Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Flytte oppover: En enkel og fleksibel In Vitro tredimensjonale invasjonen analysen protokoll

Published: March 12, 2018 doi: 10.3791/56568
Automatic Translation
1, 1,2,3,4,5, 6
1Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota - Twin Cities, 2Stem Cell Institute, University of Minnesota - Twin Cities, 3Masonic Cancer Center, University of Minnesota - Twin Cities, 4Lillehei Heart Institute, University of Minnesota - Twin Cities, 5Institute for Engineering in Medicine, University of Minnesota - Twin Cities, 6Department of Biology, Jackson State University

Summary

Denne protokollen beskriver invertert loddrett invasjonen analysen som kan brukes å kvantifisere migrasjon og invasjonen egenskapene til celler i tredimensjonale omgivelser samtidig bevare celle microenvironment. Denne analysen er egnet for sjeldne og/eller sensitive celler.

Abstract

Selv om 3D invasjonen analyser er utviklet, gjenstår utfordringen for å studere celler uten å påvirke integriteten til deres microenvironment. Tradisjonelle 3D søk som Boyden kammeret krever at cellene er fordrevet fra den opprinnelige kultur plasseringen og flyttet til et nytt miljø. Ikke bare gjør dette forstyrre de cellulære prosessene som er innebygd i microenvironment, men det resulterer ofte i et tap av celler. Disse problemene er spesielt utfordrende når du arbeider med celler som er sjeldne, eller svært følsomme for deres microenvironment. Her beskrive vi utviklingen av en 3D invasjonen analysen som unngår både bekymringer. I denne analysen, celler er belagt i en liten godt og en ECM matrise som inneholder en chemoattractant legges oppå cellene. Dette krever ingen celle forskyvning og lar cellene å invadere oppover i matrisen. I denne analysen, kan celle invasjonen samt celle morfologi vurderes i kollagen gel. Bruker denne analysen, karakterisere vi invasiv kapasiteten til sjeldne og følsom celler. hybrid cellene som følge av fusjonen mellom brystkreft celler MCF7 og mesenchymal/multipotent celler stammen/stroma (MSCs).

Introduction

Cellen motilitet er en normal utviklingsmessige og fysiologisk prosess av celler. Endringer i mønsteret og evnen til cellene å migrere og invadere er imidlertid forbundet med pathological betingelser inkludert inflammatoriske sykdommer og kreft metastasering1,2,3. Metastasering er uten tvil den mest dårlig forstått aspekten i kreft. For å metastase, må kreftceller redusere ekstra mobil matrix (EFM), invadere lokale vev og intravasate. Når i omløp, vil kreftceller spre til fjerne området, extravasate og danne sekundære svulster. Derfor muligheten av celler å nedverdige ECM, overføre og å invadere er knyttet til deres metastatisk potensial. Ulike tilnærminger har blitt utviklet for å analysere og kvantifisere migrasjon og invasjonen evnene av celler. De mest brukte tilnærmingene inkluderer sårheling analysen, time-lapse mikroskopi og Boyden kammeret analysen. De sår helbredelse analysen4 og tid forfalle mikroskopi er enkelt og bekvemt analyser som ville gi foreløpig innsikt i celle migrasjon. Men er begge 2D analyser som ikke reflekterer 3D-miljøet der celler finnes i vivo. Studier har vist at cellene reagerer forskjellig på et 3D-miljø i forhold til en 2D en5,6. Videre er sår helbredelse analyser vanskelig å gjengi og kvantitative resultater7,8,9. Cellen sonen analysen, som er en 3D endring av såret healing analysen, er en mer fysiologisk relevante analysen, men det passer ikke for cellene lav i for eksempel hybrid celler fra cellen smelting hendelser10,11 .

