Flytta uppåt: Ett enkelt och flexibelt In Vitro tredimensionella Invasion Assay protokoll
Summary
Det här protokollet beskriver en inverterad vertikala invasion analysmetod som kunde användas för att kvantifiera migration och invasion funktionerna i celler i en tredimensionell miljö samtidigt bevara den cell mikromiljö. Denna analys är lämplig för sällsynta och/eller känsliga celler.
Abstract
Även om 3D invasionen analyser har utvecklats, återstår utmaningen studera celler utan att påverka integriteten hos deras mikromiljö. Traditionella 3D analyser såsom Boyden kammare kräver att celler är fördrivna från den ursprungliga kultur platsen och flyttade till en ny miljö. Inte bara stör detta cellulära processer som är inneboende i närmiljön, men det resulterar ofta i en förlust av celler. Dessa problem är särskilt utmanande när man arbetar med celler som är sällsynta eller mycket känslig för sin mikromiljö. Här beskriver vi utvecklingen av en 3D invasionen-analysen som undviker både oro. I denna analys, celler är klädd i en liten väl och en ECM matris som innehåller ett korrektiv läggs ovanpå cellerna. Detta kräver ingen förskjutning av cellen, och cellerna att invadera uppåt in i matrisen. I denna analys, kan cell invasion samt cellmorfologi bedömas inom kollagen gelen. Med denna analys, karakterisera vi invasiv kapacitet av sällsynta och känsliga celler; hybrid cellerna resulterar från fusion mellan bröstcancerceller MCF7 och mesenkymala/multipotenta celler stamceller/stroma (MSCs).
Introduction
Cell motilitet är en normal utveckling och fysiologiska process av celler. Förändringar i mönstret och förmågan hos celler att migrera och invadera associeras dock med sjukdomstillstånd inklusive inflammatoriska sjukdomar och cancer metastaser1,2,3. Metastaser är utan tvekan den mest dåligt förstådd aspekten i cancer. För att metastasera, måste cancerceller förnedra extracellulära matrix (ECM), invadera den lokala vävnaden och intravasate. En gång i omlopp, kommer cancercellerna sprida till den avlägsna platsen, extravasate och bilda sekundära tumörer. Därför möjligheten av celler att försämra ECM, att migrera och att invadera är relaterad till deras metastatisk potential. Olika metoder har utvecklats för att analysera och kvantifiera migration och invasion funktionerna i celler. De mest använda metoderna inkluderar de sårläkning assay, time-lapse mikroskopi och Boyden kammare analysen. Såret helande assay4 och time lapse microscopyen är enkel och bekväm analyser som skulle ge preliminära inblick i cellmigration. Båda är dock 2D analyser som inte återspeglar 3D-miljö där det finns celler i vivo. Studier har visat att celler reagerar olika på en 3D-miljö jämfört med en 2D en5,6. Dessutom är sår helande analyserna svåra att återskapa och ge kvantitativa resultat7,8,9. Cell säkerhetszon analysen, som är en 3D ändring av såret läka assay, är en mer fysiologiskt relevanta analys men det passar inte för celler låg i antal som hybrid celler som härrör från cell fusion händelser10,11 .
Boyden kammare analysen är en 3-dimensionell som ger relevanta mikromiljö för cellulära studier. Det kräver dock celler tas bort från deras ursprungliga närmiljön och deponeras i den övre kammaren Boyden assay systemet att migrera och invadera nedåt mot korrektiv innehållande medium. Denna 3D strategi är inte lämpligt i analysera cellerna sårbara för deras närmiljön eller begränsade i nummer10,11,12migration och invasion förmåga. En nyare metod att analysera cellmigration och invasion är mikroflödessystem gradient kammare assay13. Även om lämplig och tillförlitlig i migration och invasion studier, denna analys är dyrare och kunde vara tekniskt utmanande för en typisk laboratorium. Vi beskriver här en enkel inverterade vertikal invasion analysmetod som är kompatibel med många celltyper inklusive celler som är känsliga för sin mikromiljö och/eller begränsade i antal. Denna analys anpassades från protokollet föreslås av Hooper et al. 14. i denna analys, cellerna kvar i sin ursprungliga närmiljön och deras flyttning och invasion övervakas när de flyttar uppåt i kollagen gel som innehåller en korrektiv11. Denna analys är reproducerbara och har optimerad och godkänts i 35-mm kultur skålen. Det kan anpassas till olika assay villkor inklusive olika cell kultur storlekar, olika matriser eller styrka vidhäftning, och olika chemoattractants. Denna analys skulle kunna tjäna som en in vitro- plattform för inledande bedömning i den drug discovery-processen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi ett enkelt inverterade vertikal invasion-test som är bekvämt för olika celltyper inklusive celler som är sällsynta och/eller beroende av sin mikromiljö. I denna 3D invasionen analys, celler kvar i sin ursprungliga mikromiljö och omfattas av kollagen gel som innehåller en korrektiv. Cellerna sedan migrera och invadera i kollagen. I denna analys, kan cellerna färgas och enkelt övervakas inom gelen. Enkelheten och reproducerbarhet av denna analys gör det till ett praktiskt verktyg för att stude…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av National Institutes of Health (NIMHD-G12MD007581) genom RCMI-centrum för miljö och hälsa vid Jackson State University och den amerikanska avdelningen av försvar, Idea Award 11-1-0205.
Materials
| MatTek P35G-1.5-10C | MatTek Corporation, Ashland, MA | P35G-1.5-10-C | mattek glass bottom dishes |
| Rat tail collagen I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | Collagen gel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | H1758 | HCl |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 10010023 | PBS |
| 10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | D2429 | 10X DMEM |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | S5761 | NaHCO3 |
| Confocal Fluorescent microscope | Olympus America, Center Valley, PA, USA | Olympus IX81 | Confocal microscope |
| Defined Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA | SH30070.03 | FBS |
| Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope | Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA | 40x NA 0.8 objective | MPLSM |
| Imaris software | Bitplane Inc. Zurich, CH | Imaris 7.5.2 | Imaris software |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | D9542 | DAPI |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 50980487 | PFA |
| α-minimum essential medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | M0894 | |
| MDA-MB-231 | ATCC; Manassas, VA, USA | HBT-22 | |
| MSC | Trivedi and Hematti, 2007 | ||
| 20X lens UPLAPO | Olympus America, Center Valley, PA, USA | 36-064 | Olympus UPLSAPO 20X Objective |
References
- Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matric. Cell Mol Life Sci. 57, 41-64 (2000).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).
- Yarrow, J. C., Perlman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparison of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21 (2004).
- Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160, 267-277 (2003).
- Sahai, E., Marshall, C. J. Differing modes of tumour cell invasion have distinct requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis. Nat Cell Biol. 5, 711-719 (2003).
- Kam, Y., Guess, C., Estrada, L., Weidow, B., Quaranta, V. A novel circular invasion assay mimics in vivo invasive behavior of cancer cell lines and distinguishes single-cell motility in vitro. BMC Cancer. 8, 198 (2008).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90, 195-221 (2009).
- Poujade, M., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 15988-15993 (2007).
- Noubissi, F. K., Harkness, T., Alexander, C. M., Ogle, B. M. Apoptosis-induced cancer cell fusion: a mechanism of breast cancer metastasis. FASEB J. 29, 4036-4045 (2015).
- McArdle, T. J., Ogle, B. M., Noubissi, F. K. An In Vitro Inverted Vertical Invasion Assay to Avoid Manipulation of Rare or Sensitive Cell Types. J Cancer. 7, 2333-2340 (2016).
- Noubissi, F. K., Ogle, B. M. Cancer Cell Fusion: Mechanisms Slowly Unravel. Int J Mol Sci. 17, (2016).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annu Rev Anal Chem. 1, 423-449 (2008).
- Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Methods In Enzymol. 406, 625-643 (2006).
- Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat Materials. 13, 645-652 (2014).
