Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

שיטה נוחה עבור חילוץ וניתוח עם כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה של נוירוטרנסמיטורים קטכולאמין מטבוליטים שלהם

Published: March 1, 2018 doi: 10.3791/56445
Automatic Translation
1, 3, 4, 1, 2
1School of Public Health of Southeast University, Laboratory of Environment and Biosafety Research Institute of Southeast University in Suzhou, 2Key Laboratory of Child Development and Learning Science (Ministry of Education), School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University, 3School of Public Health, Tianjin Medical University, 4British Columbia Academy, Nanjing Foreign Language School

Summary

נציג של מיצוי מוצק-פאזי נוח מצמידים כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC) עם זיהוי אלקטרוכימי (ECD) נחישות סימולטני של נוירוטרנסמיטרים מונואמין שלוש ושתיים של מטבוליטים שלהם בשתן תינוקות. אנחנו גם לזהות את המטבוליט MHPG כמו סמן פוטנציאלי לאבחון מוקדם של נזק מוחי תינוקות.

Abstract

החילוץ וניתוח של נוירוטרנסמיטרים קטכולאמין נוזלים הביולוגי הוא בעל חשיבות רבה בהערכת תפקוד מערכת העצבים ומחלות קשורות, אבל המדידה המדויקת שלהם הוא עדיין אתגר. פרוטוקולים רבים תוארו למדידה עצבי על ידי מגוון רחב של כלים, כולל כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC). עם זאת, ישנם חסרונות, כמו מבצע מסובך או קשה לזהות מטרות מרובות, אשר לא ניתן למנוע, תוך זמן קצר, טכניקת ניתוח הדומיננטית היא עדיין HPLC בשילוב עם רגיש אלקטרוכימי או זיהוי fluorimetric, בשל רגישות גבוהה, סלקטיביות טוב שלה. כאן, פרוטוקול מפורט מתואר רעלני, זיהוי catecholamines עם כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה עם זיהוי אלקטרוכימי (HPLC-ECD) בדגימות שתן האמיתי של תינוקות, באמצעות electrospun nanofibers ללא הפרדות צבע המורכב של אתר כתר פולימריים עם פוליסטירן כמו adsorbent, הידוע גם בשם שיטת החילוץ (PFSPE) סיבים ארוז מעבדתי. אנו מראים איך שתן דגימות יכול להיות precleaned בקלות על ידי עמודה וגדוש nanofiber מעבדתי, איך analytes המדגם יכולים להיות במהירות מועשר, desorbed, ולא זוהה במערכת ECD. PFSPE מאוד מפשט את נהלי pretreatment דגימות ביולוגיות, המאפשר זמן ירד, הוצאות, הפחתה של האובדן של מטרות.

בסך הכל, עבודה זו ממחישה פרוטוקול פשוט ונוח לחילוץ מוצק-פאזי מצמידים אל מערכת HPLC-ECD נחישות סימולטני של נוירוטרנסמיטרים מונואמין שלוש (נוראפינפרין (NE), אפינפרין (E), דופמין (DA)) ושניים של שלהם מטבוליטים (3-מתוקסי-4-hydroxyphenylglycol (MHPG), חומצה 3,4-dihydroxy-phenylacetic (DOPAC)) בשתן תינוקות. פרוטוקול הוקמה הוחל להעריך את ההבדלים של catecholamines השתן שלהם מטבוליטים בין תינוקות בסיכון גבוה עם נזק מוחי הלידה ופקדים בריא. ניתוח השוואתי גילה הבדל משמעותי בדרכי השתן MHPG בין שתי הקבוצות, המציין כי מטבוליטים קטכולאמין עשוי להיות סמן המועמד חשוב לאבחון מוקדם של המקרים בסיכון נזק מוחי אצל תינוקות.

Introduction

קטכולאמין נוירוטרנסמיטורים ותוכנן מטבוליט בנוזלי גוף יכול להשפיע על תפקוד העצבים ומשפיעים האיזון של הברית תגובה לגירוי במידה רבה1. Abnormities עלול לגרום למגוון של מחלות, כגון pheochromacytoma, ganglioneuroma, נוירובלסטומה, הפרעות נוירולוגיות1,2. החילוץ והנחישות של catecholamines בנוזלי גוף הוא בעל משמעות האבחון של מחלות רלוונטיות. אולם, catecholamines בדגימות ביולוגיות קיימות בריכוזים נמוכים, הם בקלות מחומצן. יתר על כן, הם מאוד קשה elute בגלל כמות גדולה של הפרעה בינונית3. לפיכך, זיהוי סימולטני catecholamines, נוזלים ביולוגיים הוא עדיין אתגר.

היו ביקורות מראה כי catecholamines השתן יכולה להיות מידה של מתח, וכי רמות שלהם הם סמנים ביולוגיים חשובים להגיב על גירוי חוש המישוש עיבוד ילודים5. על פי המחקר, כל התינוקות שסבלו מ מקרים מוקדמת נמצאים בסיכון במוח פציעה4,5,6, פציעה עשוי לגרום לשחרור חריגה של catecholamines ו בנושאים הקשורים לתוך הנוזלים. קיימות טכניקות מתקדמות תהודה מגנטית שיכול לזהות נזק מוחי ב שלבים קודמת7,-8. עם זאת, בתוך 48 שעות הראשון, תהליך נורמלי התפתחותיות יגרום פגיעה מוחית קבועה זה לא יהיה ניכר תמונות רפואיות11. חוץ מזה, המשאבים כלי עלות גבוה ויקר, יחד עם גורמים אחרים, לאחראי על כל היחידות neonatal גישה אלו טכניקות הדמיה עצבית מיוחדים. עם זאת, השימוש סמן בקלות נגיש ומעשי (כגון catecholamines ו מטבוליטים שלהם) יכול להתגבר על חסרונות אלה, ההקרנה של סמן בנוזלים אנושי עשוי לעזור באבחון מוקדם של פגיעה מוחית, להוביל בקשה זיהוי של תינוק בן יומו תינוקות הזקוקים neuroprotection9. Catecholamines בשתן יכול להיות אינדקס קל וברור, בגלל הקשר ישיר בין כמות אותם שוחרר לתוך נוזלים ותפקוד neuroactivity.

בין נוזלים ביולוגיים, נוזל מוחי שדרתי (CSF) ודוגמאות פלזמה לא קל להשיג באמצעות הליכים טראומטי הקיים, זה גם מאוד קשה להיפטר הפרעות עקב דבק חלבון ו אחרים זיהומים, המוביל בעייתי, תהליך הדגימה גוזלת זמן מתאים לסערת חוזר על עצמו לזיהוי. בנוסף, לילדים, זה כמעט בלתי אפשרי לתפוס את הדגימות בצורה טראומטית. לכן, דגימת השתן הוא טוב יותר מאשר צורות אחרות של הדגימה, כפי שהוא לא פולשנית, קלה לתפעול, ניתן לעשות שוב ושוב. בדיקות שתן הן שופע קל לאחסן ולהציג יתרון רב על הטפסים האחרים של דגימות ביולוגיות.

השיטות העיקריות לכמת catecholamines, נוזלים ביולוגיים כוללים מבחני radioenzymic10, מקושרים-אנזים מבחני החיסון-sorbent11, voltammetry12 , עדשה תרמי ספקטרומטר13. אבל חסרונות קיימים, כגון פעולות מסובכות, קשה לזהות מטרות מרובות. היום, טכניקת ניתוח הדומיננטית היא ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC)14, בשילוב עם רגישות אלקטרוכימי15 או fluorimetric זיהוי16, בשל רגישות גבוהה טוב סלקטיביות. עם טכנולוגיית ספקטרומטר מסה טנדם, כגון כרומטוגרפיה נוזלית/ספקטרומטר מסה (LC/MS) ו כרומטוגרפיה נוזלית/מסה ספקטרומטר מסות/מסה (LC/MS/MS), ניתוח כימות נוירוטרנסמיטורים יכולים להשיג גבוה דיוק וספציפיות17,18. עם זאת, הטכניקה MS דורשת מכשור יקר, כמו גם כוח אדם מוסמך באופן משמעותי, מקשה על השיטה להחיל אוניברסלית במעבדות המקובלת ביותר. HPLC-ECD מערכות מצוידים בדרך כלל במעבדות המקובלת ביותר קליני, ובכך הפכו בחירה נפוצה וטובה עבור קבוצות מחקר לשימוש עבור קביעת כימי, אבל הם דורשים את הדגימה הציג לתוך מערכת נקי ושל נפח microscale19. לכן חשיבות רבה כדי לטהר לדחוס את המדגם לפני הניתוח. השיטה הקלאסית עבור השלב טיהור היא מיצוי נוזל-נוזל14,15,20 ו- off-line החילוץ מוצק-פאזי, כולל אלומינה מופעל טור21,22 ו- diphenylborate (DPBA) complexation23,24,25,26.

. לי Myeongho et al. כבר משתמש שרף פולימרי כימית שונה עם אתר כתר כמו adsorbent באופן סלקטיבי לחלץ catecholamines מ שתן מאז 200727. כמו כן, בשנת 2006, הוא Haibo et al. הפגינו בגישה סינתזה נתיישב בשביל boronate זיקה החילוץ byutilizing sorbent functionalizable nanomagnetic silsesquioxane oligomeric לכל מקרה (עתירת) nanomagnetic בסיס מורכב, וליישם אותו העשרת catecholamines ב שתן (לנורה, אפינפרין ו- isoprenaline)28. הם גם ניצל ננו כדי למלא את העבודה, תוך שימוש בטכנולוגיה הנקראת ננו-electrospinning ויוצרים חומר סיבי פולימר ב הננומטרי. תהליך electrospinning ניתן להתאים את קוטר, מורפולוגיה ויישור המרחבי של המוצר באמצעות שליטה את מתח העבודה של שינוי התוכן של הפתרון ספינינג יחד עם פרמטרים נוספים29. לעומת הדיו SPE המקובלת, electrospun nanofibers מתאימים מאוד לחלץ ולהעשיר את המטרה analytes של מטריצה מורכבת, כפי הם מצוידים עם יחס פני-שטח-כדי-נפח גבוה כדי לספוח את analytes עם יעילות גבוהה, ו התערוכה יותר בקלות שבשליטת משטח הכימיות, ומאפשר מצורף בהישג יד של תרכובות היעד. מאפיינים אלה לגרום להם בחירה מוצלחת SPE adsorbents, מאוד לצמצם את מעבדתי ואת desorption כמות הממס30,31,32,33. עבור catecholamines בדגימות שתן, nanofibers electrospun, המורכבת apolymeric אתר כתר עם פוליסטירן (PCE-PS) שימשו באופן סלקטיבי לחלץ שלושה catecholamines (NE, E ו- DA)34. העיתון ציין כי האתר כתר סלקטיבי adsorbed המטרות של NE, E, ודה, שהתבסס על הגיאומטריה הנכון עבור איגוד catecholamines באמצעות יצירת קשרי מימן. התוצאות להציג את אתר כתר גשמי ביעילות, הסרת תרכובות אחרות מפריעות הכלול דגימות ביולוגיות. בהשראת דו ח זה, שיטה פותחה עבור הפקת סלקטיבי catecholamines על ידי שימוש electrospun nanofibers ללא הפרדות צבע המורכב PCE-PS.

בנייר זה, שיטת דיווח בעבר34 שיפור והעסיק לא רק לנתח בהצלחה E, NE, ועל דא, אלא גם שלהם מטבוליטים, MHPG, DOPAC, בשתן. אנחנו גם לחקור אפשרויות חדשות עבור המנגנון של התהליך ספיחה. השיטה מציגה מספק יעילות החילוץ, סלקטיביות עבור analytes חמש, השיטה אומתה בניתוח של שתן מן תינוקות בסיכון גבוה עם נזק מוחי הלידה שולטת בריא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הושגה הסכמה מדעת מההורים, באישור מועצת סקירה מוסדיים הושג לצורך המחקר. המחקר בוצע על פי הקוד האתי של ההסתדרות הרפואית העולמית (הצהרת הלסינקי) לניסויים מעורבים בני אדם. המטפלים של כל המשתתפים בתנאי ובכתב בשביל להיות נרשמו המחקר. אישור הוועדה האתית מבית החולים Zhongda, שותפים עם אוניברסיטת דרום-מזרח, היה מתקבל גם.

1. הכנת פתרונות לצורך את החילוץ והנחישות של Catecholamines והעמודות

  1. הכינו את העמודה PFSPE. לחלק 1-2 מ"ג של nanofibers PCE-PS aliquots 5-6, והשתמש מוט מתכת בסדר בקוטר 0.5 מ מ כדי לדחוס אותם מסודרת בתוך הסוף של קצה פיפטה עם נפח של 200 µL.
  2. הכן את השתן מלאכותי על ידי במשקל של 2.427 גרם אוריאה, 0.034 g חומצת שתן, 0.09 g קריאטינין, ציטראט trisodium 0.297 g, 0.634 g נתרן כלורי, 0.45 g אשלגן כלורי, 0.161 g אמוניום כלוריד, 0.089 g סידן כלורי וגופרית והרכבו, 0.1 גרם מגנזיום גופרתי heptahydrate, 0.034 g סודיום ביקרבונט, 0.003 g נתרן אוקסלט, 0.258 g נתרן גופרתי, 0.1 גר' נתרן dihydrogen פוספט, 0.011 גרם ניתרן מימן פוספט, וכן התמוססות הכימיקלים הנ לתוך 200 מ ל יונים מים.
  3. להכין 2 מ"ג/מ"ל פתרון מניות של diphenylborate (DPBA) פתרון על ידי המסת 2 מ ג של המתחם לתוך 1 מ"ל של מים מזוקקים. חנות הפתרון בחושך ב 4 º C.
  4. תקן Analyte
    הערה: המבנה הכימי והמאפיינים של catecholamines יציבה, הם מתפרקים בקלות. תהליך ההכנה של סטנדרטים חייב להיות מהיר מאוד, חייבים למנוע חשיפה לאור שמש ישיר.
    1. שוקלים 1.0 מ"ג NE, E, דא, MHPG, DOPAC ומנות פנימי סטנדרטי 3,4-dihydroxybenzylamine DHBA mL 1.5 נפרד microcentrifuge צינורות. לדלל את הפתרון DHBA במים כדי 100 ננוגרם למ"ל לפני השימוש.
    2. נעים את הסטנדרטים מוכן בחושך במהירות גבוהה עד analytes מתמוסס לחלוטין. . זה המניות העיקרי; לאחסן ב-20 ° C עבור עד מספר שבועות.
    3. להכין משני 1000 ננוגרם למ"ל analyte המניות. NE, E, דא, DOPAC, MHPG, להעביר 5 µL של כל מניה analyte ראשי µL 4,975 של מים מזוקקים בתוך שפופרת צנטרפוגה 5 מ"ל, ואחסן אותו בחושך ב 4 ° C עד השימוש. להכין את אלה פתרונות טריים מדי יום. עבור DHBA, להעביר µL 5 המניות העיקרי של µL 4,995 של מים מזוקקים בתוך שפופרת צנטרפוגה 5 מ"ל, ואחסן אותו בחושך בנפרד ב 4 º C.
    4. להפוך דילולים נוספת עם התבואה analyte משנית ליצירת עיקול רגיל (למשל., משלים בטבלה 2). לאחסן פתרונות בחושך ב 4 ° C ולהכין טריים מדי יום.
    5. מבחן עוצמת המתח האופטימלית של גלאי ECD באמצעות המניה סטנדרטי עם ריכוז נאות. להשתנות המתח כדי למצוא ערך שם analytes יש את המראה שיא הטוב ביותר.
  5. להכין eluant המכיל חומצה זרחתית 30%, 15% acetonitrile, ו- 55% מים מזוקקים. עבור 10 מ"ל של הממס eluant, השתמש 5.5 מ ל מים מזוקקים, וכן להוסיף 1.5 mL של acetonitrile ו- 3 מ ל חומצה זרחתית טיפה על ידי ירידה לתוך המים.

