Bevæger sig opad: En enkel og fleksibel In Vitro tredimensionale Invasion Assay protokol
Summary
Denne protokol beskriver en omvendt lodret invasion assay, der kunne bruges til at kvantificere migration og invasion kapaciteter af celler i en tre-dimensionelle indstilling samtidig bevare celle mikromiljø. Denne analyse er egnet for sjældne og/eller følsomme celler.
Abstract
Selv om 3D invasion assays er blevet udviklet, stadig udfordringen for at studere celler uden at påvirke integriteten af deres mikromiljø. Traditionelle 3D-undersøgelser såsom Boyden kammer kræver at celler er fordrevet fra den oprindelige placering, kultur og flyttede til et nyt miljø. Ikke alene er dette sprænges de cellulære processer, der er uløseligt forbundet med mikromiljø, men det resulterer ofte i tab af celler. Disse problemer er særligt udfordrende, når der beskæftiger sig med celler, der enten er sjældne eller yderst følsomme over for deres mikromiljø. Her, beskriver vi udviklingen af et 3D invasion assay, der undgår både bekymringer. I denne analyse, celler er forgyldt inden for et lille godt og en ECM-matrix, der indeholder en chemoattractant er lagt på toppen af cellerne. Dette kræver ingen celle fortrængning, og giver cellerne til at invadere opad i matrixen. I denne analyse, kan celle invasion samt celle morfologi vurderes inden for kollagen gel. Ved hjælp af denne analyse, karakterisere vi den invasive kapacitet af sjældne og følsomme celler; de hybride celler som følge af fusion mellem brystkræftceller MCF7 og mesenchymale/Multipotente celler stamceller/stroma (MSCs).
Introduction
Celle motilitet er en normal udviklingsmæssige og fysiologisk proces af celler. Ændringer i mønsteret og evne til celler til at migrere og invadere er imidlertid forbundet med patologiske betingelser herunder inflammatoriske sygdomme og kræft metastaser1,2,3. Metastaser er velsagtens den mest dårligt forstået aspekt i kræft. For at metastaserer, skal kræftceller nedbrydes de ekstra cellulære matrix (ECM), invadere lokale væv og intravasate. Når i omløb, kræftcellerne vil formidle til webstedet fjernt, extravasate og danner sekundære tumorer. Derfor muligheden af celler til at forringe ECM, overflytte, og at invadere er relateret til deres metastatisk potentiale. Forskellige metoder er blevet udviklet for at analysere og kvantificere funktionerne migration og invasion af celler. De mest anvendte metoder omfatter sårheling assay, time-lapse mikroskopi og Boyden kammer assay. De sår healing assay4 og tid bortfalder mikroskopi er enkel og praktisk assays, der ville give foreløbige indblik i celle migration. Begge er dog 2D assays, der ikke afspejler 3D-miljø, hvor celler findes i vivo. Undersøgelser har vist, at celler reagerer forskelligt på en 3D-miljø, sammenlignet med en 2D en5,6. Desuden, sår healing assays er svært at gengive og give kvantitative resultater7,8,9. Celle udelukkelse Zone-analysen, som er en 3D ændring af sårheling assay, er en mere fysiologisk relevante assay men det er ikke egnet til celler lavt i antal som hybrid celler som følge af celle fusion begivenheder10,11 .