Boyden kammeret analysen er en 3-dimensjonal analyse som gir relevant microenvironments for mobilnettet studier. Det krever imidlertid celler fjernes fra deres opprinnelige microenvironment og settes inn i det øvre kammeret av Boyden analysen systemet å migrere og invadere nedover mot chemoattractant som inneholder mediet. Denne 3D tilnærmingen passer ikke i å analysere migrasjon og invasjonen evnen til cellene sårbare for sine microenvironment og/eller begrenset i antall10,11,12. En nyere tilnærming til å analysere celle migrasjon og invasjonen er den microfluidic gradient kammer analyse13. Selv om passende og pålitelig i migrasjon og invasjonen studier, denne analysen er dyrere og kunne være teknisk utfordrende for et typisk laboratorium. Her beskriver vi en enkel invertert loddrett invasjonen analysen som er kompatibel med mange celletyper, inkludert celler som er følsomme for deres microenvironment og/eller begrenset i antall. Denne analysen var tilpasset fra protokollen foreslått av Hooper et al. 14. i denne analysen, cellene forbli i sine opprinnelige microenvironment og migrering og invasjonen overvåkes når de flytter oppover i kollagen gel inneholder en chemoattractant11. Denne analysen er reproduserbare og er optimalisert og godkjent i 35 mm kultur parabolen. Det kan tilpasses forskjellige analysen betingelser inkludert ulike celle kultur størrelser, ulike matriser eller styrke vedheft og ulike chemoattractants. Denne analysen kan tjene som en i vitro plattform for første screening i stoffet funnet prosess.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: Denne protokollen er beskrevet i McArdle et al. 11. en tidslinje finnes i figur 1.

1. utarbeidelse av kultur plate

  1. Vask 35 mm kultur parabol med en 10 mm glass bunn med 1 mL 1 M saltsyre (HCl) i 15 min å senke hydrophobicity glass-Bottom.
  2. Vask kultur plate to ganger med 1 mL av fosfat buffer saltvann (PBS) å kvitte seg med alle HCl.
  3. Vask kultur plate to ganger med 1 mL av 70% etanol.
  4. Skyll kultur plate med 1 mL av cellen bestemt kultur medium (her, bruk α-MEM supplert med 10% varme inaktivert FBS og 1% ikke-essensielle aminosyrer).
    Merk: Behandlet kultur plate inneholder kultur medium kan lagres i CO2 inkubator med en luftfukter på 37 ° C før neste dag.
  5. Vokse cellene (MSCs og MCF-7 co kultur) behandlet glass-nederst vel 35mm kultur parabol til 100% confluency. Co kultur 35.000 MSC celler og 75 000 av MCF7 celler i 24 timer.

2. forberedelse av kollagen gel

  1. Lagre brønnene tips brukt for pipettering kollagen gel i fryseren for å hindre polymerisasjon av kollagen ved kontakt.
    Merk: Dette er det viktigste trinnet.
  2. Bestemme et volum av rotte hale kollagen brukes basert på konsentrasjonen av kollagen aksjen. Forberede 100 µL av kollagen gel for denne analysen.
    Merk: Høy konsentrasjon av rotte hale kollagen jeg lager fungerer bedre. Bestem volumet av 10 x Dulbeccos endret Eagle's Medium å fortynne kollagen tilsvarende.
  3. Kombinere på isen rotte hale kollagen jeg (3,8 µg/mL stock), 10 x Dulbecco endret Eagle's Medium og 1 x celle kultur medium med 2% fosterets bovin serum og den aktuelle chemoattractant til en siste konsentrasjon av kollagen 2,4 mg/ml.
  4. Legg til blandingen 4,5% av natrium bikarbonat løsning å nøytralisere kollagen gel.
    Merk: Volumet av natrium bikarbonat løsning lagt kan variere basert på nøyaktig pH i andre reagenser. Det er best å teste blandingen med pH-strips sikre nøytral løsning, eller bruke en pH-indikator i kultur medium.
  5. Lå 80 µL av kollagen blandingen over cellene i glass-nederst også kultur parabolen.
  6. Tillate kollagen gel til danner i 30 min i en CO2 inkubator med en luftfukter på 37 ° C.
  7. Dekker kollagen gel med 2 mL celle medium med redusert serum (2%) og ruge cellene på 37 ° C i en CO2 inkubator med en luftfukter for 24, 48 og 72 h.
    Forsiktig: Platen bør håndteres med forsiktighet for å hindre at kollagen gel frakobling fra glass bunnen.

3. eksempel på utarbeidelsen av kollagen gel med en rotte hale kollagen lager av 3,8 µg /mL

  1. Is, kombinere 114.5 µL av rotte hale kollagen, 16,6 µL av 10 x DMEM, og 33.1 µL av kultur medium som inneholder chemoattractant.
  2. Nøytralisere kollagen blandingen med 14.0 µL av natrium bikarbonat.
  3. Fortsett som i trinn 2.5.

4. imaging cellene

  1. Forsiktig fjerne mediene fra parabolen.
  2. Forsiktig rense gel med 1 mL av PBS.
  3. Fastsette cellene med 1 mL av 4% paraformaldehyde i 15 min.
  4. Vask cellene to ganger med 1 mL av PBS.
  5. Stain cellene med DAPI løsning (100 ng/mL) for 20 min ved romtemperatur.
  6. Bilde cellene ved hjelp av en AC confocal mikroskop på forskjellige steder og tar 400 µm z-stakk bilder av hver plassering i 16 µm-trinn. Mikroskopet brukes har en disk skanning enhet som gir AC confocal bildevisning et hvitt lys, arc excitation kilde. Bruk en 20 X linsen benyttes med numerisk blenderåpning på 0,75.
  7. Rekonstituer bilder.
    1. Åpne bilder for en gitt gel (ca. 25 bilder) og opprette en bildestakk ved å klikke bilde → stabler → bilder å stable. Det første bildet korresponderte til bunnen av gel (z = 0 µm), det andre bildet tilsvarte det første trinnet i z-retningen (z = 16 µm), det tredje bildet tilsvarte det andre trinnet i z-retningen (z = 32 µm). Vurdere hver kjerne i hver bildedybde og angi dybden som kjernen var i skarpeste fokus som invasjonen dybden for denne bestemte cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har brukt en 35 mm kultur parabol med et glass bunn og rotte hale kollagen jeg å utvikle og optimalisere en i vitro 3D invasjon analysen protokollen. Bruke denne analysen, vi viste at bryst kreftceller MCF7 og MSC celler kan invadere i kollagen gel til en gjennomsnittsavstand 0.04 ± 1.8 µm og 41.3 ± 76.0 µm henholdsvis etter 48 h når IGF1 (18.6 ng/mL) ble brukt som chemoattractant (figur 2). Enda viktigere, viste vi at fusion produkter fra MSC og MCF7 celler, som er sjeldne celler, kan invadere i kollagen gel også. Deres gjennomsnittlige avstanden invasjon i 48 timer var 10.7 ± 12.4 µm når IGF jeg 18.6 ng/mL ble brukt som chemoattractant (figur 2). Forskjellen i invasjonen evnen MCF7 og MSCs var statistisk signifikant (P < 0,01)11. Forskjellen mellom invasjonen evnen til fusion produktene og en av MCF7 eller MCSs var ikke statistisk signifikant. Men viste denne analysen konsekvent at kreft cellen smelting produkter hadde en større vandrende og invasive evne enn foreldre kreftcellene, MCF7.

Celler forble sunn gjennom eksperimenter som vist av deres morfologi og antall 48t innlegget gel polymerisasjon (Figur 3et). Med invertert loddrett invasjonen analysen design, the kinetics av celle migrasjon og invasjonen kan være analysert (Figur 3b, 4) og celle morfologi kan være vurdert (Figur 4).

Figure 1
Figur 1 : Tidslinje av invertert loddrett invasjonen analysen design Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.  

Figure 2
Figur 2 : Invasjonen evnen til kreft cellen smelting produkter. Invasjonen kapasiteten til kreft cellen smelting produkter kan fastslå bruker invertert loddrett invasjonen analysen. Tallene representerer gjennomsnittlig invasjonen kapasiteten til fire uavhengige fusion produkter fra tre separate co kulturer og deres foreldre cellelinjer analysert fra åtte forskjellige felt i hver analysen. Dette eksperimentet ble gjennomført i tre eksemplarer. VARIANSANALYSE med Tukeys "HSD" post hoc test. ** P < 0,01. Feilfelt representerer standardavviket (SD). Dette tallet er tilpasset fra 11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Levedyktighet og Z serie invertert loddrett invasjonen analysen.
a) 20 X lyse feltet bilder viser morfologi av celler under kollagen gel etter to dager. Fra venstre til høyre MCF7 MSC co, MCF7 og kultur, MSC; b) representasjon av z-serien viser to steder (i og ii) i en rett fra bunnen til toppen. Etterfølgende bilder er 16 µm fra hverandre. 3.8% FBS ble brukt som en chemoattractant. Grønne sirkler på både panelene angi invadere celler. note, ut i bunnen av gel og i fokus i topp gel, invaderer i gel. Røde sirkler på begge paneler angi celler resterende på det nederste laget av z-serien (ikke invadere celler). Skala bar (a): 15 µm; Skalere bar (b): 10 µm. Dette tallet er tilpasset fra 11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Celle morfologi i invertert loddrett invasjonen analysen. Morfologi av MSCs i kollagen gel på ett sted fra bunnen (Z = 0 µm) til Z = 20 µm. 3.8% FBS ble brukt som en chemoattractant. Lang pilen viser appendage av en MSC invaderende i gel. Pilspissen angir en MSC, som er justert langs bunnen av gel, og ikke invadere. Blå viser kjernefysiske DAPI flekken mens røde viser phalloidin farget begrepsordbok filamenter. Dette tallet er tilpasset fra 11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi en enkel invertert loddrett invasjonen analysen som er gunstig for ulike celletyper inkludert celler som er sjeldne og/eller avhengig av deres microenvironment. I denne 3D invasjonen analysen, celler forblir i deres opprinnelige microenvironment og dekkes av kollagen gel inneholder en chemoattractant. Cellene deretter overføre og invadere i kollagen. I denne analysen, kan cellene være farget og lett overvåkes i gel. Enkelhet og reproduserbarhet av denne analysen gjør det til et praktisk verktøy for å studere kreft celle migrasjon og invasjon i et 3D-system. Imidlertid synes sterk chemoattractants å være nødvendig å bryte celle affinitet til bunnen av parabolen kultur.

Vi optimalisert invertert loddrett invasjonen analysen i 35 mm kultur parabolen. Smaksprøve kultur har en 10 mm glass bunn tillegg som er godt utstyrt for bildebehandling. En begrensning av Smaksprøve kultur er betydelig beløpet av kollagen gel kreves for å utføre analysen. Finne mindre kultur retter med en design som er kompatibel med bildebehandling ville være mer økonomisk. Gel laget aktuelle for 35 mm parabolen design er veldig delikat på grunn av sin styrke og kan enkelt koble fra bunnen av platen hvis ikke behandlet nøye. En annen celle kultur design kan forbedre stabiliteten av kollagen gel laget men kompatibiliteten mellom kollagen gel styrke og celle levedyktigheten skal optimaliseres.

Til tross for disse begrensningene presenterer invertert loddrett invasjonen analysen mange fordeler sammenlignet med andre 3D invasjonen analysen formater. Hovedfordelen er at cellene forbli i sine opprinnelige kultur miljø, som ikke er tilfelle i Boyden kammeret analysen. Denne protokollen beholder den cellen microenvironment som er fordelaktig for cellene strengt kontrollert av sine microenvironment som stamceller15. Denne analysen forhindrer også cellen tap eller cellen spesielt for celler som er delikat eller sjeldne10,11. I tillegg med denne analysen, kunne de celle morfologi og tilknyttede kinetics vurderes i gel, som ikke er mulig med Boyden kammeret analysen. Videre brukes non-fysiologiske polykarbonat eller polypropylen filteret av Boyden kammeret analysen ikke i invertert loddrett invasjonen analysen. Invertert loddrett invasjonen analysen er en statisk design, det etterligne ikke i vivo dynamisk miljø som microfluidic invasjon analysen design tilbyr, men det gir en enklere, mindre utfordrende og kostnadseffektiv 3D-miljø å kvantifisere migrasjon og invasjonen av ulike celletyper i en bevart og kontrollert microenvironment.

Invertert loddrett invasjonen analysen har mange bruksmuligheter patofysiologiske studier. Denne tilnærmingen kan tjene som en i vitro plattform å studere celle motilitet i løpet embryoutvikling, sår helbredelse og/eller inflammatorisk svar3. Cellen interaksjon med ECM og andre celletyper under overføring og invasjonen kunne også undersøkes bruker denne protokollen. Denne analysen kan også representere et nyttig verktøy for innledende narkotikarelaterte screening av anti-metastatisk narkotika. Et modellsystem av organ-spesifikke kreft metastasering kunne utvikles med invertert loddrett invasjonen analysen også.

Invertert loddrett invasjonen analysen ble utviklet for å omgå utfordringen som forskyvning av noen celler fra deres opprinnelige microenvironment presenterer i Boyden kammeret analysen systemet. Denne analysen er enkel, pålitelig og reproduserbar; Det er fleksibel og kan brukes å kvantifisere invasiv potensialet i en rekke celletyper inkludert følsom og sjeldne celletyper. Denne analysen kan brukes til å oppdage vandrende aktiviteten tilknyttet matrise fornedrelse og kan også tilpasses til å studere selektiv nedverdigende aktiviteten på ulike matrix underlag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har erklært at det finnes ingen konkurrerende interesse.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIMHD-G12MD007581) gjennom RCMI-Center for Environmental Health Jackson State University og US Department of Defense, ideen Award 11-1-0205.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MatTek P35G-1.5-10C MatTek Corporation, Ashland, MA P35G-1.5-10-C mattek glass bottom dishes
Rat tail collagen I Corning, Corning, NY, USA 354236 Collagen gel
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA H1758 HCl
Phosphate buffered saline Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA 10010023 PBS
10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA D2429 10X DMEM
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA S5761 NaHCO3
Confocal Fluorescent microscope Olympus America, Center Valley, PA, USA Olympus IX81 Confocal  microscope
Defined Fetal Bovine Serum GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA SH30070.03 FBS
Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA 40x NA 0.8 objective MPLSM
Imaris software Bitplane Inc. Zurich, CH Imaris 7.5.2 Imaris software
DAPI Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA D9542 DAPI
Paraformaldehyde Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA 50980487 PFA
α-minimum essential medium Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA M0894
MDA-MB-231 ATCC; Manassas, VA, USA HBT-22
MSC Trivedi and Hematti, 2007
20X lens UPLAPO Olympus America, Center Valley, PA, USA 36-064 Olympus UPLSAPO 20X Objective

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matric. Cell Mol Life Sci. 57, 41-64 (2000).
  2. Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
  3. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).
  4. Yarrow, J. C., Perlman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparison of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21 (2004).
  5. Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160, 267-277 (2003).
  6. Sahai, E., Marshall, C. J. Differing modes of tumour cell invasion have distinct requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis. Nat Cell Biol. 5, 711-719 (2003).
  7. Kam, Y., Guess, C., Estrada, L., Weidow, B., Quaranta, V. A novel circular invasion assay mimics in vivo invasive behavior of cancer cell lines and distinguishes single-cell motility in vitro. BMC Cancer. 8, 198 (2008).
  8. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90, 195-221 (2009).
  9. Poujade, M., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 15988-15993 (2007).
  10. Noubissi, F. K., Harkness, T., Alexander, C. M., Ogle, B. M. Apoptosis-induced cancer cell fusion: a mechanism of breast cancer metastasis. FASEB J. 29, 4036-4045 (2015).
  11. McArdle, T. J., Ogle, B. M., Noubissi, F. K. An In Vitro Inverted Vertical Invasion Assay to Avoid Manipulation of Rare or Sensitive Cell Types. J Cancer. 7, 2333-2340 (2016).
  12. Noubissi, F. K., Ogle, B. M. Cancer Cell Fusion: Mechanisms Slowly Unravel. Int J Mol Sci. 17, (2016).
  13. Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annu Rev Anal Chem. 1, 423-449 (2008).
  14. Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Methods In Enzymol. 406, 625-643 (2006).
  15. Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat Materials. 13, 645-652 (2014).

Tags

Kreftforskning problemet 133 invertert invasjon migrasjon tredimensjonale (3D) følsom Microenvironment sjeldne
Flytte oppover: En enkel og fleksibel <em>In Vitro</em> tredimensjonale invasjonen analysen protokoll
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McArdle, T. J., Ogle, B. M.,… More

McArdle, T. J., Ogle, B. M., Noubissi, F. K. Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol. J. Vis. Exp. (133), e56568, doi:10.3791/56568 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter