Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تحسين 3D المائية الثقافات من الخلايا الدبقية الأولية لنمذجة في المختبر نيوروينفلاميشن

Published: December 8, 2017 doi: 10.3791/56615
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,3, 1,2,4, 3, 1,2,5
1Department of Psychiatry, University of Alberta, 2Alberta Innovates-Health Solutions Interdisciplinary Team in Smart Neural Prostheses (Project SMART), University of Alberta, 3Department of Chemical and Materials Engineering, University of Alberta, 4Division of Physical Medicine and Rehabilitation, University of Alberta, 5Centre for Neuroscience, University of Alberta

Summary

هنا، نحن نقدم بروتوكول لثقافة 3D من الفئران الخلايا إطلاق المستمدة من الدماغ، بما في ذلك أستروسيتيس، ميكروجليا، وأوليجوديندروسيتيس. نظهر ثقافة الخلية الأولية وحمض الهيالورونيك ميثاكريلاتيد (حماة) هيدروجيل التوليف وتغليف هامافوتو--البلمرة وخلية وعينه تجهيز للتصوير المجهري الإلكترون [كنفوكل] والمسح.

Abstract

في الجهاز العصبي المركزي وعديدة الإصابات الحادة واضطرابات الأعصاب، كذلك مزروع الأجهزة أو المواد الحيوية هندسيا لتعزيز وظيفة تؤدي إلى نفس النتيجة: التهاب الزائدة يؤدي إلى الدباق، سيتوتوكسيسيتي، و/أو تشكيل ندبة الدبقية جماعياً إلى تفاقم الإصابة أو منع الاسترداد صحية. بقصد إنشاء نظام نموذجي ندبة الدبقية تشكيل ودراسة العمليات التحريضية، ونحن قد ولدت سقالة خلية 3D قادرة على السكن الأساسي استزراع الخلايا الدبقية: microglia التي تنظم استجابة جسم غريب، والشروع الحدث التحريضية و astrocytes التي تستجيب لتشكيل ندبة ليفية أوليجوديندروسيتيس التي تكون عادة عرضه للإصابة التحريضية. هذا العمل يوفر طريقة مفصلة خطوة بخطوة لتصنيع، والثقافة، وتوصيف مجهرية من السقالة على أساس حمض الهيالورونيك 3D المائية مع الفئران مغلفة الخلايا الدبقية المستمدة من الدماغ. علاوة على ذلك، أظهرت البروتوكولات لتوصيف تغليف الخلية والسقالة المائية [كنفوكل] الفلورة والمسح الضوئي المجهر الإلكتروني، فضلا عن القدرة على تعديل السقالة مع ركائز النشطة بيولوجيا، مع إدراج خليط تجاري الصفيحة القاعدية لدمج الخلية المحسنة.

Introduction

التهاب في الجهاز العصبي المركزي (CNS) منذ فترة طويلة تعتبر من السمات مميزة لالحاده (مثلاً، والسكتة الدماغية، والدماغ وإصابات النخاع الشوكي) والمزمنة (مثل الزهايمر، باركنسون 's، والأمراض هنتنغتون) إصابة الجهاز العصبي المركزي، ولكن يتزايد الاعتراف كمساهم سببية للأعصاب والاضطرابات العصبية. استمرار أو التهاب غير ملائمة يمكن أن تسبب الإصابة العصبية وديمييلينيشن (مثل التصلب المتعدد)، وتؤثر سلبا على نمو الدماغ (مثلالفصام والتوحد) والدول المزاج (مثلاً، والاكتئاب والقلق ، الهوس الاكتئابي). علاوة على ذلك، رواية استراتيجيات علاجية باستخدام الأجهزة القابلة للغرس (مثلاً.،2،،الدماغ-الكمبيوتر-واجهات13، الدماغ العميق تحفيز4،5، إينتراسبينال ميكروستيموليشن6،،من78،،من910) توليد استجابة التهابات يمكن التنبؤ بها في مجال التفاعل بين الجهاز والجهاز العصبي المركزي مما أدى إلى استجابة الأنسجة الواقية التي يمكن أن تسبب خسارة عدم فعالية أو الجهاز على مدى عمر زرع11. التهاب في الجهاز العصبي المركزي هو عادة بدأتها microglia، التي تعمل كخلايا محصنة ضد المقيمين من الجهاز العصبي المركزي مسؤولاً عن مراقبة الأنسجة واستجابة جسم غريب (استعرضت12). اعتماداً على شدة إهانة، إشارة microglia وتجنيد إضافية الخلية أنواع إلى موقع إصابة. على وجه التحديد، microglia تنشيط أستروسيتيس، التي بدورها تعمل كخلايا الالتهابات الثانوية وشكل حاجزاً واقيا كثيفة تحتوي13،موقع إصابة14. يمكن أيضا بدء Microglia تتالي نشاط في خلايا النظام المناعي الطرفية، والتي يمكن أن تؤدي إلى انهيار BBB السماح بتسلل المناعية (إعادة النظر في مرجع15).

في حالة الأجهزة مزروع في الجهاز العصبي المركزي، قد تلف الأنسجة الناتجة عن الإدراج الجهاز، فضلا عن استمرار وجود الجهاز الخارجية البدء في عملية تسمى تندب الدبقية. في هذه العملية، وتهاجر إلى microglia وتتكاثر في موقع الإصابة. أنها أيضا بدء الإفراج عن العوامل المثيرة لتحييد التهديدات المحتملة وتجنيد الخلايا الدبقية إضافية. وفي وقت لاحق، astrocytes المنشط تصبح الضخامي والبدء في تغليف الجهاز مزروع شكل جدار ليفي مستمر16. يشير إلى التهاب يخدم أيضا لتشجيع انسحاب عمليات العصبية من المناطق المحيطة بعملية الزرع والمجندين في نهاية المطاف الليفية لتعزيز ندبة الدبقية النامية17. أوليجوديندروسيتيس، المسؤولة عن اﻷغماد العصبية في المايلين لتعزيز الموصلية، لا ينجون من هذه العملية ويتم تقسيم الخلايا البعيدة من الزرع ب ندبة18. تندب الدبقية إلى حد كبير يقلل من الدالة وعمر الأجهزة مزروع، خاصة بالنسبة لتسجيل كهربائي، ويخدم في نهاية المطاف إلى الحد من الأداء الوظيفي لواجهات العصبية19.

استغلوا عدة نهج لزيادة توافق مع الحياة والنشاط واجهة الأجهزة مزروع في الجهاز العصبي المركزي20،21،،من2223. استعراض مستفيض يتوفر على تصميم متوافق حيويا لهذه الواجهات العصبية24. وتشمل الاستراتيجيات الأكثر بروزا المحيطة بالقطب مع الطلاء متوافق مثل بولييلثيلينيجليكول (شماعة)، أحماض اللبنيك-co-الجليكوليك (بلجا)25، أو تعزيز مسرى مع البوليمرات الموصلة مثل بولي (الإيثيلين ديوكسيثيوفيني) (بيدوت)، وبوليبيرولي (بي)26،27،،من2829،،من3031. كما استخدمت الطلاء النشطة بيولوجيا توفير إشارات لنمو الأنسجة العصبية باستخدام يغاندس المستمدة من مصفوفات خارج الخلية، بما في ذلك كولاجينس، فيبرونيكتينس، والأحماض هيالورونيك32،33،34 ،35،،من3637. تم استكشاف بيواكتيفيتي هذه الطلاءات كذلك مع نظم الإفراج عن عامل النمو لمحاكاة الخلية الطبيعية إفرازات30،38،39،،من4041 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50-في نفس الوقت، اختارت بعض المجموعات البحثية لإعادة الهندسة الكهربائي، والمرونة، وتكوين لتقليل عدم تطابق الميكانيكية بين الأجهزة والأنسجة51،52،53 ،،من5455،،من5657. بالإجمال، هذه الاستراتيجيات قد تؤدي إلى العديد من التحسينات الواعدة في الجيل التالي من الأجهزة السطح البيني العصبية، لكن التوافق طويلة الأجل قضية مستمرة، وقد أعاقت التقدم بنماذج معقدة وتستغرق وقتاً طويلاً في فيفو .

