Déplacement vers le haut : Un Simple et Flexible In Vitro Invasion en trois dimensions Assay protocole
Summary
Ce protocole décrit une analyse inversée invasion verticale qui pourrait être utilisée pour quantifier les capacités de migration et invasion des cellules dans un décor en trois dimensions tout en préservant le microenvironnement cellulaire. Ce dosage est adapté aux cellules rares et/ou sensibles.
Abstract
Bien que les analyses d’invasion 3D ont été développés, le défi demeure pour étudier les cellules sans affecter l’intégrité de leur microenvironnement. Des analyses de 3D traditionnelles telles que la chambre de Boyden exigent que les cellules sont déplacées de l’emplacement original de la culture et déplacés à un nouvel environnement. Non seulement cela perturbe les processus cellulaires qui sont intrinsèques au microenvironnement, mais il se traduit souvent par une perte de cellules. Ces problèmes sont particulièrement difficiles lorsqu’il s’agit des cellules qui sont soit rares, soit extrêmement sensible de leur microenvironnement. Nous décrivons ici le développement d’un test 3D invasion qui évite les deux préoccupations. Dans ce test, les cellules sont bien plaquées au sein d’un petit et une matrice de ECM contenant un facteur chimiotactique est dressée au sommet des cellules. Cela ne nécessite aucun déplacement de la cellule et permet aux cellules d’envahir le haut dans la matrice. Dans cet essai, invasion des cellules ainsi que la morphologie des cellules peut être évaluée dans le gel de collagène. À l’aide de ce test, nous caractérisons les capacités invasives des cellules rares et sensibles ; les cellules hybrides résultant de la fusion entre les cellules de cancer du sein MCF7 et mésenchymateuses/multipotentes tige/stroma cells (MSCs).
Introduction
Motilité cellulaire est un processus normal de développement et physiologique des cellules. Cependant, des changements dans le modèle et la capacité des cellules de migrer et d’envahir sont associées à certaines pathologies incluant les maladies inflammatoires et métastases de cancer1,2,3. Métastase est sans doute l’aspect le plus mal compris dans le cancer. Pour métastases, les cellules cancéreuses doivent dégrader la matrice extracellulaire (ECM), envahissent le tissu local et intravasate. Une fois en circulation, les cellules cancéreuses diffusera sur le site distant, extravasate et forment des tumeurs secondaires. Par conséquent, la capacité des cellules à dégrader l’ECM, à migrer et à envahir sont lié à leur potentiel métastatique. Différentes approches ont été développées pour analyser et quantifier les capacités de migration et d’invasion des cellules. Les approches les plus utilisées incluent la cicatrisation de dosage, Time-lapse microscopie et le dosage de chambre de Boyden. La plaie guérison dosage4 temps déchéance microscopie et sont simples et pratiques des dosages qui donneraient un aperçu préliminaire de la migration cellulaire. Cependant, les deux sont les tests 2D qui ne reflètent pas l’environnement 3D dans lequel les cellules existent en vivo. Des études ont montré que les cellules réagissent différemment à un environnement en 3D par rapport à une 2D5,6. De plus, essais guérison de la plaie sont difficiles à reproduire et à produire des résultats quantitatifs7,8,9. L’analyse de la Zone d’Exclusion de cellule, qui est une modification 3D du dosage de la cicatrisation, est un dosage plus physiologiquement pertinent, mais il n’est pas adapté pour les piles faibles en nombre comme les cellules hybrides résultant de cellule fusion événements10,11 .
Le dosage de chambre de Boyden est un dosage 3-dimensional prévoyant des micro-environnements pertinentes études cellulaires. Cependant, elle nécessite des cellules à déposer dans la chambre supérieure du système de dosage Boyden de migrer et d’envahir le bas vers le milieu contenant du facteur chimiotactique et être retirés de leur microenvironnement original. Cette approche 3D n’est pas appropriée dans l’analyse de la capacité de migration et invasion des cellules, susceptibles de leur microenvironnement et/ou limitée en numéro10,11,12. Une nouvelle approche pour analyser l’invasion et la migration cellulaire est la microfluidique chambre dégradé dosage13. Bien qu’adapté et fiable dans les études de migration et d’invasion, ce dosage est plus cher et pourrait être techniquement difficile pour un laboratoire typique. Nous décrivons ici un essai simple invasion verticale inversée qui est compatible avec plusieurs types de cellules dont les cellules sensibles à leur microenvironnement et/ou restreints en nombre. Ce test est une adaptation du protocole proposé par Hooper et al. 14. dans ce test, les cellules demeurent dans leur migration et leur microenvironnement original et invasion est surveillée comme ils se déplacent vers le haut dans le gel de collagène contenant un facteur chimiotactique11. Ce dosage est reproductible et a été optimisé et validé dans la boîte de Petri de 35 mm. Il pourrait être adapté aux conditions de dosage différents y compris les tailles de culture de cellules différentes, différentes matrices ou force d’adhérence et chimioattractants différents. Ce test pourrait constituer une plateforme in vitro pour la présélection dans le processus de découverte de médicaments.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici un essai simple invasion verticale inversée qui est commode pour divers types de cellules dont les cellules qui sont rares et dépendent de leur microenvironnement. Dans ce test 3D invasion, les cellules restent dans leur microenvironnement original et sont couverts par le gel de collagène contenant un facteur chimiotactique. Ensuite, les cellules migrent et envahissent dans le collagène. Dans ce test, les cellules peuvent être teintés et facilement surveiller le gel. La simplicité et la reprodu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (NIMHD-G12MD007581) par l’intermédiaire de la Royal Canadian Military Institute-Centre hygiène Jackson State University et l’US Department of Defense, Idea Award 11-1-0205.
Materials
| MatTek P35G-1.5-10C | MatTek Corporation, Ashland, MA | P35G-1.5-10-C | mattek glass bottom dishes |
| Rat tail collagen I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | Collagen gel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | H1758 | HCl |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 10010023 | PBS |
| 10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | D2429 | 10X DMEM |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | S5761 | NaHCO3 |
| Confocal Fluorescent microscope | Olympus America, Center Valley, PA, USA | Olympus IX81 | Confocal microscope |
| Defined Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA | SH30070.03 | FBS |
| Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope | Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA | 40x NA 0.8 objective | MPLSM |
| Imaris software | Bitplane Inc. Zurich, CH | Imaris 7.5.2 | Imaris software |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | D9542 | DAPI |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 50980487 | PFA |
| α-minimum essential medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | M0894 | |
| MDA-MB-231 | ATCC; Manassas, VA, USA | HBT-22 | |
| MSC | Trivedi and Hematti, 2007 | ||
| 20X lens UPLAPO | Olympus America, Center Valley, PA, USA | 36-064 | Olympus UPLSAPO 20X Objective |
References
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