Summary
Bu iletişim kuralı hücreleri hücre microenvironment koruma sırasında bir üç boyutlu ortamda göç ve işgal yeteneklerini ölçmek için kullanılabilir bir ters dikey işgali tahlil açıklar. Bu tahlil nadir ve/veya hassas hücreler için uygundur.
Abstract
3D işgali deneyleri geliştirilmiştir rağmen onların microenvironment bütünlüğünü etkilemeden hücreleri çalışmaya meydan kalır. Boyden odası gerektiren hücreleri özgün kültür konumdan yerlerinden ve yeni bir ortama taşınmış gibi geleneksel 3D deneyleri. Sadece bu microenvironment için içsel hücresel süreçler bozmak yok, ama bu kez bir hücre kaybolmasına neden. Bu nadir, ya da onların microenvironment için son derece hassas hücreler ile ilgili özellikle zorlu sorunlardır. Burada, her iki endişelerini önler bir 3D işgali tahlil gelişimi açıklayın. Bu tahlil, hücreler de içinde küçük bir kaplama ve bir chemoattractant içeren bir ECM Matris hücreleri koydu. Bu herhangi bir hücre öteleme gerektirir ve hücreleri matrisin yukarı doğru istila sağlar. Bu tahlil, hücre işgali gibi hücre morfolojisi kollajen jel içinde değerlendirilebilir. Bu tahlil kullanarak, nadir ve hassas hücreler invaziv kapasitesini karakterize; füzyon meme kanseri hücreleri MCF7 ve Mezenkimal/multipotent arasında ortaya çıkan melez hücreleri (MSCs) kök/stroma hücreleri.
Introduction
Hücre hareketliliği hücreleri bir normal gelişim ve fizyolojik süreçtir. Ancak, değişiklikleri desen ve üretilen hücre göç ve istila için inflamatuar hastalıkları ve kanser metastaz1,2,3gibi patolojik koşullarla ilişkilidir. Metastaz tartışmalı Kanserinde en kötü anlaşılır yönüdür. Metastaz için kanser hücrelerinin ekstra hücresel matris (ECM) aşağılamak, yerel doku ve intravasate istila. Bir kez dolaşımda, kanser hücrelerinin uzak siteye yaymak, extravasate ve ikincil tümörler oluşturur. Bu nedenle, yetenek hücreleri ECM aşağılamak için göç ve istila metastatik potansiyellerini ilgilidir. Çözümlemek ve hücrelerin göç ve işgal yeteneklerini ölçmek için farklı yaklaşımlar geliştirilmiştir. En çok kullanılan yaklaşımlar tahlil, hızlandırılmış mikroskobu ve Boyden odası tahlil şifa yara içerir. Yara iyileşme tahlil4 ve zaman atlamalı mikroskobu hücre göç içine ön fikir verecek basit ve kolay deneyleri var. Ancak, her iki hücre içinde vivovar 3D çevre yansıtmıyor 2D deneyleri vardır. Hücreleri farklı bir 2D bir5,-6karşılaştırıldığında 3D ortamına yanıt çalışmalar göstermiştir. Ayrıca, yara iyileştirici deneyleri çoğaltmak ve nicel sonuçları7,8,9verim için zordur. Tahlil şifa yara 3D bir değişiklik olduğunu, hücre dışlama bölgesi tahlil daha fizyolojik ilgili bir tahlil ama hücre içinde sayı hücre füzyon olaylar10,11 kaynaklanan hibrit hücreler gibi düşük için uygun değil .
Boyden odası tahlil için hücresel çalışmalar ilgili microenvironments sağlar 3 boyutlu bir tahlil olduğunu. Ancak, hücrelerin kendi özgün microenvironment kaldırılacak ve geçirmek ve aşağıya doğru chemoattractant içeren orta istila Boyden tahlil sisteminin üst odaya yatırılması için gerekli. Bu 3D yaklaşım onların microenvironment ve/veya sınırlı sayı10,11,12güvenlik açığı bulunan hücrelerin göç ve işgal yeteneği analiz uygun değildir. Hücre göç ve işgal çözümlemek için yeni bir yaklaşım mikrosıvısal degrade odası tahlil13yaşında. Her ne kadar uygun ve güvenilir geçiş ve işgal çalışmaları, bu tahlil daha pahalı ve teknik olarak tipik bir laboratuvar için zor olabilir. Biz burada hücreleri için onların microenvironment duyarlı da dahil olmak üzere birçok hücre tipleri ile uyumlu ve/veya sınırlı sayıda bir basit ters dikey işgali tahlil tanımlamak. Bu tahlil Hooper ve ark. tarafından önerilen iletişim kuralından adapte oldu 14. bu tahlil, hücreleri kendi özgün microenvironment ve onların geçiş kalır ve işgal chemoattractant11içeren kollajen jel içinde yukarı doğru ilerlerken izlenir. Bu tahlil tekrarlanabilir ve yapılmış en iyi duruma getirilmiş ve 35 mm kültür tabakta doğrulanmış. Farklı hücre kültür boyutları, farklı matrisler veya gücü yapışma ve farklı chemoattractants de dahil olmak üzere farklı tahlil şartlarına adapte. Bu tahlil ilaç bulma işleminin başlangıç tarama için bir vitro platform olarak hizmet verebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Bu protokol McArdle vd. anlatılan 11. bir zaman çizelgesi şekil 1' de verilmiştir.
1. kültür plaka hazırlanması
- Bir 10 mm cam alt 1 mL 1 M hidroklorik asit (HCl) ile iyi 15dk için cam alt hydrophobicity alt içeren 35-mm kültür bulaşık yıka.
- Kültür plaka fosfat tampon salin (PBS) tüm HCl kurtulmak için 1 mL ile iki kez yıkayın.
- Kültür plaka 1 mL % 70 etanol ile iki kez yıkayın.
- Hücre belirli kültür orta 1 mL ile kültür plaka durulama (burada, kullanım α-MEM % 10 ısı ile desteklenmiş FBS ve % 1 esansiyel olmayan amino asitler inaktive olur).
Not: Kültür ortamı içeren tedavi kültür plaka CO2 kuluçka 37 ° C'de bir nemlendirici ile ertesi güne kadar saklanabilir. - (MSCs ve MCF-7 ortak kültür) hücreleri tedavi cam-alt içinde de 35 mm kültür çanak % 100 confluency için büyümek. 35.000 MSC hücreleri ve 75.000 MCF7 hücre 24 h için ortak kültür.
2. kollajen jel hazırlanması
- Kollajen temas üzerine polimerizasyon önlemek için kollajen jel dondurucuya pipetting için kullanılan micropipette ipuçları saklayın.
Not: Bu en önemli adımdır. - Bir birim belirlemek sıçan kuyruk kollajen ben kullanılmak üzere kollajen hisse senedi toplama üzerinde tabanlı. Kollajen jel 100 µL bu tahlil için hazırlayın.
Not: Ben stok sıçan kuyruk kollajen yüksek yoğunlukta daha iyi çalışır. 10 x kollajen buna göre sulandırmak için kullanılmak üzere Dulbecco'nın modifiye kartal orta hacmi belirlemek. - Birleştirmek buz sıçan kuyruk kollajen üzerinde ben (3.8 µg/mL hisse senedi), 10 x Dulbecco'nın modifiye kartal orta ve 1 x hücre kültür % 2 fetal sığır serum ve kollajen 2.4 mg/ml nihai bir konsantrasyon için uygun chemoattractant ile takıma orta boy.
- Kollajen jel nötralize etmek için sodyum bikarbonat çözüm karışımı %4,5 ekleyin.
Not: Sodyum bikarbonat çözüm eklendi hacmi diğer reaktifleri tam pH göre değişebilir. Bu karışımı tarafsız çözüm sağlamak veya bir pH göstergesi kültür ortamında kullanmak için pH şeritler ile test etmek en iyisidir. - 80 µL kollajen karışımı cam-alt de kültür çanak içindeki hücreleri üzerinde yatıyordu.
- Kollajen jel 30 dk 37 ° C'de bir nemlendirici ile CO2 kuluçka için polimerize izin
- Kollajen jel hücre orta düşük serum (% 2) ile 2 mL ile kapak ve CO2 kuluçka bir nemlendirici ile 24, 48 veya 72 h 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
Uyarı: Plaka cam alttan ayırma kollajen jel önlemek için itina ile ele alınmalıdır.
3. hazırlık kollajen örneği jel 3.8 µg /mL bir sıçan kuyruk kollajen stokunun kullanarak
- Buz üzerinde birleştirmek 114.5 µL sıçan kuyruk kollajen, 10 DMEM x 16,6 µL ve kültür chemoattractant içeren orta 33.1 µL.
- Kollajen karışımı sodyum bikarbonat 14,0 µL ile etkisiz hale getirin.
- Adım 2,5 olduğu gibi devam edin.
4. hücreleri görüntüleme
- Yavaşça medya çanak çıkarın.
- Yavaşça jel PBS 1 mL ile yıkayın.
- %4 paraformaldehyde 15dk için 1 mL ile hücreleri tamir.
- Hücreleri iki kez PBS 1 mL ile yıkayın.
- DAPI çözüm (100 ng/mL) oda sıcaklığında 20 dk için hücrelerle leke.
- Hücreleri farklı yerlerde confocal bir mikroskop kullanarak ve 400 µm z-yığın görüntüleri her iki yerde de 16 µm adımları alarak görüntü. Kullanılan mikroskop kullanarak bir beyaz ışık, ark uyarma kaynak confocal görüntüleme sağlar birim tarama bir diski var. 0,75 sayısal diyafram ile kullanılan bir 20 X lens kullanabilirsiniz.
- Görüntüleri yeniden oluşturma.
- Görüntüler için verilen jel (yaklaşık 25 resim) açın ve görüntü → yığınları → görüntüler yığmak için tıklatarak görüntü yığını oluşturun. İlk görüntü jel altına denk (z = 0 µm), z yönde ilk adım için ikinci görüntü denk (z = 16 µm), üçüncü resim z yönünde ikinci adımına tekabül (z 32 µm =). Her çekirdek her görüntü derinlikte değerlendirmek ve hangi keskin odak olarak işgal derinliği belirli hücre için çekirdek yapıldı derinliği belirleyebilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz-si olmak kullanılmış bir 35 mm kültür yemek bir cam alt ve sıçan kuyruk kollajen ile ben geliştirmek ve vitro 3D istila en iyi duruma getirmek için tahlil protokolü. Bu tahlil, bu meme kanseri hücreleri MCF7 ve MSC gösterdik kullanarak hücreleri kollajen jel 0,04 ± 1.8 µm ve 41,3 ± 76.0 µm ortalama bir mesafe içine sırasıyla 48 saat sonra işgal ne zaman IGF1 (18,6 ng/mL) chemoattractant (Şekil 2) kullanılmıştır. Daha da önemlisi, füzyon ürünleri nadir hücrelerdir, MSC ve MCF7 hücreleri kollajen jel de istila gösterdi. IGF ı 18.6 ng/mL olarak kullanıldığında onların ortalama mesafe 48 h işgalinin 10,7 ± 12,4 µm oldu chemoattractant (Şekil 2). İstila yeteneği MCF7 ve MSCs arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı (P < 0,01)11. Füzyon ürünleri işgal kapasitesini ve bir MCF7 veya MCSs arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı değildi. Ancak, bu tahlil sürekli olarak kanser hücre füzyon ürünleri ebeveyn kanser hücreleri, MCF7 daha büyük bir göç ve invaziv yeteneği olduğunu göstermiştir.
Hücreleri sağlıklı onların morfolojisi ve miktar 48 saat sonrası jel polimerizasyon tarafından (şekil 3bir) gösterildiği gibi deneyler boyunca kaldı. Ters dikey işgali tahlil tasarımı ile hücre göç ve işgal Kinetik analiz (şekil 3b, 4) olabilir ve hücre morfolojisi olabilir (şekil 4) değerlendirildi.
Resim 1 : Zaman çizelgesi ters dikey işgali tahlil tasarım Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Invasion yetenek kanser hücre füzyon ürünleri. Kanser hücre füzyon ürünleri işgal kapasitesini ters dikey işgali tahlil kullanarak tespit edilemedi. Sayılar dört bağımsız füzyon ürünleri ortalama işgal kapasitesini üç ayrı ortak kültürler ve her tahlil içinde sekiz farklı alanlardan analiz onların ebeveyn hücre satırlarından temsil eder. Bu deneme nüsha gerçekleştirildi. ANOVA'ın Tukey HSD öğleden hoc testi ile. ** P < 0,01. Hata çubukları standart sapma (SD) temsil eder. Bu rakam 11adapte edilmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Hücre canlılığı ve Z serisi ters dikey işgali testin.
bir) kollajen altında hücre morfolojisi gösterilen 20 X parlak alan fotoğraf iki gün sonra jel. Doğru MCF7 ve MSC işbirliği kültürü, MCF7 ve MSC soldan; b) bir çanak alt üst iki konum (ı ve II) gösterilen z serisi gösterimi. Art arda gelen 16 µm ayrı görüntülerdir. % 3.8 FBS bir chemoattractant kullanıldı. Yeşil daire her iki panelleri üzerinde belirtmek istilacı hücreler; Dikkat, alt jel ve jel istila üst jel odakta odak dışı. Her iki paneller üzerine kırmızı daireler z serisi (sigara istila hücreleri) alt katmanında kalan hücreleri gösterir. Ölçek çubuğu (a): 15 µm; Ölçek (b): 10 µm. Bu rakam 11adapte edilmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Hücre morfolojisi ters dikey işgali tahlil. MSCs Morfoloji altındaki bir yerde kollajen jel içinde (Z = 0 µm) için Z = 20 µm. % 3.8 FBS bir chemoattractant kullanıldı. Uzun ok bir MSC jel işgalci apendiks gösterir. Ok ucu alt kısmındaki jel hizalanmış ve değil işgal bir MSC gösterir. Kırmızı lekeli phalloidin aktin filamentleri gösterirken mavi nükleer DAPI leke gösterir. Bu rakam 11adapte edilmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, nadir ve/veya onların microenvironment bağımlı olan hücreleri de dahil olmak üzere hücre türü için uygun olan bir basit ters dikey işgali tahlil açıklayın. Bu 3D işgali tahlil hücreler içinde onların orijinal microenvironment kalır ve bir chemoattractant içeren kollajen jel tarafından karşılanmaktadır. Hücreler göç ve kollajen istila. Bu tahlil, hücreler lekeli ve kolayca jel içinde izlenir. Basitlik ve tekrarlanabilirlik Bu testin bir 3D sisteminde kanser hücre göç ve işgali için uygun bir araç yapar. Ancak, güçlü chemoattractants hücre benzeşme kültür çanak dibine kırmak için gerekli gibi görünmektedir.
35-mm kültür tabağına ters dikey işgali tahlil en iyi duruma getirilmiş. Bu kültür yemek bir 10 mm cam alt de hangi görüntüleme için de monte vardır. Bir bu kültür yemek kollajen jel bir tahlil gerçekleştirmeye yönelik önemli miktarda kısıtlamasıdır. Bulgu daha küçük kültür yemekleri görüntüleme ile uyumlu bir tasarım ile daha ekonomik olur. 35-mm çanak tasarım için uygun jel katman gücünü nedeniyle çok hassas ve kolayca plaka alttan bağlantısını kesin olmasa bile dikkatle ele. Farklı hücre kültür tasarım kollajen jel katman kararlılığını artırmak ama kollajen jel gücü ve hücre canlılığı arasında uyumluluk optimize edilmelidir.
Bu sınırlamaları rağmen pek çok avantajı diğer 3D işgali tahlil formatlarla karşılaştırma ters dikey işgali tahlil sunar. Hücreleri Boyden odası tahlil içinde durum böyle değil onların özgün kültür ortamında kalmasını ana şeydir. Bu iletişim kuralı sıkı kök hücre15gibi kendi microenvironment tarafından kontrol hücreler için avantajlıdır hücre microenvironment korur. Bu tahlil de hücre hasarı veya hücre kaybı özellikle hassas veya nadir10,11olan hücreler için engeller. Buna ek olarak, bu tahlil ile hücre morfolojisi ve ilişkili Kinetik Boyden odası tahlil ile mümkün değildir jel içinde tabi. Ayrıca, fizyolojik polikarbonat veya polipropilen filtre Boyden odası tahlil sisteminin ters dikey işgali assay olarak kullanılmaz. Ters dikey işgali tahlil statik bir tasarımdır, mikrosıvısal işgali tahlil tasarım sağlayan vivo içinde dinamik ortamı taklit değil ama daha basit, daha az ölçmek için zorlu ve düşük maliyetli 3D ortamı sağlar göç ve hücre türü içinde korunmuş ve kontrollü microenvironment işgali.
Ters dikey işgali tahlil patofizyolojik çalışmalarda birçok potansiyel uygulamalar vardır. Embriyonik gelişim sırasında hücre hareketliliği çalışmaya bir vitro platform yara gibi şifa ve/veya inflamatuar yanıt3bu yaklaşım hizmet verebilir. ECM ve diğer hücre tipleri ile hücre etkileşim geçiş ve işgali sırasında da bu iletişim kuralını kullanan soruşturma. Bu tahlil de ilk ilaç Anti-metastatik uyuşturucu testi ile taranması için yararlı bir araç temsil edebilir. Organ özgü kanser metastaz bir modeli sistem ters dikey işgali tahlil de kullanarak geliştirilebilir.
Ters dikey işgali tahlil Boyden odası tahlil sistem içinde onların orijinal microenvironment bazı hücrelerden çıkarılması sunar meydan aşmak için geliştirilmiştir. Bu tahlil kolay, güvenilir ve tekrarlanabilir değildir; esnek ve duyarlı ve nadir hücre tipleri dahil olmak üzere hücre türleri çok çeşitli invaziv potansiyelini ölçmek için kullanılabilir. Bu tahlil matris bozulması ile ilişkili göçmen bir etkinlik tespit için uygulanabilir ve aynı zamanda farklı matris yüzeylerde seçici aşağılayıcı faaliyete çalışmaya adapte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip hiç ilgi var olduğunu ilan etti.
Acknowledgments
Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından (NIMHD-G12MD007581) Jackson Devlet Üniversitesi ve savunma, fikir Ödülü 11-1-0205 ABD Bakanlığı çevre sağlığı için RCMI merkezinden destek verdi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MatTek P35G-1.5-10C | MatTek Corporation, Ashland, MA | P35G-1.5-10-C | mattek glass bottom dishes |
| Rat tail collagen I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | Collagen gel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | H1758 | HCl |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 10010023 | PBS |
| 10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | D2429 | 10X DMEM |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | S5761 | NaHCO3 |
| Confocal Fluorescent microscope | Olympus America, Center Valley, PA, USA | Olympus IX81 | Confocal microscope |
| Defined Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA | SH30070.03 | FBS |
| Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope | Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA | 40x NA 0.8 objective | MPLSM |
| Imaris software | Bitplane Inc. Zurich, CH | Imaris 7.5.2 | Imaris software |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | D9542 | DAPI |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 50980487 | PFA |
| α-minimum essential medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | M0894 | |
| MDA-MB-231 | ATCC; Manassas, VA, USA | HBT-22 | |
| MSC | Trivedi and Hematti, 2007 | ||
| 20X lens UPLAPO | Olympus America, Center Valley, PA, USA | 36-064 | Olympus UPLSAPO 20X Objective |
References
- Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matric. Cell Mol Life Sci. 57, 41-64 (2000).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).
- Yarrow, J. C., Perlman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparison of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21 (2004).
- Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160, 267-277 (2003).
- Sahai, E., Marshall, C. J. Differing modes of tumour cell invasion have distinct requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis. Nat Cell Biol. 5, 711-719 (2003).
- Kam, Y., Guess, C., Estrada, L., Weidow, B., Quaranta, V. A novel circular invasion assay mimics in vivo invasive behavior of cancer cell lines and distinguishes single-cell motility in vitro. BMC Cancer. 8, 198 (2008).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90, 195-221 (2009).
- Poujade, M., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 15988-15993 (2007).
- Noubissi, F. K., Harkness, T., Alexander, C. M., Ogle, B. M. Apoptosis-induced cancer cell fusion: a mechanism of breast cancer metastasis. FASEB J. 29, 4036-4045 (2015).
- McArdle, T. J., Ogle, B. M., Noubissi, F. K. An In Vitro Inverted Vertical Invasion Assay to Avoid Manipulation of Rare or Sensitive Cell Types. J Cancer. 7, 2333-2340 (2016).
- Noubissi, F. K., Ogle, B. M. Cancer Cell Fusion: Mechanisms Slowly Unravel. Int J Mol Sci. 17, (2016).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annu Rev Anal Chem. 1, 423-449 (2008).
- Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Methods In Enzymol. 406, 625-643 (2006).
- Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat Materials. 13, 645-652 (2014).
