위쪽으로 이동: 간단 하 고 유연한 생체 외에서 3 차원 침공 분석 실험 프로토콜
Summary
이 프로토콜 셀 셀 microenvironment를 유지 하면서 3 차원 설정의 마이그레이션 및 침입 기능을 계량 하는 데 사용할 수 있는 반전된 세로 침공 분석 결과를 설명 합니다. 이 분석 결과 희소 한 또는 민감한 세포에 적합 합니다.
Abstract
3D 침입 분석을 개발 하 고, 그들의 microenvironment의 무결성을 영향을 주지 않고 세포를 연구 하는 도전 남아 있다. 전통적인 3D Boyden 챔버 필요한 셀은 원래 문화 위치에서 전치 하 고 새로운 환경에 이동와 같은 분석 실험. 뿐만 아니라이 microenvironment, 내부는 세포질 과정을 방해 하지만 그것은 종종 세포의 손실에 결과. 이러한 문제는 드문, 또는 그들의 microenvironment에 매우 민감한 세포와 거래 할 때 특히 도전. 여기, 우리 둘 다 문제를 방지 하는 3 차원 침공 분석 결과의 개발을 설명 합니다. 이 분석 결과에서 세포는 잘 작은 내 도금 고는 ECM 매트릭스는 chemoattractant를 포함 하는 셀 위에. 이 없는 셀 변위를 요구 하 고 행렬에 위쪽으로 침략을 셀 수 있습니다. 이 분석 결과에서 셀 침공으로 세포 형태 콜라겐 젤 내 평가 될 수 있습니다. 이 분석 결과 사용 하 여, 우리는 희귀 하 고 민감한 세포;의 침략 적 용량 특징 유방암 세포 MCF7 고 엽/multipotent 사이의 융합에서 발생 하는 하이브리드 세포 줄기/기질 세포 (MSCs).
Introduction
세포 운동 성 세포의 정상적인 발달 및 생리 적 과정 이다. 그러나, 변화 패턴 및를 침공 하는 세포의 능력에 염증 성 질환 및 암 전이1,2,3를 포함 하 여 병 적인 상태와 연결 됩니다. 전이 암에 가장 저조한 이해 측면. 전이, 암 세포 해야 합니다 여분의 세포 매트릭스 (ECM)을 저하를 현지 조직 및 intravasate를 침략. 혈액 순환, 암 세포는 먼 사이트에 유포 됩니다, 일단 extravasate 하 고 2 차 종양을 형성 한다. 따라서, 능력 저하는 ECM 셀, 마이그레이션, 침략 하 고 관련이 그들의 전이성 잠재력. 다른 방법은 분석 하 고 세포의 이동과 침략 기능 척도 개발 되었습니다. 가장 많이 사용 되는 접근 분석 결과, 시간 경과 현미경 검사 법, 그리고 Boyden 챔버 분석 결과 치유 하는 상처를 포함 한다. 상처 치유 분석 결과4 와 시간 경과 현미경 검사 법은 간단 하 고 편리한 분석 셀 마이그레이션에 예비 통찰력을 줄 것 이라고. 그러나, 둘 다는 세포 생체 내에존재 하는 3D 환경을 반영 하지 않는 2D 분석 실험입니다. 연구 결과 세포 2D 한5,6에 비해 3D 환경에 다르게 반응으로 나타났습니다. 또한, 상처 치유 분석 실험은 재현 하 고 양적 결과7,,89를 어렵습니다. 셀 제외 영역 분석 결과, 분석 결과 치유 하는 상처의 3D 수정 이면 더 순수 관련 분석 결과 이지만 하이브리드 셀 셀 퓨전 이벤트10,11 인 등 수에 낮은 셀에 적합 하지 않습니다. .
Boyden 챔버 분석 결과 세포 연구에 대 한 관련 microenvironments를 제공 하는 3 차원 분석 결과가 이다. 그러나, 그것은 그들의 원래 microenvironment에서 제거 하 고 예금 Boyden 분석 결과 시스템 마이그레이션 및 chemoattractant 포함 매체를 향해 아래쪽으로 침략의 위 상공으로 셀 필요 합니다. 이 3D 접근 취약 그들의 microenvironment 또는 제한 번호10,,1112셀의 마이그레이션 및 침략 기능 분석에 적합 하지 않다. 셀 마이그레이션 및 침략을 분석 하는 새로운 접근은 미세 그라데이션 챔버 시험13. 적합 하 고 마이그레이션 및 침략에 신뢰할 수 있는, 비록이 분석 결과 더 비싼 이며 전형적인 실험실에 대 한 기술적으로 어려울 수 있습니다. 여기 그들의 microenvironment에 민감한 세포를 포함 한 많은 세포 종류와 호환은 숫자에 제한 된 간단한 반전된 세로 침공 분석 결과 설명 합니다. 이 분석 결과 후 퍼 그 외 여러분 에 의해 제안 된 프로토콜에서 적응 시켰다 14.이 분석 결과에서 셀 그들의 원래 microenvironment 및 그들의 이동에 남아 있고 chemoattractant11를 포함 하는 콜라겐 젤에서 위쪽으로 이동 침입 모니터링. 이 분석 결과 재현성 및 최적화 되었으며 35 m m 문화 접시에. 그것은 다른 세포 문화 크기, 다른 행렬 또는 접착, 및 다른 chemoattractants의 강도 포함 하 여 다른 시험 조건에 적응 시킬 수 있었다. 이 분석 결과 약 발견 과정에서 초기 심사를 위한 생체 외에서 플랫폼으로 될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기, 희귀 및 그들의 microenvironment에 의존 하는 셀을 포함 하 여 세포 유형의 다양 한 편리한 간단한 반전된 세로 침공 분석 결과 설명 합니다. 이 3D 침공 분석 결과에서 세포는 그들의 원래 microenvironment에 남아 하 고 콜라겐 젤 포함 하는 chemoattractant에 의해 보호 됩니다. 세포 이동 그리고 콜라겐에 침공. 이 분석 결과에서 셀 스테인드 고 쉽게 젤 내 모니터링 될 수 있습니다. 단순 하 고이 분석 결?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품에서 잭슨 주립 대학 및 미국 부서 방어, 아이디어 상 11-1-0205의 환경 건강을 위한 RCMI 센터를 통해 건강의 국가 학회 (NIMHD-G12MD007581)에 의해 지원 되었다.
Materials
| MatTek P35G-1.5-10C | MatTek Corporation, Ashland, MA | P35G-1.5-10-C | mattek glass bottom dishes |
| Rat tail collagen I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | Collagen gel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | H1758 | HCl |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 10010023 | PBS |
| 10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | D2429 | 10X DMEM |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | S5761 | NaHCO3 |
| Confocal Fluorescent microscope | Olympus America, Center Valley, PA, USA | Olympus IX81 | Confocal microscope |
| Defined Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA | SH30070.03 | FBS |
| Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope | Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA | 40x NA 0.8 objective | MPLSM |
| Imaris software | Bitplane Inc. Zurich, CH | Imaris 7.5.2 | Imaris software |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | D9542 | DAPI |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 50980487 | PFA |
| α-minimum essential medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | M0894 | |
| MDA-MB-231 | ATCC; Manassas, VA, USA | HBT-22 | |
| MSC | Trivedi and Hematti, 2007 | ||
| 20X lens UPLAPO | Olympus America, Center Valley, PA, USA | 36-064 | Olympus UPLSAPO 20X Objective |
References
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