Перемещение вверх: Простая и гибкая в Vitro трехмерной вторжения протокол Assay
Summary
Этот протокол описывает пробирного Перевернутый вертикальных вторжения, которые могут использоваться для количественного определения миграции и вторжения возможности клеток в трехмерное обстановке при сохранении микроокружения клеток. Этот assay подходит для редких и/или чувствительных клеток.
Abstract
Хотя были разработаны 3D вторжения анализов, задача по-прежнему изучать клетки без ущерба целостности их микроокружения. Традиционные 3D assays, такие как Бойден камеры требуют что клетки являются перемещенными лицами из исходного местоположения культуры и переехал в новую среду. Не только делает это нарушить клеточные процессы, которые являются неотъемлемыми для микроокружения, но это часто приводит к потере клеток. Эти проблемы особенно сложным, при работе с ячейками, которые являются редкими, либо чрезвычайно чувствительны к их микроокружения. Здесь мы описывают развитие assay 3D вторжения, который избегает обеих проблем. В этот assay клетки покрыты в рамках небольшой хорошо и ECM матрицы, содержащие хемотаксического укладывается поверх клетки. Это требует перемещения не ячейки и позволяет клеткам вверх вторгнуться в матрицу. В этот assay клетки вторжения, а также морфология клеток может быть оценена внутри гель коллагена. С помощью этого анализа, мы характеризуют инвазивного потенциала редких и чувствительных клеток; гибридных клеток результате сплавливание между клетками рака молочной железы MCF7 и мезенхимальных/Multipotent с стволовых/стромы клеток (Майкрософт) (MSCs).
Introduction
Подвижности клеток это нормальный процесс развития и физиологических клеток. Однако изменения в структуре и способность клеток к миграции и вторгнуться связаны с патологических состояний, включая воспалительных заболеваний и рака метастазы1,2,3. Метастазирование является вероятно наиболее плохо понимали аспектом в рак. Метастазировать, раковые клетки должны ухудшить дополнительных клеточных матриц (ECM), вторгнуться местные ткани и intravasate. Однажды в обращении раковые клетки будет распространять на дальних сайт, extravasate и формируют вторичные опухоли. Таким образом, способность клеток к разложению ECM, мигрировать и вторгнуться связано с их метастатическим потенциалом. Были разработаны различные подходы для анализа и количественной оценки миграции и вторжения возможности клеток. Наиболее часто используемые подходы включают ранозаживляющее пробирного, покадровой микроскопии и Бойден Пробирной палаты. Рану исцеления пробирного4 и время перерыва микроскопии являются простой и удобный анализов, которые дали бы предварительное представление о миграции клеток. Однако оба являются 2D анализов, которые не отражают 3D окружающей среды, в которой клетки существуют в естественных условиях. Исследования показали, что клетки реагируют по-разному в 3D среде, по сравнению с 2D5,6. Кроме того трудно воспроизвести и давать количественные результаты7,8,9анализов заживления раны. Assay клетки запретной зоны, который является 3D модификация ранозаживляющее пробирного, является более физиологически соответствующим методом, но это не подходит для ячеек низкого числа таких гибридных клеток результате клетки фьюжн события10,11 .
Пробирная палата Бойден является 3-мерной assay, который предоставляет соответствующие микросреды для сотовых исследования. Однако он требует клетки быть удалены от их первоначального микроокружения и зачислены на верхней палаты Бойден пробирного системы для миграции и вторгнуться вниз к хемотаксического содержащие среднего. Этот 3D подход не подходит для анализа миграции и вторжения способность клеток подвержены их микроокружения и/или ограниченные в число11,10,12. Новые подход для анализа миграции клеток и вторжение является microfluidic градиента палате пробирного13. Хотя подходящих и надежных исследований в миграции и вторжения, этот assay является более дорогостоящим и может быть технически сложных для типичной лаборатории. Мы опишем здесь простой Перевернутый вертикальных вторжения assay, который совместим со многими типами клеток, включая клетки, чувствительные к их микроокружения и/или ограниченного числа. Этот assay был адаптирован от протокола, предложенный Hooper et al. 14. в этот assay клетки остаются в их оригинальной микроокружения и их миграции и вторжения контролируется как они перемещаются вверх в гель коллагена, содержащий хемотаксического11. Этот assay воспроизводимость и был оптимизирован и проверены в 35-мм культуры блюдо. Это могут быть адаптированы к условиям различных пробирного, включая различные клетки культуры размеров, различные матрицы или прочность адгезии и различные chemoattractants. Этот assay может служить в качестве платформы в пробирке для первоначальной проверки в процессе обнаружения наркотиков.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем пробирного простой Перевернутый вертикальных вторжения, который удобен для различных типов клеток, включая клетки, которые являются редкими и/или зависит от их микроокружения. В этой 3D вторжения assay клетки остаются в их оригинальной микроокружения и покрыты гель кол…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана национальных институтов здравоохранения (NIMHD-G12MD007581) через RCMI-центр для санитарного состояния окружающей среды в Джексон государственного университета и министерства обороны, идея премии 11-1-0205 США.
Materials
| MatTek P35G-1.5-10C | MatTek Corporation, Ashland, MA | P35G-1.5-10-C | mattek glass bottom dishes |
| Rat tail collagen I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | Collagen gel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | H1758 | HCl |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 10010023 | PBS |
| 10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | D2429 | 10X DMEM |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | S5761 | NaHCO3 |
| Confocal Fluorescent microscope | Olympus America, Center Valley, PA, USA | Olympus IX81 | Confocal microscope |
| Defined Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA | SH30070.03 | FBS |
| Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope | Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA | 40x NA 0.8 objective | MPLSM |
| Imaris software | Bitplane Inc. Zurich, CH | Imaris 7.5.2 | Imaris software |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | D9542 | DAPI |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 50980487 | PFA |
| α-minimum essential medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | M0894 | |
| MDA-MB-231 | ATCC; Manassas, VA, USA | HBT-22 | |
| MSC | Trivedi and Hematti, 2007 | ||
| 20X lens UPLAPO | Olympus America, Center Valley, PA, USA | 36-064 | Olympus UPLSAPO 20X Objective |
References
- Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matric. Cell Mol Life Sci. 57, 41-64 (2000).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).
- Yarrow, J. C., Perlman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparison of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21 (2004).
- Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160, 267-277 (2003).
- Sahai, E., Marshall, C. J. Differing modes of tumour cell invasion have distinct requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis. Nat Cell Biol. 5, 711-719 (2003).
- Kam, Y., Guess, C., Estrada, L., Weidow, B., Quaranta, V. A novel circular invasion assay mimics in vivo invasive behavior of cancer cell lines and distinguishes single-cell motility in vitro. BMC Cancer. 8, 198 (2008).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90, 195-221 (2009).
- Poujade, M., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 15988-15993 (2007).
- Noubissi, F. K., Harkness, T., Alexander, C. M., Ogle, B. M. Apoptosis-induced cancer cell fusion: a mechanism of breast cancer metastasis. FASEB J. 29, 4036-4045 (2015).
- McArdle, T. J., Ogle, B. M., Noubissi, F. K. An In Vitro Inverted Vertical Invasion Assay to Avoid Manipulation of Rare or Sensitive Cell Types. J Cancer. 7, 2333-2340 (2016).
- Noubissi, F. K., Ogle, B. M. Cancer Cell Fusion: Mechanisms Slowly Unravel. Int J Mol Sci. 17, (2016).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annu Rev Anal Chem. 1, 423-449 (2008).
- Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Methods In Enzymol. 406, 625-643 (2006).
- Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat Materials. 13, 645-652 (2014).