يمكن أن تحد من الإنتاجية التجريبية النهج المستندة إلى نموذج الحيوان وزيادة تكاليف اختبار توافق مع الحياة القطب. في المختبر نهج استخدام زراعة الخلايا التقليدية تقنيات تقديم بديل أكثر فعالية من حيث تكلفة، لكنهم فشلوا في تلخيص الكثير من تعقيد التفاعل بين الأجهزة والأنسجة58. على وجه الخصوص، اختبار سطح الطلاء باستخدام حدود الثقافة الخلية 2D النمذجة للهندسة الكهربائي وتأثير عدم تطابق الميكانيكية وميكروموشن ويعتقد أن يسهم في توليد استجابة مضيف تسهم في فشل الجهاز59 , 60.

للتغلب على المشاكل المرتبطة بثقافة الخلية 2D، وضعت الثقافات المائية للخلايا العصبية لمجموعة واسعة من التطبيقات،61من الدراسات الدوائية، لتوجيه الخلايا العصبية التمايز62، لفهم الأمراض 63،مسارات64، أو الطبقات في ثقافة المشارك مع أنواع أخرى من الخلية إلى نموذج الهجرة الخلية، نيوروبروتيكشن، أو إلى نموذج الأنسجة ميكرونفيرونمينتس61. الهلاميات المائية تشكل سهولة في أحجام مختلفة وهندستها يمكن إدراج أنواع عديدة من الثقافات الخلية الأولية أو مخلدة، وهي الغاية قابلة للتحليل باستخدام تقنيات شائعة الاستخدام مثل الأسفار [كنفوكل] مجهرية. لإنشاء نموذج لعملية تندب الدبقية، لدينا مؤخرا نمواً ووصفت نظام هيدروجيل 3D على أساس حمض الهيالورونيك لاختبار الفائق لاستجابة الدبقية لأقطاب مزروع (الشكل 1)65. وهذا النظام له العديد من المزايا المتميزة: 1) يتم تغليف الخلايا الدبقية الأولية (ميكروجليا وأستروسيتيس و oligodendrocytes) في مصفوفة ثلاثية الأبعاد تتكون من بوليمرات حمض الهيالورونيك، وعنصر مصفوفة خارج الخلية ذاتية؛ 2) تصلب مصفوفة يمكن 'ضبطها' لإعادة إنشاء الخواص الميكانيكية للدماغ أو أنسجة النخاع الشوكي؛ و 3) يمكن تغليف الخلايا في المصفوفة في نهج أعلى مقاعد البدلاء سريع باستخدام فوتوبوليميريزيشن مع الضوء الأخضر، الحد من السمية أثناء التغليف. هذا النظام يتيح للملامح الرئيسية في فيفو توافق مع الحياة: أجهزة تندس في المائية بطريقة مماثلة للأنسجة، ويتم رصد الاستجابة الخلوية للأجهزة مزروع لمجموعة واسعة من المعلمات65. وتشمل هذه الميكانيكية يوجد عدم تطابق بين الأجهزة والدهانات المائية من مختلف الهياكل والبقول التحفيز الكهربائي. ويشمل هذا النظام أيضا oligodendrocyte والسلائف المتصلة بها، والتي غالباً ما تكون الحاضرة والمعينين في ندوب الدبقية. بهم الضرر والموت البلعمه من microglia عاليا يدل على الإصابة التحريضية ونموذج تخفيض تندب أو الاسترداد، لديهم القدرة على إثبات re-مييلينيشن من الخلايا العصبية66.

وهنا يصف لنا أسلوباً للتوليف وتشكيل هجين حمض الهيالورونيك الهلاميات المائية جنبا إلى جنب مع تركيبات الغشاء متاحة تجارياً لتحسين إدماج خلية. علاوة على ذلك، سوف نظهر إدراج الخلايا الدبقية مثقف الابتدائي (ميكروجليا وأستروسيتيس و oligodendrocytes) وتحليل لنمو ثقافة استخدام إيمونوسيتوتشيميستري والفحص المجهري [كنفوكل].

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأقر البروتوكول لاستخراج أنسجة الدماغ من الجراء الفئران "سبراغ داولي" يوم 1، euthanized بقطع الرأس، العناية بالحيوان واستخدام اللجنة في جامعة ألبرتا.

1-Microglia والعزلة أستروسيتي67،68

ملاحظة: جميع وسائل الإعلام لعزل وزراعة الخلايا هو يسخن إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. وقد هانك لحل متوازن الملح (حبس) 1% البنسلين-ستربتوميسين (PS). تعديل جميع دولبيكو النسور مع F12 في لحم الخنزير وتستكمل مزيج المغذيات (DMEM/F12) مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) و 1% البنسلين-ستربتوميسين (PS). وتفتقر إلى خلائط فقط مع التربسين FBS. جميع المواد في هذا البروتوكول العقيمة (تصفية، الكحول، التي تم شراؤها، ويعقم) ويتم تنفيذ كل خطوة بعد خطوة رقم 1.8 في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء مع تقنية العقيم.

  1. كل الدماغ، قبل الحرارة 15 مل من حبس و 12.5 مل DMEM/F12 إلى 37 درجة مئوية في أنابيب الطرد المركزي المخروطية 50 مل، وحوالي 2 مل من التربسين 0.25% مع حمض الإيثيلين 1 مم (يدتا) في أنبوب الطرد مركزي مخروطية 15 مل. الحرارة 25 مل إضافية من DMEM/F12. التربسين الحارة السابقة حوالي 10 دقيقة استخدامها لمنع فقدان النشاط الأنزيمي.
  2. صب ما يكفي حبس الحارة في 6 العقيمة، وأطباق الثقافة 10 سم لتغطية السطح. تحضير طبق 10 سم واحد لكل العقول اثنين زائد صحن إضافي 6 سم.
  3. ضع العقول تصل إلى 2 في كل طبق2 10 سم (الشكل 2A).
  4. تحت مجهر تشريح، استخدم الملقط منحنية ومستقيمة لفصل كورتيسيس على طول خط الوسط، والمخيخ مع جذع الدماغ. وهذا غلة ثلاثة أقسام من الأنسجة في الدماغ (الشكل 2).
  5. قشر طبقة رقيقة، شبه شفافة، (السحايا) من الأنسجة التي تحتوي على الأوعية الدموية من كل قسم الأنسجة والمرتجع، نقل الأنسجة المتبقية في صحن ثقافة منفصلة. فهم طبقات رقيقة كشفها بواسطة التخفيضات الأنسجة، مع الملقط، وسحب بعناية حتى أجزاء رئيسية هي 'تتدلى' أنسجة المخ. وأخيراً قم بإزالة هذا الجزء التي تشيد بلطف. انظر الشكل 2--2E لصور الممثل من قبل وأثناء وبعد هذه الخطوة.
  6. في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء، إزالة حبس المتبقية من طبق الثقافة، الاحتفاظ بعناية في الأنسجة. مسرات الأنسجة مع مشرط ونقل الأنسجة إلى أنبوب المعالجون مسبقاً 15 مل مع التربسين.
  7. احتضان هذا الأنبوب لمدة 25 دقيقة في حمام 37 درجة مئوية لهضم الأنسجة انزيماتيكالي.
  8. الطرد المركزي الأنبوب إلى أسفل في ز 500 x لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وصب المادة طافية.
  9. استخدام ماصة 10 مل مصلية، إضافة 10 مل من دميم الحارة/F12 لإلغاء تنشيط التربسين وتريتوراتي الحل 5 مرات تفكك النسيج.
  10. الطرد المركزي الأنبوب إلى أسفل في ز 500 x لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وصب المادة طافية.
  11. استخدام ماصة 10 مل مصلية، إعادة تعليق بيليه إلى 10 مل من DMEM/F12 الحارة ونقل الحل إلى 50 مل أنبوب مخروطي أجهزة الطرد المركزي.
  12. باستخدام حقنه 10 مل مع إبرة قياس 18، تريتوراتي الحل 3 مرات.
  13. توزيع هذا الحل في زيادات بمقدار 12.5 مل من الحارة DMEM/F12 كل الدماغ.
  14. ماصة زيادات 1 مل الحل يسحق في 12 لوحة جيدا (1 في الدماغ).
  15. احتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2في حاضنة ثقافة خلية هوميديفيد. استبدال وسائط الإعلام بعد ثلاثة أيام، وتحديث وسائل الإعلام كل ثلاثة أيام لاحقة. وبعد أسبوعين، يمكن جمع الخلايا للتجارب.

2-ماكرومير التوليف69

  1. تزن 375 ملغ ملح حمض الهيالورونيك (ها) في أنبوب 50 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي، وإضافة 37.5 مل ماء المقطر.
  2. مسح الحل مع فورتيكسير لمدة 1 دقيقة و sonicate الخليط حتى تظهر متجانسة ويفقد اللزوجة مثل جل به. قد تستغرق هذه العملية ح 6.
  3. حل نقل كوب 100 مل مع المغناطيسية يقلب بار (38 مم)، ويقلب بشدة في درجة حرارة الغرفة.
  4. عناية تيتراتي 5.0 M هيدروكسيد الصوديوم في خلط هكتار والتدبير مع ورقة pH حتى تستقر درجة الحموضة بين 8 و 12.
  5. جمع 3 مل الخل ميثاكريليك الطازجة (ماجستير، 94%)، غطت النيتروجين أثناء التخزين.
    ملاحظة: ما يتعرض إلى الغلاف الجوي لفترات طويلة (أيام)، سوف تفقد مفاعليه.
    تنبيه: ينبغي استخدام جميع ما في غطاء دخان.
  6. إضافة 200 ميليلتر من MA في حل ها خلط. أن رد الفعل يخفض الرقم الهيدروجيني للحل أدناه 8.
  7. كرر الخطوات من 2.4 إلى 2.6 حتى 3 مل ما قد أضيفت إلى الحل. قد تستغرق هذه العملية ما يصل إلى 1-2 س.
  8. السماح بأن رد الفعل على تواصل بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، دون خلط.
  9. نقل الحل إلى 400 مل إيثانول البارد (EtOH) في كوب 500 مل والسماح لهطول الأمطار ح 24-72 في 4 درجات مئوية. 56
  10. عناية صب الجزء الأكبر من الحل في كوب منفصلة للتخلص منها، وجمع متسرعا في أنبوب 50 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي. وقد توزع هذا في أنابيب 2-4، إذا لزم الأمر.
  11. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 200 غ س في أجهزة الطرد مركزي لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة والتخلص من المادة طافية.
  12. أعلى الأنبوب مع EtOH الباردة ومزيج الحل مع فورتيكسير لمدة 1 دقيقة، وكرر الخطوة 2، 10-2.11.
  13. إضافة 25 مل مياه المعقمة، ومزيج الحل مع فورتيكسير لمدة 1 دقيقة، sonicate (> 20 كيلو هرتز) ح 1، واحتضان في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
  14. ضع الحل في ثلاجة-80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة أو حتى تجمد أو تجميد فلاش في نيتروجين سائل.
    تنبيه: عند استخدام النتروجين السائل، استخدام قفازات واقية ودرع وجه، وساحة.
  15. تجميد الجافة الأنبوب (أقل من 0.1 من [مبر] و-30 درجة مئوية) ح 24-48 حتى يتم إنتاج مسحوق مثل الثلج.
  16. في هذه المرحلة، اختبار العينة للنقاء عن طريق الرنين المغناطيسي النووي 1ح، حيث يمكن تأكيد مقدار البروتونات ميثاكريلات (قمم في جزء في المليون 6.1 و 5.6)، بالنسبة للبروتونات الميثيل (1.9 جزء في المليون)، في العمود الفقري هكتار. مقبول بنسبة 95% ميثاكريلات الميثيل البروتونات إلى الحد أدنى. 69

3-هلام تشكيل وتغليف 3D65

  1. ساترة وإعداد العفن
    1. جعل حل مياه 50 مل المقطر 2% 3--(تريميثوكسيسيليل) ميثاكريلات روبيل في أنبوب 50 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي.
    2. ضع كوفيرسليبس الزجاج 18 ملم في الحل والصخور ح 1 في درجة حرارة الغرفة. ما يصل إلى 50 كوفيرسليبس يمكن إضافتها في وقت واحد.
    3. أشطف كوفيرسليبس بالتسلسل غمس كل في 3 قنينة ماء منزوع 100 مل.
    4. الجاف كوفيرسليبس في فراغ عند 40 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع مجففة والفرن.
    5. تزج بسرعة كوفيرسليبس الفردية في 70% EtOH مع الملقط.
    6. دون التجفيف، وإسقاط كل ساترة في بئر 12 لوحة جيدا.
    7. أغسل ونضح كل بئر بالمياه المعقمة (1 مل كل بئر).
    8. أضف 1 مل من العقيمة 2 ميكروغرام/mL بولي-L-يسين (PLL) لكل بئر واحتضانها > ح 2.
    9. نضح PLL الحل والسماح كوفيرسليبس للهواء الجاف.
    10. تزج قوالب siloxane (PDMS) بوليديميثيل (انظر الشكل 1) في 70% EtOH، ومكان واحد عند مركز كل ساترة، والسماح للهواء الجاف وإنشاء ختم بين العفن والزجاج.
      1. إعداد قوالب PDMS بالصب PDMS مواده الكواشف بنسبة 10:1 في طبق البوليستيرين مغلوطاً. يتم تحديد كمية PDMS أعدت تسفر عن ورقة سميكة حوالي 1 مم. لنموذج الآبار في PDMS، قص الأوراق لكمه دائرة مع قطر داخلي من 10.
  2. إعداد الخلية
    ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات في البروتوكول مع تقنية عقيمة في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء. يتم ضبط الحل (PBS) المالحة الفوسفات مخزنة على درجة الحموضة 7.4 لكل الخطوات.
    1. تحديث 24 ساعة قبل التغليف خلية في حماة، متوسطة لمدة 2 أسبوع الثقافات الأولية (من الخطوة 1، 15) في لوحات 12 جيدا. أضف 1 مل من DMEM/F12 (10% FBS و 1% PS) متوسطة كل بئر.
    2. لكل لوحة 12-جيدا من الخلايا وإعداد 12.5 مل من تمييع التربسين (0.25% التربسين-يدتا مخففة 30% مع وسائط الإعلام DMEM/F12)، و 25 مل DMEM/F12 (10% FBS و 1% PS) والحارة في عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
    3. جمع المتوسطة مكيفة من لوحات ماصة 10 مل مصلية (> 0.5 مل في البئر) باستخدام دقة نضح السائل المتبقية واستبدال مع 1 مل الواحد من تمييع التربسين (0.075% التربسين-يدتا) لمدة 20-30 دقيقة في حاضنة (37 درجة مئوية، 5% CO2) جيدا حتى طبقة الخلايا المتلاقية يفصل من اللوحة.
    4. استرداد مواد الخلية مع وقف التنفيذ مع ماصة 1 مل (يظهر كقطعة عائمة واحدة) وجمع في أنبوب الطرد مركزي مخروطية 15 مل. مخفف مع حجم مكافئ من DMEM/F12 (10% FBS و 1% PS)، وأجهزة الطرد المركزي في ز 200 x لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مع تجاهل المادة طافية.
    5. ريسوسبيند بيليه الخلية في 10 مل الحارة DMEM/F12 (10% FBS و 1% PS)، تريتوراتي الخلايا 5 مرات مع ماصة 10 مل، والطرد المركزي في 200 غ س ل 2 دقيقة.
    6. صب المادة طافية، وإعادة تعليق الخلايا في 5 مل الحارة DMEM/F12، ونقل الخلايا إلى أنبوب 50 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي.
    7. باستخدام حقنه 10 مل بإبرة قياس 18، تريتوراتي الحل خلية 3 مرات، وتصفية التعليق من خلال غربال خلية 40 ميكرومتر في أنبوب مخروطي أجهزة الطرد مركزي جديدة.
    8. جمع 10 ميليلتر من تعليق خلية، وتمييع 1: 100 في الحارة DMEM/F12، وحساب عدد الخلايا مع عداد الآلي خلية
    9. احتضان في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى خطوة تغليف.
  3. تغليف خلية
    ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات في البروتوكول مع تقنية عقيمة في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
    1. لكل لوحة 12-جيدا من 3D الحارة الهلاميات المائية 12.5 مل من DMEM/F12 و 12.5 مل من وسائط الإعلام DMEM/F12 المكيفة التي تم جمعها أثناء إعداد الخلية.
    2. وزن الكمية حمض الهيالورونيك ميثاكريلاتيد (حماة) المطلوبة لحل نهائي تركيز 0.5% wt/المجلد حماة هذا في برنامج تلفزيوني تم تصفيتها العقيمة بتركيز (wt/المجلد 2%)؛ ويستخدم بتركيز أعلى 4 مرات من تركيز النهائي لاستيعاب إضافة الخلايا وغيرها الكواشف. واحد يتطلب 12 لوحة جيدا من الهلاميات المائية ~ 350 ميليلتر برنامج تلفزيوني مع 7 مغ حماة.
    3. Sonicate (> 20 كيلو هرتز) الحلول حتى يذوب حماة تماما لمدة 60 دقيقة.
    4. إعداد الحلول الفردية 10% من ثلاثي إيثانول أمين (الشاي) و 1-الفينيل-2-بيروليدينوني (النيفيرابين)، وحل 1 مم من ثم Y (EY) في مختبرين 1 مل من pH PBS العقيمة 7.4.
    5. للوحة واحدة 12 أيضا، جعل خليط نهائي 1.4 مل من 1 × 107 الخلايا، 0.5% wt/المجلد حماة (350 ميليلتر من 2% wt/المجلد)، 0.1% الشاي (14 ميليلتر من 10 ٪)، 0.1% النيفيرابين (14 ميليلتر من 10 ٪)، و 0.01 ملم EY (14 ميليلتر من 1 مم) ، ونسبة 20% الصفيحة القاعدية خليط (280 ميليلتر للأوراق المالية). حجم المتبقية من برنامج تلفزيوني.
    6. بلطف مزيج الحل و "الماصة؛" 100 ميليلتر إلى كل العفن PDMS مع تلميح 1 مل.
    7. تعرض عينات لضوء LED عالية كثافة خضراء (~ 520 نانومتر، 60 ميغاواط، في مغلقة 20 سم × 20 سم × 20 سم مربع) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    8. إضافة 1 مل كل بئر الحارة مكيفة DMEM/F12 إلى لوحة جيدا 12.
    9. فهم كل ساترة بين الإبهام والسبابة، ببطء تقشر العفن PDMS مع منحنى ملاقط مع الحرص على عدم تشريد الهلام، ووضعه في بئر مع المتوسطة مكيفة.
    10. إضافة 1 مل إضافية الحارة DMEM/F12 لكل بئر.
    11. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 لمدة أسبوعين، تحديث خلية وسائل الإعلام كل أسبوع حسب 1 مل بيبيتينج لوسائل الإعلام من كل الآبار واستبدال مع 1 مل DMEM/F12.

4-الفحص المجهري

  1. إيمونوسيتوتشيميستري
    ملاحظة: استخدمت مجهر مقلوب [كنفوكل] صورة هذه العينات واستخدمت إيماجيج للعملية وعرض الصور. وسوف يكون المسمى Microglia، أستروسيتيس، oligodendrocytes، ونوى، بعد 3 أسابيع في حماة الثقافة.
    1. يسخن 10% مخزنة في برنامج تلفزيوني الفورمالين (pH 7.0) في حمام 37 درجة مئوية.
      تنبيه: على الرغم من أن يمكن استخدام الفورمالين خارج غطاء دخان، هذه المواد المتفاعلة مع الأنسجة، وينبغي أن يكون التعامل مع الرعاية والقفازات دائماً. وينبغي أن يتصرف بشكل منفصل.
    2. عناية نضح وسائل الإعلام من لوحات وماصة 1 مل فورمالين 10% لكل بئر.
    3. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية في شركة 5%2 لمدة 20 دقيقة.
    4. نضح السائل من كل لوحة، "الماصة؛" 2 مل من برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4) في كل بئر، واحتضان لمدة 15 دقيقة.
    5. كرر الخطوة 4.1.4 مرتين.
    6. نضح السائل من اللوحات وإضافة 1 مل كل من برنامج تلفزيوني جيدا مع 10% مصل الحصان العادي (NHS) و 0.5% triton X-100 روك برفق في السرعة الحد الأدنى) ح 1.
    7. كرر الخطوة 4.1.4 ثلاث مرات.
    8. نضح السائل وإضافة 1 مل كل بئر في خليط التالية في برنامج تلفزيوني: أرنب المتأين الكالسيوم-ربط محول جزيء (Iba1) 1:1، 000، الدجاج بروتين فيبريلاري الدبقية (توصيني) 1:5، 000، الماوس 2 '، 3'-دوري-نوسيلوتيدي 3-فوفوديستيراسي (كنباسي) 1:1، 000، 1% دائرة الصحة الوطنية ، والخلية 0.1% تثقيب الفاعل. احتضان عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها، هزاز اللوحة بلطف قدر الإمكان.
    9. كرر الخطوة 4.1.4 ثلاث مرات مع إينكوباتيونس ح 1 بين بين.
    10. نضح السائل وإضافة 1 مل الواحد من المخلوط التالي جيدا في برنامج تلفزيوني: 647 نانومتر متحمس حمار جسم الأرنب المضادة 1: 200، 546 نانومتر متحمس الماعز الأجسام المضادة الدجاج 1: 200، 488 نانومتر متحمس حمار الماوس المضادة الأجسام المضادة 1: 200، 1% دائرة الصحة الوطنية، والأزرق 1:1,000 النووية وصمة عار. احتضان في درجة حرارة الغرفة ح 1، تعصف بلطف اللوحة.
    11. كرر الخطوة 4 ثلاث مرات مع إينكوبيشنز ح 1 بين بين.
    12. للاحتفاظ الهلاميات المائية، نضح المخزن المؤقت، وتزج لهم في 0.5 مل من الخلية تصاعد المتوسطة لدقيقة 1 ماصة بالمتوسط تصاعد بلطف ضع ساترة على رأس الجل، خلق طبقة بين الزجاج. إضافة كمية صغيرة من تصاعد المتوسطة إلى جانب الكشف عن كوفيرسليبس لمنع تجفيف المائية.
      ملاحظة: لأغراض استكشاف الأخطاء وإصلاحها، يمكن تصويرها المواد الهلامية في خطوة 4.1.11. لمشاهدة العلامات المناسبة قبل إجراء مزيد من المعالجة.
  2. المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM)
    ملاحظة: استخدمت المسح الإلكتروني المجهري لتصور المائية، صورة هذه العينات.
    1. قبل تسخين خليط مثبت من بارافورمالدهيد 2.5 ٪ glutaraldehyde و 2 في المائة في برنامج تلفزيوني (0.1 M) في حمام مائي 37 درجة مئوية.
      تنبيه: هذه الكواشف هي شديدة التفاعل مع الأنسجة، وينبغي التعامل معها بعناية والقفازات. وينبغي التعامل معها في غطاء دخان قدر الإمكان والتخلص منها بشكل منفصل.
    2. نضح المتوسطة من لوحات ثقافة الخلية وإضافة 1 مل خليط مثبت مسبقاً ساخنة.
    3. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية في شركة 5%2 لمدة 20 دقيقة.
    4. وضع اللوحات في 4 درجات مئوية (ثلاجة/برودة) بين عشية وضحاها.
    5. نضح الحل مثبت من الآبار وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني.
    6. نضح السائل من كل لوحة، وإضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني في كل بئر، واحتضان لمدة 15 دقيقة.
    7. كرر الخطوة 4.2.6 مرتين أخريين.
    8. نضح في برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل من 1% أوزميوم تيتراوكسيدي مخزنة في برنامج تلفزيوني لكل بئر.
      ملاحظة: حتى يتم تجفيف العينات، يتم إجراء هذه الخطوة وكل الخطوات اللاحقة في غطاء دخان.
    9. السماح بالتثبيت تحدث لبخار أوزميوم 30 دقيقة من السائل يمكن إصلاح العينات الأخرى في نفس اللوحة؛ ولذلك، تقسيم العينات تبعاً لذلك قبل هذه الخطوة.
      تنبيه: تيتراوكسيدي أوزميوم درجة عالية من التفاعلية مع الأنسجة ومتقلبة. أنه أمر خطير وينبغي التعامل معها في غطاء الدخان مع القفازات. وأي فورا غسلها ينبغي أن يتم التخلص منها بشكل منفصل.
    10. كرر الخطوة 4.2.6 ثلاث مرات.
    11. نضح السائل وأضف الخلائط التجفيف في القائمة أدناه، حسب الترتيب، واحتضان (درجة حرارة الغرفة) للوقت المشار إليه. ابدأ بالتدريج إضافة الإيثانول (EtOH) ثم يتبع هيكساميثيلديسيلازاني (همدس). انظر الجدول 2 لكل زيادة.
      ملاحظة: عند إضافة همدس، كوفيرسليبس يمكن بشدة التمسك بالبلاستيك وأصبحت صعبة للغاية لإزالة. يمكن منع هذا بوضع منصة بلاستيكية صغيرة تحت زلة الزجاج بعد التطبيق الأول من همدس. بعد الاحتضان EtOH الثانية، يمكن أخذ العينة ومروى في النتروجين السائل لبضع ثوان لتجميد كسر العينة.
    12. بعناية إزالة العينات المجففة وجبل العينات على بذرة المسح الإلكتروني المجهري مع مزدوج الوجهين الشريط موصلة.
    13. معطف الرش العينات مع الحد أدنى من الذهب. وضع العينات في حامل ويعمل الجهاز لمدة 2 دقيقة في 15 mA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويتطلب نظام المختبر في نموذج استجابة المضيف الأنسجة العصبية وندبة الدبقية في إنتاجية عالية، سقالة خلية ثلاثية الأبعاد مع مادة مصفوفة الذي هو متوافق حيويا، لا تتحمل حدثاً السامة للخلايا أثناء تكوين في الموقع ، وهو قابل للتعديل مع المكونات النشطة بيولوجيا لتوجيه استجابة الخيرين. وتحقيقا لهذه الغاية، ونحن إنشاء نظام سقالة خلية 3D يستند إلى حمض الهيالورونيك، ومغلفة سكان الرئيسية خلية الدبقية مختلطة لدراسة التفاعلات خلية خلية وبيوريكتيفيتي الدبقية. وأجريت دراسة موجزة بصرية للخلايا والسقالة. مورفولوجيا الخلايا الفئات السكانية الفرعية، بما في ذلك أوليجوديندروسيتيس (كنباسي باللون الأخضر)، microglia (Iba1 باللون الأحمر)، وتظهر astrocytes (توصيني باللون الأصفر)، يتم بالفحص المجهري إيمونوفلوريسسينت [كنفوكل] (3Ai الشكلالثاني-Ci-ثانيا). كما تظهر مورفولوجيا سقالة والخلية المشتركة حسب (الرقم 3Aiii-رابعا-سيي-الرابع) ووزارة شؤون المرأة. وترد في هذه الصور، منخفضة (الأولى والثالثة)، و (الثاني والرابع) صور عالية الدقة الممثل. وكان طلاء ساترة PLL ثنائي الأبعاد (الشكل 3A) بالمقارنة مع 0.5% w/v حماة 3D سقالة (الشكل 3B)، وهي مزيج من 20% v/v الصفيحة القاعدية المخلوط في 0.5% w/v حماة (الشكل 3). وقد تم ذلك لإظهار الاختلافات المورفولوجية في 2D و 3D خلية ثقافة، فضلا عن أثر الأخذ الصفيحة بيولوجية إلى السقالة. إعادة إنشاء 3D تتوفر أيضا معلومات تكميلية.

