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Chemistry

Un metodo pratico per estrazione ed analisi con cromatografia liquida dei neurotrasmettitori della catecolamina e loro metaboliti

Published: March 1, 2018 doi: 10.3791/56445
Automatic Translation
1, 3, 4, 1, 2
1School of Public Health of Southeast University, Laboratory of Environment and Biosafety Research Institute of Southeast University in Suzhou, 2Key Laboratory of Child Development and Learning Science (Ministry of Education), School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University, 3School of Public Health, Tianjin Medical University, 4British Columbia Academy, Nanjing Foreign Language School

Summary

Vi presentiamo una comoda estrazione in fase solida accoppiata alla cromatografia liquida (HPLC) con rivelazione elettrochimica (ECD) per la determinazione simultanea di tre neurotrasmettitori di monoammina e due dei loro metaboliti nelle urine dei bambini. Identifichiamo anche il metabolita MHPG come potenziale biomarcatore per la diagnosi precoce del danno cerebrale per neonati.

Abstract

L'estrazione e l'analisi dei neurotrasmettitori della catecolamina nei fluidi biologici è di grande importanza nel valutare la funzione del sistema nervoso e malattie correlate, ma la loro misura precisa è ancora una sfida. Molti protocolli sono stati descritti per la misura di neurotrasmettitore da una varietà di strumenti, tra cui la cromatografia liquida (HPLC). Tuttavia, ci sono carenze, come funzionamento complicato o difficile da rilevare bersagli multipli, che non possono essere evitate, e attualmente, la tecnica di analisi dominante è ancora HPLC accoppiato con sensibile elettrochimica o rilevazione fluorimetrica, dovuto a sua alta sensibilità e buona selettività. Qui, un protocollo dettagliato è descritto per il pretrattamento e la rilevazione delle catecolamine con cromatografia liquida ad alta pressione con rilevazione elettrochimica (HPLC-ECD) in campioni di urina reale degli infanti, utilizzando elettrofilate nanofibre composito composte di etere corona polimerici con polistirolo come adsorbente, noto anche come il metodo di estrazione (PFSPE) di fase solida fibra di pranzo. Vi mostriamo come urina campioni possono essere facilmente precleaned da una colonna di nanofibra-pranzo in fase solida, e come gli analiti nel campione possono arricchirsi rapidamente, sotto esame desorbita e rilevata su un sistema ECD. PFSPE semplifica notevolmente le procedure di pretrattamento per campioni biologici, permettendo per tempo in diminuzione, spese e riduzione della perdita di obiettivi.

Nel complesso, questo lavoro illustra un protocollo semplice e conveniente per estrazione in fase solida accoppiato ad un sistema di HPLC-ECD per la determinazione simultanea di tre neurotrasmettitori di monoammina (norepinefrina (NE), epinefrina (E), dopamina (DA)) e due di loro metaboliti (3-metossi-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) e 3,4-diidrossi acido fenilacetico (DOPAC)) nelle urine dei bambini. Il protocollo è stato applicato per valutare le differenze di catecolamine urinarie e loro metaboliti tra neonati ad alto rischio con lesione cerebrale perinatale e controlli sani. Analisi comparativa ha rivelato una differenza significativa in MHPG urinario fra i due gruppi, che indica che i metaboliti delle catecolamine possono essere un indicatore importante candidato per la diagnosi precoce dei casi a rischio di danni di cervello in infanti.

Introduction

Neurotrasmettitori della catecolamina e il loro contenuto di metabolita nei liquidi corporei possa influenzare la funzione neurale e compromettere l'equilibrio degli Stati di risposta a stimolo di una larga misura1. Anormalità può causare una varietà di malattie, quali pheochromacytoma, ganglioneuroma, neuroblastoma e disturbi neurologici1,2. L'estrazione e la determinazione delle catecolamine nei liquidi corporei è significativo per la diagnosi delle malattie. Tuttavia, le catecolamine in campioni biologici presenti in basse concentrazioni e sono facilmente ossidate. Inoltre, sono molto difficili eluire a causa della grande quantità di interferenze in media3. Così, la rilevazione simultanea delle catecolamine nei fluidi biologici è ancora una sfida.

Ci sono state recensioni mostrando che le catecolamine urinarie possono essere una misura di stress, e che i loro livelli sono importanti indicatori biologici risponde alla stimolazione tattile elaborazione in neonati5. Secondo la ricerca, tutti gli infanti che hanno sofferto gli incidenti precoce sono a rischio per la ferita di cervello4,5,6, e danno può causare il rilascio anormale delle catecolamine e questioni connesse nei fluidi. Esistono tecniche di risonanza magnetica avanzata che possono rilevare danni al cervello in precedenti fasi7,8. Tuttavia, entro le prime 48 h, un processo anormale neurodevelopmental causerà danno cerebrale permanente che non sarà evidente in immagini mediche11. Inoltre, le risorse di alto costo e scarsa strumento, insieme ad altri fattori, rende impossibile per tutte le unità neonatale di avere accesso a queste tecniche di neuro-imaging per applicazioni specializzate. Tuttavia, l'uso di un biomarcatore facilmente accessibile e pratico (come le catecolamine e loro metaboliti) potrebbe superare queste carenze, e la proiezione di un biomarcatore nei fluidi umani può aiutare nella diagnosi precoce della lesione cerebrale e condurre per richiedere identificazione dei neonati che necessitano di neuroprotezione9. Le catecolamine nelle urine possono essere un indice semplice ed evidente, a causa della correlazione diretta tra la quantità di loro rilasciata fluidi e neuroactivity funzione.

Tra i fluidi biologici, campioni di plasma e del liquido cerebrospinale (CSF) non sono facili da ottenere tramite procedure esistenti traumatiche, e inoltre è molto difficile sbarazzarsi di disturbi causati dalla proteina adesiva e altre impurità, portando a un fastidioso e processo che richiede tempo di campionamento che è inadatto per il rilevamento di ripetute. Inoltre, per i bambini, è quasi impossibile ottenere i campioni in modo traumatico. Pertanto, campionamento urinaria è meglio di altre forme di campionamento, come è non invasivo, facile da usare e può essere fatto più volte. Campioni di urina sono abbondanti e facili da memorizzare e mostrerà grandi vantaggi rispetto alle altre forme di campioni biologici.

I principali metodi per quantificare le catecolamine nei fluidi biologici includono radioenzymic saggi10, enzimo-immunitario-sorbent test11, voltammetria12 e lente termica spettrometria13. Ma esistono carenze, quali operazioni complicate e difficili da rilevare bersagli multipli. Oggi, la tecnica di analisi dominante è ad alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC)14, accoppiato con sensibili elettrochimico15 o fluorimetrico rilevazione16, a causa della sua alta sensibilità e buona selettività. Con tecnologia di spettrometria di massa tandem, come cromatografia liquida/spettrometria di massa (LC/MS) e liquido cromatografia/spettrometria di massa/spettrometria di massa (LC/MS/MS), l'analisi e la quantificazione dei neurotrasmettitori possono realizzare alto precisione e specificità17,18. Tuttavia, la tecnica MS richiede strumentazione costosa così come sostanzialmente qualificata manodopera, rendendo il metodo difficilmente applicabile universalmente nei laboratori più convenzionali. Sistemi HPLC-ECD sono comunemente dotate di laboratori più convenzionali e clinici e così sono diventati una scelta comune e buona per gruppi di ricerca da utilizzare per la determinazione chimica, ma richiedono il campione introdotto nel sistema per essere pulito e di Microscala volume19. Così, è di grande importanza per purificare e condensare il campione prima dell'analisi. Il metodo classico per la fase di purificazione è estrazione liquido-liquido14,15,20 e off-line estrazione in fase solida, tra cui colonna di allumina attivata21,22 e diphenylborate (DPBA) complessazione23,24,25,26.

Myeongho Lee et al. hanno utilizzato resina polimerica chimicamente con etere corona come adsorbente per estrarre selettivamente le catecolamine da urina umana dal 200727. Inoltre, nel 2006, Haibo He et al. ha dimostrato un approccio facile sintesi per boronato affinità estrazione sorbente byutilizing un composito a base nanomagnetici nanomagnetici functionalizable silsesquioxane oligomerici poliedrici (POSS) e la sua applicazione all'arricchimento delle catecolamine nel urina umana (adrenalina e della noradrenalina, isoprenalina)28. Essi hanno anche approfittato dei nanomateriali a compiere l'opera, utilizzando una tecnologia chiamata nano-elettrofilatura e formando il materiale fibroso di polimero in scala nanometrica. Il processo di elettrofilatura può regolare il diametro e la morfologia spaziale allineamento del prodotto controllando la tensione di lavoro e cambiare il contenuto della soluzione di filatura insieme ad altri parametri29. Confronto con la cartuccia SPE convenzionale, le nanofibre elettrofilate sono molto adatte per estrarre e arricchire analiti bersaglio da una matrice complessa, come sono dotate di elevati rapporti di superficie-zona--volume di adsorbire gli analiti con alta efficienza, e presentano più facilmente controllato superficie proprietà chimiche, che permette il comodo attacco dei composti bersaglio. Queste caratteristiche li rendono buone scelte per adsorbenti SPE, riducendo notevolmente la fase solida e desorbimento quantità solvente30,31,32,33. Per le catecolamine in campioni di urina, le nanofibre elettrofilate composte da etere corona apolymeric con polistirene (PCE-PS) sono state utilizzate per estrarre selettivamente tre catecolamine (NE, E e DA)34. La carta indicata che l'etere corona selettiva adsorbito gli obiettivi di NE, E e DA, che si basava sulla sua corretta geometria per l'associazione di catecolamine via formando legami idrogeno. I risultati visualizzati l'etere corona materiale in modo efficace, eliminando altri composti interferenti contenute in campioni biologici. Ispirato da questo rapporto, un nuovo metodo è stato sviluppato per l'estrazione selettiva delle catecolamine mediante uso di elettrofilate nanofibre composito composte di PCE-PS.

In questa carta, il metodo segnalato precedentemente34 era migliorato e impiegato non solo per analizzare correttamente E, NE e DA, ma anche loro metaboliti, MHPG e DOPAC, nelle urine. Inoltre esploriamo nuove possibilità per il meccanismo del processo di adsorbimento. Il metodo Mostra soddisfacente efficienza di estrazione e selettività per gli cinque analiti, e il metodo è stato verificato nell'analisi delle urine da neonati ad alto rischio con lesione cerebrale perinatale e controlli sani.

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Protocol

È stato ottenuto il consenso informato da parte dei genitori, e l'approvazione del Consiglio di revisione istituzionale è stata ottenuta per lo studio. Lo studio è stato effettuato in conformità al codice etico dell'associazione medica mondiale (dichiarazione di Helsinki) per esperimenti su esseri umani. Operatori sanitari di tutti i partecipanti forniti consenso per essere arruolati nello studio. Approvazione del comitato etico dall'ospedale di Zhongda, affiliazione con Southeast University, inoltre è stato ottenuto.

1. preparazione delle colonne e delle soluzioni necessarie per l'estrazione e la determinazione delle catecolamine

  1. Preparare la colonna PFSPE. Dividere 1-2 mg di nanofibre PCE-PS in 5-6 aliquote e utilizzare un bel tondino di acciaio con diametro di 0,5 mm per comprimerli ordinata nell'estremità della punta di una pipetta con un volume di 200 µ l.
  2. Preparare l'urina artificiale mediante pesatura 2,427 g di urea, acido urico g 0,034, 0,09 g di creatinina, citrato trisodico 0,297 g, 0,634 g di cloruro di sodio, 0,45 g di cloruro di potassio, 0,161 g di cloruro di ammonio, 0,089 g cloruro di calcio diidrato, 0,1 g di solfato di magnesio eptaidrato, 0,034 g di bicarbonato di sodio, ossalato di sodio 0,003 g, 0,258 g di solfato di sodio, diidrogenofosfato di sodio 0,1 g e sodio fosfato dibasico g 0,011 e sciogliere deionizzata le suddette sostanze chimiche in 200 mL di acqua.
  3. Preparare 2 mg/mL soluzione di riserva di diphenylborate (DPBA) soluzione dissolvendo 2 mg del composto in 1 mL di acqua distillata. Conservare la soluzione al buio a 4 ° C.
  4. Analita standard
    Nota: La struttura chimica e proprietà delle catecolamine sono instabili e si decompongono facilmente. Il processo di preparazione delle norme deve essere molto veloce e deve evitare l'esposizione alla luce solare diretta.
    1. Pesare 1,0 mg di NE, E, DA, MHPG, DOPAC e interno standard 3,4-dihydroxybenzylamine hydrobromide DHBA in microcentrifuga separata 1,5 mL. Diluire la soluzione DHBA in acqua a 100 ng/mL prima dell'uso.
    2. Oscillano gli standard preparati al buio a una velocità elevata fino a analiti sciogliere completamente. Questo è lo stock di primario; conservare a-20 ° C per fino a parecchie settimane.
    3. Preparare le scorte di analita secondario 1.000 di ng/mL. Per NE, E, DA, DOPAC e MHPG, trasferire 5 µ l di ogni stock di analita primario in 4.975 µ l di acqua distillata in una provetta da centrifuga da 5 mL e conservarlo al buio a 4 ° C fino all'utilizzo. Preparare giornalmente queste soluzioni. Per DHBA, trasferire 5 µ l di magazzino primario in 4.995 µ l di acqua distillata in una provetta da centrifuga da 5 mL e conservarlo al buio separatamente a 4 ° C.
    4. Effettuare diluizioni maggiori con il brodo di analita secondario per creare una curva standard (ad es., supplementare tabella 2). Conservare soluzioni al buio a 4 ° C e preparare freschi ogni giorno.
    5. Verificare la tensione ottima del rivelatore ECD utilizzando lo standard stock con concentrazione appropriata. Variare la tensione per trovare un valore dove gli analiti sono il miglior aspetto di picco.
  5. Preparare eluente contenenti acido fosforico di 30%, 15% acetonitrile, e 55% di acqua distillata. Per 10 mL di solvente eluente, utilizzare 5,5 mL di acqua distillata e aggiungere 1,5 mL di acetonitrile e 3 mL di acido fosforico goccia a goccia in acqua.

2. preparazione dei campioni di urina reale e fase Mobile

  1. Hanno madri raccogliere la prima urina del mattino dei loro infanti usando tazze di urina asettica. Trasferire immediatamente i campioni in provette di polipropilene ed etichetta. Quindi, conservare i campioni in un congelatore a-20 ° C.
  2. Vortex e centrifugare i campioni urinari a 1.510 x g per 10 min a temperatura ambiente (RT) per sbarazzarsi della maggior parte delle interferenze del particolato. Scartare il sedimento e raccogliere i surnatanti per ulteriori esperimenti. Al fine di estrarre efficacemente analiti, procedere al pretrattamento PFSPE (passaggio 3) immediatamente dopo la centrifugazione.
  3. Preparare la fase mobile
    1. Preparare una bottiglia pulita, almeno 1 L. È riportata la composizione della fase mobile supplementare tabella 1; per la fase mobile 1 L, misura 6,7242 g di acido citrico, 93,06 mg di sale disodico di etilene diammina tetra acido acetico (EDTA), 7,02 g di sodio monometallici ortofosfato, 404,5 mg di sale di sodio acido 1-heptanesulfonic e 3,5 g di sodio idrato nella bottiglia. Aggiungere 40 mL acetonitrile e acqua distillata per 1.000 mL. Agitare e vibrare con ultrasuoni per 15 minuti fino a quando la questione della soluzione è tutto sciolto.
    2. Utilizzando un pH-metro con un elettrodo di vetro, regolare il pH della fase mobile su 4.21 con una soluzione satura di idrossido di sodio.
    3. Filtrare la fase mobile con una membrana di 0,45 µm polivinilidene fluoruro microporosa e un dispositivo di aspirazione per sbarazzarsi delle impurità.
    4. Utilizzare la vibrazione ultrasonica per 15 min per degassare la fase mobile ogni volta prima dell'uso.

3. PFSPE estrazione ed analisi HPLC

  1. Attivare le nanofibre. Premere 100 µ l di metanolo e 100 µ l di acqua in sequenza attraverso la colonna PFSPE utilizzando una siringa da 5 mL in maniera lenta, goccia a goccia.
  2. Mix 100 µ l di urina di esempio con soluzione DPBA di 100 µ l 2 mg/ml e 30 µ l 100 ng/ml di soluzione DHBA (IS, standard interno) in una provetta 0,5 mL EP, quindi trasferire la soluzione mista alla colonna PFSPE. Premere la soluzione campione miscelato attraverso la colonna PFSPE con una siringa da 5 mL di plastica tenuta di gas usando la forza della pressione dell'aria.
  3. Filtrare la colonna tre volte caricando 100 µ l di soluzione DPBA (2 mg/mL) nella colonna SPE e spingere la soluzione lentamente attraverso la cartuccia con pressione d'aria utilizzando una siringa di plastica da 5 mL tenuta di gas.
  4. 50 µ l di eluente sulla colonna PFSPE di carico e spingerlo attraverso la colonna, raccogliendo l'eluato con un tubo di 0,5 mL EP.
  5. Accendere il degassificatore HLPC a degassare l'aria nel sistema. Prima dell'analisi del campione, il sistema dovrebbe funzionare per più di 0,5 h con la fase mobile per equilibrare e ridurre il rumore della linea di base. Vedere complementare la tabella 1 Mostra i parametri di configurazione del sistema HPLC.
  6. Campione 20 µ l di eluato utilizzando un campionatore automatico e poi iniettare il sistema HPLC-ECD.
  7. Quando le piste sono state completate, spegnere la cellula di rilevamento utilizzando l'interfaccia del rivelatore. NON spegnere il cellulare con l'interruttore sul retro del rilevatore, poichè questo potrebbe danneggiare lo strumento.
  8. Modificare manualmente la composizione della fase mobile 10% metanolo e 90% di acqua. Correre per almeno 30 min. Quindi, modificare manualmente la fase mobile HPLC-metanolo. Eseguire per circa 15 min proteggere il sistema in metanolo. Per eseguire questo passaggio dopo il tempo di esercizio raccomandato potrebbe comportare danni alla colonna e il rivelatore. Spegnere il flusso, quindi spegnere il degasatore.

4. Phenylboronic Acid cartucce (PBA) estrazione

Le procedure di estrazione di PBA cartuccia erano simili al regime a Kumar et al. (2011) 25. tutte le soluzioni sono spinti attraverso la cartuccia PBA (100 mg, 1 mL) con aria forzata da una siringa.

  1. Condizionare la cartuccia con 1 mL 80: 20 acetonitrile-acqua (v/v) contenente 1% di acido formico e 1 mL di tampone fosfato 50 mM (pH 10) in sequenza.
  2. Premere il campione di urina nel buffer (1 mL di urina e 2 mL di tampone fosfato, pH 8.5) attraverso la cartuccia PBA.
  3. Lavare la cartuccia con 1 mL 50: 50 v/v acetonitrile di tampone fosfato (10 mM, pH 8.5).
  4. Eluire la cartuccia con 1 mL di acetonitrile-acqua (80: 20 v/v) contenente 1% di acido formico.

5. identificazione e quantificazione delle catecolamine

  1. Linearità
    1. Diluire lo stock di analiti secondario con urina artificiale a sei concentrazioni (1,5, 3, 12, 25, 50 e 100 ng/mL); il volume di diluizione dell'urina artificiale segue supplementari tabella 2. Fare tre campioni paralleli con ogni concentrazione per ottenere 18 analita soluzioni sperimentali per la costruzione di curve di calibrazione.
    2. Diluire il magazzino secondario DHBA con urina artificiale 10 volte per ottenere 100 ng/mL di soluzione sperimentale.
    3. Pretrattare tutte le soluzioni di analita da 5.1.1, secondo la fase 3 (procedure di estrazione di PFSPE). Come nel passaggio 3, iniettare 20 µ l di ciascun eluato corrispondente nel sistema HPLC-ECD per ottenere un cromatogramma HPLC.
    4. Costruire le curve di calibrazione degli cinque analiti tracciando il rapporto tra area di picco (obiettivi/IS) come asse Y contro il rapporto delle concentrazioni (obiettivi/IS) come asse X, come illustrato nella Figura 1 supplementare.
  2. Valore LOD e LOQ per sensibilità
    1. Iniettare 20 µ l di urina artificiale vuoto nel sistema HPLC-ECD (come nel passaggio 3), per ottenere il cromatogramma HPLC del campione.
    2. Nel cromatogramma da 5.2.1, raccogliere 11 valori del segnale in bianco e calcolare il valore medio Xb e la deviazione standard Sb. Calcolare il minimo segnale di una sostanza che può essere rilevato ad un certo livello di fiducia, XL, come XL = Xb+ K * Sb (K è il coefficiente determinato dal livello di confidenza, Sb riflette il livello di rumore della Metodo di misurazione e il livello di rumorosità della macchina). Così, LOD = (XL-Xb) / s = (K * Sb) / s (S sta per il valore di pendenza della curva di lavoro).
    3. Definire un S/N di 3:1 (K = 3) come il limite di rilevabilità (LOD) e un S/N di 10:1 (K = 10) come il limite di quantificazione (LOQ).
  3. Valutare i recuperi
    1. Preparare i campioni di urina reale e appuntiti. Diluire lo stock di analiti secondario con urina reale a tre concentrazioni (5, 50, 100 ng/mL) per ottenere i campioni di urina a spillo. Preparare tre campioni paralleli per ogni soluzione di analita. Contare la concentrazione a spillo come la quantità di composti target a spillo nel campione di urina. Definire questo valore come uns.
    2. Stock DHBA diluito a 100 ng/mL, come descritto al punto 5.1.2.
    3. Elaborare ogni soluzione di esempio da 5.3.1 secondo la fase 3 (procedure di estrazione di PFSPE) e iniettare il 20 µ l di ogni eluente corrispondente nel sistema HPLC-ECD per ottenere il risultato di cromatogramma. Il valore di analiti verrà conteggiato come una quantità di composti target quantificati nel campione di urina a spillo. Definire questo valore come unt.
    4. Iniettare 20 µ l di campione di urina nel sistema HPLC-ECD (come al punto 3) per ottenere il risultato di cromatogramma. Il valore di analiti verrà conteggiato come una quantità iniziale di composti target quantificati nel campione di urina. Definire questo valore come unio.
    5. Calcolare la quantità di composti di destinazione nei campioni dall'equazione della curva standard. La percentuale di recupero è stimato come recupero metodologico % = (unat - aimi) × 100 / (unas). I valori medi sono riportati nella tabella 1.
  4. Valutare l'imprecisione
    1. Preparare i campioni di urina artificiale a spillo per 5, 50 e 100 ng/mL concentrazioni come descritto al punto 5.3.1. Preparare sei campioni paralleli per ogni soluzione di analita. Preparazione di campioni sperimentali freschi ogni giorno.
    2. Diluire stock DHBA a 100 ng/mL come descritto al punto 5.1.2.
    3. Valutare la precisione intra-giorno (n = 6). Elaborare ogni soluzione del campione in 5.4.1 secondo passaggio 3 e iniettare il 20 µ l di ogni eluente corrispondente nel sistema HPLC-ECD per ottenere il cromatogramma. Fare la stessa operazione sei volte nello stesso giorno.
    4. Calcolare la quantità di composti di destinazione nei campioni dall'equazione della curva standard. Sotto la stessa concentrazione dello stesso composto, la deviazione standard relativa (RSD) dei sei saggi in un giorno è determinata come precisione intra-day. I valori medi sono riportati nella tabella 1.
    5. Valutare la precisione inter-giorno (n = 6). Allo stesso tempo ogni giorno nei sei giorni sequenziali, preparare i campioni di urina artificiale a spillo per tre concentrazioni di 5, 50, 100 ng/mL, come in 5.4.1 e 5.4.2. ed elaborare ogni soluzione di campione di analita secondo passaggio 3.
    6. Iniettare il 20 µ l di ciascun eluato corrispondente da 5.4.5 nel sistema HPLC-ECD per ottenere risultati di cromatogramma ogni giorno. Calcolare la quantità di composti di destinazione nei campioni dall'equazione della curva standard. Precisione Inter-giorno è espressa dalla RSD della quantità dai campioni di urina artificiale a spillo alle tre concentrazioni saggi in sei giorni sequenziali. I valori medi sono riportati nella tabella 1.

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Representative Results

Questo protocollo è un metodo semplice e conveniente di PFSPE per pretrattare i campioni di urina e arricchire le cinque catecolamine per il rilevamento tramite un sistema di HPLC-ECD; un diagramma del processo è illustrato nella Figura 1. Il protocollo comprende principalmente quattro passaggi-attivazione, caricamento, risciacquo e medicati - accoppiato con una piccola quantità di nanofibre PCE-PS e un dispositivo semplice estrazione in fase solida. La morfologia di nanofibre PCE-PS è stata valutata utilizzando un analizzatore di superficie e porosità (Vedi Tabella materiali). La scommessa, la proprietà tessiturale (Brunauer, Emmett e Teller) di superficie, volume dei pori e la dimensione dei pori-erano 2,8297 m2 g-1, cm 0,0093 g-1e 12,76 nm, rispettivamente. Questi dati indicano che il materiale utilizzato nel protocollo ha su scala nanometrica pori sulla superficie, che può contribuire per l'efficienza di adsorbimento ad alta e il pH abbassato associazione nel protocollo.

Questo protocollo utilizza ingredienti di campione, percolato, eluente, volumi ottimizzati, ecc., così come di lavoro pH e tempo consumato durante le procedure. In Chen et al., l'eluente è una soluzione di acido acetico di 12,0 M perché condizioni acide causano l'adsorbente diventare protonata e caricato positivamente, che è favorevole per l'eluizione di CAs34,35. In questo studio, la ricetta di eluente è stata ricondizionata per essere 30% acido fosforico, 15% acetonitrile, e 55% di acqua distillata. Il valore di pH finale di eluente è stato regolato a 3.0. Il solvente eluente dovrebbe essere tenuto in un ambiente acido quando medicati, ma molto più moderato rispetto all'acido acetico 12,0 M, che può portare a aspetto povero picco e danni al sistema HPLC.

Per l'identificazione delle catecolamine, tempi di ritenzione del cromatogramma delle cime nei campioni con picchi di soluzione standard vengono confrontati. Nella figura 2 vengono illustrati esempi di cromatogrammi HPLC-ECD da varie soluzioni. Se il protocollo è stato seguito correttamente, i profili cromatografici di tre catecolamine e loro metaboliti devono essere ottenuti da HPLC-ECD con picchi chiaro simmetrici, ben definiti e con rumore di fondo minimo, come illustrato nella figura 2 . Per il confronto con il metodo convenzionale, una cartuccia commerciale di PBA è stata selezionata come un controllo. Nella Figura 2(un–c), cinque cime destinazione (b) sono significativamente superiori a thaosein (c), che indica che il metodo PFSPE è più sensibile rispetto al metodo di cartuccia PBA. Inoltre, il picco DOPAC non ha mostrato nel risultato di estrazione della cartuccia PBA, che indica che la colonna PBA non era in grado di estrarre DOPAC. Figura 2 (d) raffigura il cromatogramma del campione di urina in bianco senza alcun pretrattamento e spettacoli di Figura 2(e) i cromatogrammi del campione di urina estratte utilizzando nanofibre composite PCE-PS. Figura 2 (f) Mostra i cromatogrammi del campione di urina dopo l'estrazione con la colonna PBA, che non mostra anche estrazione DOPAC coerente con il risultato in Figura 2(c). Il diagramma indica che il metodo PFSPE non poteva solo estrarre i bersagli con buon effetto, ma anche potrebbe sbarazzarsi della maggior parte dell'interferenza nelle urine, fornendo buona picco identificazione per i composti di destinazione.

L'analisi statistica ha rivelato che le misurazioni per le tre catecolamine e due metaboliti erano attendibilmente riprodotto (tabella 1). Tutte le destinazione composti hanno mostrato buona linearità tra 1,5 e 100 ng/mL (R2> 0,99), e la curva standard di ciascun analita può essere trovata in complementari nella figura 1. Le curve ed i valori di R2 dimostrano che gli analiti hanno buona linearità e relatività entro un certo intervallo lineare, adatto per il calcolo delle concentrazioni degli analiti nei campioni di urina. I limiti di rilevabilità (LOD) variavano da 0,25 a 0,54 ng/mL, e i limiti di quantificazione (LOQ) erano 0,83 a 1,81 ng/mL, rispettivamente. Il valore di segnale-rumore (S/N) è pari a 3. La gamma delle riprese metodologiche dei composti cinque bersaglio era 97,4% (MHPG)-124,2% (DOPAC), che era soddisfacente per l'applicazione ai campioni reali. La precisione intra-giorno era da 2,7 a 4,8% (espresso come deviazione standard relativa) e la precisione inter-day era 2-8,1%, visualizzazione di buona precisione e ripetibilità.

Per la rilevazione di bersagli in campioni di urina reale, 28 neonati ad alto rischio e 22 neonati sani nella divisione di puericultura, ospedale municipale di Suzhou, sono stati reclutati. Tutte le 50 infanti presi in studio erano ragazzi. Quando sono stati sei mesi di età, sono stati presi ad un controllo sistematico di salute in settembre 2016. Tutti i campioni di urina sono stati raccolti e pretrattati seguendo i passi di protocollo 3.1 e 3.2, e i campioni sono stati analizzati usando il resto del passaggio 3. Le concentrazioni sono state calcolate contro le curve di taratura. Le differenze statistiche sono state analizzate tramite analisi della varianza (ANOVA). I risultati possono essere visti nella tabella 2. La differenza della catecolamine e metaboliti fra i due gruppi sono stati confrontati e analizzati. Il p-valori mostrano che le catecolamine non erano significativamente differenti tra i gruppi sani e un ad alto rischio, mentre il contenuto MHPG metabolita era diverso tra questi gruppi (p = 0,001). Il gruppo di neonati ad alto rischio ha avuto una maggiore quantità di MHPG rispetto al gruppo di controllo (14,8 ± 3.6 ng/mL vs 1,4 ± 0,2 ng/mL), che significa che il livello di MHPG urinario può essere un indicatore potenziale per l'identificazione precoce dei neonati ad alto rischio.

Figura 3 e tabella 3 descrivere il metodo di quantificazione classico di determinazione materiali della monoammina e confrontare con altri metodi per i quali il processo di funzionamento e le figure di interesse sono date. Rispetto ai metodi classici, PFSPE metodo ha vantaggi come un timespan breve (5-10 min), processo di funzionamento semplificato, meno organico solvente e più ecocompatibilità con soddisfacenti parametri metodologici. L'importo di eluente necessario è basso volume (50 µ l) e la fase di arricchimento di destinazione non richiede nessuna evaporazione, che favorisce notevolmente la sensibilità di rilevamento per i composti di destinazione nelle urine. Questo metodo rispetto ai convenzionali basati su particelle SPE, migliorato l'efficienza, semplificato il processo di preparazione e ridotto il tempo dell'analisi con sensibilità, selettività e affidabilità accettabile.

Figure 1
Figura 1 : Diagramma di flusso schematico della procedura PFSPE nel libro e una rappresentazione del suo dispositivo. (1), Gastight siringa, punta (2), pipetta e nanofibre (3), possibilità di pranzo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Cromatogrammi dei campioni differenti. (un) campione di acqua di Spiked con obiettivi e IS in (100 ng/mL) senza estrazione. campione (b), Spiked acqua estratta dal metodo PFSPE e (c) dalla cartuccia di acido (PBA) phenylboronic commerciale. (d), vero e proprio vuoto urina campione senza estrazione. (e), vera e propria urina campione estratto dal metodo PFSPE. (f), vera e propria urina campione estratto dalla cartuccia commerciale di PBA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Diagramma di flusso analitica dei metodi di determinazione. (a, b) Precedentemente segnalati metodi di estrazione classica. (un) estrazione di allumina, (b) di DPBA complessa e (c) con il metodo proposto in questa carta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Complementare figura 1: curve Standard ed equazioni. Le curve standard per gli cinque analiti sono costruite al fine di utilizzare l'equazione della retta per calcolare la concentrazione di analiti sconosciuti nel campione. (un) NE, E (b), (c) DA, MHPG (d) ed (e), DOPAC. Per favore clicca qui per scaricare questa figura.

Complementare figura 2: interazione affinità boronato boronico gruppo acido e cis-diolo o adiacenti due gruppi ossidrilici. (A) schema di interazione fra Acidi boronici e più gruppi -OH per gli esteri ciclici cinque o sei termini di forma. (B) gruppo Cis-diolo o adiacenti due gruppi ossidrilici in cerchi rossi raffigurano i siti principali di reazione per cinque analiti ad acido boronico composto. Per favore clicca qui per scaricare questa figura.

NE MHPG E È DOPAC DA
Range di linearità (ng/mL) 1.5-400 1.5-200 1.5-100 1.5-100 1.5-400
R-squared valori 0.9945 0.995 0.9976 0.9902 0.9954
LOD (ng/mL) 0.323 0,322 0,313 0,657 0,249 0,543
LOQ (ng/mL) 1.076 1.072 1.043 2.191 0,83 1.809
Recupero ± RSD (%)(n=9) 110.7±2.9 97.4±9.1 103.9±5.2 86.5±7.3 124.2±3.1 117.3±5.4
Precisione (% RSD) (n = 9)
Intra-day 4.5 4 2.7 4.8 3.3 4.7
Inter-day 4.1 8.1 2 6.3 3.2 5.9
NE, noradrenalina; MHPG, 3-metossi-4-hydroxyphenylglycol; E, epinefrina; IS, standard interno; DOPAC, 3, 4-Dihydroxyphenylacetic acido; DA, dopamina;

Tabella 1: Risultati analitici del protocollo proposto per la determinazione delle tre catecolamine e due metaboliti con soluzioni standard.

Concentrazione (ng mL-1) Gruppo di controllo (22) Gruppo ad alto rischio infante (28) Valore di P
NE 7.52±1.34 5.56±1.7 0,37
MHPG 1.4±0.2 14.8±3.6 0,001
E 24±15.8 20.9±5.87 0.841
DOPAC 106.36±30.1 72.12±18.07 0,312
DA 55.53±11.9 48.12±20.9 0,76
P < 0.05 * * * Mostra una differenza significativa tra i due gruppi

Tabella 2: confronto delle concentrazioni per tre catecolamine e due metaboliti nelle urine tra neonati sani e neonati ad alto rischio. I risultati sono stati analizzati statisticamente mediante analisi della varianza (ANOVA) con un livello di significatività di p = 0,05 per le differenze tra il contenuto MHPG. Mezzi ± deviazioni standard sono indicate.

Campione Solvente esausto (mL) Volume di campione (mL) Tempo di pretrattamento (min) Range di linearità LOD Recupero di relativa (%) Evaporare e
ridisciogliere		 Metodo analitico
solvente volume tempo (min) recupero (%) solvente e
(mL) (mL) ricostitutivo
residuo
Urina 0,5 0.05 10 2.0 – 200 ng/mL (NE, E, DA) 0.2-0.5 ng/mL (NE, E, DA) 88,5-94,5 (NE, E, DA) No HPLC-ECD (Chen et al., 2016)
Urina 19 0,7 — 47 – 167 µ g/L (DA) 166-500 nM (DA) 98.3-101.1 (DA) No HPLC-UV (Piotr et al., 2016)
Urina 1.3 0,01 — 0,5 – 1250 ng/mL (NE, E, DA, NMN, MN) 0.5-2.5 ng/mL (NE, E, DA, NMN, MN) 74,1 – 97,3 (NE, E, DA, NMN, MN) No LC-MS/MS (Li et al., 2016)
Dell'urina e del plasma 20 0.05 10 0,04-2.5 ng/mL (NE, E, DA) 0,01-0,02 ng/mL (NE, E, DA) 87,0-97,5 (NE, E, DA) No HPLC-UV (Mohammad et al., 2016)
Urina < 0,5 0.1 5 1.5-400 ng/mL (NE, MHPG, E, DOPAC, DA) 0,249-0,543 ng/mL (NE, MHPG, E, DOPAC, DA) 97,4-124.2 (NE, MHPG, E, DOPAC, DA) No quest'opera
—, Non definito.
PBA, acido Phenylboronic

Tabella 3: Confronto di questo lavoro con studi il pretrattamento di monoamine o altri argomenti correlati negli ultimi anni.

Complementare tabella 1: parametri per l'individuazione e la quantificazione degli analiti nel libro di HPLC-ECD di instrumentare. Per favore clicca qui per scaricare questa tabella.

Complementare tabella 2: preparazione della curva standard per cinque analiti. Per favore clicca qui per scaricare questa tabella.

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Discussion

Il metodo PFSPE proposto nel presente documento può essere significativi e significativi per quanto riguarda la sua rapidità, semplicità e convenienza. Gli adsorbenti utilizzati nel protocollo sono le nanofibre elettrofilate, che hanno elevati rapporti superfici di zona-volume e assorbono gli analiti con alta efficienza. La procedura solo ha bisogno di pochi milligrammi di nanofibra e un piccolo volume di solvente eluente e non richiedono un passaggio di evaporazione per concentrare gli analiti. Qui, abbiamo presentato una panoramica dettagliata di un protocollo di HPLC-ECD basata che permetterà nuovi agli utenti di stabilire un efficace metodo per il rilevamento e la quantificazione delle tre catecolamine e due dei loro metaboliti (NE, E, DA e MHPG, DOPAC).

La superiorità di questo protocollo deriva principalmente dai quattro passaggi critici durante le procedure, come illustrato nella Figura 1: usando le nanofibre PCE-PS per catturare i composti target per ridurre le dimensioni del sorbente di pochi milligrammi, portando a un rapido assorbimento / desorbimento e che necessitano solo di un piccolo volume di eluizione fluido (1); Aggiunta di DPBA nell'urina al complesso con gli analiti per migliorare la loro idrofobicità (2); le nanofibre di risciacquo con la soluzione contenente DPBA per trattenere gli analiti e rimuovere le impurità (3); e ottimizzazione della condizione estrazione ed analisi per ottenere buona sensibilità e selettività per gli analiti (4).

Per il passaggio (1), il meccanismo di prestazioni superiori di capacità adsorbente per PCE-PS ascrivibile ad una varietà di fattori. I polimeri di etere corona drogati nelle nanofibre possono formare un complesso di ospite con le molecole ospite contenenti gruppi amminici di legami H, ad esempio le catecolamine in questa carta. Inoltre, Hongyou Hu et al e Jishun Chen et al. anche proposto che l'acido boronico possibile legame con gli atomi di azoto nella struttura chimica attraverso interazioni B-N, e che lo scheletro idrofobico possa interagire con anelli di benzene e di altri gruppi alifatici di analiti36,37. Inoltre, durante il processo di desorbimento, i legami dell'idrogeno e le interazioni B-N si rompono facilmente a pH molto bassi; così, eluenti con pH acido sono solitamente adatti per l'esplorazione per desorbimento. Inoltre, ci sono anche numerose interazioni secondarie, tra cui idrofobo, ionico e idrogeno di legame, che può verificarsi tra Boronici prodotti chimici e composti correlati36,37,38. Tutte queste interazioni possono contribuire per l'adsorbimento degli analiti per i materiali.

Per il passaggio (2), con l'aiuto di DPBA aggiunto, le nanofibre PCE-PS adsorbono complessi DPBA-catecolammina rapidamente. Zhen Liu et al hanno dimostrato che i materiali di affinità boronato sono emersi come importanti mezzi di comunicazione per la separazione selettiva e riconoscimento molecolare di composti organici, come nucleosidi, saccaridi, glicani, glicoproteine e così via38. La complessazione si verifica principalmente dall'interazione boronato affinità tra Acido boronico e gruppi di cis-diolo o due gruppi di idrossile adiacenti, per gli esteri ciclici membered di forma cinque o sei, come mostrato complementare figura 2A. Complementare figura 2B raffigura i siti principali di reazione per cinque analiti in questo lavoro il composto acido boronico. Quando i dintorni diventano acidi, il complesso di diolo-cis-acido boronico si dissocia. L'interazione tra Acido boronico e il gruppo cis-diolo o i due gruppi di idrossile adiacente esiste estesamente e relativamente fortemente.

Per il passaggio (3), il complesso formato tra analiti e DPBA può tenerli su adsorbente mentre altre impurità vengono sciacquati dalla superficie PCE-PS, ottenendo la migliore prenotazione per gli obiettivi. Per il passaggio (4), c'è stato un rapporto che mostra che il pH ottimale era circa 9.0 per l'incollaggio di acido borico e catecolo composto39. Tuttavia, Chen et al. esplorato il miglior valore di pH per il complessante di catecolammina-DPBA e abbiamo trovato che le prestazioni di adsorbimento delle nanofibre di PS-PCE composite per il CAs era ottimale quando è stato modificato il valore del pH tra 6.0 e 7.034,35. Liu et al. implicato che la struttura dei materiali di supporto per boronato composti acidi, specialmente con confinamento spaziale delle cavità e pori su scala nanometrica e i ligandi di B-N formati durante la reazione, può ridurre anche significativamente i associazione di pH e migliorare associazione affinità38. Il PCE-PS struttura così come la struttura della catecolammina è tutte dotata di: - NH-gruppi. Quindi, le proprietà e i pori su scala nanometrica di PCE-PS (dati come mostrato nei Risultati di rappresentante), così come ligandi B-N formate, possono contribuire al pH abbassato associazione nel protocollo. Così, il valore di pH ottimale in questo protocollo può essere neutro, che semplifica le procedure ed evita la degradazione degli analiti.

I limiti di determinazione catcholamine sono che le loro concentrazioni in campioni biologici sono molto bassi e che le loro strutture sono instabili (facilmente ossidato); Inoltre, è difficile sbarazzarsi delle impurità nei media. Così, per l'analisi della catecolamina in campioni biologici, pretrattamento, solitamente di estrazione in fase solida, è necessario. Il metodo PFSPE proposto nel presente libro fornito una pre-concentrazione semplice e conveniente per gli analiti in campioni di urina. Ma, quando si fa l'esperimento, la condizione di esperimento deve essere strettamente controllata, in modo ad esempio evitando l'esposizione alla luce e accorciamento tempo quanto possibile il pre-trattamento.

L'applicabilità del metodo è stata valutata tramite il relativo uso per determinare le concentrazioni di tre catecolamine e due metaboliti nell'urina di neonati sani e neonati ad alto rischio. C'era una differenza significativa tra i due gruppi in MHPG urinario. Come sintetizzato in precedenza, la quantità MHPG nel corpo umano ora è principalmente riferita come un indice per riflettere il tono di un neurone noradrenergico, l'attività del metabolismo delle catecolamine nella centrale e sistema nervoso periferico40,41, 42, ed è un indicatore utile del plasma/urina per metabolismo centrale NE43. Per i neonati ad alto rischio, una varietà di fattori, quali l'encefalopatia hypoxic-ischemica (HIE) induce il cervello insulti trauma e cervello, portando a diversi gradi di deficit neurodevelopmental di infanzia. Questo danno di cervello a sua volta porterà alla liberazione di neurotrasmettitori (MHPG incluso) in fluidi fisiologici44,45. Secondo quanto riferito da J.W. Maas, non ci sono correlazioni significative tra il cervello, CSF, plasma e concentrazioni urinarie di MHPG46,47. La misurazione di MHPG totale (libero + coniugato) nelle urine lungo è stata utilizzata per valutare il metabolismo di centrale NE e metabolismo periferico NE in esseri umani41,48,49. Così, si può concludere che i neonati ad alto rischio hanno danni di un neurone noradrenergico tono rispetto a quelle sane, che interessano il metabolismo delle catecolamine nel centrale e sistema nervoso periferico. Questa discrepanza indica che dovrebbe essere fatto ulteriori ricerche sul rapporto tra il deficit di livello e neurodevelopmental MHPG urinario. È stato dimostrato che il metodo proposto potrebbe essere utilizzato per la determinazione della presenza di catecolamine nelle urine, con una prospettiva promettente per l'uso in clinica per la valutazione di malattie rilevanti per questi neurotrasmettitori.

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Disclosures

Gli autori certificano che non esiste alcun conflitto di interessi con qualsiasi organizzazione finanziaria per quanto riguarda il materiale descritto in questo articolo.

Acknowledgments

Questo studio è stato sostenuto dal National Foundation Science of China (No.81172720, n. 81673230), sociale sviluppo ricerca programma di Jiangsu Province scienza e dipartimento di tecnologia (No. BE2016741), scienza & tecnologia progetto di Cina Amministrazione generale della supervisione della qualità, ispezione e quarantena (2015QK055), il programma di progetto aperto del laboratorio chiave di sviluppo del bambino e l'apprendimento della scienza del Ministero dell'istruzione, Southeast University (CDLS-2016-04). Riconosciamo sinceramente Song Yuan e Ping Liu, che ci ha aiutato nella raccolta di campioni.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 µL pipette tip column to contain nanofibers
PCE-PS nanofibers material for PFSPE extraction
steel rod (about 0.5 mm diameter) fill the nanofibres into the column
gastight plastic syringe (5 ml) compress solution into the end of the tip
methanol Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 67-56-1
diphenylborinic acid 2-aminoethyl ester(DPBA) Sigma-Aldrich.Inc A-106408 complex reagent
norepinephrine(NE) Sigma-Aldrich.Inc A-9512 analyte
3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol(MHPG) Sigma-Aldrich.Inc H1377 analyte
epinephrine(E) Sigma-Aldrich.Inc 100154-200503 analyte
3, 4-Dihydroxyphenylacetic acid(DOPAC) Sigma-Aldrich.Inc D-9128 analyte
dopamine(DA) Sigma-Aldrich.Inc H-8502 analyte
3, 4-dihydroxybenzylamine hydrobromide(DHBA) Sigma-Aldrich.Inc 858781 interior label
acetonitrile Sigma-Aldrich.Inc 75-05-8 eluriant and mobile phase
phosphoric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7664-38-2 eluriant
uric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 69-93-2 artifical urine
creatinine Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 60-27-5 artifical urine
trisodium citrate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 6132-04-3 artifical urine
KCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7447-40-7 artifical urine
NH4Cl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 12125-02-9 artifical urine
NaHCO3 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd SWC0140326 artifical urine
C2Na2O4 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 62-76-0 artifical urine
NaSO4 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7757-82-6 artifical urine
disodium hydrogen phosphate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10039-32-4 artifical urine
urea Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 57-13-6 artifical urine
NaCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7647-14-5 artifical urine
MgSO4.7H2O Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10034-99-8 artifical urine
CaCl2 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10035-04-8 artifical urine
HCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7647-01-0 artifical urine
citric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 77-92-9 artifical urine and mobile phase
EDTA disodium salt Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 34124-14-6 mobile phase
monometallic sodium orthophosphate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7558-80-7 artifical urine and mobile phase
1-heptanesulfonic acid sodium salt Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 22767-50-6 mobile phase
sodium hydroxide Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 1310-73-2 mobile phase
phenylboronic acid column(PBA column) Aglilent 12102018 PBA extraction
Inertsil® ODS-3 5 µm 4.6×150 mm column Dikma 5020-06731 HPLC column for seperation
SHIMADZU SIL-20AC prominence AUTO SAMPLER Shimadzu Corporation, Japan SIL-20AC auto injection for eluriant
SHIMADZU LC-20AD High Performance Liquid Chromatography Shimadzu Corporation, Japan LC-20AD HPLC pump
SHIMADZU L-ECD-60A electrochemical detector Shimadzu Corporation, Japan L-ECD-60A detector for the analytes
ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry System Micromeritics, USA surface and porosity analyzer 

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Chimica problema 133 catecolamine corona polimerico nanofibre elettrofilate estrazione in fase solida fibra pranzo (PFSPE) cromatografia liquida ad alta pressione con rilevazione elettrochimica (HPLC-ECD) i neonati ad alto rischio
Un metodo pratico per estrazione ed analisi con cromatografia liquida dei neurotrasmettitori della catecolamina e loro metaboliti
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Xie, L., Chen, L., Gu, P., Wei, L.,… More

Xie, L., Chen, L., Gu, P., Wei, L., Kang, X. A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites. J. Vis. Exp. (133), e56445, doi:10.3791/56445 (2018).

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