Summary
Este protocolo describe un ensayo de invasión vertical invertido que podría ser utilizado para cuantificar la capacidad de migración y la invasión de las células en un entorno tridimensional conservando el microambiente celular. Este ensayo es adecuado para las células raras o sensibles.
Abstract
Aunque se han desarrollado ensayos de invasión 3D, el desafío sigue siendo estudiar las células sin afectar la integridad de su microambiente. 3D tradicionales ensayos tales como el compartimiento de Boyden requieren que las células son desplazadas de la ubicación original de la cultura y se trasladó a un nuevo entorno. No sólo hace esto interrumpir los procesos celulares que son intrínsecos al microentorno, pero a menudo resulta en una pérdida de células. Estos problemas son especialmente difíciles cuando se trata de las células que son raros, o extremadamente sensibles a su microambiente. Aquí, describimos el desarrollo de un ensayo de invasión 3D que evita ambos problemas. En este ensayo, las células se platean dentro de un pequeño bien y una matriz del ECM que contiene un chemoattractant se coloca encima de las células. Esto no requiere desplazamiento de la célula y permite a las células invadir hacia arriba en la matriz. En este ensayo, invasión celular y morfología celular puede ser evaluada en el gel de colágeno. Usando este análisis, se caracteriza la capacidad invasiva de las células raras y sensibles; las células híbridas resultantes de la fusión entre las células de cáncer de mama MCF7 y mesenquimales multipotentes/tallo/estroma células (MSCs).
Introduction
La motilidad celular es un proceso fisiológico y de desarrollo normal de las células. Sin embargo, cambios en el patrón y la capacidad de las células para migrar e invadir están asociados a condiciones patológicas como enfermedades inflamatorias y cáncer metástasis1,2,3. La metástasis es posiblemente el aspecto más mal entendido en cáncer. Para metástasis, las células cancerosas deben degradar la matriz extracelular (ECM), invaden el tejido local y intravasate. Una vez en circulación, las células cancerosas se difundir el sitio distante extravasate y formar tumores secundarios. Por lo tanto, la capacidad de las células para degradar el ECM, a migrar y a invadir se relaciona con su potencial metastásico. Han desarrollado diferentes enfoques para analizar y cuantificar las capacidades de migración y la invasión de las células. Los enfoques más utilizados incluyen la cicatrización ensayo, microscopía Time-lapse y el análisis de la cámara de Boyden. La herida curativo ensayo4 y tiempo lapso microscopia son ensayos simples y convenientes que darían visión preliminar de migración de la célula. Sin embargo, ambos son ensayos 2D que reflejan el entorno 3D en el que las células existen en vivo. Los estudios han demostrado que las células responden de manera diferente a un entorno 3D comparado con un 2D5,6. Por otra parte, ensayos curativos de heridas son difíciles de reproducir y producir resultados cuantitativos7,8,9. El análisis de la zona de exclusión de la célula, que es una modificación 3D de ensayo de las heridas, es un ensayo más fisiológico relevante pero no es adecuada para células bajas en número como células híbridas resultantes de celular fusión eventos10,11 .
El análisis de la cámara de Boyden es un ensayo de 3 dimensiones que provee microambientes pertinentes estudios celulares. Sin embargo, necesita extraerse su microentorno original y ser depositado en la cámara alta del sistema de análisis de Boyden para migrar e invadir hacia abajo hacia el medio que contiene chemoattractant. Este enfoque 3D no es apropiado en el análisis de la capacidad de migración y la invasión de células vulnerables a su microambiente o limitada en número de11,10,12. Un enfoque más reciente para analizar la invasión y migración de la célula es la microfluídica cámara gradiente análisis13. Aunque conveniente y fiable en los estudios de migración y la invasión, este análisis son más costoso y pueden ser técnicamente difícil para un laboratorio típico. Describimos aquí un ensayo de invasión vertical invertido simple que es compatible con muchos tipos de células incluyendo las células sensibles a su microambiente o restringidas en número. Este ensayo fue adaptado del protocolo propuesto por Hooper et al. 14. en este ensayo, las células permanecen en su microentorno original y su migración y la invasión se controla mientras se mueven hacia arriba en el gel de colágeno que contiene un chemoattractant11. Este ensayo es reproducible y ha sido optimizado y validado en la placa de cultivo de 35 mm. Podría adaptarse a las condiciones de ensayo diferentes incluyendo tamaños de célula diferente cultura, diferentes matrices o fuerza de adherencia y diferentes atrayentes. Este análisis podrían servir como una plataforma en vitro para la detección inicial en el proceso de descubrimiento de fármacos.