مورفولوجيا خلية من كل نوع الخلية يتغير مع الأخذ بخطة عمل ثلاثية الأبعاد. في 2D الثقافة ملتصقة (الزجاج المغلفة PLL كوفيرسليبس)، oligodendrocytes وبدأ جولة عادة وشكلت شبكات الاتصال الصغيرة عادة ما يربط باستخفاف المسمى العمليات توصيني. ميكروجليا كانت أصغر من الخلايا الأخرى والعمليات المتفرعة الصغيرة التي لا تمتد بعيداً عن أجسادهم الخلية (< 20 ميكرومتر). أستروسيتيس كانت أكثر امرأتين على شكل، بعض بعد مورفولوجيا شعاعي مع أصغر خلية الهيئات والعمليات المتفرعة ورقيقة واسعة النطاق، بينما كان آخرون الليفي مع مظهر مسطح وبعض العمليات الواسعة التي معطف السطح. في ثقافة حماة 3D، ظهرت oligodendrocytes في مجموعات قد تشعبت إلى مجالات أصغر. Microglia جولة مع بعض العمليات، وتم تقريب astrocytes أو تشعبت إشعاعيا في شبكات من كتلة واحدة. عموما، هذه الخلايا يبدو أنها قد تجاوزت من نقطة واحدة أو البقاء في مناطق حماة دون إجراء الاتصال مع خلايا أخرى، وهو خلافا لثقافة 2D وهي توحي بالحركة المحدودة من خلال المصفوفة. عندما تمت إضافة 20% v/v من خليط الصفيحة القاعدية إلى خليط صور--البلمرة، جميع أنواع فرعية الدبقية متكاملة مع منصة ثلاثية الأبعاد، وتشكيل هياكل تشعبت أكثر اتساعاً، والتفاعلية. Oligodendrocytes تمديد عمليات منتفخة إشعاعيا شبيه مورفولوجيس الخليط الصفيحة غير القاعدية، ولكن بالإضافة إلى ذلك يبدو أن تمتد العمليات على طول الشبكات المترابطة رقيقة astrocyte العمليات المتفرعة في جميع أنحاء السقالة. Microglia تفرقوا بين هذه الشبكات الخلية، وقد انتشرت مع العمليات رقيقة أكثر اتساقا مع مورفولوجيا بهم في الأنسجة. عموما، توحي مورفولوجيس الأنواع الثلاثة إطلاق تدمج في الخليط الصفيحة القاعدية حماة بحرية، يحتمل أن تكون عن طريق أما زيادة التقيد بالركيزة مختلطة أو من خلال زيادة القدرة على إعادة السقالة.

عندما لاحظت وزارة شؤون المرأة، واعتبر مورفولوجيا الخلايا للتأكد من صحة ميكروجرافس [كنفوكل]. مصفوفة حماة يبدو كسطح أملس مع 10-50 ميكرون المسام ينظر خافت تحت السطح. وكانت الزنزانات ملتصقة على السطح حماة وكانت أيضا مرئية ضعيف في طبقات تحت. لا تشكل هذه إطلاق مورفولوجيس مماثلة لتلك التي لوحظت في 2D الثقافة، لكن مع إضافة خليط الصفيحة القاعدية، لوحظ الشبكات واسعة النطاق. وقد لوحظت ألياف astrocyte سميكة، مع مجموعات أصغر من microglia سواء على سطح خليط الصفيحة القاعدية حماة وتمتد من خلال المصفوفة بطريقة سلسة. وهذا يمكن اعتبار خافت المصفوفة مطوية حول الخلايا، مما يوحي بأن الخلايا قد يكون تغيير السقالة تشكيل والتشكلات المرغوب بها.

Figure 1
رقم 1: التخطيطي من حمض الهيالورونيك ميثاكريلاتيد (حماة)-على أساس بروتوكول خلية 3D الثقافة وفوتوبوليميريزيشن. الخلايا الدبقية (ثقافة الدماغ الفئران الابتدائي الأسبوع 2) مختلطة مع حماة وبيبيتيد إلى العفن بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) في ساترة زجاج. هذا الخليط معرضة لضوء LED عالية كثافة خضراء بلمرة المائية لمدة 5 دقائق. تتم إزالة العفن وهي المحتضنة للهلام في وسائل الإعلام. وتشمل الخلايا الممثل microglia (أحمر)، أستروسيتيس (أصفر) وأوليجوديندروسيتيس (أخضر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تشريح للمخ ألجرو الفئران "سبراغ داولي" يوم 1- صور لكامل الدماغ (A)، تشريح كورتيسيس والمخيخ (ب)، لحاء واحد مع السحايا (ج)، وتقشير السحايا مع الملقط (د)، وقشرة مينينج مجاناً (E). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: [كنفوكل] إيمونوفلوريسسينت (i-ii) ومسح ميكروجرافس الإلكترون (الثالث والرابع) من السكان خلية إطلاق مختلطة في 2D PLL الطلاء (A) وحماه (ب)، ومزيج الصفيحة القاعدية حماة (ج). السفلي (ط، الثالث) وأعلى (ثانيا، رابعا) تظهر الصور التكبير. وتشمل تسميات Iba1 باللون الأحمر ل microglia، توصيني في أستروسيتيس، كنباسي باللون الأخضر ل oligodendrocytes، ووصمة نووية هويشت باللون الأصفر. تغيير حجم أشرطة = 25 ميكرومتر للصور [كنفوكل] و 50 (iii) و 20 ميكرون (الرابع) لمسح ميكروجرافس إلكترون. الهلاميات المائية 0.5% w/v، وخليط الصفيحة القاعدية وكان 20 في المائة من حيث الحجم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

تكميلية الشكل 1: 3D التعمير صغير إيمونوفلوريسسينت خليط الصفيحة القاعدية حماة مع مختلطة السكان خلية إطلاق خليط الصفيحة القاعدية-حماة- وتشمل تسميات Iba1 باللون الأحمر ل microglia، توصيني في أستروسيتيس، كنباسي باللون الأخضر ل oligodendrocytes، ووصمة نووية هويشت باللون الأصفر. الهلاميات المائية 0.5% w/v، وجيتريكس بنسبة 20 في المائة من حيث الحجم. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

حماة الصفيحة القاعدية النيفيرابين الشاي إرنست ويونغ
تركيز العمل 0.5% w/v 20% v/v 0.10 في المائة 0.10 في المائة مم.01
12-كذلك لوحة 2% w/v 100% w/v 10% v/v 10% v/v 1 مم
1.4 مل مجموع 350 ميليلتر ميليلتر 280 14 ميليلتر 14 ميليلتر 14 ميليلتر

الجدول 1: مثال لتغليف الخلايا.

المكون المحتوى وقت الحضانة
EtOH 30% 30 دقيقة
EtOH 50% 30 دقيقة
EtOH 70 في المائة 30 دقيقة
EtOH 90% 20 دقيقة
EtOH 100 ٪ 20 دقيقة
EtOH 100 ٪ 20 دقيقة
EtOH:HMDS أقاليمهم 20 دقيقة
EtOH:HMDS 50:50:00 20 دقيقة
EtOH:HMDS 25:75 20 دقيقة
همدس 100 ٪ 20 دقيقة
همدس 100 ٪ بين عشية وضحاها

الجدول 2: زيادات تدريجية EtOH وهمدس في الجفاف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نحو تحقيق هدف توليد نظام ثقافة ثلاثية الأبعاد إلى طراز بيوريكتيفيتي الدبقية وعملية تندب الدبقية، قمنا بتطوير نظام يمكن أن تدعم microglia مثقف الأولية، أستروسيتيس وأوليجوديندروسيتيس ويمكن توصيف قوية للخلية التفاعلات مورفولوجيا وخلية خلية. من ميكروجرافس هو مبين، كان مورفولوجية كل نوع خلية اختلافاً واضحا مع 2D و 3D-حماة و 3D منصات خليط الصفيحة القاعدية حماة. في نظام ثنائي الأبعاد، ومورفولوجيا كان متحيزا متميز على طول طائرة السطح، لكن عند مقارنتها بحماة 3D، microglia و astrocytes عموما أصغر داخل المصفوفة، باستثناء مجموعات oligodendrocyte. في ميكروجرافس إلكترون المسح، كانت الخلايا عموما أكثر على شكل جولة في حماة. قد يكون هذا إلى حد كبير بسبب الخلايا يتم تغليف، مع قدرة محدودة على تعديل المصفوفة الخاصة بالحركة وحرية الحركة والنمو من العمليات. وكان ثمرة الخلية في حماة شعاعي عادة لكل من أستروسيتيس وأوليجوديندروسيتيس. بينما هذه الخلايا العمليات الموسعة، توحي منظمتهم أن حركتهم طوال مصفوفة والقدرة على التفاعل مع الخلايا الأخرى كان محدودا. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت الأعمال السابقة كسر تجميد حماة أن تكون مسامية دون الشبكات المترابطة، مما قد يفسر هذا عدم وجود ثمرة65،70. قد يكون من الممكن أن بعض هذه الخلايا لم ينج فوتوبوليميريزيشن، المتبقية يتم الحفاظ عليها في المصفوفة، ولكن البقاء وقيمت بشكل منهجي في أعمالنا السابقة العمل، وبقي 80% (0.5% w/v) على مدى الأسبوع65.

لتحسين تفاعل الخلايا مع المصفوفة في الثقافة 3D، قدمنا خليط الصفيحة القاعدية كعنصر من عناصر مصفوفة متوافق حيويا وقابلة للتعديل. دمج الخلية مع المصفوفة تبين تحسن ملحوظ، مع جميع أنواع الخلايا تظهر العمليات واسعة النطاق بالمقارنة مع الثقافة 2D وحماه 3D على حد سواء. يتكون من مكونات الصفيحة القاعدية متنوعة الخليط الصفيحة القاعدية ووضعت أساسا لدعم الدبقية تمايز الخلايا الجذعية العصبية السلائف71. لم يكن غير متوقع أن الخلايا الدبقية ورد إلى الخليط الصفيحة القاعدية، وفي وقت لاحق مصفوفة 3D المحيطة بها، ولكن يوحي بمدى التكامل في بيئة صحية مثل الأنسجة. مقارنة حماة إلى خليط الصفيحة القاعدية حماة، مورفولوجيا المائية لا تظهر اختلافاً واضحا، ولذلك قد تكون الخلايا أكثر بنشاط تجديد ذلك. نظراً لبساطة إضافة هذه المكونات النشطة بيولوجيا، وليس لا يمكن تصورها استخدام لاميناس مختلفة و/أو الرموز البروتين على تهيئة الظروف الثقافة للخلايا العصبية. في اتجاه المستقبلية محتملة، ويمكن استخدام هذا النظام للتفريق بين الخلايا العصبية العصبية المتكفل بالتزامن مع إطلاق مختلط لمجموعة متنوعة من مييلينيشن تأثيراً أو نماذج الإصابة العصبية الملتهبة.

في حالة إصابة الجهاز العصبي المركزي خطيرة وضارة أو رفض مادة بيولوجية، يبدأ النسيج المقيم التحريضية ردود فعل يمكن أن يؤدي إلى تفاقم نيوروديجينيريشن وديمييلينيشن. عادة ما يؤدي إلى تشكيل ندبة الدبقية القسم في موقع الإصابة، مما يمنع التجديد. في هذه الدراسة، بالتفصيل الأساليب ميثاكريلاتيد بلمرة الصور المستندة إلى حمض الهيالورونيك 3D سقالة قصد وضع نماذج الاستجابة الخلوية الأولية وراء تشكيل ندبة الدبقية؛ مفاعليه microglial وتجنيد astrocyte وتضخم، وإصابة أوليجوديندروسيتي والانسحاب. سقالة خلية 3D صمم لدمج جميع أنواع الخلايا الدبقية ثلاثة، وكذلك تعديل مع خليط الصفيحة القاعدية المتعددة عناصر. وتقرر، بالمجهر الإلكتروني [كنفوكل] ومسح التصوير، وأن الخلايا كانت مغلفة في حماة، وكانت أفضل قادرة على دمج عندما قدم الخليط الصفيحة القاعدية. يمكن أن تؤدي هذه النتائج إلى عدة تطبيقات جديدة. حماة وحدها قد يؤدي إلى إنشاء نظم الثقافة المشارك فيها القصد من ذلك الحد من التفاعل خلية إلى خلية أو الدراسة استخلاص إيصال المخدرات باستخدام الهلام كمصفوفة محدودة نشر تحميل المخدرات. الهلاميات المائية إدماج الخليط الصفيحة القاعدية في المصفوفة حماة تسمح لبيئة مثل الأنسجة أكثر اتساقا قادرة على نمذجة التهاب حاد أو الدباق، أو تندب الدبقية، ويتيح كذلك الفائق توصيف الدبقية بيوريكتيفيتي يزرع والمخدرات وجهاز التنمية واستراتيجيات أخرى لتقليل واسترداد الإصابة التحريضية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

الكتاب ممتنون للدعم المالي من الأموال و CFI، عيس، والخدمات الصحية في ألبرتا والهبات ديفي "أبحاث الدماغ".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Materials for HAMA synthesis and photopolymerization
Hyaluronic acid (HA) Sigma-Aldrich 53747-10G Streptococcus equi, MW: 1.5 - 1.8 X 10^6
Methacrylic anhydride (MA) Sigma-Aldrich 275585-100ML
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 221465-25G
Ethanol (EtOH) Commerical Alcohols Inc. Anhydrous
Phosphate buffered saline (pH 7.4) tablets Fisher Scientific 18912014
Triethanolamine (TEA) Sigma-Aldrich 90279-100ML
1-Vinyl-2pyrrolidinone (NVP) Sigma-Aldrich V3409-5G
EosinY (EY) Sigma-Aldrich E6003-25G
Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate Sigma-Aldrich 440159-100ML
Beaker (100 mL) Corning 1000-100
Beaker (500 mL) Corning 1000-600
pH paper (Labstick) Sigma-Aldrich 9580
Name Company Catalog Number Comments
2. Materials for glial cell isolation and cell culture
P1-2 Sprague Dawley rat pups Charles River CD Sprague Dawley rat strain code 001
Dissector scissors - slim blades (small) Fine Science Tools 14081-09
Surgical scissors - Toughcut (large) Fine Science Tools 14130-17
Fine forceps (Dumont #5) Fine Science Tools 11521-10
Curved fine forceps (Dumont #7) Fine Science Tools 11271-30
Hank's balanced salt solution (HBSS) Gibco 14170-112
Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) Gibco 11320-033
Penicillin-streptomycin (PS) Gibco 15140-122
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 12483-020
0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Gibco 25200-072
Poly-L-lysine (PLL) Sigma-Aldrich P-6282
50 mL conical centrifuge tube Fisher Scientific 05-539-13
15 mL conical centrifuge tube Fisher Scientific 05-539-5
12 well Tissue culture treated plates (Cellstar) Greiner Bio-One 665 108
10 mL serological pipette Fisher Scientific 13-676-10F
25 mL serological pipette Fisher Scientific 12-676-10K
Petri dish (60 mm X 15 mm) Fisher Scientific FB0875713A
Petri dish (100 mm X 15 mm) Fisher Scientific FB0875712
Microscope Coverslip (18 mm) Fisher Scientific 12-545-100 18CIR
Name Company Catalog Number Comments
3. Materials for microscopy (confocal and scanning electron microscopy)
Mouse monoclonal anti-CNPase abcam ab6319
Rabbit anti-Iba1 Wako Laboratory Chemicals 019-17741
Chicken anti-GFAP abcam ab4674
Hoechst 33342 Fisher Scientific 62249
Fluoromount-G Fisher Scientific 00-4958-02
Formalin Sigma Aldrich HT501128-4L Buffered (10%)
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
Horse Serum Gibco 16050-122
Paraformaldehyde Electon Microscopy Sciences 157-8 Buffered (8%)
Guteraldehyde Electon Microscopy Sciences 16019 Buffered (8%)
Osmium tetraoxide Electon Microscopy Sciences 19152 Buffered (2%)
Hexamethyldilazane (HMDS) Electon Microscopy Sciences 16700
Ethanol (EtOH) Electon Microscopy Sciences 15055 Anhydrous
Microscope Slide (25 X 75 X 1 mm) VWR International 48311-703

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shih, J. J., Krusienski, D. J., Wolpaw, J. R. Brain-Computer Interfaces in Medicine. Mayo Clin. Proc. 87, 268-279 (2012).
  2. Kennedy, P. R., Bakay, R. A. Restoration of neural output from a paralyzed patient by a direct brain connection. Neuroreport. 9, 1707-1711 (1998).
  3. Kennedy, P. R., Bakay, R. A., Moore, M. M., Adams, K., Goldwaithe, J. Direct control of a computer from the human central nervous system. IEEE Trans. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 8, 198-202 (2000).
  4. Mayberg, H. S., et al. Deep Brain Stimulation for Treatment-Resistant Depression. Neuron. 45, 651-660 (2005).
  5. Dougherty, D. D., et al. A Randomized Sham-Controlled Trial of Deep Brain Stimulation of the Ventral Capsule/Ventral Striatum for Chronic Treatment-Resistant Depression. Biol. Psychiatry. 78, 240-248 (2015).
  6. Bamford, J. A., Marc Lebel, R., Parseyan, K., Mushahwar, V. K. The Fabrication, Implantation, and Stability of Intraspinal Microwire Arrays in the Spinal Cord of Cat and Rat. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 25, 287-296 (2017).
  7. Holinski, B. J., et al. Intraspinal microstimulation produces over-ground walking in anesthetized cats. J. Neural Eng. 13, 056016 (2016).
  8. Toossi, A., Everaert, D. G., Azar, A., Dennison, C. R., Mushahwar, V. K. Mechanically Stable Intraspinal Microstimulation Implants for Human Translation. Ann. Biomed. Eng. 45, 681-694 (2017).
  9. Saigal, R., Renzi, C., Mushahwar, V. K. Intraspinal microstimulation generates functional movements after spinal-cord injury. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 12, 430-440 (2004).
  10. Lau, B., Guevremont, L., Mushahwar, V. K. Strategies for generating prolonged functional standing using intramuscular stimulation or intraspinal microstimulation. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 15, 273-285 (2007).
  11. Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. J. Neurosci. Methods. 148, 1-18 (2005).
  12. Sierra, A., et al. Surveillance, phagocytosis, and inflammation: how never-resting microglia influence adult hippocampal neurogenesis. Neural Plast. 2014, 610343 (2014).
  13. Holm, T. H., Draeby, D., Owens, T. Microglia are required for astroglial Toll-like receptor 4 response and for optimal TLR2 and TLR3 response. Glia. 60, 630-638 (2012).
  14. Gao, Z., et al. Reciprocal modulation between microglia and astrocyte in reactive gliosis following the CNS injury. Mol. Neurobiol. 48, 690-701 (2013).
  15. Jin, X., Yamashita, T. Microglia in central nervous system repair after injury. J. Biochem. (Tokyo). 159, 491-496 (2016).
  16. Griffith, R. W., Humphrey, D. R. Long-term gliosis around chronically implanted platinum electrodes in the Rhesus macaque motor cortex. Neurosci. Lett. 406, 81-86 (2006).
  17. Biran, R., Martin, D. C., Tresco, P. A. Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays. Exp. Neurol. 195, 115-126 (2005).
  18. Fawcett, J. W., Asher, R. A. The glial scar and central nervous system repair. Brain Res. Bull. 49, 377-391 (1999).
  19. Szarowski, D. H., et al. Brain responses to micro-machined silicon devices. Brain Res. 983, 23-35 (2003).
  20. Park, D. -W., et al. Graphene-based carbon-layered electrode array technology for neural imaging and optogenetic applications. Nat. Commun. 5, 5258 (2014).
  21. McAllister, J. P., et al. Biocompatibility of Penetrating Recording Electrode Arrays Implanted Chronically in the Feline Visual Cortex. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 1528 (2005).
  22. Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. J. Neurochem. 109, 117-125 (2009).
  23. Chung, H., et al. In vivo Biocompatibility and Stability of Polyimide Microelectrode Array for Retinal Stimulation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 5072 (2003).
  24. Aregueta-Robles, U. A., Woolley, A. J., Poole-Warren, L. A., Lovell, N. H., Green, R. A. Organic electrode coatings for next-generation neural interfaces. Front. Neuroengineering. 7, (2014).
  25. Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24, 4337-4351 (2003).
  26. Yang, J., et al. Ordered surfactant-templated poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) conducting polymer on microfabricated neural probes. Acta Biomater. 1, 125-136 (2005).
  27. Ludwig, K. A., et al. Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) polymer coatings facilitate smaller neural recording electrodes. J. Neural Eng. 8, 014001 (2011).
  28. Kim, D. -H., Abidian, M., Martin, D. C. Conducting polymers grown in hydrogel scaffolds coated on neural prosthetic devices. J. Biomed. Mater. Res. A. 71, 577-585 (2004).
  29. George, P. M., et al. Fabrication and biocompatibility of polypyrrole implants suitable for neural prosthetics. Biomaterials. 26, 3511-3519 (2005).
  30. Stauffer, W. R., Cui, X. T. Polypyrrole doped with 2 peptide sequences from laminin. Biomaterials. 27, 2405-2413 (2006).
  31. Green, R. A., Lovell, N. H., Wallace, G. G., Poole-Warren, L. A. Conducting polymers for neural interfaces: challenges in developing an effective long-term implant. Biomaterials. 29, 3393-3399 (2008).
  32. Gumbiner, B. M. Cell adhesion: the molecular basis of tissue architecture and morphogenesis. Cell. 84, 345-357 (1996).
  33. Chan, G., Mooney, D. J. New materials for tissue engineering: towards greater control over the biological response. Trends Biotechnol. 26, 382-392 (2008).
  34. Green, R. A., Lovell, N. H., Poole-Warren, L. A. Impact of co-incorporating laminin peptide dopants and neurotrophic growth factors on conducting polymer properties. Acta Biomater. 6, 63-71 (2010).
  35. Green, R. A., Lovell, N. H., Poole-Warren, L. A. Cell attachment functionality of bioactive conducting polymers for neural interfaces. Biomaterials. 30, 3637-3644 (2009).
  36. Koss, K. M., Unsworth, L. D. Neural tissue engineering: Bioresponsive nanoscaffolds using engineered self-assembling peptides. Acta Biomater. 44, 2-15 (2016).
  37. Koss, K. M., et al. Brain biocompatibility and microglia response towards engineered self-assembling (RADA)4 nanoscaffolds. Acta Biomater. 35, 127-137 (2016).
  38. Evans, A. J., et al. Promoting neurite outgrowth from spiral ganglion neuron explants using polypyrrole/BDNF-coated electrodes. J. Biomed. Mater. Res. A. 91, 241-250 (2009).
  39. Yu, X., Bellamkonda, R. V. Tissue-engineered scaffolds are effective alternatives to autografts for bridging peripheral nerve gaps. Tissue Eng. 9, 421-430 (2003).
  40. Houweling, D. A., Lankhorst, A. J., Gispen, W. H., Bär, P. R., Joosten, E. A. Collagen containing neurotrophin-3 (NT-3) attracts regrowing injured corticospinal axons in the adult rat spinal cord and promotes partial functional recovery. Exp. Neurol. 153, 49-59 (1998).
  41. Wells, M. R., et al. Gel matrix vehicles for growth factor application in nerve gap injuries repaired with tubes: a comparison of biomatrix, collagen, and methylcellulose. Exp. Neurol. 146, 395-402 (1997).
  42. Barras, F. M., Pasche, P., Bouche, N., Aebischer, P., Zurn, A. D. Glial cell line-derived neurotrophic factor released by synthetic guidance channels promotes facial nerve regeneration in the rat. J. Neurosci. Res. 70, 746-755 (2002).
  43. Fine, E. G., Decosterd, I., Papaloïzos, M., Zurn, A. D., Aebischer, P. GDNF and NGF released by synthetic guidance channels support sciatic nerve regeneration across a long gap. Eur. J. Neurosci. 15, 589-601 (2002).
  44. Burdick, J. A., Ward, M., Liang, E., Young, M. J., Langer, R. Stimulation of neurite outgrowth by neurotrophins delivered from degradable hydrogels. Biomaterials. 27, 452-459 (2006).
  45. Piantino, J., Burdick, J. A., Goldberg, D., Langer, R., Benowitz, L. I. An injectable, biodegradable hydrogel for trophic factor delivery enhances axonal rewiring and improves performance after spinal cord injury. Exp. Neurol. 201, 359-367 (2006).
  46. Jain, A., Kim, Y. -T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27, 497-504 (2006).
  47. Taylor, S. J., Sakiyama-Elbert, S. E. Effect of controlled delivery of neurotrophin-3 from fibrin on spinal cord injury in a long term model. J. Control. Release Off. J. Control. Release Soc. 116, 204-210 (2006).
  48. Jhaveri, S. J., et al. Release of nerve growth factor from HEMA hydrogel-coated substrates and its effect on the differentiation of neural cells. Biomacromolecules. 10, 174-183 (2009).
  49. Lee, A. C., et al. Controlled release of nerve growth factor enhances sciatic nerve regeneration. Exp. Neurol. 184, 295-303 (2003).
  50. Matsumoto, K., et al. Neurite outgrowths of neurons with neurotrophin-coated carbon nanotubes. J. Biosci. Bioeng. 103, 216-220 (2007).
  51. Khaled, I., et al. A Flexible Base Electrode Array for Intraspinal Microstimulation. IEEE Trans. Biomed. Eng. 60, 2904 (2013).
  52. David-Pur, M., Bareket-Keren, L., Beit-Yaakov, G., Raz-Prag, D., Hanein, Y. All-carbon-nanotube flexible multi-electrode array for neuronal recording and stimulation. Biomed. Microdevices. 16, 43-53 (2014).
  53. Hsu, H. -L., et al. Flexible UV-ozone-modified carbon nanotube electrodes for neuronal recording. Adv. Mater. Deerfield Beach Fla. 22, 2177-2181 (2010).
  54. Lacour, S. P., et al. Flexible and stretchable micro-electrodes for in vitro and in vivo neural interfaces. Med. Biol. Eng. Comput. 48, 945-954 (2010).
  55. Lin, C. -M., Lee, Y. -T., Yeh, S. -R., Fang, W. Flexible carbon nanotubes electrode for neural recording. Biosens. Bioelectron. 24, 2791-2797 (2009).
  56. Richter, A., et al. A simple implantation method for flexible, multisite microelectrodes into rat brains. Front. Neuroengineering. 6, 6 (2013).
  57. Rousche, P. J., et al. Flexible polyimide-based intracortical electrode arrays with bioactive capability. IEEE Trans. Biomed. Eng. 48, 361-371 (2001).
  58. Polikov, V. S., Block, M. L., Fellous, J. -M., Hong, J. -S., Reichert, W. M. In vitro model of glial scarring around neuroelectrodes chronically implanted in the CNS. Biomaterials. 27, 5368-5376 (2006).
  59. Sohal, H. S., Clowry, G. J., Jackson, A., O'Neill, A., Baker, S. N. Mechanical Flexibility Reduces the Foreign Body Response to Long-Term Implanted Microelectrodes in Rabbit Cortex. PloS One. 11, e0165606 (2016).
  60. Moshayedi, P., et al. The relationship between glial cell mechanosensitivity and foreign body reactions in the central nervous system. Biomaterials. 35, 3919-3925 (2014).
  61. Hopkins, A. M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. 3D in vitro modeling of the central nervous system. Prog. Neurobiol. 125, 1-25 (2015).
  62. Pöttler, M., Zierler, S., Kerschbaum, H. H. An artificial three-dimensional matrix promotes ramification in the microglial cell-line, BV-2. Neurosci. Lett. 410, 137-140 (2006).
  63. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. 0, 42-51 (2014).
  64. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12, 207-218 (2014).
  65. Jeffery, A. F., Churchward, M. A., Mushahwar, V. K., Todd, K. G., Elias, A. L. Hyaluronic acid-based 3D culture model for in vitro testing of electrode biocompatibility. Biomacromolecules. 15, 2157-2165 (2014).
  66. Fitch, M. T., Silver, J. CNS Injury, Glial Scars, and Inflammation. Exp. Neurol. 209, 294-301 (2008).
  67. Churchward, M. A., Todd, K. G. Statin treatment affects cytokine release and phagocytic activity in primary cultured microglia through two separable mechanisms. Mol. Brain. 7, 85 (2014).
  68. Lai, A. Y., Todd, K. G. Differential regulation of trophic and proinflammatory microglial effectors is dependent on severity of neuronal injury. Glia. 56, 259-270 (2008).
  69. Hachet, E., Van Den Berghe, H., Bayma, E., Block, M. R., Auzély-Velty, R. Design of biomimetic cell-interactive substrates using hyaluronic acid hydrogels with tunable mechanical properties. Biomacromolecules. 13, 1818-1827 (2012).
  70. Eslami, M., Javadi, G., Agdami, N., Shokrgozar, M. A. Expression of COLLAGEN 1 and ELASTIN Genes in Mitral Valvular Interstitial Cells within Microfiber Reinforced Hydrogel. Cell J (Yakhteh). , (2015).
  71. Shaltouki, A., Peng, J., Liu, Q., Rao, M. S., Zeng, X. Efficient Generation of Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells in Defined Conditions. STEM CELLS. 31, 941-952 (2013).

Tags

خلية 3D الهندسة الحيوية، العدد 130، الثقافة، المائية، إطلاق الأولية، astrocyte، microglia، أوليجوديندروسيتي، نيوروينفلاميشن، حمض الهيالورونيك، حماة
تحسين 3D المائية الثقافات من الخلايا الدبقية الأولية لنمذجة <em>في المختبر</em> نيوروينفلاميشن
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koss, K. M., Churchward, M. A.,… More

Koss, K. M., Churchward, M. A., Jeffery, A. F., Mushahwar, V. K., Elias, A. L., Todd, K. G. Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (130), e56615, doi:10.3791/56615 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter