephrine(E) Sigma-Aldrich.Inc 100154-200503 analyte
3, 4-Dihydroxyphenylacetic acid(DOPAC) Sigma-Aldrich.Inc D-9128 analyte
dopamine(DA) Sigma-Aldrich.Inc H-8502 analyte
3, 4-dihydroxybenzylamine hydrobromide(DHBA) Sigma-Aldrich.Inc 858781 interior label
acetonitrile Sigma-Aldrich.Inc 75-05-8 eluriant and mobile phase
phosphoric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7664-38-2 eluriant
uric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 69-93-2 artifical urine
creatinine Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 60-27-5 artifical urine
trisodium citrate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 6132-04-3 artifical urine
KCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7447-40-7 artifical urine
NH4Cl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 12125-02-9 artifical urine
NaHCO3 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd SWC0140326 artifical urine
C2Na2O4 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 62-76-0 artifical urine
NaSO4 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7757-82-6 artifical urine
disodium hydrogen phosphate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10039-32-4 artifical urine
urea Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 57-13-6 artifical urine
NaCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7647-14-5 artifical urine
MgSO4.7H2O Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10034-99-8 artifical urine
CaCl2 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10035-04-8 artifical urine
HCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7647-01-0 artifical urine
citric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 77-92-9 artifical urine and mobile phase
EDTA disodium salt Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 34124-14-6 mobile phase
monometallic sodium orthophosphate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7558-80-7 artifical urine and mobile phase
1-heptanesulfonic acid sodium salt Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 22767-50-6 mobile phase
sodium hydroxide Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 1310-73-2 mobile phase
phenylboronic acid column(PBA column) Aglilent 12102018 PBA extraction
Inertsil® ODS-3 5 µm 4.6×150 mm column Dikma 5020-06731 HPLC column for seperation
SHIMADZU SIL-20AC prominence AUTO SAMPLER Shimadzu Corporation, Japan SIL-20AC auto injection for eluriant
SHIMADZU LC-20AD High Performance Liquid Chromatography Shimadzu Corporation, Japan LC-20AD HPLC pump
SHIMADZU L-ECD-60A electrochemical detector Shimadzu Corporation, Japan L-ECD-60A detector for the analytes
ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry System Micromeritics, USA surface and porosity analyzer 

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Chimie numéro 133 catécholamines Couronne polymérique nanofibres électrofilées emballé en fibres extraction en phase solide (PFSPE) chromatographie liquide à haute pression avec détection électrochimique (HPLC-DPE) les nourrissons à haut risque
Une méthode pratique pour l’Extraction et analyse par chromatographie liquide à haute pression des neurotransmetteurs catécholamines et de leurs métabolites
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Xie, L., Chen, L., Gu, P., Wei, L., Kang, X. A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites. J. Vis. Exp. (133), e56445, doi:10.3791/56445 (2018).

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