Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

En praktisk metode for utvinning og analyse med høyt trykk væske kromatografi katekolaminer nevrotransmittere og deres metabolitter

Published: March 1, 2018 doi: 10.3791/56445
Automatic Translation
1, 3, 4, 1, 2
1School of Public Health of Southeast University, Laboratory of Environment and Biosafety Research Institute of Southeast University in Suzhou, 2Key Laboratory of Child Development and Learning Science (Ministry of Education), School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University, 3School of Public Health, Tianjin Medical University, 4British Columbia Academy, Nanjing Foreign Language School

Summary

Vi presenterer en praktisk solid-fase utvinning koblet til høytrykks flytende kromatografi (HPLC) med elektrokjemiske deteksjon (ECD) samtidige fastsettelse av tre monoamin nevrotransmittere, og to av deres metabolitter i spedbarn urin. Vi har også identifisere metabolitten MHPG som en potensiell biomarkør for tidlig diagnostikk av hjerneskade for spedbarn.

Abstract

Utvinning og analyse av katekolaminer nevrotransmittere i biologiske væsker er av stor betydning i vurderingen nervesystemet funksjon og sykdommer, men deres presise målingen er fortsatt en utfordring. Mange protokoller har blitt beskrevet for nevrotransmitter måling av en rekke instrumenter, inkludert høytrykks flytende kromatografi (HPLC). Men det er mangler, for eksempel komplisert operasjon eller vanskelige å oppdage flere mål, som ikke kan unngås, og for tiden dominerende analyse teknikken er fortsatt HPLC kombinert med sensitive elektrokjemiske eller fluorimetric deteksjon, grunn dens høy følsomhet og god selektivitet. Her er en detaljert protokoll beskrevet for forbehandling og påvisning av katekolaminer med høyt trykk væske kromatografi med elektrokjemiske deteksjon (såkalt HPLC-ECD) i ekte urinprøver av spedbarn, benytter electrospun sammensatte nanofibers sammensatt polymere crown Ether med polystyren som adsorbent, også kjent som metoden pakket-fiber solid fase utvinning (PFSPE). Vi viser hvordan urin prøver kan lett precleaned av en nanofiber-pakket solid fase-kolonne, og hvordan kan analytter i utvalget være raskt beriket, desorbed og oppdaget på et ECD system. PFSPE forenkler forbehandling prosedyrer for biologiske prøver, slik at redusert tid og bekostning reduksjon av tapet av mål.

Alt illustrerer dette arbeidet en enkel og praktisk protokoll for solid-fase utvinning koblet til en såkalt HPLC-ECD system for samtidige fastsettelse av tre monoamin nevrotransmittere (noradrenalin (NE), adrenalin (E), dopamin (DA)) og to av deres metabolitter (3-metoksy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) og 3,4-dihydroxy-phenylacetic syre (DOPAC)) i spedbarn urin. Etablerte protokollen ble brukt for å vurdere forskjellene i urin katekolaminer og deres metabolitter mellom høy risiko spedbarn med perinatal hjerneskade og sunn kontroller. Komparativ analyse avslørte en betydelig forskjell i urin MHPG mellom de to gruppene, indikerer at katekolaminer metabolitter kan være en viktig kandidat markør for tidlig diagnostisering av tilfeller utsatt for hjerneskade hos spedbarn.

Introduction

Katekolaminer nevrotransmittere og metabolitten innholdet i kroppsvæsker kan påvirke nevrale funksjon og påvirker balansen av svar til stimulans til en stor grad1. Abnormities kan føre til en rekke sykdommer, for eksempel pheochromacytoma, ganglioneuroma, neuroblastom og nevrologiske lidelser1,2. Utvinning og fastsettelse av katekolaminer i kroppsvæsker er meningsfulle for diagnostisering av relevante sykdommer. Men katekolaminer i biologiske prøver finnes i lave konsentrasjoner, og er lett oksidert. Videre, de er svært vanskelig å elute på grunn av den store mengden av interferens i middels3. Dermed er samtidige påvisning av katekolaminer i biologiske væsker fortsatt en utfordring.

Det har vært vurderinger viser at urin katekolaminer kan være et mål av stress, og at nivåene er viktig biologiske markører svarer taktil stimulering behandling i nyfødte5. Ifølge forskning, alle barn som har lidd av tidlig hendelser er utsatt for hjernen skade4,5,6, og skade kan føre til unormal utgivelsen av katekolaminer og relaterte saker i væsker. Det finnes avanserte magnetisk resonans teknikker som kan oppdage hjerneskade i tidligere faser7,8. Men innen de første 48 timer, vil en unormal neurodevelopmental prosessen føre til permanent hjerneskade som ikke er tydelig i medisinske bilder11. Dessuten, høy kostnad og knappe ressurser, sammen med andre faktorer, gjør det umulig for alle neonatal enheter skal ha tilgang til disse spesialiserte neuro-imaging teknikker. Men bruk av en lett tilgjengelig og praktisk biomarkør (som katekolaminer og deres metabolitter) kunne overvinne disse svakhetene, og screening av en biomarkør i menneskelig væsker kan hjelpe i tidlig diagnostikk av hjerneskade og føre til be Identifikasjon av nyfødte spedbarn trenger neuroprotection9. Katekolaminer i urinen kan en enkelt og opplagt indeks, på grunn av den direkte korrelasjonen mellom mengden av dem ut i væsker og neuroactivity funksjon.

Blant biologiske væsker, cerebrospinalvæske (CSF) og plasmaprøver er ikke lett å få via eksisterende traumatisk prosedyrer, og det er også svært vanskelig å bli kvitt interferensen selvklebende protein og andre urenheter, fører til en plagsom og tidkrevende utvalg prosess som er uegnet for gjentatte gjenkjenning. Også for barn er det nesten umulig å få eksemplene på en traumatisk måte. Derfor urin prøvetaking er bedre enn den andre former for prøvetaking, som det er ikke-invasiv, enkel å betjene, og kan gjøres gjentatte ganger. Urinprøver er rikelig og lett å lagre og vise store fordeler over andre former for biologiske prøver.

De viktigste metodene for å kvantifisere katekolaminer i biologiske væsker inkluderer radioenzymic analyser10, enzym knyttet immun-absorberende analyser11, voltammetry12 og termisk linsen massespektrometri13. Men mangler finnes, som omveier og vanskelig å oppdage flere mål. I dag er dominerende analyse teknikken høy ytelse flytende kromatografi (HPLC)14, kombinert med følsom elektrokjemiske15 eller fluorimetric gjenkjenning16, på grunn av dens høy følsomhet og god selektivitet. Med tandem massespektrometri teknologien, som flytende kromatografi/massespektrometri (LC/MS) og massespektrometri/massespektrometri med flytende Ture/mass (LC/MS/MS), analyse og kvantifisering av signalstoffer kan oppnå høy nøyaktighet og spesifisitet17,18. Men krever MS teknikken dyre instrumentering samt betydelig kvalifiserte arbeidskraft, gjør metoden vanskelig å gjelde universelt i de fleste konvensjonelle laboratorier. HPLC-ECD systemer er ofte utstyrt i mest konvensjonelle og kliniske laboratorier og har dermed blitt et vanlig valg for forskning holdene å bruke kjemiske besluttsomhet, men de krever prøven introdusert i systemet å være ren og av Mikroskala volum19. Dermed er det av stor betydning å rense og kondensere prøven før analysen. Den klassiske metoden for renselse trinn er væske-flytende utvinning14,15,20 og off-line solid-fase utvinning, inkludert aktivert alumina kolonnen21,22 og diphenylborate (DPBA), complexation,23,,24,,25,,26.

Myeongho Lee et al. ha blitt benytter polymer harpiks kjemisk endret med kronen Eter som adsorbent selektivt trekke ut katekolaminer fra menneskelige urin siden 200727. Også i 2006 Haibo han et al. demonstrert en lettvinte syntese tilnærming for boronate affinitet utvinning absorberende byutilizing functionalizable nanomagnetic polyhedral oligomeric silsesquioxane (EV) basert nanomagnetic sammensatt, og bruke det på anriking av katekolaminer i menneskelige urin (noradrenalin, adrenalin og isoprenaline)28. De tok fordel av nanomaterialer å oppfylle arbeidet, bruker en teknologi kalt nano-electrospinning og dannet polymer fibrøst materiale i nanoskala. Electrospinning prosessen kan justere diameter, morfologi og romlig justering av produktet ved å kontrollere arbeider spenningen og endre innholdet i spinning løsningen sammen med andre parametere29. Sammenlignet med konvensjonelle SPE kassetten, electrospun nanofibers er svært egnet til å trekke ut og berike målet analytter fra en kompleks matrise, som er utstyrt med høy overflate-område-til-volum forhold til adsorberes i analytter med høy effektivitet, og vise flere lett-kontrollerte overflaten kjemiske egenskaper, slik at praktiske vedlegg av målet forbindelser. Disse egenskaper gjør dem gode valg for SPE adsorbents, noe som reduserer solid fase og desorpsjon løsemiddel beløpet30,31,32,33. Katekolaminer i urinprøver, var electrospun nanofibers består av apolymeric krone Eter med polystyren (PCE-PS) pleide å selektivt ekstra tre katekolaminer (NE, E og DA)34. Avisen indikerte at selektiv crown Eter adsorbert mål for NE, E og DA, som var basert på riktig geometri for innbinding katekolaminer via danner hydrogenbindinger. Resultatene vises materiale crown Eter effektivt, fjerne andre forstyrrende forbindelser i biologiske prøver. Inspirert av denne rapporten, en roman metoden ble utviklet for selektiv utvinning av katekolaminer ved bruk av electrospun sammensatte nanofibers består av PCE-PS.

I denne utredningen rapportert metoden tidligere34 ble forbedret og ikke bare å analysere E, NE, og DA, men også deres metabolitter, MHPG og DOPAC, i urin. Vi har også utforske nye muligheter for mekanismen av adsorpsjon prosessen. Metoden viser tilfredsstillende utvinning effektivitet og selektivitet for de fem analytter, og metoden ble bekreftet i analyse av urin fra høy risiko spedbarn med perinatal hjerneskade og sunn kontroller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Informert samtykke fra foreldre ble innhentet, og institusjonelle gjennomgang styret godkjenning ble innhentet for studier. Studien ble utført i henhold til koden for etikk i World Medical Association (Helsinkideklarasjonen) for eksperimenter som involverte mennesker. Omsorgspersoner av alle deltakerne gitt skriftlig samtykke for å være inkludert i studien. Etisk komité godkjenning fra Zhongda sykehus, affiliate med Sørøst University, var også innhentet.

1. forberedelse kolonner og løsninger som kreves for utvinning og fastsettelse av katekolaminer

  1. Forberede kolonnen PFSPE. Del 1-2 mg PCE-PS nanofibers i 5-6 dele, og bruk en fin stål stang med 0,5 mm diameter komprimere dem ryddig i slutten av en pipette tips med et volum på 200 µL.
  2. Forberede kunstig urin ved veiing 2.427 g urea, urinsyre 0.034 g, 0.09 g kreatinin, 0.297 g trisodium citrate, 0.634 g natriumklorid, 0,45 g kalium klorid, 0.161 g salmiakk, 0.089 g veisalt dihydrate, 0.1 g Magnesiumsulfat heptahydrate, 0.034 g natriumbikarbonat, 0.003 g natrium oxalate, 0.258 g natrium sulfat, 0.1 g natrium dihydrogen fosfat, og 0.011 g disodium hydrogen fosfat og oppløse vaskebuffer ovenfor kjemikalier i 200 mL vann.
  3. Forberede 2 mg/mL lagerløsning diphenylborate (DPBA) løsning ved å løse opp 2 mg av sammensatt i 1 mL destillert vann. Lagre løsningen i mørket på 4 ° C.
  4. Analytt standard
    Merk: Den kjemiske strukturen og egenskapene til katekolaminer er ustabil, og de brytes ned lett. Forberedelsesprosessen standarder må være svært rask og må hindre eksponering for direkte sollys.
    1. Veie 1.0 mg av NE, E, DA, MHPG, DOPAC og interne standard 3,4-dihydroxybenzylamine hydrobromide DHBA i separate 1,5 mL microcentrifuge rør. Fortynne den DHBA løsningen i vann til 100 ng/mL før bruk.
    2. Svinge forberedt standarder i mørket med høy hastighet til analytter oppløse helt. Dette er den primære lager; Lagre på-20 ° C i opptil flere uker.
    3. Forberede den sekundære 1000 ng/mL analytt aksjer. NE, E, DA, DOPAC og MHPG, overføre 5 µL av hver primære analytt lager i 4,975 µL destillert vann i et 5 mL sentrifuge rør, og lagre den i mørket på 4 ° C før bruk. Forberede disse løsninger fresh daglig. For DHBA, overføre 5 µL av primære lager i 4,995 µL destillert vann i et 5 mL sentrifuge rør, og lagre den i mørket separat på 4 ° C.
    4. Gjøre ytterligere fortynninger med sekundær analytt lager å lage en standard kurve (f.eks., utfyllende tabell 2). Lagre løsninger i mørket på 4 ° C og forberede fersk hver dag.
    5. Teste optimal spenningen av ECD detektor med standard aksjen med riktig konsentrasjon. Variere spenningen til å finne en verdi der analytter har beste topp utseendet.
  5. Forberede eluant med 30% fosforsyre, 15% acetonitrile, og 55% destillert vann. For 10 mL eluant løsemiddel, bruke 5,5 mL destillert vann og legge til 1,5 mL acetonitrile og 3 mL fosforsyre dråpe for dråpe i vannet.

2. forberedelse av ekte urinprøver og Mobile fase

  1. Har mødre samle den første morgen urinen for sine barn med aseptiske urin kopper. Overføre prøvene i polypropylen rør og etiketten umiddelbart. Oppbevar deretter prøvene i 20 ° C fryser.
  2. Vortex og sentrifuger urin prøvene 1510 x g i 10 min ved romtemperatur (RT) å kvitte seg med de fleste partikler forstyrrelser. Forkaste sedimentet og samle supernatants for ytterligere eksperimenter. For å trekke ut analytter effektivt, går du til PFSPE forbehandling (trinn 3) umiddelbart etter sentrifugering.
  3. Forberede den mobile fasen
    1. Forberede en ren flaske, minst 1 L. Sammensetningen av mobile fase er oppført i supplerende tabell 1; 1 L mobile fase, mål 6.7242 g sitronsyre, 93.06 mg av etylen diamine tetra eddiksyre (EDTA) disodium salt, 7.02 g monometallic natrium orthophosphate, 404.5 mg 1-heptanesulfonic syre natrium salt, og 3.5 g av natrium hydrat i flasken. Legge til 40 mL acetonitrile og destillert vann til 1000 mL. Agitere og vibrere ultrasonically i 15 min til saken i løsningen er alle oppløst.
    2. Bruke en pH-meter med en glass elektrode, justere pH verdien av den mobile fasen til 4,21 med en mettet natriumhydroksid løsning.
    3. Filtrere den mobile fasen med en 0,45 µm polyvinylidene fluor mikroporøs membran og en vakuum sugeinnretning bli kvitt urenheter.
    4. Bruk ultrasoniske vibrasjoner i 15 min å degas mobile fasen før bruk.

3. PFSPE utvinning og såkalt HPLC-analyse

  1. Aktivere nanofibers. Trykk 100 µL av metanol og 100 µL vann sekvensielt gjennom kolonnen PFSPE bruker en 5 mL sprøyte på en langsom, dropwise måte.
  2. Mix 100 µL urin prøve med 100 µL 2 mg/ml DPBA løsning og 30 µL 100 ng/ml DHBA løsning (IS, interne standard) i en 0,5 mL EP-tube, deretter overføre blandet løsningen til kolonnen PFSPE. Trykk blandet prøve løsningen gjennom kolonnen PFSPE med en 5 mL gastight plastsprøyte med kraften av lufttrykket.
  3. Leach kolonnen tre ganger av lessing 100 µL DPBA løsning (2 mg/mL) i kolonnen SPE, og skyv løsningen sakte gjennom kassetten med lufttrykk bruker en 5 mL gastight plastsprøyte.
  4. Laste 50 µL av eluant på kolonnen PFSPE, og skyv den gjennom kolonnen, samle eluate med et 0,5 mL EP-rør.
  5. Slå på HLPC degasser å degas luften i systemet. Før eksempel analyser, bør systemet kjøre mer enn 0,5 h med mobile fase equilibrate og redusere planlagte støy. Se utfyllende tabell 1 viser oppsettparameterne for HPLC systemet.
  6. Prøve 20 µL av eluate ved hjelp av en automatisk sampler, og deretter injisere det i HPLC-ECD systemet.
  7. Når går er fullført, Deaktiver merker cellen ved hjelp av detektoren grensesnittet. IKKE slå av cellen med bryteren på baksiden detektoren, da dette kan skade apparatet.
  8. Manuelt endre mobil fase sammensetningen til 10% metanol og 90% vann. Kjøre minst 30 min. Deretter manuelt endre mobil fasen til HPLC-grade metanol. Kjør i ca 15 min å beskytte systemet i metanol. Unnlatelse av å kjøre dette trinnet etter anbefalte kjøretiden kan resultere i skader kolonnen og detektoren. Slå av strømmen, og slå degasser.

4. Phenylboronic syre kassetter (PBA) utvinning

PBA patron utvinning prosedyrer var lik oppsettet i Kumar et al. (2011) 25. alle løsninger er presset gjennom PBA kassetten (100 mg, 1 mL) med luft tvunget av sprøyte.

  1. Tilstand kassetten med 1 mL 80:20 acetonitrile-vann (v/v) som inneholder 1% maursyre og 1 mL av 50 mM fosfatbuffer (pH 10) sekvensielt.
  2. Trykk den bufrede urinprøve (1 mL urin og 2 mL fosfatbuffer, pH 8.5) gjennom PBA kassetten.
  3. Vask kassetten med 1 mL 50/50 v/v acetonitrile-fosfat buffer (10 mM, pH 8.5).
  4. Elute patronen med 1 mL acetonitrile vann (80:20 v/v) inneholder 1% maursyre.

5. identifikasjon og kvantifisering av katekolaminer

  1. Linearitet
    1. Fortynne den sekundære analytter lager med kunstig urin til seks konsentrasjoner (1,5, 3, 12, 25, 50 og 100 ng/mL); fortynning volumet av kunstige urin følger supplerende tabell 2. Lage tre parallelle prøver med hver konsentrasjon får 18 analytt eksperimentelle løsninger for å konstruere kalibrering kurver.
    2. Fortynn DHBA sekundære lager med kunstig urin 10-fold for å få 100 ng/mL eksperimentelle løsning.
    3. Pretreat alle analytt løsningene fra 5.1.1, etter trinn 3 (PFSPE utvinning prosedyrer). I trinn 3, injisere 20 µL av hver tilsvarende eluate i HPLC-ECD systemet for å få en såkalt HPLC-chromatogram.
    4. Konstruere kalibrering kurver av de fem analytter ved å plotte forholdet peak området (mål/IS) som Y-aksen mot forholdet mellom konsentrasjoner (mål/IS) som X-aksen, som vist i supplerende figur 1.
  2. LOD og LOQ verdi for følsomhet
    1. Injisere 20 µL av Tom kunstig urin i HPLC-ECD systemet (som i trinn 3), for å få HPLC chromatogram av prøven.
    2. I chromatogram fra 5.2.1 Oppgi, samler 11 tom signalet verdier og beregne middelverdien Xb og standardavvik Sb. Beregne minste signalet av et stoff som kan oppdages på et visst nivå av tillit, XL, som XL = Xb+ K * Sb (K er koeffisienten bestemmes av konfidenskoeffisienten, Sb reflekterer støynivået av den måle metoden og maskinen støynivå). Dermed LOD = (XL-Xb) /S = (K * Sb) /S (S står for slope-verdien av arbeider kurven).
    3. Definere en S/N 3:1 (K = 3) som grensen for påvisning (LOD) og en S/N 10:1 (K = 10) som grensen for kvantifisering (LOQ).
  3. Evaluere inngang
    1. Forberede reelle og piggete urinprøver. Fortynne den sekundære analytter lager med ekte urin til tre konsentrasjoner (5, 50, 100 ng/mL) å få de piggete urinprøver. Forberede tre parallelle prøver hver analytt løsning. Telle piggete konsentrasjonen som antall mål forbindelser piggete i urine prøve. Definere denne verdien som ens.
    2. Fortynn DHBA lager til 100 ng/mL, som i trinn 5.1.2.
    3. Behandle hvert eksempel løsning fra 5.3.1 etter trinn 3 (PFSPE utvinning prosedyrer) og injisere den 20 µL av hver tilsvarende eluant i HPLC-ECD systemet å få chromatogram resultatet. Verdien av analytter vil bli regnet som en mengde mål forbindelser kvantifisert i den piggete urinprøve. Definere denne verdien som ent.
    4. Injisere 20 µL av urinprøve i HPLC-ECD (som i trinn 3) systemet for å få chromatogram resultatet. Verdien av analytter vil bli regnet som en første mengde mål forbindelser kvantifisert i urine prøve. Angi denne verdien som enjeg.
    5. Beregne antall mål forbindelser i prøvene fra standardkurve ligningen. Prosent utvinning er beregnet som metodologiske utvinning % = (ent - Ajeg) × 100 / (ens). Mener vises i tabell 1.
  4. Evaluere den upresisjonsverdier
    1. Forberede piggete kunstig urinprøver 5, 50 og 100 ng/mL konsentrasjonen som i trinn 5.3.1. Forberede seks parallelle prøver hver analytt løsning. Forberede frisk eksperimentelle prøver hver dag.
    2. Fortynn DHBA lager til 100 ng/mL som i trinn 5.1.2.
    3. Evaluere intradag presisjon (n = 6). Behandle hver eksempel løsning i 5.4.1 etter trinn 3 og injisere den 20 µL av hver korrespondent eluant i HPLC-ECD systemet å få chromatogram. Gjøre den samme operasjonen seks ganger på samme dag.
    4. Beregne antall mål forbindelser i prøvene fra standardkurve ligningen. Under samme konsentrasjonen av samme sammensatte bestemmes relative standardavviket (RSD) for seks analyser på en dag som intradag presisjon. Mener vises i tabell 1.
    5. Evaluere mellom dag presisjon (n = 6). På samme tid hver dag i seks sammenhengende dager, forberede piggete kunstig urinprøver tre konsentrasjoner av 5, 50, 100 ng/mL, 5.4.1 og 5.4.2., og behandler hver analytt eksempel løsning etter trinn 3.
    6. Injisere den 20 µL av hver tilsvarende eluate fra 5.4.5 i HPLC-ECD systemet å få chromatogram resultater hver dag. Beregne antall mål forbindelser i prøvene fra standardkurve ligningen. Mellom dag presisjon er uttrykt ved RSD antallet analyser fra de piggete kunstig urinprøver på de tre konsentrasjonene i seks sammenhengende dager. Mener vises i tabell 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokollen er en enkel og praktisk PFSPE metode pretreat urinprøver og berike fem katekolaminer for gjenkjenning via en såkalt HPLC-ECD systemet. et diagram av prosessen er vist i figur 1. Protokollen inneholder hovedsakelig fire trinn-aktivering, lasting, rense, og eluting - kombinert med en liten mengde PCE-PS nanofibers og en enkel solid-fase utvinning. Morfologi av PCE-PS nanofibers ble vurdert ved hjelp av en overflate og porøsitet analyzer (se Tabell for materiale). Tekstur egenskaper-INNSATSEN (Brunauer, Emmett og Teller) overflate område, pore volum og porestørrelse-var 2.8297 m2 g-1, 0.009 cm3 g-1og 12.76 nm, henholdsvis. Disse data indikerer at materialet som brukes i protokollen har nanoskala porene på overflaten, som kan bidra til høy adsorpsjon effektiviteten og senket bindende pH i protokollen.