Boyden kammer assay er en 3-dimensionelle analyse, der giver relevante microenvironments for cellular undersøgelser. Det kræver dog celler fjernes fra deres oprindelige mikromiljø og deponeres i det øverste kammer af Boyden assay system til at migrere og invadere nedad mod chemoattractant indeholdende medium. Denne 3D tilgang er ikke egnet til at analysere migration og invasion evnen til celler sårbare over for deres mikromiljø og/eller begrænset i antal10,11,12. En nyere tilgang til at analysere celle migration og invasion er mikrofluid gradient kammer assay13. Selvom egnet og pålideligt i migration og invasion undersøgelser, denne analyse er dyrere og kunne være en teknisk udfordring for en typisk laboratorium. Vi beskriver her en simpel omvendt lodrette invasion assay, der er kompatibel med mange celletyper, herunder celler følsomme over for deres mikromiljø og/eller begrænset i antal. Denne analyse blev tilpasset fra protokollen som Hooper et al. foreslået 14. i denne analyse, cellerne forbliver i deres oprindelige mikromiljø og deres migration og invasion er overvåget, når de bevæger sig opad i kollagen gele indeholdende en chemoattractant11. Denne analyse er reproducerbare og er blevet optimeret og godkendt i 35-mm kultur parabol. Det kunne tilpasses forskellige assay betingelser herunder forskellige celle kultur størrelser, forskellige matricer eller styrke af vedhæftning og forskellige chemoattractants. Denne analyse kunne tjene som en in vitro- platform for indledende screening i drug discovery proces.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her, beskriver vi en simpel omvendt lodrette invasion assay, som er bekvem for en række forskellige celletyper, herunder celler, der er sjældne og/eller afhængige af deres mikromiljø. I denne 3D invasion assay, celler forbliver i deres oprindelige mikromiljø og er omfattet af kollagen gelen indeholder et chemoattractant. Cellerne derefter migrere og invadere i kollagen. I denne analyse, kan cellerne farves og nemt overvåges i gelen. Enkelhed og reproducerbarhedsværdierne af denne analyse gør det et praktisk redsk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIMHD-G12MD007581) gennem RCMI-Center for miljø og sundhed ved Jackson State University og US Department of Defense, idé Award 11-1-0205.
Materials
| MatTek P35G-1.5-10C | MatTek Corporation, Ashland, MA | P35G-1.5-10-C | mattek glass bottom dishes |
| Rat tail collagen I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | Collagen gel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | H1758 | HCl |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 10010023 | PBS |
| 10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | D2429 | 10X DMEM |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | S5761 | NaHCO3 |
| Confocal Fluorescent microscope | Olympus America, Center Valley, PA, USA | Olympus IX81 | Confocal microscope |
| Defined Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA | SH30070.03 | FBS |
| Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope | Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA | 40x NA 0.8 objective | MPLSM |
| Imaris software | Bitplane Inc. Zurich, CH | Imaris 7.5.2 | Imaris software |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | D9542 | DAPI |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 50980487 | PFA |
| α-minimum essential medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | M0894 | |
| MDA-MB-231 | ATCC; Manassas, VA, USA | HBT-22 | |
| MSC | Trivedi and Hematti, 2007 | ||
| 20X lens UPLAPO | Olympus America, Center Valley, PA, USA | 36-064 | Olympus UPLSAPO 20X Objective |
References
- Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matric. Cell Mol Life Sci. 57, 41-64 (2000).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).
- Yarrow, J. C., Perlman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparison of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21 (2004).
- Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160, 267-277 (2003).
- Sahai, E., Marshall, C. J. Differing modes of tumour cell invasion have distinct requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis. Nat Cell Biol. 5, 711-719 (2003).
- Kam, Y., Guess, C., Estrada, L., Weidow, B., Quaranta, V. A novel circular invasion assay mimics in vivo invasive behavior of cancer cell lines and distinguishes single-cell motility in vitro. BMC Cancer. 8, 198 (2008).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90, 195-221 (2009).
- Poujade, M., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 15988-15993 (2007).
- Noubissi, F. K., Harkness, T., Alexander, C. M., Ogle, B. M. Apoptosis-induced cancer cell fusion: a mechanism of breast cancer metastasis. FASEB J. 29, 4036-4045 (2015).
- McArdle, T. J., Ogle, B. M., Noubissi, F. K. An In Vitro Inverted Vertical Invasion Assay to Avoid Manipulation of Rare or Sensitive Cell Types. J Cancer. 7, 2333-2340 (2016).
- Noubissi, F. K., Ogle, B. M. Cancer Cell Fusion: Mechanisms Slowly Unravel. Int J Mol Sci. 17, (2016).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annu Rev Anal Chem. 1, 423-449 (2008).
- Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Methods In Enzymol. 406, 625-643 (2006).
- Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat Materials. 13, 645-652 (2014).