2. הכנת דגימות שתן אמיתי, שלב ניידים

  1. יש אמהות לאסוף שתן הבוקר הראשון של התינוקות שלהן באמצעות כוסות שתן אספטי. להעביר מיד את הדגימות לתוך צינורות פוליפרופילן, תווית. לאחר מכן, אחסן את הדגימות במקפיא-20 ° C.
  2. מערבולת, צנטריפוגה הדגימות השתן ב g 1,510 x 10 דקות ב חדר טמפרטורה (RT) כדי להיפטר רוב ההפרעות חלקיקים. למחוק את המשקע ולאסוף את supernatants לניסויים נוספים. על מנת לחלץ analytes ביעילות, להמשיך PFSPE רעלני (שלב 3) מיד לאחר צריך שתוציאו.
  3. הכן השלב ניידים
    1. להכין בקבוק נקי, לפחות 1 ל' ההרכב של שלב הנייד רשום משלים טבלה 1; עבור שלב נייד 1 ליטר, מדד 6.7242 g של חומצה ציטרית, 93.06 מ"ג של-אתילן diamine ב טטרה חומצה אצטית (EDTA) ניתרן מלח, 7.02 גר' נתרן monometallic האורטו, mg 404.5 של מלח נתרן חומצה 1-heptanesulfonic, ו- 3.5 גר' נתרן מימה לתוך הבקבוק. להוסיף 40 מ"ל acetonitrile, 1,000 מ ל מים מזוקקים. להתסיס, רטט ultrasonically למשך 15 דקות עד הבעיה בפתרון כל היא התפרקה.
    2. באמצעות מד pH אלקטרודת זכוכית, התאם את הערך ה-pH של שלב נייד כדי 4.21 עם פתרון רווי נתרן הידרוקסידי.
    3. לסנן השלב ניידים עם פלואוריד polyvinylidene מיקרומטר 0.45 נקבובי ממברנה, מכשיר היניקה ואקום כדי להיפטר זיהומים.
    4. השתמש רטט קולי למשך 15 דקות כדי דגה השלב ניידים בכל פעם לפני השימוש.

3. PFSPE החילוץ וניתוח HPLC

  1. הפעל את nanofibers. הקש µL 100 של מתנול, 100 µL של מים באופן רציף באמצעות העמודה PFSPE באמצעות מזרק 5 מ ל צורה איטית, dropwise.
  2. מיקס 100 µL שתן לטעום עם פתרון DPBA של 2 מ"ג/מ"ל µL 100 ו 30 µL 100 ננוגרם למ"ל של DHBA פתרון (IS, תקן פנימי) צינור 0.5 mL EP, ולאחר מכן להעביר את הפתרון מעורב העמודה PFSPE. הקש על הפתרון מדגם מעורבת באמצעות העמודה PFSPE מ ל gastight פלסטיק בהזרקה תוך שימוש בכוח לחץ האוויר.
  3. ליץ את העמודה שלוש פעמים על ידי העמסת 100 µL DPBA פתרון (2 מ"ג/מ"ל) לתוך העמודה SPE, ודחף את הפתרון באיטיות דרך הדיו עם לחץ אוויר באמצעות מזרק פלסטיק gastight מ.
  4. לטעון µL 50 של eluant אל העמודה PFSPE, דרך העמודה, איסוף של eluate עם צינור 0.5 mL EP.
  5. הפעל את degasser HLPC כדי דגה האוויר במערכת. לפני ניתוחים לדוגמה, המערכת לפעול עבור יותר מ 0.5 h עם השלב ניידים equilibrate ולהפחית את הרעש בסיסית. ראה משלים טבלה 1 מציג את הפרמטרים ההתקנה של מערכת HPLC.
  6. לטעום 20 µL של eluate השימוש של דוגם אוטומטי ולאחר מכן תזריק את זה לתוך מערכת HPLC-ECD.
  7. בעת שלשול הושלמו, כבה את התא גלאי באמצעות ממשק גלאי. אל תכבה את התא עם הבורר בתוך הגלאי, כמו זו עלולה לגרום נזק לכלי.
  8. לשנות באופן ידני את ההרכב כדי 10% מתנול ל- 90% מים. הפעל במשך לפחות 30 דקות. לאחר מכן, ידנית לשנות השלב ניידים HPLC-כיתה מתנול. הפעל למשך כ 15 דקות להגן על המערכת ב מתנול. כישלון להפעיל שלב זה בעקבות הזמן רץ המומלצת יכולה לגרום נזק את העמודה ואת הגלאי. כבה את הזרימה ולאחר מכן לבטל את degasser.

4. Phenylboronic חומצה מחסניות (PBA) החילוץ

PBA מחסנית מיצוי הליכים היו הדומה ערכת קומאר ואח. (2011) 25. כל הפתרונות הם דחף דרך המחסנית PBA (100 מ"ג, 1 מ"ל) עם אוויר על-ידי מזרק.

  1. להתנות את המחסנית עם 1 מ ל 80:20 acetonitrile-מים (v/v) המכיל חומצה פורמית 1% 1 מ"ל של 50 מ מ פוספט מאגר (pH 10) ברצף.
  2. הקש את דגימת שתן במאגר (1 מ"ל שתן ו- 2 mL פוספט מאגר, pH 8.5) דרך המחסנית PBA.
  3. לשטוף את מיכל הדיו באמצעות 1 מ"ל 50: 50 v/v acetonitrile-פוספט מאגר (10 מ מ, pH 8.5).
  4. Elute את המחסנית עם 1 מ ל acetonitrile-מים (80:20 v/v) המכיל חומצה פורמית 1%.

5. זיהוי, כימות Catecholamines

  1. ליניאריות
    1. לדלל את המניה analytes משנית עם שתן מלאכותי ריכוזי 6 (1.5 3, 12, 25, 50, 100 ננוגרם למ"ל); דילול כמות שתן מלאכותי בעקבות משלים בטבלה 2. להפוך את שלוש דוגמאות מקבילות לריכוז כל כדי לקבל 18 analyte ניסיוני פתרונות לבניית עקומות כיול.
    2. לדלל מניות משני DHBA עם שתן מלאכותי 10-fold כדי לקבל 100 ננוגרם למ"ל פתרון נסיוני.
    3. Pretreat כל הפתרונות analyte מ 5.1.1, לפי שלב 3 (PFSPE מיצוי הליכים). כמו בשלב 3, להזריק µL 20 של כל eluate המקביל לתוך מערכת HPLC-ECD להגיע chromatogram של HPLC.
    4. לבנות עקומות כיול של analytes חמש ידי היחס של אזור הפסגה (מטרות/IS) כמו ציר Y נגד היחס בין ריכוז (מטרות/IS) כמו ציר X, כפי שמוצג באיור1 משלים.
  2. לוד וערך LOQ רגישות
    1. מזריקים µL 20 של שתן מלאכותי ריקה לתוך מערכת HPLC-ECD (כמו בשלב 3), כדי לקבל את chromatogram HPLC של המדגם.
    2. Chromatogram מן 5.2.1, לאסוף 11 ערכים ריקים אות, לחשב את הערך הממוצע Xb וסטיית התקן Sb. לחשב את האות המינימלי של חומר שניתן לאתר ברמה מסוימת של ביטחון, XL, כ- XL = Xb+ K * Sb (K הוא המקדם נקבע על ידי רמת הביטחון, Sb משקף רמת הרעש שיטת מדידה ואת רמת רעש מכונת). לפיכך, לוד = (X -XLb) /S = (K * Sb) /S (S מייצג ערך השיפוע של העקומה עבודה).
    3. הגדרת S/N של 3:1 (K = 3) כמו המגבלה של זיהוי (לוד), ו- S/N של 10:1 (K = 10) כמו מהמגבלה של כימות (LOQ).
  3. להעריך את ושחזורים
    1. להכין דגימות שתן מחודדים ואמיתית. לדלל המניה analytes משנית עם שתן אמיתי ריכוזי 3 (5, 50, 100 ננוגרם למ"ל) כדי להשיג את דגימות שתן מחודדים. להכין שלוש דוגמאות מקבילות עבור כל הפתרונות analyte. לספור את הריכוז מחודדים כמו כמות תרכובות היעד קפץ לתוך דגימת השתן. להגדיר ערך זה כמו As.
    2. לדלל DHBA מניות 100 ננוגרם למ"ל, כמו שלב 5.1.2.
    3. לעבד את כל הפתרונות דגימה מן 5.3.1 לפי שלב 3 (PFSPE מיצוי הליכים), להזריק את µL 20 של כל eluant המקביל לתוך מערכת HPLC-ECD כדי לקבל את התוצאה chromatogram. הערך של analytes ייספר להוסיף1כמו כמות של תרכובות היעד לכמת בדגימת השתן מחודדים. להגדיר ערך זה כמוt.
    4. מזריקים µL 20 של דגימת שתן לתוך מערכת HPLC-ECD (כמו בשלב 3) כדי לקבל את התוצאה chromatogram. הערך של analytes ייספר על כמות ראשונית של תרכובות היעד לכמת בדגימת השתן. להגדיר ערך זה כמו אני.
    5. לחשב את הכמות של תרכובות היעד דגימות מן המשוואה עיקול רגיל. ההתאוששות אחוז מוערך כמו שחזור מתודולוגי % = (t - Aאני) × 100 / (s). כלומר הערכים מוצגים בטבלה 1.
  4. להעריך את אי
    1. להכין דגימות שתן מלאכותי מחודדים 5, 50 ו- 100 ננוגרם למ"ל ריכוזי כמו שלב 5.3.1. להכין דוגמאות מקבילות 6 עבור כל הפתרונות analyte. להכין דגימות ניסיוני טריים מדי יום.
    2. לדלל DHBA מניות 100 ננוגרם למ"ל כמו שלב 5.1.2.
    3. להעריך את מידת הדיוק של היום (n = 6). לעבד את כל הפתרונות דוגמה ב 5.4.1 לפי שלב 3, להזריק את µL 20 של כל eluant כתב לתוך מערכת HPLC-ECD כדי לקבל את chromatogram. לעשות את אותה הפעולה שש פעמים באותו היום.
    4. לחשב את הכמות של תרכובות היעד דגימות מן המשוואה עיקול רגיל. תחת ריכוז זהה של המתחם זהה, סטיית תקן (RSD) היחסי של מבחני שש ביום אחד נקבע היום דיוק. כלומר הערכים מוצגים בטבלה 1.
    5. להעריך את מידת הדיוק של הבין-היום (n = 6). באותו זמן בכל יום בששת הימים רציפים, להתכונן לבדיקת שתן מלאכותי מחודדים שלושה ריכוזים של 5, 50, 100 ננוגרם למ"ל, כמו 5.4.1 ועם 5.4.2., ולעבד את כל הפתרונות מדגם analyte לפי שלב 3.
    6. להזריק את µL 20 של כל eluate המקביל של 5.4.5 לתוך מערכת HPLC-ECD כדי לקבל את התוצאות chromatogram כל יום. לחשב את הכמות של תרכובות היעד דגימות מן המשוואה עיקול רגיל. הבין-היום דיוק מתבטאת על ידי RSD כמות מבחני בין דגימות שתן מלאכותי מחודדים בריכוזים שלושה שישה ימים רציפים. כלומר הערכים מוצגים בטבלה 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה היא שיטה פשוטה ונוחה PFSPE pretreat דגימות שתן ולהעשיר catecholamines חמש לגילוי באמצעות מערכת HPLC-ECD; דיאגרמה של התהליך מוצג באיור1. הפרוטוקול בעיקר כולל ארבעה הפעלת צעדים, טעינה, שטיפה, ו eluting - בשילוב עם כמות קטנה של nanofibers PCE-PS ומכשיר פשוט מיצוי מוצק-פאזי. המורפולוגיה של PCE-PS nanofibers הוערכה באמצעות מנתח השטח, נקבוביות (ראה טבלה של חומרים). ההתערבות את מאפייני רקמתי (מן המלון, אמט ו טלר) פני שטח, נפח נקבוביות, גודל הנקבוביות-היו 2.8297 m-2 -g--1, g3 ס מ 0.009-1ו 12.76 ננומטר, בהתאמה. נתונים אלה מצביעים על כי החומר המשמש בפרוטוקול יש נקבוביות ננו על פני השטח, אשר עשוי לתרום את היעילות ספיחה גבוהה ו- pH מחייב הנמכת בפרוטוקול.

פרוטוקול זה משתמש באמצעי אחסון ממוטב, דוגמת מרכיבים, leachate, eluant, וכדומה, כמו גם עבודה pH וזמן הנצרכים במהלך ההליכים. חן. et al., eluant היה פתרון חומצה אצטית 12.0 M כי בתנאים חומציים לגרום את adsorbent להיות protonated, טעונה באופן חיובי, אשר היא חיובית עבור • תנאי של רשויות אישורים34,35. במחקר זה, המתכון eluant היה שיפוץ להיות 30% חומצה זרחתית, 15% acetonitrile, ו- 55% מים מזוקקים. ערך pH הסופי של eluant היה להתאים ל- 3.0. הממס eluant יש לשמור סביבה חומצית כאשר eluting, אבל מתונה הרבה יותר מאשר חומצה אצטית 12.0 M, אשר עלול להוביל שיא המסכן מראה להזיק למערכת HPLC.

זיהוי catecholamines, מושווים chromatogram פעמים השמירה של הפסגות הדגימות עם שיאים כל פתרון. איור 2 מציג דוגמאות של chromatograms HPLC-ECD מן הפתרונות השונים. אם הפרוטוקול לאחר בהצלחה, פרופילים כרומטוגרפי של שלושה catecholamines ו מטבוליטים שלהם צריכה להתקבל על ידי HPLC-ECD פסגות סימטרית ברורה, מוגדרת היטב, עם רעש רקע מינימלי, כמופיע ב איור 2 . לשם השוואה עם השיטה המקובלת, מחסנית PBA מסחרי נבחר לפקד. באיור2(–c), חמש פסגות ההרים יעד (b) גבוהים באופן משמעותי thaosein (c), המציין השיטה PFSPE הוא רגיש יותר בשיטת דיו PBA. כמו כן, הפסגה DOPAC לא הראה בתוצאת ההפרדה PBA מחסנית, המציין כי העמודה PBA, לא היה מסוגל להפיק DOPAC. איור 2 (ד) מתאר את chromatogram של דגימת השתן ריקה ללא כל רעלני, וכן איור 2(e) מראה chromatograms של דגימת השתן חילוץ באמצעות PCE-PS nanofibers ללא הפרדות צבע. איור 2 (ו) מראה את chromatograms של דגימת השתן לאחר החילוץ עם העמודה PBA, אשר גם מראה החילוץ DOPAC לא עקביים עם התוצאה איור 2(ג). הדיאגרמה מציין שיטת PFSPE לא רק לחלץ את המטרות עם השפעה טובה, אך גם יכולים להיפטר רוב ההפרעות בשתן, נותנת זיהוי שיא טוב עבור תרכובות היעד.

ניתוח סטטיסטי גילה כי מידות עבור שלושת catecholamines ו מטבוליטים שני היו בצורה אמינה לשכפל (טבלה 1). כל המטרה תרכובות הראה ליניאריות טובה בין 1.5 ו- 100 ננוגרם (R2> 0.99), ניתן למצוא עקומת סטנדרטי של כל analyte Supplementary איור 1. עקומות והערכים2 R מדגימים כי analytes יש ליניאריות טובה היחסות בטווח מסוים ליניארי, מתאים החישוב של ריכוזי analytes בדגימות שתן. הגבולות של זיהוי (לוד) נע בין 0.25 ל 0.54 ng/mL, הגבולות של כימות (LOQ) היו 0.83 כדי 1.81 ננוגרם למ"ל, בהתאמה. הערך (S/N) אות לרעש שווה 3. טווח שחזורי מתודולוגי של תרכובות היעד חמש היה מ- 97.4% (MHPG) ל- 124.2% (DOPAC), אשר היה משביע רצון של היישום כדי הדגימות בפועל. הדיוק היום היה בין 2.7 ל 4.8% (המבוטא סטיית תקן יחסית) והיה הדיוק יום אינטר 2-8.1%, הצגת דיוק טוב, הדיר.

לצורך זיהוי של מטרות בדגימות שתן אמיתי, 28 תינוקות בסיכון ותינוקות בריאים 22 בהחלוקה של טיפול בילדים, סאזהאו בבה ח, גויסו. כל התינוקות 50 נלקחה לתוך המחקר היו בנים. כשהם היו בן שישה חודשים, הם נלקחו בבדיקה שגרתית בריאות בספטמבר 2016. כל הדגימות שתן היו נאספים pretreated השלבים פרוטוקול 3.1 ו- 3.2 ו הדגימות נותחו באמצעות שאר שלב 3. הריכוזים חושבו נגד עקומות כיול. הבדלים סטטיסטיים נותחו על ידי ניתוח השונות (ANOVA). התוצאות ניתן לראות בטבלה מס ' 2. ההבדל catecholamines ו מטבוליטים בין שתי הקבוצות היו יחסית, מנותח. P-ערכים להראות כי catecholamines לא היו שונים באופן משמעותי בין סיכון גבוה לבין קבוצות בריא, בעוד התוכן MHPG מטבוליט היה שונה בין הקבוצות הללו (p = 0.001). קבוצת פעוטות בסיכון גבוה היו כמויות גבוהות יותר של MHPG מאשר קבוצת הביקורת (14.8 ± 3.6 ננוגרם למ"ל לעומת 1.4 ± 0.2 ננוגרם למ"ל), מה שאומר כי רמת MHPG השתן עשוי להיות סמן פוטנציאליות לזיהוי מוקדם של תינוקות בסיכון גבוה.

איור 3 ו לטבלה 3 לתאר את השיטה כימות קלאסי לקביעת מונואמין חומרים, ולהשוות עם שיטות אחרות אשר מקבלים את תהליך הניתוח ודמויות מעניינות. לעומת שיטות קלאסיות, PFSPE שיטה יש יתרונות כמו timespan קצר (5-10 דקות), תהליך הניתוח מפושטת, הממס האורגני פחות ידידותיות הסביבה יותר עם פרמטרים מתודולוגי משביע רצון. Eluant הכמות הדרושה היא נמוכה בכרך (50 µL) ודורש הצעד העשרה היעד אין אידוי, המקדם במידה רבה את הרגישות זיהוי עבור תרכובות היעד בשתן. בהשוואה ל- SPE מבוסס חלקיק קונבנציונאלי, שיטה זו משופרת היעילות תהליך הכנה פשוטה, מצטמצם הזמן של הניתוח אמינות מקובל, סלקטיביות ורגישות.

Figure 1
איור 1 : תרשים זרימה סכמטי של הליך PFSPE הנייר, ייצוג של ההתקן שלו. מזרק (1) Gastight, (2) פיפטה עצה ו (3) Packed nanofibers. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : Chromatograms דוגמאות שונות של. () Spiked דגימת מים עם מטרות, IS ב (100 ng/mL) ללא חילוץ. (b) Spiked מים מדגם מופקים על ידי שיטת PFSPE, (ג) phenylboronic מסחרי חומצה (PBA) מחסנית. לדוגמה (d) שתן ממש ריק ללא חילוץ. (e) שתן אמיתי מדגם מופקים בשיטת PFSPE. (f) שתן אמיתי מדגם שחולצו על ידי מחסנית PBA מסחרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : תרשים זרימה אנליטית של שיטות נחישות. (a, b) דיווח בעבר שיטות החילוץ קלאסי. () חילוץ על ידי אלומינה, (b) על ידי DPBA מורכבים, ו- (ג) בשיטה המוצעת במאמר זה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

משלים איור 1: רגיל עקומות משוואות. העקומות סטנדרטי עבור analytes חמש נבנות על מנת להשתמש המשוואה של הקו לחישוב ריכוז analytes לא ידוע במדגם. NE (), E (b), DA (c), MHPG (ד) ו- (e) DOPAC. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.

משלים איור 2: Boronate האינטראקציה זיקה בין חומצה boronic וקבוצת cis-diol או סמוך לשתי קבוצות הידרוקסיל. תיאור סכמטי של האינטראקציה בין חומצות boronic לבין קבוצות מרובות -הו ל אסטרים מחזורית חמש - או 6-אנחנו שמרנו אותו טופס (A). (B) Cis-diol קבוצה או סמוכים שתי קבוצות הידרוקסיל בעיגולים אדומים מתארים את האתרים העיקריים התגובה analytes חמש ליצירת תרכובת boronic חומצה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.

NE MHPG E הוא DOPAC DA
טווח ליניארי (ng/mL) 1.5-400 1.5-200 1.5-100 1.5-100 1.5-400
ערכי R בריבוע 0.9945 0.995 0.9976 0.9902 0.9954
לוד (ng/mL) 0.323 0.322 0.313 0.657 0.249 0.543
LOQ (ng/mL) 1.076 1.072 1.043 2.191 0.83 1.809
שחזור ± RSD (%)(n=9) 110.7±2.9 97.4±9.1 103.9±5.2 86.5±7.3 124.2±3.1 117.3±5.4
דיוק (RSD %) (n = 9)
היום 4.5 4 2.7 4.8 3.3 4.7
הבין-היום 4.1 8.1 2 6.3 3.2 5.9
NE, נוראדרנלין; MHPG, 3-מתוקסי-4-hydroxyphenylglycol; E, אפינפרין; IS, תקן פנימי; DOPAC, 3, 4-Dihydroxyphenylacetic חומצה; דא, דופמין;

טבלה 1: התוצאות האנליטיות של הפרוטוקול המוצע מצפני שלושה catecholamines ו מטבוליטים שני עם פתרונות סטנדרטיים.

ריכוז (ng מ ל-1) קבוצת הביקורת (22) הפעוט בסיכון גבוה קבוצה (28) ערך P
NE 7.52±1.34 5.56±1.7 0.37
MHPG 1.4±0.2 14.8±3.6 0.001
E 24±15.8 20.9±5.87 0.841
DOPAC 106.36±30.1 72.12±18.07 0.312
DA 55.53±11.9 48.12±20.9 0.76
P < 0.05 * * * מראה הבדל משמעותי בין שתי קבוצות

בטבלה 2: השוואת ריכוזים עבור שלושה catecholamines ו שני מטבוליטים ב שתנים בין תינוקות בריאים לתינוקות בסיכון גבוה- התוצאות נותחו סטטיסטית באמצעות ניתוח השונות (ANOVA) עם רמת מובהקות של p = 0.05 להבדלים בין תכנים MHPG. סטיות תקן ± באמצעים מוצגים.

מדגם מותשת הממס (mL) נפח דגימה (mL) Pretreatment הזמן (דקות) טווח ליניארי לוד שחזור היחסי (%) מתאדים,
redissolve		 שיטה אנליטית
תמיסה # הממס נפח הזמן (דקות) שחזור (%) הממס,
(mL) (mL) לשחזר
שאריות
שתן 0.5 0.05 10 2.0 – 200 ng/mL (NE, E, DA) 0.2-0.5 ng/mL (NE, E, DA) 88.5-94.5 (NE, E, DA) לא HPLC-ECD (חן ואח ', 2016)
שתן 19 0.7 — 47 – 167 µg/L (DA) 166-500 ננומטר (DA) 98.3-101.1 (DA) לא HPLC-UV (Piotr ואח ', 2016)
שתן 1.3 0.01 — 0.5 – 1250 ng/mL (NE, E, DA, מצמצמים, MN) 0.5-2.5 ng/mL (NE, E, DA, מצמצמים, MN) 74.1 – 97.3 (NE, E, DA, מצמצמים, MN) לא LC-MS/MS (Li ואח ', 2016)
פלזמה ושתן 20 0.05 10 0.04-2.5 ng/mL (NE, E, DA) 0.01-0.02 ng/mL (NE, E, DA) 87.0-97.5 (NE, E, DA) לא HPLC-UV (מוחמד ואח ', 2016)
שתן < 0.5 0.1 5 1.5-400 ng/mL (NE, MHPG, E, DOPAC, DA) 0.249-0.543 ng/mL (NE, MHPG, E, DOPAC, DA) 97.4-124.2 (NE, MHPG, E, DOPAC, DA) לא עבודה זו
—, לא מוגדר.
PBA, חומצה Phenylboronic

טבלה 3: השוואה של עבודה זו עם מחקרים על רעלני של מונואמינס או אחרים הקשורים נושאים בשנים האחרונות.

משלים טבלה 1: כלי נגינה פרמטרים זיהוי, כימות של analytes בעיתון על ידי HPLC-ECD. אנא לחץ כאן כדי להוריד את השולחן הזה.

משלים בטבלה 2: הכנה של עיקול רגיל חמש analytes. אנא לחץ כאן כדי להוריד את השולחן הזה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה PFSPE המוצעת במאמר זה עשוי להיות משמעותי ומשמעותי ביחס שלו במהירות, פשטות ונוחות. Adsorbents להשתמש בפרוטוקול הם electrospun nanofibers, אשר גבוה יחסי נפח באיזור פני השטח, לספוח את analytes עם יעילות גבוהה. ההליך רק צריך כמה מיליגרמים של nanofiber, נפח קטן של הממס eluant, אינו דורש שלב אידוי לרכז את analytes. . הנה, הוצגו סקירה מפורטת של פרוטוקול HPLC-ECD מבוסס אשר יאפשרו למשתמשים חדשים ליצור שיטה יעילה לצורך זיהוי, כימות של שלושה catecholamines ו שניים שלהם מטבוליטים (NE, E, דא, MHPG, DOPAC).

העליונות של פרוטוקול זה בעיקר נובע מתוך ארבעת השלבים הקריטיים במהלך ההליכים, כפי שמוצג באיור1: באמצעות PCE-PS nanofibers כדי ללכוד את תרכובות היעד כדי להקטין את הגודל של sorbent עד כמה מיליגרמים, המוביל ספיחה מהיר / desorption, ולא רק צורך נפח קטן של eluting נוזל (1); הוספת DPBA לתוך השתן מורכב עם analytes כדי לשפר את hydrophobicity שלהם (2); שטיפה של nanofibers עם הפתרון המכיל DPBA כדי לשמר את analytes ולהסיר את הזיהומים (3); ואופטימיזציה של מיצוי וניתוח המצב לקבל רגישות טובה, סלקטיביות analytes (4).

עבור שלב (1), המנגנון של ביצועים מעולים של יכולת adsorbent עבור PCE-PS עלול לייחס מגוון גורמים. פולימרים אתר הכתר מסטול ב nanofibers יכולים ליצור מתחם מארח-אורח חוות מולקולות המכילות קבוצות אמין מאת H-חוב, כגון catecholamines נייר זה. בנוסף, Hongyou Hu. et al. , צ'ן Jishun. et al. כמו כן, הציעה כי חומצה boronic יכול להתחבר. עם אטומי חנקן במבנה כימי באמצעות אינטראקציות B-N, השלד הידרופובי יכול לקיים אינטראקציה עם טבעות בנזן וקבוצות אליפטיות אחרות של36,analytes37. כמו כן, במהלך תהליך desorption, קשרי מימן וקשרי הגומלין B-N שבורות בקלות ב- pH נמוך מאוד; לפיכך, eluants עם pH חומצי מתאימים בדרך כלל לחקר עבור desorption. יתר על כן, יש גם כמה אינטראקציות המשניים, לרבות הידרופובי, יוניים, מימן מליטה, אשר יכול להתרחש בין כימיקלים boronic36,נלווים תרכובות37,38. כל האינטראקציות האלה עשויים לתרום ספיחה של analytes את החומרים.

עבור שלב (2), עם העזרה של DPBA נוספת, PCE-PS nanofibers לספוח DPBA-קטכולאמין מתחמי במהירות. . ג'ן ליו et al. הראה כי החומרים זיקה boronate הופיעו כמו המדיה עבור הפרדה סלקטיבית ו הכרה מולקולרית של תרכובות אורגניות, כגון נוקלאוזידים, saccharides, glycans, glycoproteins, וכן הלאה38. Complexation בעיקר מתרחשת מהאינטראקציה זיקה boronate בין חומצה boronic ו- cis-diol קבוצות, או שתי קבוצות הידרוקסיל סמוכים, כדי אסטרים מחזורית אנחנו שמרנו אותו טופס חמש או שש, כפי שמוצג איור משלים 2A. איור משלים 2B מתארת האתרים העיקריים התגובה analytes חמש בעבודה זו למתחם חומצה boronic. כאשר הסביבה להיות חומצי, המתחם חומצה-cis-diol boronic dissociates. האינטראקציה בין חומצה boronic, הקבוצה cis-diol או סמוך לשתי קבוצות הידרוקסיל קיימת בהרחבה יחסית חזק.

עבור שלב (3), המתחם נוצר בין analytes ואת DPBA לעכב אותם על adsorbent בזמן זיהומים אחרים הם לשטוף מעל פני השטח PCE-PS, להשגת ההזמנה הטוב ביותר עבור המטרות. שלב (4), יש כבר דו ח מראה כי ה-pH אופטימלי היה בערך 9.0 לקשר של המתחם, פנמיות, catechol39. עם זאת, חן ואח. חקר ערך pH מיטבי תמורת complexing של קטכולאמין-DPBA, נמצא כי הביצועים ספיחה של nanofibers ללא הפרדות צבע PS-PCE עבור רשויות אישורים האופטימלית בעת שינוי ערך ה-pH היה להיות בין 6.0 7.034,35. ליו. ואח ערבו מבנה החומרים תמיכה עבור תרכובות חומצה boronate, במיוחד עם כליאה המרחבי של חללים הננומטרי נקבוביות, ואת את ליגנדים B-N נוצר במהלך התגובה, יכולה להפחית באופן משמעותי גם איגוד ה-pH ולשפר את איגוד זיקה38. מבנה PCE-PS וכן את מבנה קטכולאמין מצוידים כולם עם - NH-קבוצות. לפיכך, המאפיינים ואת נקבוביות הננומטרי PCE-PS (הנתונים כפי שמוצג בתוצאות נציג), כמו גם B-N ליגנדים נוצר, עשויים לתרום רמת החומציות של איגוד הוריד בפרוטוקול. לפיכך, ערך ה-pH האופטימלי פרוטוקול זה יכול להיות נייטרלי, אשר מאוד מפשט את ההליכים ומונעת מהשפלת analytes.

המגבלות העיקריות של נחישות catcholamine הינם שלהם הריכוזים בדגימות ביולוגיות נמוכים מאוד כי מבנים שלהם אינם יציבים (בקלות מחומצן); יתר על כן, קשה להיפטר הטומאה בתקשורת. לפיכך, לניתוח של קטכולאמין בדגימות ביולוגיות, רעלני, בדרך כלל על ידי מיצוי מוצק-פאזי, יש צורך. שיטת PFSPE המוצעת במאמר זה מסופק ריכוז קדם פשוטה ונוחה עבור analytes הדגימות שתן. אבל, כאשר עושים את הניסוי, חייבים להיות מבוקרים בקפדנות תנאי הניסוי, באמצעים כגון הימנעות לאור החשיפה לינוק הטיפול מראש זמן ככל האפשר.