Denne protokollen bruker optimalisert volumer, prøve ingredienser, sigevann, eluant, etc., arbeider pH og tidsforbruket i prosedyrene. I Chen et al., eluant var en 12,0 M eddiksyre løsning fordi Sure forhold føre adsorbent å bli protonerte og ladet positivt, som er gunstig for tilsettes ca34,35. I denne studien, eluant oppskriften ble overhalt for å være 30% fosforsyre, 15% acetonitrile, og 55% destillert vann. Siste pH verdien av eluant ble justert til 3.0. Eluant løsemiddelet skal holdes i en syrlig miljø når eluting, men mye mer moderat enn 12,0 M eddiksyre, som kan føre til dårlig peak utseende og skade HPLC systemet.

For identifikasjon av katekolaminer sammenlignes chromatogram tid av toppene i prøvene med standardløsning topper. Figur 2 viser eksempler på HPLC-ECD chromatograms fra ulike løsninger. Hvis protokollen etterfølges vellykket, skal brukt kromatografiske profiler av tre katekolaminer og deres metabolitter oppnås ved HPLC-ECD klart symmetriske, veldefinert topper og med minimal bakgrunnsstøy, som vist i figur 2 . Til sammenligning med det tradisjonelle metoden ble kommersielle PBA patron valgt som en kontroll. I figur 2(en-c), fem mål toppene i (b) er betydelig høyere enn thaosein (c), som angir at metoden PFSPE er mer følsom enn metoden PBA patron. Også viste DOPAC toppen ikke i PBA patron utvinning resultatet, som indikerer at kolonnen PBA ikke var i stand til å trekke ut DOPAC. Figur 2 (d) viser chromatogram av den tomme urinprøve uten noen forbehandling, og figur 2(e) viser chromatograms av urinprøve utdraget benytter PCE-PS sammensatt nanofibers. Figur 2 (f) viser chromatograms av urinprøve etter ekstraksjon med kolonnen PBA som også viser ingen DOPAC utvinning samsvar med resultatet i figur 2(c). Diagrammet angir at metoden PFSPE ikke kan bare trekke ut mål med god effekt, men også kunne kvitte mesteparten av forstyrrelser i urinen, gir god peak identifikasjon for mål-forbindelser.

Statistisk analyse avslørte at målene for de tre katekolaminer og to metabolitter var pålitelig gjengis (tabell 1). Alle målet forbindelser viste god linearitet mellom 1,5 og 100 ng/mL (R2> 0,99), og standardkurven hver analytt med finnes i utfyllende figur 1. Kurvene og R2 -verdier viser at analytter har god linearitet og relativitetsteori innenfor et bestemt lineær, egnet for beregning av konsentrasjoner av analytter i urinprøver. Grensene for påvisning (LOD) varierte fra 0,25 til 0.54 ng/mL, og grensene for kvantifisering (LOQ) var 0,83 til 1,81 ng/mL, henholdsvis. Signal-å-bråk (S/N) verdien tilsvarte 3. Omfanget av de metodologiske inngang av fem mål forbindelser var fra 97.4% (MHPG) til 124.2% (DOPAC), som var tilfredsstillende for programmet faktisk prøvene. Mellom dag presisjonen var 2-8,1%, god nøyaktighet og repeterbarhet intradag presisjonen var fra 2.7 til 4,8% (uttrykt som relative standardavvik).

Deteksjon av mål i ekte urinprøver, ble 28 høyrisikoatferd spedbarn og 22 sunn spedbarn i delingen av Barnepass, Suzhou kommunale sykehus, rekruttert. Alle 50 spedbarn tatt i studien var gutter. Da de var seks måneder gamle, ble de tatt en rutinemessige Helse Sjekk i September 2016. Alle urin prøvene ble samlet inn og forbehandlet etter protokollen trinnene 3.1 og 3.2, og prøvene ble analysert med resten av trinn 3. Konsentrasjonen ble beregnet mot kalibrering kurvene. Statistisk forskjeller ble analysert av variansanalyse (ANOVA). Resultatene kan sees i tabell 2. Forskjellen på katekolaminer og metabolitter mellom de to gruppene ble sammenlignet og analysert. P-verdier viser at katekolaminer ikke var signifikant forskjellig mellom høy risiko og sunt grupper, mens metabolitten MHPG innholdet var annerledes over disse gruppene (p = 0,001). Gruppen høyrisikoatferd spedbarn hadde høyere mengder MHPG enn i kontrollgruppen (14.8 ± 3.6 ng/mL vs 1,4 ± 0,2 ng/mL), som betyr at nivået av urin MHPG kan være en potensiell markør for tidlig identifisering av høy risiko spedbarn.

Figur 3 og tabell 3 beskriver klassiske kvantifisering metoden for å bestemme monoamin materialer, og sammenligne med andre metoder som operasjonen prosessen og tallene for interessen er gitt. Sammenlignet med klassiske metoder, har PFSPE metode fordeler som et kort tidsrom (5-10 min), forenklet operasjonen prosessen, mindre organisk løsemiddel og mer miljøvennlighet med tilfredsstillende metodologiske parametere. Eluant-beløpet som er nødvendig er lav i volum (50 µL) og det mål berikelse trinnet krever ingen fordamping, som sterkt fremmer oppdagelse følsomheten for målet forbindelser i urinen. Sammenlignet med konvensjonelle partikkel-baserte SPE, denne metoden forbedret effektivitet, forenklet forberedelsesprosessen, og redusert tidspunktet for analysen med akseptabel pålitelighet, selektivitet og følsomhet.

Figure 1
Figur 1 : Skjematisk flytdiagram for PFSPE prosedyre i papiret og en representasjon av sin enhet. (1) Gastight sprøyten, (2) Pipette tips og (3) pakket nanofibers. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Chromatograms av forskjellige prøver. (en) Spiked vann utvalget med mål og er i (100 ng/mL) uten ekstraksjon. (b) Spiked vann eksempel utdraget av PFSPE metoden og (c) av kommersielle phenylboronic syre (PBA) patron. (d) virkelig tom urin eksempel uten ekstraksjon. (e) ekte urin eksempel utdraget av metoden PFSPE. (f) ekte urin eksempel utdraget av kommersielle PBA patron. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Analytisk flytdiagram for fastsettelse metoder. (a, b) Tidligere rapportert klassiske utvinning metoder. (en) utvinning av alumina, (b) av DPBA komplekse, og (c) av metoden foreslått i denne artikkelen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende figur 1: Standard kurver og ligninger. Standard kurvene for de fem analytter er konstruert for å bruke ligningen for linjen til å beregne ukjent analytter konsentrasjonen i utvalget. (en) NE, (b) E, (c) DA, (d) MHPG og (e) DOPAC. Klikk her for å laste ned dette tallet.

Supplerende figur 2: Boronate affinitet samspillet mellom boronic syre og cis-diol gruppe eller tilstøtende to hydroksyl grupper. (A) skjematisk av samspillet mellom boronic syrer og flere -OH grupper til skjemaet fem eller seks medlemmer syklisk estere. (B) Cis-diol gruppe eller tilstøtende to hydroksyl grupper i røde sirkler viser store reaksjon nettstedene for de fem analytter å boronic syre sammensatte. Klikk her for å laste ned dette tallet.

NE MHPG E ER DOPAC DA
Lineær utvalg (ng/mL) 1.5-400 1.5-200 1.5-100 1.5-100 1.5-400
R-kvadrerte verdier 0.9945 0.995 0.9976 0.9902 0.9954
LOD (ng/mL) 0.323 0.322 0.313 0.657 0.249 0.543
LOQ (ng/mL) 1.076 1.072 1.043 2.191 0,83 1.809
Utvinning ± RSD (%)(n=9) 110.7±2.9 97.4±9.1 103.9±5.2 86.5±7.3 124.2±3.1 117.3±5.4
Presisjon (RSD %) (n = 9)
Intradag 4.5 4 2.7 4.8 3.3 4.7
Mellom dag 4.1 8.1 2 6.3 3.2 5.9
NE, noradrenalin; MHPG, 3-metoksy-4-hydroxyphenylglycol; E, adrenalin; ER, interne standard. DOPAC, 3, 4-Dihydroxyphenylacetic syre; DA, dopamin;

Tabell 1: Analytisk resultatene av den foreslåtte protokollen for fastsettelse av tre katekolaminer og to metabolitter med standard løsninger.

Konsentrasjonen (ng mL-1) Kontrollgruppe (22) Høy risiko spedbarn gruppen (28) P-verdi
NE 7.52±1.34 5.56±1.7 0,37
MHPG 1.4±0.2 14.8±3.6 0,001
E 24±15.8 20.9±5.87 0.841
DOPAC 106.36±30.1 72.12±18.07 0.312
DA 55.53±11.9 48.12±20.9 0.76
P < 0,05 *** viser en betydelig forskjell mellom to grupper

Tabell 2: sammenligning av konsentrasjoner for tre katekolaminer og to metabolitter i urinen mellom sunn spedbarn og høy risiko spedbarn. Resultatene var statistisk analysert variansanalyse (ANOVA) med et signifikansnivå på p = 0,05 for forskjeller mellom MHPG innhold. Betyr ± standardavvik vises.

Eksempel Utmattet løsemiddel (mL) Eksempel volum (mL) Forbehandling tid (min) Lineær utvalg LOD Relativ Recovery (%) Fordampe og
redissolve		 Analysemetode
løsemiddel volum tid (min) Systemgjenoppretting (%) løsemiddel og
(mL) (mL) gjenoppbygge
rester
Urin 0,5 0,05 10 2.0-200 ng/mL (NE, E, DA) 0,2-0,5 ng/mL (NE, E, DA) 88.5-94,5 (NE, E, DA) nei HPLC-ECD (Chen et al., 2016)
Urin 19 0,7 - 47-167 µg/L (DA) 166-500 nM (DA) 98,3-101.1 (DA) nei HPLC-UV (Piotr et al., 2016)
Urin 1.3 0,01 - 0,5-1250 ng/mL (NE, E, DA, NMN, MN) 0,5-2.5 ng/mL (NE, E, DA, NMN, MN) 74,1-97.3 (NE, E, DA, NMN, MN) nei LC-MS/MS (Li et al., 2016)
Urin og plasma 20 0,05 10 0,04-2.5 ng/mL (NE, E, DA) 0,01-0,02 ng/mL (NE, E, DA) 87.0-97,5 (NE, E, DA) nei HPLC-UV (Mohammad et al., 2016)
Urin < 0,5 0,1 5 1.5-400 ng/mL (NE, MHPG, E, DOPAC, DA) 0.249-0.543 ng/mL (NE, MHPG, E, DOPAC, DA) 97.4-124.2 (NE, MHPG, E, DOPAC, DA) nei Dette arbeidet
-, Udefinert.
PBA, Phenylboronic syre

Tabell 3: Sammenligning av dette arbeidet med studier på forbehandling av monoamines eller andre beslektede emner de siste årene.

Supplerende tabell 1: Instrument for deteksjon og kvantifisering av analytter i papir av HPLC-ECD. Klikk her for å laste ned denne tabell.

Supplerende tabell 2: utarbeidelse av standardkurven for fem analytter. Klikk her for å laste ned denne tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den foreslåtte PFSPE metoden i dette dokumentet kan være betydelige og meningsfylt forhold til sin hurtighet, enkelhet og bekvemmelighet. Adsorbents brukes i protokollen er electrospun nanofibers, som har en høy overflate område-til-volum, og adsorberes i analytter med høy effektivitet. Prosedyren bare trenger noen milligram nanofiber og en liten mengde eluant løsemiddel og krever ikke en fordampning skritt å konsentrere seg på analytter. Her har vi presentert en detaljert oversikt over en såkalt HPLC-ECD basert protokoll som tillater nye brukere å etablere en effektiv metode for påvisning og måling av tre katekolaminer og to av deres metabolitter (NE, E, DA, og MHPG, DOPAC).

Suvereniteten til denne protokollen stammer hovedsakelig fra de fire viktige trinnene under prosedyrene, som vist i figur 1: bruke PCE-PS nanofibers for å fange målet forbindelser for å redusere størrelsen på absorberende til noen milligram, fører til en rask adsorpsjon / desorpsjon, og bare trenger en liten mengde eluting væske (1); legge til DPBA i urin til komplekse med analytter å forbedre deres hydrophobicity (2); skylling i nanofibers med løsning som inneholder DPBA for å beholde analytter og fjerne urenheter (3); og optimalisering av betingelsen utvinning og analyse å få god følsomhet og selektivitet for analytter (4).

Trinn (1), kan mekanismen av overlegen ytelse adsorbent evne for PCE-PS tilskrives en rekke faktorer. Crown Eter polymerer dopet i nanofibers kan danne en vert-gjest kompleks med gjest molekyler som inneholder Amin grupper av H-obligasjoner, som katekolaminer i dette papiret. I tillegg Hongyou Hu et al. og Jishun Chen et al. også foreslått at boronic syre kan bånd med nitrogen-atomer i den kjemiske strukturen gjennom B-N interaksjoner og at hydrofobe skjelettet samvirke med benzen ringer og andre alifatisk grupper av analytter36,37. Også under desorpsjon prosessen er hydrogen obligasjoner og B-N interaksjoner lett ødelagt ved svært lav pH; Dermed er eluants med surt pH vanligvis passende for leting for desorpsjon. Videre er det også flere sekundære interaksjoner, inkludert hydrofobe, jonisk, og hydrogen bånd, som kan forekomme mellom boronic kjemikalier og beslektede forbindelser36,37,38. Alle disse interaksjoner kan bidra til opptak av analytter materialet.

For trinn (2), ved hjelp av ekstra DPBA adsorberes PCE-PS nanofibers DPBA-katekolaminer komplekser raskt. Zhen Liu et al. viste at boronate tilhørighet materialet har dukket opp som viktige medier for selektiv separasjon og molekylære anerkjennelse av organiske forbindelser, som nucleosides, saccharides, glykaner, glykoproteiner, og så på38. Complexation oppstår hovedsakelig fra boronate affinitet samspillet mellom boronic syre og cis-diol grupper eller to tilstøtende hydroksyl grupper, til skjemaet fem eller seks medlemmer syklisk estere, som vist i supplerende figur 2A. Supplerende figur 2B viser store reaksjon nettstedene for de fem analytter i dette arbeidet til den boronic syre sammensatt. Når omgivelsene blir Sure, dissociates boronic syre-cis-diol komplekset. Samspillet mellom boronic syre og gruppen cis-diol eller de tilstøtende to hydroksyl gruppene finnes mye og relativt sterkt.

Komplekset dannet mellom analytter og DPBA kan holde dem på adsorbent mens andre urenheter er skylt fra PCE-PS overflaten, oppnå den beste reservasjonen for målene for trinn (3). Trinn (4), har det vært en rapport som viser at optimal pH var om 9.0 for liming av borsyre og catechol sammensatte39. Imidlertid Chen et al. utforsket den beste pH verdien for complexing av katekolaminer-DPBA og fant at adsorpsjon ytelsen til den sammensatte PS-PCE nanofibers for CAs var optimal når pH-verdi ble endret mellom 6.0 og 7.034,35. Liu et al. innblandet at strukturen støtte materialet til boronate syre forbindelser, spesielt med romlig confinement hulrom og nanoskala porene og B-N ligander dannet under reaksjonen, kan også betydelig redusere den bindende pH og forbedre bindende affinitet38. PCE-PS strukturen samt katekolaminer struktur er utstyrt med - NH-grupper. Dermed kan egenskapene og nanoskala porene i PCE-PS (data som vises i Representant resultater), så vel som B-N ligander dannet, bidra til redusert bindende pH i protokollen. Dermed kan optimal pH verdien i denne protokollen være nøytral, som sterkt forenkler prosedyrene og forhindrer nedbrytning av analytter.

De viktigste begrensningene catcholamine besluttsomhet er at konsentrasjonene i biologiske prøver er svært lav og at deres strukturer er ustabile (lett oksidert); Det er vanskelig å bli kvitt urenheter i media. Dermed analyse av katekolaminer i biologiske prøver er forbehandling, vanligvis av solid-fase utvinning, nødvendig. PFSPE metoden foreslått i denne artikkelen gitt en enkel og praktisk pre konsentrasjon for analytter i urin utvalgene. Men når du gjør eksperimentet, eksperimentet betingelsen må bli nøye kontrollert, av midler som unngå eksponering og forkorte pre-behandling tid som mulig.

Anvendelse av metoden ble evaluert av bruk for å bestemme konsentrasjonen av tre katekolaminer og to metabolitter i urinen av sunn spedbarn og høy risiko spedbarn. Det var en betydelig forskjell mellom de to gruppene i urin MHPG. Idet sammenfattet tidligere, rapporteres hvor MHPG i menneskekroppen hovedsakelig som en indeks gjenspeile noradrenergic neuronal tone, katekolaminer metabolisme aktiviteten i det sentrale og perifere nervesystem40,41, 42, og er en nyttig plasma/urin markør for sentrale NE metabolisme43. For høy risiko spedbarn forårsaker en rekke faktorer som hypoxic-iskemiske encefalopati (HIE) hjernen traumer og hjernen fornærmelser, fører til ulike grader av barndommen neurodevelopmental underskudd. Denne hjerneskade vil igjen føre til utgivelsen av nevrotransmittere (MHPG inkludert) i kroppsvæsker44,45. Ifølge rapporter etter JW Maas er det betydelig sammenhenger mellom hjernen, CSF, plasma og urin konsentrasjoner av MHPG46,47. Måling av totalt (gratis + konjugert) MHPG i urin har lenge vært brukt til å vurdere metabolismen av sentrale NE og eksterne NE stoffskiftet i mennesker41,48,49. Dermed kan det konkluderes at høy risiko spedbarn har noradrenergic neuronal tone skade sammenlignet med friske seg, påvirker katekolaminer stoffskiftet i sentralt og perifere nervesystem. Dette avviket angir at videre forskning bør gjøres på forholdet mellom urin MHPG nivå og neurodevelopmental underskuddene. Det har vist at den foreslåtte metoden kan brukes for fastsettelse av katekolaminer tilstedeværelse i urin, med et lovende prospekt for bruk i klinikken for å vurdere sykdommer relevant for disse nevrotransmittere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne bekrefter at det ikke er noen interessekonflikt med økonomiske organisasjoner angående materialet omtalt i denne artikkelen.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av National Science Foundation av Kina (No.81172720, nr. 81673230), sosial utvikling forskning Program av Jiangsu provinsen vitenskap og avdelingen (nr. BE2016741), Science & Technology prosjekt av Kina General Administration of Quality tilsyn, inspeksjon og karantene (2015QK055), åpne prosjektet programmet nøkkel laboratorium for barns utvikling og læring naturfag i utdanningsdepartementet, Sørøst University (CDLS-2016-04). Vi anerkjenner oppriktig Yuan sang og Ping Liu som hjalp oss på eksempler samling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 µL pipette tip column to contain nanofibers
PCE-PS nanofibers material for PFSPE extraction
steel rod (about 0.5 mm diameter) fill the nanofibres into the column
gastight plastic syringe (5 ml) compress solution into the end of the tip
methanol Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 67-56-1
diphenylborinic acid 2-aminoethyl ester(DPBA) Sigma-Aldrich.Inc A-106408 complex reagent
norepinephrine(NE) Sigma-Aldrich.Inc A-9512 analyte
3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol(MHPG) Sigma-Aldrich.Inc H1377 analyte
epinephrine(E) Sigma-Aldrich.Inc 100154-200503 analyte
3, 4-Dihydroxyphenylacetic acid(DOPAC) Sigma-Aldrich.Inc D-9128 analyte
dopamine(DA) Sigma-Aldrich.Inc H-8502 analyte
3, 4-dihydroxybenzylamine hydrobromide(DHBA) Sigma-Aldrich.Inc 858781 interior label
acetonitrile Sigma-Aldrich.Inc 75-05-8 eluriant and mobile phase
phosphoric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7664-38-2 eluriant
uric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 69-93-2 artifical urine
creatinine Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 60-27-5 artifical urine
trisodium citrate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 6132-04-3 artifical urine
KCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7447-40-7 artifical urine
NH4Cl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 12125-02-9 artifical urine
NaHCO3 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd SWC0140326 artifical urine
C2Na2O4 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 62-76-0 artifical urine
NaSO4 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7757-82-6 artifical urine
disodium hydrogen phosphate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10039-32-4 artifical urine
urea Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 57-13-6 artifical urine
NaCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7647-14-5 artifical urine
MgSO4.7H2O Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10034-99-8 artifical urine
CaCl2 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10035-04-8 artifical urine
HCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7647-01-0 artifical urine
citric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 77-92-9 artifical urine and mobile phase
EDTA disodium salt Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 34124-14-6 mobile phase
monometallic sodium orthophosphate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7558-80-7 artifical urine and mobile phase
1-heptanesulfonic acid sodium salt Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 22767-50-6 mobile phase
sodium hydroxide Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 1310-73-2 mobile phase
phenylboronic acid column(PBA column) Aglilent 12102018 PBA extraction
Inertsil® ODS-3 5 µm 4.6×150 mm column Dikma 5020-06731 HPLC column for seperation
SHIMADZU SIL-20AC prominence AUTO SAMPLER Shimadzu Corporation, Japan SIL-20AC auto injection for eluriant
SHIMADZU LC-20AD High Performance Liquid Chromatography Shimadzu Corporation, Japan LC-20AD HPLC pump
SHIMADZU L-ECD-60A electrochemical detector Shimadzu Corporation, Japan L-ECD-60A detector for the analytes
ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry System Micromeritics, USA surface and porosity analyzer 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elhwuegi, A. S. Central monoamines and their role in major depression. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 28, 435-451 (2004).
  2. Da, C. F., Ngoabdalla, S., Houzel, J. C., Rehen, S. K. Murine model for Parkinsons disease: From 6-OH dopamine lesion to behavioral test. J. Vis. Exp. (35), e1376 (2010).
  3. Varley, H., Gowenlock, A. H. The clinical chemistry of monoamines. Brit. Med. J. 2, 1330 (1963).
  4. Wang, X., Rousset, C. I., Hagberg, H., Mallard, C. Lipopolysaccharide-induced inflammation and perinatal brain injury. Semin. Fetal. Neonatal. Med. 11, 343-353 (2006).
  5. Inder, T. E., Volpe, J. J. Mechanisms of perinatal brain injury. Semin. Neonatol. 5, 3-16 (2000).
  6. Miller, S. P., Ferriero, D. M. From selective vulnerability to connectivity: Insights from newborn brain imaging. Trends. Neurosci. 32, 496-505 (2009).
  7. Barkovich, A. J., et al. Proton MR spectroscopy for the evaluation of brain injury in asphyxiated, term neonates. Am. J. Neuroradiol. 20, 1399-1405 (1999).
  8. Liauw, L., van Wezel-Meijler, G., Veen, S., van Buchem, M. A., van der Grond, J. Do apparent diffusion coefficient measurements predict outcome in children with neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy? Am. J. Neuroradiol. 30, 264-270 (2009).
  9. Varsami, M., et al. Inflammation and oxidative stress biomarkers in neonatal brain hypoxia and prediction of adverse neurological outcome: A review. J. Pediatr. Neonat. Individual. Med. 2, e020203 (2013).
  10. Cooper, R. L., Walker, R. F. Microradioenzymic assays for the measurement of catecholamines and serotonin. Methods. Enzymol. 103, 483-493 (1983).
  11. Murphy, J. F. The development of enzyme linked immunosorbent assays (ELISA) for the catecholamines adrenaline and noradrenaline. J. Immunol. Methods. 154, 89-98 (1992).
  12. Jones, S. R., Mickelson, G. E., Collins, L. B., Kawagoe, K. T., Wightman, R. M. Interference by pH and Ca2+ ions during measurements of catecholamine release in slices of rat amygdala with fast-scan cyclic voltammetry. J. Neurosci. Methods. 52, 1-10 (1994).
  13. Sanchismallols, J. M., Villanuevacamañas, R. M., Ramisramos, G. Determination of unconjugated catecholamine in urine as dopamine by thermal lens spectrometry. Analyst. 117, 1367-1371 (1992).
  14. Lan, C., Liu, W. Determination of catecholamines by HPLC-ECD in urine. Medical Laboratory Science and Clinics. , (2007).
  15. Tsunoda, M., Aoyama, C., Ota, S., Tamura, T., Funatsu, T. Extraction of catecholamines from urine using a monolithic silica disk-packed spin column and high-performance liquid chromatography-electrochemical detection. Anal. Methods. 3, 582-585 (2011).
  16. Bartolini, B., et al. Determination of monoamine oxidase activity by HPLC with fluorimetric detection. Neurobiology (Bp). 7, 109-121 (1999).
  17. Dunand, M., Gubian, D., Stauffer, M., Abid, K., Grouzmann, E. High throughput and sensitive quantitation of plasma catecholamines by ultraperformance liquid chromatography tandem mass spectrometryusing a solid phase microwell extraction plate. Anal. Chem. 85, 3539-3544 (2013).
  18. He, H., Carballo-Jane, E., Tong, X., Cohen, L. H. Measurement of catecholamines in rat and mini-pig plasma and urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry coupled with solid phase extraction. J. Chromatogr. B. 997, 154-161 (2015).
  19. Simon, N., Young, P. How to increase serotonin in the human brain without drugs. J. Psychiatry. Neurosci. 32, 394-399 (2007).
  20. Grossi, G., et al. Improvements in automated analysis of catecholamine and related metabolites in biological samples by column-switching high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 541, 273-284 (1991).
  21. Iwamot, T., Yoshiura, M., Iriyama, K. Liquid chromatographic identification of urinary catecholamine metabolites adsorbed on alumina. J. Liq. Chromatogr. R. T. 10, 1217-1235 (1987).
  22. Maycock, P. F., Frayn, K. N. Use of alumina columns to prepare plasma samples for liquid-chromatographic determination of catecholamines. Clin. Chem. 33, 286-287 (1987).
  23. Grossi, G., Bargossi, A., Lippi, A., Battistoni, R. A fully automated catecholamines analyzer based on cartridge extraction and HPLC separation. Chromatographia. 24, 842-846 (1987).
  24. Rondelli, I., et al. New method for the resolution of the enantiomers of 5,6-dihydroxy-2-methyl-aminotetralin by selective derivatization and HPLC analysis: Application to biological fluids. Chirality. 8, 381-389 (1996).
  25. Kumar, A., Hart, J. P., McCalley, D. V. Determination of catecholamines in urine using hydrophilic interaction chromatography with electrochemical detection. J. Chromatogr. A. 1218, 3854-3861 (2011).
  26. Sabbioni, C., et al. Simultaneous liquid chromatographic analysis of catecholamines and 4-hydroxy-3-methoxyphenylethylene glycol in human plasma: Comparison of amperometric and coulometric detection. J. Chromatogr. A. 1032, 65-71 (2004).
  27. Lee, M., et al. Selective solid-phase extraction of catecholamines by the chemically modified polymeric adsorbents with crown ether. J. Chromatogr. A. 1160, 340-344 (2007).
  28. He, H., et al. Facile synthesis of a boronate affinity sorbent from mesoporous nanomagnetic polyhedral oligomeric silsesquioxanes composite and its application for enrichment of catecholamines in human urine. Anal. Chim. Acta. 944, 1-13 (2016).
  29. Subbiah, T., Bhat, G. S., Tock, R. W., Parameswaran, S., Ramkumar, S. S. Electrospinning of nanofibers. J. Appl. Polym. Sci. 96, 557-569 (2005).
  30. Hu, W. Y., et al. Packed-fiber solid-phase extraction coupled with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry for determination of diethylstilbestrol, hexestrol, and diedestrol residues in milk. J. Chromatogr. B. 957, 7-13 (2014).
  31. Liu, Z., Kang, X., Fang, F. Solid phase extraction with electrospun nanofibers for determination of retinol and α-tocopherol in plasma. Microchim. Acta. 168, 59-64 (2010).
  32. Qi, D., Kang, X., Chen, L., Zhang, Y., Wei, H., Gu, Z. Electrospun polymer nanofibers as a solid-phase extraction sorbent for the determination of trace pollutants in environmental water. Anal. Bioanal. Chem. 390, 929-938 (2008).
  33. Kang, X. J., Chen, L. Q., Zhang, Y. Y., Liu, Y. W., Gu, Z. Z. Performance of electrospun nanofibers for SPE of drugs from aqueous solutions. J. Sep. Sci. 31, 3272-3278 (2008).
  34. Chen, L. Q., Wang, Y., Qu, J. S., Deng, J. J., Kang, X. J. Selective extraction of catecholamines by packed fiber solid-phase using composite nanofibers composing of polymeric crown ether with polystyrene. Biomed. Chromatogr. 29, 103-109 (2015).
  35. Chen, L. Q., Zhu, X. H., Shen, J., Zhang, W. Q. Selective solid-phase extraction of catecholamines from plasma using nanofibers doped with crown ether and their quantitation by HPLC with electrochemical detection. Anal. Bioanal. Chem. 408, 4987-4994 (2016).
  36. Hu, H., Zhang, Y., Zhang, Y., Huang, X., Yuan, D. Preparation of a new sorbent based on boronate affinity monolith and evaluation of its extraction performance for nitrogen-containing pollutants. J. Chromatogr. A. 1342, 8-15 (2014).
  37. Chen, J., et al. Sensitive determination of four camptothecins bysolid-phase microextraction-HPLC based on a boronic acid contained polymer monolithic layer. Anal. Chim. Acta. 879, 41-47 (2015).
  38. Li, D., Chen, Y., Liu, Z. Boronate affinity materials for separation and molecular recognition: structure, properties and applications. Chem. Soc. Rev. 44, 8097-8123 (2015).
  39. Yan, J., Springsteen, G., Deeter, S., Wang, B. The relationship among pKa, pH, and binding constants in the interactions between boronic acids and diols: It is not as simple as it appears. Tetrahedron. 60, 11205-11209 (2004).
  40. Reuster, T., Rilke, O., Oehler, J. High correlation between salivary MHPG and CSF MHPG. Psychopharmacology. 162, 415-418 (2002).
  41. Beckmann, H., Goodwin, F. K. Urinary MHPG in subgroups of depressed patients and normal controls. Neuropsychobiology. 6, 91-100 (1980).
  42. Mitoma, M., et al. Stress at work alters serum brain-derived neurotrophic factor (BDNF) levels and plasma 3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) levels in healthy volunteers: BDNF and MHPG as possible biological markers of mental stress? Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 32, 679-685 (2008).
  43. Ressler, K. J., Nemeroff, C. B. Role of Norepinephrine in the Pathophysiology and Treatment of Mood Disorders. Biol. Psychiatry. 46, 1219-1233 (1999).
  44. Alonso-Spilsbury, M., et al. Perinatal asphyxia pathophysiology in pig and human: A review. Anim. Reprod. Sci. 90, 1-30 (2005).
  45. Shalak, L., Perlman, J. M. Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant: Current concepts. Early. Hum. Dev. 80, 125-141 (2004).
  46. Maas, J. W., Leckman, J. F. relationships between central nervous system noradrenergic function and plasma and urinary MHPG and other norepinephrine metabolites. MHPG: Basic Mechanisms and Psychopathology. , Academic Press. 33-43 (1983).
  47. Maas, J. W. Relationships between central nervous system noradrenergic function and plasma and urinary concentrations of norepinephrine metabolites. Adv. Biochem. Psychopharmacol. 39, 45-55 (1984).
  48. Peyrin, L., Pequignot, J. M., Chauplannaz, G., Laurent, B., Aimard, G. Sulfate and glucuronide conjugates of 3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) in urine of depressed patients: Central and peripheral influences. J. Neural. Transm. 63, 255-269 (1985).
  49. Peyrin, L. Urinary MHPG sulfate as a marker of central norepinephrine metabolism: A commentary. J. Neural. Transm. 80, 51-65 (1990).

Tags

Kjemi problemet 133 katekolaminer polymere kronen electrospun nanofiber pakket-fiber solid-fase utvinning (PFSPE) høytrykks flytende kromatografi med elektrokjemiske deteksjon (såkalt HPLC-ECD) høy risiko spedbarn
En praktisk metode for utvinning og analyse med høyt trykk væske kromatografi katekolaminer nevrotransmittere og deres metabolitter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xie, L., Chen, L., Gu, P., Wei, L.,… More

Xie, L., Chen, L., Gu, P., Wei, L., Kang, X. A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites. J. Vis. Exp. (133), e56445, doi:10.3791/56445 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter