Summary

Flytta uppåt: Ett enkelt och flexibelt In Vitro tredimensionella Invasion Assay protokoll

Published: March 12, 2018
doi:

Summary

Det här protokollet beskriver en inverterad vertikala invasion analysmetod som kunde användas för att kvantifiera migration och invasion funktionerna i celler i en tredimensionell miljö samtidigt bevara den cell mikromiljö. Denna analys är lämplig för sällsynta och/eller känsliga celler.

Abstract

Även om 3D invasionen analyser har utvecklats, återstår utmaningen studera celler utan att påverka integriteten hos deras mikromiljö. Traditionella 3D analyser såsom Boyden kammare kräver att celler är fördrivna från den ursprungliga kultur platsen och flyttade till en ny miljö. Inte bara stör detta cellulära processer som är inneboende i närmiljön, men det resulterar ofta i en förlust av celler. Dessa problem är särskilt utmanande när man arbetar med celler som är sällsynta eller mycket känslig för sin mikromiljö. Här beskriver vi utvecklingen av en 3D invasionen-analysen som undviker både oro. I denna analys, celler är klädd i en liten väl och en ECM matris som innehåller ett korrektiv läggs ovanpå cellerna. Detta kräver ingen förskjutning av cellen, och cellerna att invadera uppåt in i matrisen. I denna analys, kan cell invasion samt cellmorfologi bedömas inom kollagen gelen. Med denna analys, karakterisera vi invasiv kapacitet av sällsynta och känsliga celler; hybrid cellerna resulterar från fusion mellan bröstcancerceller MCF7 och mesenkymala/multipotenta celler stamceller/stroma (MSCs).

Introduction

Cell motilitet är en normal utveckling och fysiologiska process av celler. Förändringar i mönstret och förmågan hos celler att migrera och invadera associeras dock med sjukdomstillstånd inklusive inflammatoriska sjukdomar och cancer metastaser1,2,3. Metastaser är utan tvekan den mest dåligt förstådd aspekten i cancer. För att metastasera, måste cancerceller förnedra extracellulära matrix (ECM), invadera den lokala vävnaden och intravasate. En gång i omlopp, kommer cancercellerna sprida till den avlägsna platsen, extravasate och bilda sekundära tumörer. Därför möjligheten av celler att försämra ECM, att migrera och att invadera är relaterad till deras metastatisk potential. Olika metoder har utvecklats för att analysera och kvantifiera migration och invasion funktionerna i celler. De mest använda metoderna inkluderar de sårläkning assay, time-lapse mikroskopi och Boyden kammare analysen. Såret helande assay4 och time lapse microscopyen är enkel och bekväm analyser som skulle ge preliminära inblick i cellmigration. Båda är dock 2D analyser som inte återspeglar 3D-miljö där det finns celler i vivo. Studier har visat att celler reagerar olika på en 3D-miljö jämfört med en 2D en5,6. Dessutom är sår helande analyserna svåra att återskapa och ge kvantitativa resultat7,8,9. Cell säkerhetszon analysen, som är en 3D ändring av såret läka assay, är en mer fysiologiskt relevanta analys men det passar inte för celler låg i antal som hybrid celler som härrör från cell fusion händelser10,11 .

Boyden kammare analysen är en 3-dimensionell som ger relevanta mikromiljö för cellulära studier. Det kräver dock celler tas bort från deras ursprungliga närmiljön och deponeras i den övre kammaren Boyden assay systemet att migrera och invadera nedåt mot korrektiv innehållande medium. Denna 3D strategi är inte lämpligt i analysera cellerna sårbara för deras närmiljön eller begränsade i nummer10,11,12migration och invasion förmåga. En nyare metod att analysera cellmigration och invasion är mikroflödessystem gradient kammare assay13. Även om lämplig och tillförlitlig i migration och invasion studier, denna analys är dyrare och kunde vara tekniskt utmanande för en typisk laboratorium. Vi beskriver här en enkel inverterade vertikal invasion analysmetod som är kompatibel med många celltyper inklusive celler som är känsliga för sin mikromiljö och/eller begränsade i antal. Denna analys anpassades från protokollet föreslås av Hooper et al. 14. i denna analys, cellerna kvar i sin ursprungliga närmiljön och deras flyttning och invasion övervakas när de flyttar uppåt i kollagen gel som innehåller en korrektiv11. Denna analys är reproducerbara och har optimerad och godkänts i 35-mm kultur skålen. Det kan anpassas till olika assay villkor inklusive olika cell kultur storlekar, olika matriser eller styrka vidhäftning, och olika chemoattractants. Denna analys skulle kunna tjäna som en in vitro- plattform för inledande bedömning i den drug discovery-processen.

Protocol

Obs: Detta protokoll beskrivs i McArdle o.a. 11. en tidslinje ges i figur 1. 1. beredning av kultur plattan Tvätta den 35 mm kultur maträtt som innehåller en 10 mm glas-botten väl med 1 mL 1 M saltsyra (HCl) för 15 min till sänka den vattenavvisande egenskaper av glas-botten. Tvätta kultur plattan två gånger med 1 mL av fosfat buffert saltlösning (PBS) för att bli av alla i HCl. Tvätta kult…

Representative Results

Vi har använt en 35 mm kultur maträtt med ett glas botten och rat tail kollagen I till utveckla och optimera en in vitro- 3D invasion assay protokoll. Med denna analys, visade vi att bröstcancer cancerceller MCF7 och MSC celler kunde invadera i kollagen gelen till ett genomsnittligt avstånd av 0,04 ± 1,8 µm och 41,3 ± 76,0 µm respektive efter 48 h när IGF1 (18,6 ng/mL) användes som korrektiv (figur 2). Viktigare, visade vi att fusion produk…

Discussion

Här beskriver vi ett enkelt inverterade vertikal invasion-test som är bekvämt för olika celltyper inklusive celler som är sällsynta och/eller beroende av sin mikromiljö. I denna 3D invasionen analys, celler kvar i sin ursprungliga mikromiljö och omfattas av kollagen gel som innehåller en korrektiv. Cellerna sedan migrera och invadera i kollagen. I denna analys, kan cellerna färgas och enkelt övervakas inom gelen. Enkelheten och reproducerbarhet av denna analys gör det till ett praktiskt verktyg för att stude…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöds av National Institutes of Health (NIMHD-G12MD007581) genom RCMI-centrum för miljö och hälsa vid Jackson State University och den amerikanska avdelningen av försvar, Idea Award 11-1-0205.

Materials

MatTek P35G-1.5-10C MatTek Corporation, Ashland, MA P35G-1.5-10-C mattek glass bottom dishes
Rat tail collagen I Corning, Corning, NY, USA 354236 Collagen gel
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA H1758 HCl
Phosphate buffered saline Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA 10010023 PBS
10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA D2429 10X DMEM
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA S5761 NaHCO3
Confocal Fluorescent microscope Olympus America, Center Valley, PA, USA Olympus IX81 Confocal  microscope
Defined Fetal Bovine Serum GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA SH30070.03 FBS
Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA 40x NA 0.8 objective MPLSM
Imaris software Bitplane Inc. Zurich, CH Imaris 7.5.2 Imaris software
DAPI Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA D9542 DAPI
Paraformaldehyde Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA 50980487 PFA
α-minimum essential medium Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA M0894
MDA-MB-231 ATCC; Manassas, VA, USA HBT-22
MSC Trivedi and Hematti, 2007
20X lens UPLAPO Olympus America, Center Valley, PA, USA 36-064 Olympus UPLSAPO 20X Objective

References

  1. Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matric. Cell Mol Life Sci. 57, 41-64 (2000).
  2. Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
  3. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).
  4. Yarrow, J. C., Perlman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparison of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21 (2004).
  5. Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160, 267-277 (2003).
  6. Sahai, E., Marshall, C. J. Differing modes of tumour cell invasion have distinct requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis. Nat Cell Biol. 5, 711-719 (2003).
  7. Kam, Y., Guess, C., Estrada, L., Weidow, B., Quaranta, V. A novel circular invasion assay mimics in vivo invasive behavior of cancer cell lines and distinguishes single-cell motility in vitro. BMC Cancer. 8, 198 (2008).
  8. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90, 195-221 (2009).
  9. Poujade, M., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 15988-15993 (2007).
  10. Noubissi, F. K., Harkness, T., Alexander, C. M., Ogle, B. M. Apoptosis-induced cancer cell fusion: a mechanism of breast cancer metastasis. FASEB J. 29, 4036-4045 (2015).
  11. McArdle, T. J., Ogle, B. M., Noubissi, F. K. An In Vitro Inverted Vertical Invasion Assay to Avoid Manipulation of Rare or Sensitive Cell Types. J Cancer. 7, 2333-2340 (2016).
  12. Noubissi, F. K., Ogle, B. M. Cancer Cell Fusion: Mechanisms Slowly Unravel. Int J Mol Sci. 17, (2016).
  13. Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annu Rev Anal Chem. 1, 423-449 (2008).
  14. Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Methods In Enzymol. 406, 625-643 (2006).
  15. Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat Materials. 13, 645-652 (2014).

Play Video

Cite This Article
McArdle, T. J., Ogle, B. M., Noubissi, F. K. Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol. J. Vis. Exp. (133), e56568, doi:10.3791/56568 (2018).

View Video