Flytte oppover: En enkel og fleksibel In Vitro tredimensjonale invasjonen analysen protokoll

Summary

Denne protokollen beskriver invertert loddrett invasjonen analysen som kan brukes å kvantifisere migrasjon og invasjonen egenskapene til celler i tredimensjonale omgivelser samtidig bevare celle microenvironment. Denne analysen er egnet for sjeldne og/eller sensitive celler.

Abstract

Selv om 3D invasjonen analyser er utviklet, gjenstår utfordringen for å studere celler uten å påvirke integriteten til deres microenvironment. Tradisjonelle 3D søk som Boyden kammeret krever at cellene er fordrevet fra den opprinnelige kultur plasseringen og flyttet til et nytt miljø. Ikke bare gjør dette forstyrre de cellulære prosessene som er innebygd i microenvironment, men det resulterer ofte i et tap av celler. Disse problemene er spesielt utfordrende når du arbeider med celler som er sjeldne, eller svært følsomme for deres microenvironment. Her beskrive vi utviklingen av en 3D invasjonen analysen som unngår både bekymringer. I denne analysen, celler er belagt i en liten godt og en ECM matrise som inneholder en chemoattractant legges oppå cellene. Dette krever ingen celle forskyvning og lar cellene å invadere oppover i matrisen. I denne analysen, kan celle invasjonen samt celle morfologi vurderes i kollagen gel. Bruker denne analysen, karakterisere vi invasiv kapasiteten til sjeldne og følsom celler. hybrid cellene som følge av fusjonen mellom brystkreft celler MCF7 og mesenchymal/multipotent celler stammen/stroma (MSCs).

Introduction

Cellen motilitet er en normal utviklingsmessige og fysiologisk prosess av celler. Endringer i mønsteret og evnen til cellene å migrere og invadere er imidlertid forbundet med pathological betingelser inkludert inflammatoriske sykdommer og kreft metastasering^1,2,3. Metastasering er uten tvil den mest dårlig forstått aspekten i kreft. For å metastase, må kreftceller redusere ekstra mobil matrix (EFM), invadere lokale vev og intravasate. Når i omløp, vil kreftceller spre til fjerne området, extravasate og danne sekundære svulster. Derfor muligheten av celler å nedverdige ECM, overføre og å invadere er knyttet til deres metastatisk potensial. Ulike tilnærminger har blitt utviklet for å analysere og kvantifisere migrasjon og invasjonen evnene av celler. De mest brukte tilnærmingene inkluderer sårheling analysen, time-lapse mikroskopi og Boyden kammeret analysen. De sår helbredelse analysen⁴ og tid forfalle mikroskopi er enkelt og bekvemt analyser som ville gi foreløpig innsikt i celle migrasjon. Men er begge 2D analyser som ikke reflekterer 3D-miljøet der celler finnes i vivo. Studier har vist at cellene reagerer forskjellig på et 3D-miljø i forhold til en 2D en^5,6. Videre er sår helbredelse analyser vanskelig å gjengi og kvantitative resultater^7,8,9. Cellen sonen analysen, som er en 3D endring av såret healing analysen, er en mer fysiologisk relevante analysen, men det passer ikke for cellene lav i for eksempel hybrid celler fra cellen smelting hendelser^10,11 .

Boyden kammeret analysen er en 3-dimensjonal analyse som gir relevant microenvironments for mobilnettet studier. Det krever imidlertid celler fjernes fra deres opprinnelige microenvironment og settes inn i det øvre kammeret av Boyden analysen systemet å migrere og invadere nedover mot chemoattractant som inneholder mediet. Denne 3D tilnærmingen passer ikke i å analysere migrasjon og invasjonen evnen til cellene sårbare for sine microenvironment og/eller begrenset i antall^10,11,12. En nyere tilnærming til å analysere celle migrasjon og invasjonen er den microfluidic gradient kammer analyse¹³. Selv om passende og pålitelig i migrasjon og invasjonen studier, denne analysen er dyrere og kunne være teknisk utfordrende for et typisk laboratorium. Her beskriver vi en enkel invertert loddrett invasjonen analysen som er kompatibel med mange celletyper, inkludert celler som er følsomme for deres microenvironment og/eller begrenset i antall. Denne analysen var tilpasset fra protokollen foreslått av Hooper et al. ¹⁴. i denne analysen, cellene forbli i sine opprinnelige microenvironment og migrering og invasjonen overvåkes når de flytter oppover i kollagen gel inneholder en chemoattractant¹¹. Denne analysen er reproduserbare og er optimalisert og godkjent i 35 mm kultur parabolen. Det kan tilpasses forskjellige analysen betingelser inkludert ulike celle kultur størrelser, ulike matriser eller styrke vedheft og ulike chemoattractants. Denne analysen kan tjene som en i vitro plattform for første screening i stoffet funnet prosess.

Protocol

Merk: Denne protokollen er beskrevet i McArdle et al. 11. en tidslinje finnes i figur 1. 1. utarbeidelse av kultur plate Vask 35 mm kultur parabol med en 10 mm glass bunn med 1 mL 1 M saltsyre (HCl) i 15 min å senke hydrophobicity glass-Bottom. Vask kultur plate to ganger med 1 mL av fosfat buffer saltvann (PBS) å kvitte seg med alle HCl. Vask kultur plate to ganger med 1 mL av 70% etanol. …

Representative Results

Vi har brukt en 35 mm kultur parabol med et glass bunn og rotte hale kollagen jeg å utvikle og optimalisere en i vitro 3D invasjon analysen protokollen. Bruke denne analysen, vi viste at bryst kreftceller MCF7 og MSC celler kan invadere i kollagen gel til en gjennomsnittsavstand 0.04 ± 1.8 µm og 41.3 ± 76.0 µm henholdsvis etter 48 h når IGF1 (18.6 ng/mL) ble brukt som chemoattractant (figur 2). Enda viktigere, viste vi at fusion produkter fra M…

Discussion

Her beskriver vi en enkel invertert loddrett invasjonen analysen som er gunstig for ulike celletyper inkludert celler som er sjeldne og/eller avhengig av deres microenvironment. I denne 3D invasjonen analysen, celler forblir i deres opprinnelige microenvironment og dekkes av kollagen gel inneholder en chemoattractant. Cellene deretter overføre og invadere i kollagen. I denne analysen, kan cellene være farget og lett overvåkes i gel. Enkelhet og reproduserbarhet av denne analysen gjør det til et praktisk verktøy for …

Materials

MatTek P35G-1.5-10C	MatTek Corporation, Ashland, MA	P35G-1.5-10-C	mattek glass bottom dishes
Rat tail collagen I	Corning, Corning, NY, USA	354236	Collagen gel
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA	H1758	HCl
Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA	10010023	PBS
10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA	D2429	10X DMEM
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA	S5761	NaHCO3
Confocal Fluorescent microscope	Olympus America, Center Valley, PA, USA	Olympus IX81	Confocal  microscope
Defined Fetal Bovine Serum	GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA	SH30070.03	FBS
Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope	Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA	40x NA 0.8 objective	MPLSM
Imaris software	Bitplane Inc. Zurich, CH	Imaris 7.5.2	Imaris software
DAPI	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA	D9542	DAPI
Paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA	50980487	PFA
α-minimum essential medium	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA	M0894
MDA-MB-231	ATCC; Manassas, VA, USA	HBT-22
MSC	Trivedi and Hematti, 2007
20X lens UPLAPO	Olympus America, Center Valley, PA, USA	36-064	Olympus UPLSAPO 20X Objective