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Protocol
Nota: Este protocolo se describe en McArdle et al. 11. una línea de tiempo se proporciona en la figura 1.
1. preparación de la placa de cultivo
- Lave la placa de cultivo de 35 mm que contiene un fondo de cristal de 10 mm con 1 mL de 1 M de ácido clorhídrico (HCl) durante 15 minutos reducir la hidrofobicidad de la parte inferior de cristal.
- Lave la placa de cultivo dos veces con 1 mL de solución salina buffer fosfato (PBS) para deshacerse de la HCl.
- Lave la placa de cultivo dos veces con 1 mL de etanol al 70%.
- Enjuague la placa de cultivo con 1 mL de medio de cultivo específico celular (aquí uso α-MEM suplementado con 10% de calor inactiva FBS y los de aminoácidos no esenciales 1%).
Nota: La placa de cultivo tratado que contiene el medio de cultivo se puede almacenar en la incubadora de CO2 con un humidificador a 37 ° C hasta el día siguiente. - Crecen las células (MSCs y MCF-7 co de la cultura) en el fondo de cristal tratado de la placa de cultivo de 35mm a 100% de confluencia. Co de la cultura células MSC 35.000 y 75.000 de células MCF7 durante 24 h.
2. preparación del gel de colágeno
- Guarde las puntas de micropipeta utilizadas para pipetear el gel de colágeno en el congelador para evitar la polimerización del colágeno al entrar en contacto.
Nota: Este es el paso más crítico. - Determinar un volumen de colágeno de cola de rata I utilizar basado en la concentración de la población de colágeno. Preparar 100 μl de gel de colágeno para este ensayo.
Nota: Alta concentración de colágeno de la cola de rata que stock funciona mejor. Determinar el volumen de 10 x medio modificado Eagle de Dulbecco para diluir el colágeno por consiguiente. - Combinar en el colágeno de cola de rata de hielo I (acción de 3,8 μg/mL), modificado Eagle de 10 x Dulbecco mediana y 1 x celular medio de cultivo suplementado con 2% de suero bovino fetal y la chemoattractant correspondiente a una concentración final de colágeno de 2.4 mg/mL.
- Añadir a la mezcla 4,5% de solución de bicarbonato de sodio para neutralizar el gel de colágeno.
Nota: El volumen de solución de bicarbonato de sodio añadido puede variar según el pH exacto de los otros reactivos. Es mejor probar la mezcla con tiras de pH para garantizar la solución neutral, o usar un indicador de pH en el medio de cultivo. - Pone 80 μl de la mezcla de colágeno sobre las células en el fondo de cristal de la placa de cultivo.
- Permita que el gel de colágeno polimerizar durante 30 minutos en un incubador de CO2 con un humidificador a 37 ° C.
- Cubrir el gel de colágeno con 2 mL de medio de celular con suero reducido (2%) e incubar a las células a 37 ° C en un incubador de2 CO con un humidificador para 24, 48 o 72 h.
PRECAUCIÓN: La placa debe manejarse con cuidado para evitar que el gel de colágeno extraer desde el fondo de cristal.
3. ejemplo de elaboración de colágeno gel usando un stock de colágeno de cola de rata de 3,8 μg/ml
- Con hielo, combinar 114.5 μl de colágeno de cola de rata, 16.6 μl de 10 x DMEM y 33,1 μl del medio de cultivo que contiene la chemoattractant.
- Neutralizar la mezcla de colágeno con 14.0 μL de bicarbonato de sodio.
- Continuar como en el paso 2.5.
4. la proyección de imagen de las células
- Retire con cuidado los medios de comunicación de la fuente.
- Enjuague suavemente el gel con 1 mL de PBS.
- Fijar las células con 1 mL de paraformaldehído al 4% durante 15 minutos.
- Lavan las células dos veces con 1 mL de PBS.
- Se tiñen las células con solución DAPI (100 ng/mL) durante 20 min a temperatura ambiente.
- Imagen de las células utilizando un microscopio confocal en diferentes lugares y tomando imágenes de z-stack de 400 μm de cada ubicación en 16 pasos de μm. El microscopio utilizado tiene un disco central que permite la proyección de imagen confocal usando una luz blanca, fuente de excitación del arco de la exploración. Utilizar un objetivo de X 20 utilizado con apertura numérica de 0,75.
- Imágenes de reconstituir.
- Abrir imágenes de un gel determinado (alrededor de 25 imágenes) y crear una pila de imagen pulsando en imagen → pila → imágenes para apilar. La primera imagen corresponde a la parte inferior del gel (z = 0 μm), la segunda imagen corresponde al primer paso en la dirección z (z = 16 μm), la tercera imagen corresponde al segundo paso en la dirección z (z = 32 μm). Evaluar cada núcleo en cada profundidad de imagen y designar la profundidad en que el núcleo estaba en el foco más agudo como la profundidad de invasión para ese celular particular.
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Representative Results
Hemos utilizado una placa de cultivo de 35 mm con un vidrio inferior y rata de cola colágeno I a desarrollar y optimizar una invasión en vitro 3D análisis de protocolo. Usando este análisis, hemos demostrado eso mama células cancerosas MCF7 y MSC células podrían invadir en el gel de colágeno a una distancia media de 0.04 μm ± 1.8 y 41,3 ± 76.0 respectivamente después de 48 h cuando IGF1 (18,6 ng/mL) fue utilizado como chemoattractant (figura 2). Más importante aún, demostramos que productos de la fusión de células MCF7 y MSC, que son las células raras, podrían invadir en el gel de colágeno también. Su distancia media de invasión en 48 h fue 10,7 ± 12,4 μm cuando IGF 18,6 ng/ml estaba acostumbrado como chemoattractant (figura 2). La diferencia en la capacidad de invasión MCF7 MSCs fue estadísticamente significativa (P < 0,01)11. La diferencia entre la capacidad de invasión de los productos de la fusión y la de MCF7 o MCS no fue estadísticamente significativa. Sin embargo, este ensayo demostró constantemente que los productos de fusión de células de cáncer tenían una mayor capacidad migratoria e invasor de las células de cáncer parental, MCF7.
Las células saludables a lo largo de los experimentos como se muestra por su morfología y cantidad 48 h post gel de polimerización (figura 3a). Con el diseño del ensayo de invasión vertical invertida, la cinética de la migración celular y la invasión puede ser analizado (figura 3b, 4) y la morfología celular puede ser evaluado (figura 4).
Figura 1 : Línea de tiempo del diseño del ensayo de invasión vertical invertido Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Capacidad de invasión de productos de fusión de células de cáncer. La capacidad de invasión de productos de fusión de células de cáncer se podría determinar mediante el ensayo de invasión vertical invertida. Los números representan la capacidad de invasión media de cuatro productos independientes de tres culturas Co independientes y sus líneas de la célula parental analizados desde ocho diferentes campos dentro de cada ensayo. Este experimento se realizó por triplicado. ANOVA con prueba post-hoc de HSD de Tukey. ** P < 0.01. Barras de error representan la desviación estándar (SD). Esta figura ha sido adaptada de 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Célula de viabilidad y serie Z del ensayo de invasión vertical invertido.
un) 20 X imágenes de campo claro mostrando la morfología de las células bajo el gel de colágeno después de dos días. De izquierda a derecha MCF7 MSC co-cultivo, MCF7 y MSC; b) representación de la serie z mostrando dos ubicaciones (i y ii) dentro de un plato de la parte inferior hasta la parte superior. Imágenes sucesivas son aparte 16 μm. 3.8% FBS fue utilizado como un chemoattractant. Verde círculos en ambos paneles indican células invasoras; Nota, fuera de foco en la parte inferior del gel y en foco en el gel superior, invadiendo en el gel. Círculos rojos en ambos paneles indican las células en la capa inferior de la serie z (no invade las células). Barra de escala (a): 15 μm; Escala de la barra (b): 10 μm. Esta figura ha sido adaptada de 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Célula de morfología en el ensayo de invasión vertical invertido. Morfología de MSCs en el gel de colágeno en un lugar de la parte inferior (Z = 0 μm) a Z = 20 μm. 3.8% FBS fue utilizado como un chemoattractant. La flecha larga indica el apéndice de una invasión de MSC en el gel. La punta de flecha indica un MSC, que se alinea a lo largo de la parte inferior del gel y no invasor. El azul muestra la tinción DAPI nuclear mientras que el rojo muestra los filamentos de actina phalloidin manchado. Esta figura ha sido adaptada de 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí, describimos un ensayo de invasión vertical invertido simple que es conveniente para una variedad de tipos de células incluyendo las células que son raros o dependiente en su microambiente. En este ensayo de invasión 3D, las células permanecen en su microentorno original y están cubiertas por el gel de colágeno que contiene un chemoattractant. Las células entonces migraran e invaden en el colágeno. En este ensayo, las células pueden ser manchadas y fácilmente monitoreadas en el gel. La simplicidad y reproducibilidad de este ensayo es una herramienta conveniente para estudiar la migración de la célula de cáncer y la invasión en un sistema 3D. Sin embargo, fuertes atrayentes parecen obligados a romper la afinidad de la célula en la parte inferior de la placa de cultivo.
Hemos optimizado el ensayo de invasión vertical invertida en la placa de cultivo de 35 mm. Este plato de la cultura tiene un fondo de cristal de 10 mm bien que está equipado bien para imágenes. Una limitación de este plato de la cultura es la considerable cantidad de gel de colágeno necesario para realizar un ensayo. Encontrar platos de cultura más pequeño con un diseño compatible con la proyección de imagen sería más económicos. La capa de gel apropiada para el diseño del plato de 35 mm es muy delicada debido a su fuerza y puede separar fácilmente de la parte inferior de la placa si no se maneja cuidadosamente. Un diseño de cultura diferente de la célula puede mejorar la estabilidad de la capa de gel de colágeno pero la compatibilidad entre la viabilidad de fuerza y de la célula del gel de colágeno debe ser optimizada.
A pesar de estas limitaciones, el ensayo de invasión vertical invertida presenta muchas ventajas comparados con otros formatos de ensayo de invasión 3D. La ventaja principal es que las células permanecen en su ambiente original de la cultura, que no es el caso en el análisis de la cámara de Boyden. Este protocolo mantiene el microambiente de la célula que es ventajoso para las células estrictamente controladas por su microambiente como células madre15. Este ensayo también previene el daño celular o pérdida de la célula especialmente para las células que son delicados o raro10,11. Además, con este ensayo, la morfología de la célula y cinética asociada podrían evaluarse dentro del gel, que no es posible con el análisis de la cámara de Boyden. Por otra parte, el policarbonato no fisiológica o polipropileno filtro del sistema de ensayo de cámara de Boyden no se utiliza en el ensayo de invasión vertical invertida. El ensayo de invasión vertical invertida es un diseño estático, no imitan al en vivo ambiente dinámico que ofrece el diseño de ensayo de invasión de microfluidos pero proporciona un más simple, menos rentable y desafiante entorno 3D para cuantificar migración y la invasión de una gran variedad de tipos celulares en un microambiente controlado y conservado.
El ensayo de invasión vertical invertida tiene muchas aplicaciones potenciales en estudios fisiopatológicos. Este enfoque podría servir como una plataforma en vitro para el estudio de la motilidad de la célula durante el desarrollo embrionario, la herida curativo, o las respuestas inflamatorias3. Interacción celular con el ECM y otros tipos celulares durante la migración y la invasión también podía ser investigado mediante este protocolo. Este ensayo también podría representar una herramienta útil para la detección de la droga inicial de medicamentos anti-metastásicos. Un sistema modelo de metástasis de cáncer de órganos específicos podría ser desarrollado usando el ensayo de invasión vertical invertido también.
El ensayo de invasión vertical invertida fue desarrollado para eludir el desafío que presenta el desplazamiento de algunas células de su microentorno original en el sistema de ensayo de cámara de Boyden. Este ensayo es fácil, confiable y reproducible; es flexible y puede utilizarse para cuantificar el potencial invasor de una amplia variedad de tipos celulares, incluyendo los tipos de células sensibles y rara. Este análisis pueden ser aplicado para detectar la actividad migratoria asociada a la degradación de la matriz y también pueden ser adaptado para el estudio de la actividad degradante selectiva sobre sustratos diferentes de la matriz.
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Disclosures
Los autores han declarado que ningún interés competencia existen.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por los institutos nacionales de salud (NIMHD-G12MD007581) a través del RCMI-centro de salud ambiental en la Universidad Estatal de Jackson y el Departamento de defensa, Premio Idea 11-1-0205.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MatTek P35G-1.5-10C | MatTek Corporation, Ashland, MA | P35G-1.5-10-C | mattek glass bottom dishes |
| Rat tail collagen I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | Collagen gel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | H1758 | HCl |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 10010023 | PBS |
| 10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | D2429 | 10X DMEM |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | S5761 | NaHCO3 |
| Confocal Fluorescent microscope | Olympus America, Center Valley, PA, USA | Olympus IX81 | Confocal microscope |
| Defined Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA | SH30070.03 | FBS |
| Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope | Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA | 40x NA 0.8 objective | MPLSM |
| Imaris software | Bitplane Inc. Zurich, CH | Imaris 7.5.2 | Imaris software |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | D9542 | DAPI |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 50980487 | PFA |
| α-minimum essential medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | M0894 | |
| MDA-MB-231 | ATCC; Manassas, VA, USA | HBT-22 | |
| MSC | Trivedi and Hematti, 2007 | ||
| 20X lens UPLAPO | Olympus America, Center Valley, PA, USA | 36-064 | Olympus UPLSAPO 20X Objective |
References
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