תחולתה של השיטה הוערך על ידי השימוש כדי לקבוע את ריכוזי catecholamines שלושה מטבוליטים שני בשתן של תינוקות בריאים ותינוקות בסיכון גבוה. היה הבדל משמעותי בין שתי הקבוצות ב- MHPG השתן. כפי שסוכם קודם לכן, הסכום MHPG בגוף האדם בעיקר דווח כמו אינדקס כדי לשקף את הטון עצביים noradrenergic, את פעילות חילוף החומרים קטכולאמין במרכז מערכות העצבים ההיקפית40,41, 42, הוא סמן הפלזמה מועיל/שתן במרכז מטבוליזם NE43. לתינוקות בסיכון גבוה, מגוון גורמים כגון לפציעה hypoxic-איסכמי אנצפלופתיה (HIE) גורם למוח עלבונות טראומה והמוח, שמוביל דרגות שונות של גירעונות התפתחותיות בילדות. נזק מוחי זה בתורו יוביל השחרור של הנוירוטרנסמיטרים (MHPG כלול) לתוך נוזלי הגוף44,45. דווח על ידי וו Maas, יש מתאמים משמעותי בין המוח, CSF, פלזמה, ואת ריכוז השתן של46,MHPG47. המדד של MHPG (חינם + מצומדת) הכולל בשתן זמן שימש כדי להעריך את חילוף החומרים של NE המרכזית ואת חילוף החומרים NE היקפיים בני41,48,49. לכן, הוא עשוי להיות סיכם כי תינוקות בסיכון גבוה יש נזק הטון עצביים noradrenergic לעומת הבריאים, המשפיעים על חילוף החומרים קטכולאמין המרכזי, מערכת העצבים ההיקפית. אי-התאמה זו מציין כי יש לעשות מחקר נוסף על הקשר בין השתן MHPG התפתחותיות וברמת הגירעונות. זה הוכח, כי השיטה המוצעת יכול לשמש לקביעת נוכחות קטכולאמין בשתן, עם לקוח פוטנציאלי מבטיח לשימוש במרפאה להערכת מחלות רלוונטיות נוירוטרנסמיטרים אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים לאשר שיש אין ניגוד אינטרסים עם כל ארגון פיננסי לגבי החומר המוזכרים במאמר זה.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי את הלאומי למדע קרן של סין (No.81172720, לא 81673230), חברתי פיתוח מחקר תוכנית של ג'יאנגסו מחוז מדע טכנולוגיה המחלקה (מס ' BE2016741), מדע & טכנולוגיה פרויקט של סין מינהל כללי של פיקוח איכות, פיקוח, בידוד (2015QK055), תוכנית הפרוייקט הפתוח של המעבדה מפתח של התפתחות הילד ולמידה המדע של משרד החינוך, אוניברסיטת דרום מזרח (CDLS-2016-04). אנו בכנות להכיר יואן השיר לבין ליאו פינג שסייעו לנו אוסף דגימות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 µL pipette tip column to contain nanofibers
PCE-PS nanofibers material for PFSPE extraction
steel rod (about 0.5 mm diameter) fill the nanofibres into the column
gastight plastic syringe (5 ml) compress solution into the end of the tip
methanol Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 67-56-1
diphenylborinic acid 2-aminoethyl ester(DPBA) Sigma-Aldrich.Inc A-106408 complex reagent
norepinephrine(NE) Sigma-Aldrich.Inc A-9512 analyte
3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol(MHPG) Sigma-Aldrich.Inc H1377 analyte
epinephrine(E) Sigma-Aldrich.Inc 100154-200503 analyte
3, 4-Dihydroxyphenylacetic acid(DOPAC) Sigma-Aldrich.Inc D-9128 analyte
dopamine(DA) Sigma-Aldrich.Inc H-8502 analyte
3, 4-dihydroxybenzylamine hydrobromide(DHBA) Sigma-Aldrich.Inc 858781 interior label
acetonitrile Sigma-Aldrich.Inc 75-05-8 eluriant and mobile phase
phosphoric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7664-38-2 eluriant
uric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 69-93-2 artifical urine
creatinine Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 60-27-5 artifical urine
trisodium citrate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 6132-04-3 artifical urine
KCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7447-40-7 artifical urine
NH4Cl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 12125-02-9 artifical urine
NaHCO3 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd SWC0140326 artifical urine
C2Na2O4 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 62-76-0 artifical urine
NaSO4 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7757-82-6 artifical urine
disodium hydrogen phosphate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10039-32-4 artifical urine
urea Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 57-13-6 artifical urine
NaCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7647-14-5 artifical urine
MgSO4.7H2O Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10034-99-8 artifical urine
CaCl2 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10035-04-8 artifical urine
HCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7647-01-0 artifical urine
citric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 77-92-9 artifical urine and mobile phase
EDTA disodium salt Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 34124-14-6 mobile phase
monometallic sodium orthophosphate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7558-80-7 artifical urine and mobile phase
1-heptanesulfonic acid sodium salt Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 22767-50-6 mobile phase
sodium hydroxide Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 1310-73-2 mobile phase
phenylboronic acid column(PBA column) Aglilent 12102018 PBA extraction
Inertsil® ODS-3 5 µm 4.6×150 mm column Dikma 5020-06731 HPLC column for seperation
SHIMADZU SIL-20AC prominence AUTO SAMPLER Shimadzu Corporation, Japan SIL-20AC auto injection for eluriant
SHIMADZU LC-20AD High Performance Liquid Chromatography Shimadzu Corporation, Japan LC-20AD HPLC pump
SHIMADZU L-ECD-60A electrochemical detector Shimadzu Corporation, Japan L-ECD-60A detector for the analytes
ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry System Micromeritics, USA surface and porosity analyzer 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elhwuegi, A. S. Central monoamines and their role in major depression. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 28, 435-451 (2004).
  2. Da, C. F., Ngoabdalla, S., Houzel, J. C., Rehen, S. K. Murine model for Parkinsons disease: From 6-OH dopamine lesion to behavioral test. J. Vis. Exp. (35), e1376 (2010).
  3. Varley, H., Gowenlock, A. H. The clinical chemistry of monoamines. Brit. Med. J. 2, 1330 (1963).
  4. Wang, X., Rousset, C. I., Hagberg, H., Mallard, C. Lipopolysaccharide-induced inflammation and perinatal brain injury. Semin. Fetal. Neonatal. Med. 11, 343-353 (2006).
  5. Inder, T. E., Volpe, J. J. Mechanisms of perinatal brain injury. Semin. Neonatol. 5, 3-16 (2000).
  6. Miller, S. P., Ferriero, D. M. From selective vulnerability to connectivity: Insights from newborn brain imaging. Trends. Neurosci. 32, 496-505 (2009).
  7. Barkovich, A. J., et al. Proton MR spectroscopy for the evaluation of brain injury in asphyxiated, term neonates. Am. J. Neuroradiol. 20, 1399-1405 (1999).
  8. Liauw, L., van Wezel-Meijler, G., Veen, S., van Buchem, M. A., van der Grond, J. Do apparent diffusion coefficient measurements predict outcome in children with neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy? Am. J. Neuroradiol. 30, 264-270 (2009).
  9. Varsami, M., et al. Inflammation and oxidative stress biomarkers in neonatal brain hypoxia and prediction of adverse neurological outcome: A review. J. Pediatr. Neonat. Individual. Med. 2, e020203 (2013).
  10. Cooper, R. L., Walker, R. F. Microradioenzymic assays for the measurement of catecholamines and serotonin. Methods. Enzymol. 103, 483-493 (1983).
  11. Murphy, J. F. The development of enzyme linked immunosorbent assays (ELISA) for the catecholamines adrenaline and noradrenaline. J. Immunol. Methods. 154, 89-98 (1992).
  12. Jones, S. R., Mickelson, G. E., Collins, L. B., Kawagoe, K. T., Wightman, R. M. Interference by pH and Ca2+ ions during measurements of catecholamine release in slices of rat amygdala with fast-scan cyclic voltammetry. J. Neurosci. Methods. 52, 1-10 (1994).
  13. Sanchismallols, J. M., Villanuevacamañas, R. M., Ramisramos, G. Determination of unconjugated catecholamine in urine as dopamine by thermal lens spectrometry. Analyst. 117, 1367-1371 (1992).
  14. Lan, C., Liu, W. Determination of catecholamines by HPLC-ECD in urine. Medical Laboratory Science and Clinics. , (2007).
  15. Tsunoda, M., Aoyama, C., Ota, S., Tamura, T., Funatsu, T. Extraction of catecholamines from urine using a monolithic silica disk-packed spin column and high-performance liquid chromatography-electrochemical detection. Anal. Methods. 3, 582-585 (2011).
  16. Bartolini, B., et al. Determination of monoamine oxidase activity by HPLC with fluorimetric detection. Neurobiology (Bp). 7, 109-121 (1999).
  17. Dunand, M., Gubian, D., Stauffer, M., Abid, K., Grouzmann, E. High throughput and sensitive quantitation of plasma catecholamines by ultraperformance liquid chromatography tandem mass spectrometryusing a solid phase microwell extraction plate. Anal. Chem. 85, 3539-3544 (2013).
  18. He, H., Carballo-Jane, E., Tong, X., Cohen, L. H. Measurement of catecholamines in rat and mini-pig plasma and urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry coupled with solid phase extraction. J. Chromatogr. B. 997, 154-161 (2015).
  19. Simon, N., Young, P. How to increase serotonin in the human brain without drugs. J. Psychiatry. Neurosci. 32, 394-399 (2007).
  20. Grossi, G., et al. Improvements in automated analysis of catecholamine and related metabolites in biological samples by column-switching high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 541, 273-284 (1991).
  21. Iwamot, T., Yoshiura, M., Iriyama, K. Liquid chromatographic identification of urinary catecholamine metabolites adsorbed on alumina. J. Liq. Chromatogr. R. T. 10, 1217-1235 (1987).
  22. Maycock, P. F., Frayn, K. N. Use of alumina columns to prepare plasma samples for liquid-chromatographic determination of catecholamines. Clin. Chem. 33, 286-287 (1987).
  23. Grossi, G., Bargossi, A., Lippi, A., Battistoni, R. A fully automated catecholamines analyzer based on cartridge extraction and HPLC separation. Chromatographia. 24, 842-846 (1987).
  24. Rondelli, I., et al. New method for the resolution of the enantiomers of 5,6-dihydroxy-2-methyl-aminotetralin by selective derivatization and HPLC analysis: Application to biological fluids. Chirality. 8, 381-389 (1996).
  25. Kumar, A., Hart, J. P., McCalley, D. V. Determination of catecholamines in urine using hydrophilic interaction chromatography with electrochemical detection. J. Chromatogr. A. 1218, 3854-3861 (2011).
  26. Sabbioni, C., et al. Simultaneous liquid chromatographic analysis of catecholamines and 4-hydroxy-3-methoxyphenylethylene glycol in human plasma: Comparison of amperometric and coulometric detection. J. Chromatogr. A. 1032, 65-71 (2004).
  27. Lee, M., et al. Selective solid-phase extraction of catecholamines by the chemically modified polymeric adsorbents with crown ether. J. Chromatogr. A. 1160, 340-344 (2007).
  28. He, H., et al. Facile synthesis of a boronate affinity sorbent from mesoporous nanomagnetic polyhedral oligomeric silsesquioxanes composite and its application for enrichment of catecholamines in human urine. Anal. Chim. Acta. 944, 1-13 (2016).
  29. Subbiah, T., Bhat, G. S., Tock, R. W., Parameswaran, S., Ramkumar, S. S. Electrospinning of nanofibers. J. Appl. Polym. Sci. 96, 557-569 (2005).
  30. Hu, W. Y., et al. Packed-fiber solid-phase extraction coupled with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry for determination of diethylstilbestrol, hexestrol, and diedestrol residues in milk. J. Chromatogr. B. 957, 7-13 (2014).
  31. Liu, Z., Kang, X., Fang, F. Solid phase extraction with electrospun nanofibers for determination of retinol and α-tocopherol in plasma. Microchim. Acta. 168, 59-64 (2010).
  32. Qi, D., Kang, X., Chen, L., Zhang, Y., Wei, H., Gu, Z. Electrospun polymer nanofibers as a solid-phase extraction sorbent for the determination of trace pollutants in environmental water. Anal. Bioanal. Chem. 390, 929-938 (2008).
  33. Kang, X. J., Chen, L. Q., Zhang, Y. Y., Liu, Y. W., Gu, Z. Z. Performance of electrospun nanofibers for SPE of drugs from aqueous solutions. J. Sep. Sci. 31, 3272-3278 (2008).
  34. Chen, L. Q., Wang, Y., Qu, J. S., Deng, J. J., Kang, X. J. Selective extraction of catecholamines by packed fiber solid-phase using composite nanofibers composing of polymeric crown ether with polystyrene. Biomed. Chromatogr. 29, 103-109 (2015).
  35. Chen, L. Q., Zhu, X. H., Shen, J., Zhang, W. Q. Selective solid-phase extraction of catecholamines from plasma using nanofibers doped with crown ether and their quantitation by HPLC with electrochemical detection. Anal. Bioanal. Chem. 408, 4987-4994 (2016).
  36. Hu, H., Zhang, Y., Zhang, Y., Huang, X., Yuan, D. Preparation of a new sorbent based on boronate affinity monolith and evaluation of its extraction performance for nitrogen-containing pollutants. J. Chromatogr. A. 1342, 8-15 (2014).
  37. Chen, J., et al. Sensitive determination of four camptothecins bysolid-phase microextraction-HPLC based on a boronic acid contained polymer monolithic layer. Anal. Chim. Acta. 879, 41-47 (2015).
  38. Li, D., Chen, Y., Liu, Z. Boronate affinity materials for separation and molecular recognition: structure, properties and applications. Chem. Soc. Rev. 44, 8097-8123 (2015).
  39. Yan, J., Springsteen, G., Deeter, S., Wang, B. The relationship among pKa, pH, and binding constants in the interactions between boronic acids and diols: It is not as simple as it appears. Tetrahedron. 60, 11205-11209 (2004).
  40. Reuster, T., Rilke, O., Oehler, J. High correlation between salivary MHPG and CSF MHPG. Psychopharmacology. 162, 415-418 (2002).
  41. Beckmann, H., Goodwin, F. K. Urinary MHPG in subgroups of depressed patients and normal controls. Neuropsychobiology. 6, 91-100 (1980).
  42. Mitoma, M., et al. Stress at work alters serum brain-derived neurotrophic factor (BDNF) levels and plasma 3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) levels in healthy volunteers: BDNF and MHPG as possible biological markers of mental stress? Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 32, 679-685 (2008).
  43. Ressler, K. J., Nemeroff, C. B. Role of Norepinephrine in the Pathophysiology and Treatment of Mood Disorders. Biol. Psychiatry. 46, 1219-1233 (1999).
  44. Alonso-Spilsbury, M., et al. Perinatal asphyxia pathophysiology in pig and human: A review. Anim. Reprod. Sci. 90, 1-30 (2005).
  45. Shalak, L., Perlman, J. M. Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant: Current concepts. Early. Hum. Dev. 80, 125-141 (2004).
  46. Maas, J. W., Leckman, J. F. relationships between central nervous system noradrenergic function and plasma and urinary MHPG and other norepinephrine metabolites. MHPG: Basic Mechanisms and Psychopathology. , Academic Press. 33-43 (1983).
  47. Maas, J. W. Relationships between central nervous system noradrenergic function and plasma and urinary concentrations of norepinephrine metabolites. Adv. Biochem. Psychopharmacol. 39, 45-55 (1984).
  48. Peyrin, L., Pequignot, J. M., Chauplannaz, G., Laurent, B., Aimard, G. Sulfate and glucuronide conjugates of 3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) in urine of depressed patients: Central and peripheral influences. J. Neural. Transm. 63, 255-269 (1985).
  49. Peyrin, L. Urinary MHPG sulfate as a marker of central norepinephrine metabolism: A commentary. J. Neural. Transm. 80, 51-65 (1990).

Tags

כימיה גיליון 133 Catecholamines כתר פולימריים electrospun nanofiber מיצוי מוצק-שלב סיבי ארוז (PFSPE) כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה עם זיהוי אלקטרוכימי (HPLC-ECD) תינוקות בסיכון גבוה
שיטה נוחה עבור חילוץ וניתוח עם כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה של נוירוטרנסמיטורים קטכולאמין מטבוליטים שלהם
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xie, L., Chen, L., Gu, P., Wei, L.,… More

Xie, L., Chen, L., Gu, P., Wei, L., Kang, X. A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites. J. Vis. Exp. (133), e56445, doi:10.3791/56445 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter