Summary
여기, 우리는 쥐의 3D 문화에 대 한 프로토콜 이다, microglia, 및 oligodendrocytes를 포함 하 여 두뇌 파생 명과 셀을 제시. 1 차 세포 배양, methacrylated 히 알루 론 산 (하 마) 하이드로 겔 합성, HAMAphoto 중 합 및 셀 캡슐화 및 샘플 공초점 레이저 스캐닝 전자 현미경 이미징 처리 설명 합니다.
Abstract
중앙 신경 조직, 수많은 급성 부상 및 신경 장애, 뿐만 아니라 이식 장치 또는 생체 같은 결과에서 함수 결과 향상 시키기 위해 설계: gliosis, 세포 독성, 이끌어 과잉 염증 또는 집합적으로 부상 악화 또는 건강 회복을 방해 glial 흉터 대형. 우리가 3 차원 셀 비 계 기본 교양된 glial 세포 수 있는 모델 glial 흉터 대형 그리고 연구 염증 성 프로세스에 시스템을 만드는의 도와 함께 생성: microglia 이물질 응답을 통제 하 고 시작 하는 염증 성 이벤트, 이다 섬유질 흉터 형성에 응답 하는 및 oligodendrocytes 일반적으로 염증 성 손상에 취약. 현재 작업 방법을 제공 한다는 상세한 단계별 제작, 문화, 및 캡슐화 된 쥐와 히 알루 론 산 기반 3D 히드로 발판의 현미경 특성 두뇌 파생 glial 세포를. 또한, 세포 캡슐화 및 confocal 면역 형광 및 전자 현미경을 스캐닝 하 여 하이드로 겔 비의 특성에 대 한 프로토콜을 보여 줍니다와 생리 활성 기판으로 비 계를 수정 하는 능력 뿐만 아니라 향상 된 셀 통합 상업 기저 lamina 혼합물 설립
Introduction
중앙 신경 조직 (CNS)의 염증이 오래 고려 되었습니다 급성의 특징 (예:허 혈 성 뇌졸중, 외상 성 뇌, 척수 손상) 및 만성 (예: 알츠하이머병, 파 킨 슨 병의, 그리고 Huntington의 질병) CNS 상해, 하지만 점점 신경 정신병 무질서 하 인과 기여자로 인식 됩니다. 지속 또는 부적 절 한 수 있습니다 신경 상해의 원인과 demyelination (예: 다 발성 경화 증), 염증과 부정적인 영향 (예를 들어, 정신 분열 증, 자폐증) 두뇌 개발 및 기분 상태 (예, 우울증, 불안 양극성 질환). 또한, 새로운 치료 전략을 이식할 수 있는 장치를 사용 하 여 (예., 뇌-컴퓨터 인터페이스1,2,3, 깊은 두뇌 자극4,5, intraspinal microstimulation6,7,8,,910) 장치 및 CNS에서 결과 사이의 인터페이스에서 예측 가능한 선 동적인 응답을 생성 한 11임 플 란 트 수명에 걸쳐 효능 또는 장치 실패의 손실을 일으킬 수 있는 보호 조직 응답. CNS에 염증은 일반적으로 CNS 조직 감시 및 이물질 응답 (검토12) 장착에 대 한 책임의 거주 면역 세포 기능 microglia에 의해 시작 됩니다. 모욕의 심각도에 따라, microglia 신호 및 모집 추가 부상 사이트 종류 세포. 특히,는 microglia 활성화에 보조 염증 세포 및 양식 부상 사이트13,14를 포함 하는 밀도 보호벽 역할 이다. Microglia 또한 (참조15검토) 면역 침투를 허용 하도록 BBB의 붕괴 귀 착될 수 있다 주변 면역계의 세포에 활동 캐스케이드를 시작할 수 있습니다.
CNS에 이식 하는 장치의 경우 조직을 피해 외국 장치의 지속적인된 존재로 서 장치 삽입 glial 흉터 라고 하는 프로세스를 시작할 수 있습니다. 이 과정에서는 microglia 마이그레이션을 하 고 상해의 사이트에 확산. 그들은 또한 잠재적인 위협을 중화 하 고 모집 추가 glial 세포를 염증 인자의 방출을 시작 합니다. 그 후, 활성화 이다 hypertrophic 되 고 연속 섬유 장벽16이식된 장치를 캡슐화 시작. 염증 신호는 임 플 란 트의 주변에서 신경 프로세스의 철수를 촉진 하는 역할도 하 고 결국 개발 glial 흉터17강화 섬유 아 세포를 신병. Oligodendrocytes, 전도성, 강화 하기 위하여 myelin 신경 세포를 넣는 담당 할 하지이 과정 생존과 먼 셀 플에서 흉터18으로 분할 된다. Glial 흉터 크게 기능과 기록 전극, 특히 이식된 소자의 수명 감소 하 고 궁극적으로 신경 인터페이스19의 기능을 제한 하는 역할.
몇 가지 방법은 생체 적합성 및 CNS20,21,,2223에서 이식 장치 인터페이스 활동 증가 악용 되어 있다. 이러한 신경 인터페이스24의 생체 디자인에 광범위 한 검토를 이용하실 수 있습니다. 가장 눈에 띄는 전략 polyelthyleneglycol (PEG), 공동 glycolic polylactic 산 (PLGA)25, 같은 호환 코팅 전극 주변 또는 강화 폴 리 (에틸렌 등 전도성 폴리머와 전극 포함 dioxythiophene) (PEDOT), polypyrrole (PPy)26,,2728,29,30,31. 생리 활성 코팅 collagens, 히 알루 론 산32,33,34, fibronectins, 등 세포 외 매트릭스에서 파생 하는 ligands를 사용 하 여 신경 조직의 성장에 대 한 단서를 제공 하기 위해 고용 또한 있다 ,35,,3637. 성장 인자 릴리스 시스템을 흉내 낸 자연 세포 분 비 물30,38,39,,4041 이 코팅의 bioactivity 더 탐험 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50. 동시에, 일부 연구 그룹 전극 형상, 유연성, 및 구성 장치 및 조직51,52,53 사이 기계적인 불일치 감소을 개장 하기로 ,,5455,,5657. 그러나 이러한 전략 있는 많은 유망 개선 이어질 다음-세대 신경 계면 장치, 장기 호환성에 문제 이며 진행 복잡 하 고 시간이 걸리는 시내 vivo 모델에 의해 방해 받을 수 있습니다. .
동물 모델 기반 접근 실험 처리량을 제한 하 고 전극 생체 적합성 테스트의 비용을 증가 시킬 수 있습니다. 생체 외에서 기존의 세포 배양 기술을 더 비용 효율적인 대안을 제공 하지만 많은 장치 및 조직58사이 상호 작용의 복잡성을 정리 하지를 사용 하 여 접근 한다. 특히, 전극 형상의 모델링 및 기계적 불일치 및 micromotion 장치 오류59 기여 호스트 응답 생성을 생각 영향 문화 제한, 2D 셀을 사용 하 여 표면 코팅의 테스트 , 60.
2 차원 세포 배양과 관련 된 문제를 해결 하려면 신경 세포의 하이드로 겔 문화 개발 되었으며, 다양 한 응용 프로그램, 약리 연구61, 신경 세포 분화62, 질병을 이해 하는 것을 직접 경로63,64또는 다른 세포 유형 모델 셀 마이그레이션, neuroprotection, 또는 모델 조직 microenvironments61층된에 공동 문화. Hydrogels 쉽게 다른 크기로 형성 되 고 형상 기본 또는 불멸 하 게 한 세포 배양의 수많은 종류를 통합할 수 있습니다 매우 공초점 형광 현미경 등 일반적으로 사용 되 기술에 의해 분석을 받을. Glial 흉터 프로세스의 모델을 만들려면, 우리는 최근 개발과 이식된 전극 (그림 1)65glial 응답의 높은 처리량 테스트를 위해 히 알루 론 산 기반된 3 차원 하이드로 겔 시스템 특징. 이 시스템은 여러 가지 이점이 있다: 1) 3 차원 매트릭스 고분자 히 알루 론 산, 생 세포 외 매트릭스 구성;의 구성에서 기본 glial 세포 (microglia, 이다, 및 oligodendrocytes) 캡슐화 2)는 매트릭스 강성 조정 될 수 있다 '' 두뇌 또는 척수 조직;의 기계적 특성을 재현 하 그리고 3) 세포는 빠른 벤치탑 접근 제한 독성 캡슐화 중 녹색 빛으로 photopolymerization를 사용 하 여 매트릭스에 캡슐화 될 수 있습니다. 이 시스템은 생체 내에서 생체 적합성의 주요 기능 수 있습니다: 장치는 하이드로 겔 조직으로, 유사한 방식으로 삽입 되 고 이식된 장치에 세포질 응답은 다양 한 매개 변수65에 대 한 모니터링. 다양 한 구조와 전기 자극 펄스의 하이드로 겔 코팅, 기계 불일치나 장치 포함 됩니다. 이 시스템은 또한 oligodendrocyte 및 자주 존재 하 고 glial 흉터에 채용 관련된 선구자 포함 됩니다. 그들의 손상, 죽음, 그리고 microglia에 의해 식 균 작용은 매우 선 동적인 상해의 지표 그리고 모델 감소 흉터 또는 복구, 그들은 능력을 다시-myelination 뉴런66의 설명.
여기는 합성 및 하이브리드 히 알루 론 산 hydrogels 셀 병합을 개선 하기 위해 상용 지하실 멤브레인 공법으로 결합의 형성 하는 방법에 설명 합니다. 또한, 우리는 기본 교양된 glial 세포 (microglia, 이다, 및 oligodendrocytes)의 설립 및 문화 성장 immunocytochemistry 그리고 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 분석을 시연할 예정 이다.
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Protocol
주 1 Sprague Dawley 쥐 새끼, 잘린에 의해 안락사에서 뇌 조직 추출 프로토콜 동물 관리 및 사용 위원회 앨버타의 대학에 의해 승인 되었다.
1. Microglia 및 사이토 격리67,68
참고: 격리 및 세포 배양에 대 한 모든 미디어는 물 욕조에 37 ° c으로 미리 데워 행 크의 균형된 소금물 (HBSS)는 1% 페니실린-스 (PS). 모든 Dulbecco의 햄의 F12 영양소 혼합 (DMEM/F12) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린-스 (PS) 보충은 글의 미디어를 수정 합니다. 트립 신으로 유일한 혼합물 FBS 부족합니다. 이 프로토콜에서 모든 물질이 살 균 (필터, 알코올, 산, 고 압력가) 고 단계 번호 1.8 이후 모든 단계 biosafety 무 균 기법으로 캐비닛에서 수행 됩니다.
- 뇌, 당 전 15 mL HBSS의 그리고 12.5 mL 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에서 37 ° C에 DMEM/F12 약 2 mL 1 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 0.25 %trypsin 열. DMEM/F12의 추가 25 mL가 열. 효소 활동의 손실을 방지 하기 위해 사용 하 여 따뜻한 트립 신 약 10 분 전에.
- 살 균, 6 충분 한 따뜻한 HBSS 붓고와 표면 하 10 cm 문화 요리. 한 10 cm 접시 마다 2 개의 두뇌에 대 한 더하기 추가로 6 cm 접시를 준비 합니다.
- 각 10 cm2 접시 (그림 2A)에 최대 2 두뇌를 놓습니다.
- 해 부 현미경 아래 곡선 및 직선 겸 자 사용 하 여 뇌 줄기 따라 중간, 그리고 소 뇌 외피가 구분. 이 뇌 (그림 2B) 당 조직의 3 개의 섹션을 생성합니다.
- 혈관 조직 및 삭제, 별도 문화 그릇에 남은 조직 전송의 각 섹션에서 포함 된 조직의 얇은, 반투명, 레이어 (meninges) 껍질. 집게와 조직의 상처에 의해 노출 되는 얇은 층을 파악 하 고 주요 부분은 '걸려' 뇌 조직 때까지 조심 스럽게 빼냅니다. 마지막으로 부드럽게 잡아 당 겼 여이 부분을 제거 합니다. 그림 2C참조-2E 전에, 동안, 그리고이 단계 후의 대표 이미지.
- Biosafety 내각에서 나머지 HBSS 신중 하 게 유지 하는 조직 문화 접시에서 제거 합니다. 메스와 조직 macerate 하 고 조직을 트립 신으로 미리 데워 15 mL 튜브에 전송.
- 조직을 효소 소화 37 ° C 목욕에서 25 분이 튜브를 품 어.
- 실 온에서 2 분 동안 500 x g에서 다운 튜브를 원심과 상쾌한 밖으로 붓는 다.
- 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 조직 헤어 따뜻한 DMEM/F12 비활성화는 트립 신을 triturate 솔루션 5 번의 10 mL를 추가 합니다.
- 실 온에서 2 분 동안 500 x g에서 다운 튜브를 원심과 상쾌한 밖으로 붓는 다.
- 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 다시 따뜻한 DMEM/F12의 10 mL에 펠 릿을 일시 중단 하 고 솔루션 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 전송.
- 18 게이지 바늘 10 mL 주사기를 사용 하 여, triturate 솔루션 3 번.
- 따뜻한 DMEM/F12 뇌 당 12.5 mL 씩으로이 솔루션을 배포 합니다.
- 12에 triturated 솔루션의 피 펫 1 mL 씩 잘 (뇌 당 1) 접시.
- 습도 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO2에서 품 어. 3 일 후, 미디어를 교체 하 고 모든 후속 3 일 미디어를 새로 고침. 2 주 후, 실험에 대 한 셀을 수집할 수 있습니다.
2. Macromer 종합69
- 히 알루 론 산 (HA) 소금의 375 mg 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브 무게 고 37.5 mL의 증류수를 추가 합니다.
- 1 분 동안 vortexer와 함께 솔루션을 플러시 하 고 동질적인 나타납니다의 젤 같은 점도 잃는 때까지 혼합물을 sonicate. 이 프로세스는 6 h를 걸릴 수 있습니다.
- 자기와 함께 100 mL 비 커에 전송 솔루션 (38mm), 바 저 어 하 고 실 온에서 적극적으로 저 어.
- 8과 12 사이 pH 안정화 될 때까지 신중 하 게 혼합 하 고 pH 종이 측정으로 5.0 M NaOH 적정.
- 보관 시 질소 blanketed 신선한 酸 무수 물 (MA, 94%)의 3 mL를 수집 합니다.
참고: MA 긴 기간에 대 한 분위기에 노출은 (일), 그것은 그것의 반응성을 잃을 것 이다.
주의: 엄마의 모든 사용 증기 두건에서 이루어져야 합니다. - 혼합 HA 솔루션으로 엄마의 200 µ L를 추가 합니다. 반응 8 아래 솔루션의 pH를 낮춘 다.
- 2.4 2.6 단계를 반복 하 여 엄마의 3 mL 솔루션에 추가 되었습니다. 이 과정은 1-2 h까지 걸릴 수 있습니다.
- 반응 혼합 하지 않고 4 ° C에서 밤새 계속 허용 합니다.
- 400 ml 500 mL 비 커에 찬 에탄올 (EtOH)의 솔루션을 전송 및 4 ° c.에 24-72 h에 대 한 강 수를 허용 56
- 신중 하 게 처리, 별도 비 커에는 솔루션의 주요 부분을 가만히 따르다을 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 침전을 수집 합니다. 이 필요한 경우 2-4 튜브에 배포할 수 있습니다.
- 실내 온도 상쾌한의 dispose에서 2 분 동안 원심 분리기에서 200 x g에서 튜브 원심
- 차가운 EtOH와 튜브 top 가기 하 고 1 분 동안 vortexer 솔루션 혼합 단계 2.10 2.11 반복.
- 살 균 이온된 물 25 mL를 추가, 1 분 동안 vortexer 솔루션 혼합, sonicate (> 20 kHz) 1 시간, 및 4 ° C에서 밤새 품 어.
- 15 분 또는 때까지 동결-80 ° C 냉동 고에서 솔루션 배치 또는 플래시 동결에 액체 질소.
주의: 액체 질소를 사용할 경우 사용 하 여 보호 장갑, 얼굴 방패, 및 앞치마. - 동결 건조 24-48 시간 (아래 0.1 mBar-30 ° C) 튜브 눈 모양의 분말 생산 될 때까지.
- 이 시점에서 1H 핵 자기 공명, HA 등뼈에 메타 크 릴 산 양성자 (6.1 및 5.6 ppm에서 봉우리) 메 틸 양성자 (1.9 p p m), 기준의 금액을 확인할 수 있습니다 통해 순도 대 한 샘플 테스트. 95% 메타 크 릴 산 메 틸 양성자에의 최소 비율 허용 됩니다. 69
3. 젤 형성 및 3D 캡슐화65
-
Coverslip 및 금형 준비
- 2%의 증류수 50 mL 물 솔루션 3-(Trimethoxysilyl) 틸 메타 크 릴 산 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에서.
- 18 m m 유리 coverslips를 솔루션 및 실 온에서 1 h에 대 한 바위에 놓습니다. 50 coverslips까지 한 번에 추가할 수 있습니다.
- Coverslips 직렬 3 비 커 100ml 이온된 물에 각각 담거 서 린스.
- 40 ° C 하룻밤 desiccator와 오븐에서 진공 상태에서 coverslips를 건조.
- 신속 하 게 담가 70%에서 개별 coverslips EtOH 집게와.
- 건조 하지 않고 12 잘 접시의 우물에 각 coverslip 드롭.
- 세척 하 고 살 균 이온된 수 (우물 당 1 mL)으로 각 잘 발음.
- 각 잘을 1 mL의 멸 균 2 µ g /mL 폴 리-L-리 신 (PLL)를 추가 하 고 위해 품 어 > 2 h.
- PLL 솔루션을 발음 하 고 건조 공기를 coverslips 있습니다.
- Polydimethyl 실록 산 (PDMS) 형 ( 그림 1참조) 70 %EtOH, 및 각 coverslip의 센터에 장소 하나에 담가 건조 공기를 허용 하 고 형과 유리 사이 물개를 만들.
- 폴리스 티 렌 접시 바닥에 10:1 비율에서 PDMS 섞은 약을 캐스팅 하 여 PDMS 몰드를 준비 합니다. 준비 된 PDMS의 수량 약 1 m m 두꺼운 시트를 선택 합니다. 10의 내부 직경을 가진 원형 펀치와 함께 시트를 잘라 PDMS에의 모양 우물을
-
세포 준비
참고: 프로토콜에서 모든 단계는 biosafety 캐비닛에 무 균 기법으로 수행 됩니다. 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)은 모든 단계에 대 한 pH 7.4에 조정 된다.- 하 마에 셀 캡슐화 하기 전에 24 시간 12 잘 플레이트에 (에서 단계 1.15) 2 주 기본 문화권에 대 한 매체를 새로 고칩니다. DMEM/F12의 1 mL을 추가 (10 %FBS 1 %PS) 잘 당 중간.
- 셀의 각 12-잘 접시 준비의 희석 trypsin (0.25% trypsin EDTA 희석 30 %DMEM / F12 미디어), 12.5 mL 25 mL DMEM/F12 (10 %FBS 1 %PS)에 따뜻한 물 욕조에 37 ° C에서.
- 10 mL 혈 청 학적인 피 펫 (> 0.5 mL 잘 당)를 사용 하 여 격판덮개에서 조절된 매체를 수집, 철저 하 게 남은 액체, 발음 및까지 희석 트립 신 (0.075% 트립 신-EDTA) (37 ° C, 5% CO2) 인큐베이터에서 20-30 분의 당 1 mL를 바꿉니다 confluent 셀 레이어 접시에서 분리합니다.
- 1 mL 피 펫 (단일 부동 조각으로 표시)와 정지 셀 자료를 복구 하 고 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 수집 합니다. DMEM/f 12의 동등한 양으로 희석 (10 %FBS 1 %PS), 그리고 삭제는 상쾌한 실내 온도에 2 분 동안 200 x g에서 원심 분리기.
- Resuspend 셀 펠 릿 10 ml에서 따뜻한 DMEM/F12 (10 %FBS 1 %PS), triturate 셀 10 mL 피 펫을 5 번 하 고 2 분 200 x g에서 원심.
- 상쾌한 가만히 따르다, 다시 5 mL에 셀 중단 DMEM/F12, 따뜻하고 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 세포를 전송.
- 18 게이지 바늘 10 mL 주사기를 사용 하 여, triturate 셀 솔루션 3 번 하 고 새로운 원뿔 원심 분리기 튜브로 40 µ m 세포 체를 통해 정지를 필터링 합니다.
- 세포 현 탁 액의 10 µ L를 수집, 따뜻한 DMEM/F12, 및 자동화 된 셀 카운터 카운트 셀에서 1: 100 희석
- 캡슐화 단계까지 37 ° C 물 욕조에 품 어.
-
셀 캡슐화
참고: 프로토콜에서 모든 단계는 biosafety 캐비닛에 무 균 기법으로 수행 됩니다.- 3D의 각 12-잘 접시 hydrogels DMEM/F12의 12.5 mL 및 셀 준비 하는 동안 수집 된 바른된 DMEM/F12 미디어의 12.5 mL 따뜻한.
- Methacrylated 히 알루 론 산 (하 마) 최종 농도 0.5 %wt / vol.의 분해 (2 %wt / vol);의 농도에서 살 균 필터링 된 PBS에이 마에 필요한 양의 무게 최종 농도 보다 4 배 높은 농도 세포 및 다른 시 약의 추가 수용 하기 위하여 이용 된다. 한 12 잘 접시 hydrogels 필요 7 mg 하 마와 ~ 350 µ L PBS.
- Sonicate (> 20 kHz) 솔루션 하 마 60 분 동안 완전히 해산 될 때까지.
- Triethanolamine (차) 및 1-비닐-2-pyrrolidinone (NVP), 개별 10% 솔루션 및 살 균 PBS pH 7.4의 1 mL aliquots에서 1 m m 솔루션 오신 Y (EY)의 준비.
- 한 12 음 접시에 대 한 확인 1 x 10의 최종 1.4 mL 혼합7 셀, 0.5 %wt / 집 하 마 (2 %wt / 집의 350 µ L), 0.1% 차 (10%의 14 µ L), 0.1 %NVP (10%의 14 µ L), 0.01 m m EY (1 m m의 14 µ L) 그리고 20% 기저 lamina 혼합물 (재고의 280 µ L). 나머지 볼륨은 PBS.
- 부드럽게 솔루션을 혼합 하 고 1 mL 팁 각 PDMS 몰드로 100 µ L를 플라스틱.
- 샘플 높은 강도 녹색 LED 빛에 노출 (~ 520 nm, 60 mW는 동봉 된 20 cm x 20 cm x 20 cm 상자에에서) 실 온에서 5 분.
- 12 잘 접시에 따뜻한 조건된 DMEM/F12의 당 1 mL를 추가 합니다.
- 각 coverslip 엄지와 검지로 잡고, 천천히 젤, 치환 하지 않도록 주의 되 고 곡선된 핀셋으로 PDMS 몰드를 벗기다 고 그것 조절된 매체와 잘 합니다.
- 추가 1 mL을 추가 각 잘 DMEM/F12 따뜻한.
- 2 주 동안, 각 우물에서 미디어의 pipetting 1 mL에 의해 매주 셀 미디어를 상쾌하 고 1 mL DMEM/F12 교체 5% CO2 와 37 ° C에서 접시를 품 어.
4입니다. 현미경
-
Immunocytochemistry
참고: 거꾸로 confocal 현미경이이 샘플 이미지를 사용 했다 고 ImageJ 처리 하 고 이미지를 표시 하는 데 사용 되었다. Microglia, 이다, oligodendrocytes, 및 핵, 3 주 후에 하 마 문화 표시 됩니다.- 10 %PBS 버퍼링 포 르 말린 (pH 7.0) 37 ° C 욕조에 예 열.
주의: 포 르 말린 증기 두건 밖에 서 사용할 수 있습니다, 하지만이 자료는 조직와 반응 이며 항상 관심과 장갑 처리 되어야 합니다. 그것은 별도로 삭제 해야 합니다. - 신중 하 게 각 우물에 접시와 피 펫 10% 포 르 말린의 1 mL에서 미디어 발음.
- 5% CO2 20 분 동안 37 ° C에서 번호판을 품 어.
- 각 접시에서 액체를 발음 하 고, 플라스틱 2 mL PBS (pH 7.4)의 각 음에 15 분 동안 품 어.
- 4.1.4 단계를 두 번 반복 합니다.
- 접시에서 액체를 발음, 10% 정상 말 혈 청 (NHS)와 0.5% 트라이 톤 X-100, PBS의 잘 당 1 mL을 추가 하 고 최소 속도로 부드럽게 바위) 1 시간에 대 한.
- 4.1.4 단계를 세 번 반복 합니다.
- 액체를 발음 하 고 PBS에 다음 혼합물의 당 1 mL을 추가: 토끼 이온화 칼슘 바인딩 어댑터 분자 (Iba1) 1:1, 000, 닭고기 glial fibrillary 단백질 (GFAP) 1:5, 000, 마우스 2', 3'-주기적-nucelotide 3'-phophodiesterase (CNPase) 1:1, 000, 1% 보 건국 0.1% 세포 꿰 뚫는 계면 활성 제. 품 어 4 ° C에서 하룻밤, 접시를 최대한 부드럽게 락.
- 사이 세 번 1 h 외피와 4.1.4 단계를 반복 합니다.
- 액체를 발음 하 고 PBS에 다음 혼합물의 당 1 mL을 추가: 647 nm 흥분 당나귀 안티 토끼 항 체 1: 200, 546 nm 흥분 염소 안티 닭 항 체 1: 200, 488 nm 흥분 당나귀 반대로 마우스 항 체 1: 200, 1% 보 건국, 1:1,000 파란 핵 얼룩. 부드럽게 접시 락 1 시간 실 온에서 품 어.
- 사이 세 번 1 h 외피와 4 단계를 반복 합니다.
- 유지는 hydrogels, 버퍼, 발음 하 고 설치 중간에 밖으로 1 분 피 펫에 대 한 셀 장착 매체의 0.5 mL에 그들을 담가 부드럽게 유리 사이의 계층 젤 위에 coverslip 장소. 하이드로 겔의 건조를 방지 하기 위해 coverslips의 발견된 측에 장착 매체의 작은 금액을 추가 합니다.
참고: 문제 해결을 위해, 젤 수 수 몇 군데 단계 4.1.11에. 더 처리 하기 전에 적절 한 라벨을 참조 하십시오.
- 10 %PBS 버퍼링 포 르 말린 (pH 7.0) 37 ° C 욕조에 예 열.
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스캐닝 전자 현미경 (SEM)
참고: 시각화는 히드로, 스캐닝 전자 현미경이이 샘플 이미지를 사용 되었다.- 전 2.5%도 및 2% paraformaldehyde PBS (0.1 M)에서 37 ° C 물 목욕에서 통 혼합 열.
주의:이 시 약 조직, 반응성이 매우 높은 이며 진료와 장갑 처리 합니다. 그들은 가능한 한 많이 연기 후드에 처리 한다 고 별도로 삭제. - 세포 배양 배지에서 매체를 발음 하 고 미리가 열된 통 혼합물의 1 mL를 추가 합니다.
- 5% CO2 20 분 동안 37 ° C에서 번호판을 품 어.
- 4 ° C (냉장고/쿨러)에 하룻밤 접시를 놓습니다.
- 우물에서 통 솔루션을 발음 하 고 PBS의 1 mL를 추가 합니다.
- 각 접시에서 액체를 발음, 각 음에 PBS의 2 개 mL를 추가 하 고 15 분 동안 품 어.
- 단계 4.2.6 두 번 더 반복 합니다.
- PBS를 발음 하 고 1% 오스뮴 tetraoxide 각 우물에 PBS에 버퍼의 1 mL를 추가 합니다.
참고: 샘플, 건조 될 때까지 모든 후속 단계 및이 단계에서에서 수행 됩니다 증기 두건. - 액체에서 30 분 오스뮴 증기 같은 접시;에 다른 샘플을 수정할 수 있습니다에 대 한 발생 하는 고정 허용 따라서, 그에 따라 샘플을 분할 하기 전에이 단계.
주의: 오스뮴 tetraoxide 높은 조직으로 반응 하 고 휘발성 이다. 그것은 위험 하며 장갑과 증기 두건에서 처리 되어야 합니다. 그것은 및 즉시 세척 되어야 disposed 별도로. - 4.2.6 단계를 세 번 반복 합니다.
- 액체를 발음 탈수 혼합물 순서 대로 아래 목록에 추가 하 고 지정 된 시간에 대 한 (실내 온도)를 품 어. 에탄올 (EtOH) hexamethyldisilazane (HMDS) 다음 다음 점차적으로 추가 하 여 시작 합니다. 각 증분에 표 2 를 참조 하십시오.
참고: HMDS를 추가 하는 경우는 coverslips 고 수 있습니다 강력 하 게 플라스틱을 제거 하기 매우 어려운 될. 이 후 HMDS의 첫 번째 응용 프로그램 유리 슬립 아래 작은 플라스틱 플랫폼을 배치 하 여 방지할 수 있습니다. 두 번째 EtOH 부 화 후 샘플 촬영 고 액체 질소 동결 골절 샘플 몇 초 동안 침묵 될 수 있습니다. - 조심 스럽게 말린된 샘플을 제거 하 고 이중 양면된 전도성 테이프와 스캐닝 전자 현미경 명세서에 샘플을 탑재.
- 스퍼터 코트 최소한 골드의 샘플. 홀더 샘플 놓고 15 시 2 분에 대 한 기계 작동 mA.
- 전 2.5%도 및 2% paraformaldehyde PBS (0.1 M)에서 37 ° C 물 목욕에서 통 혼합 열.
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Representative Results
신경 조직 호스트 응답 및 높은 처리량 glial 흉터를, 에서 시험관 시스템 생체, 원래의 장소에 형성 하는 동안 세포 독성 이벤트를 초래 하지 않습니다 이며 대 행렬 자료와 3D 셀 비 계 필요 로 자비로 운 응답 가이드 bioactive 구성 요소. 이 위해, 우리 히 알루 론 산에 따라 3D 셀 발판 시스템 하 고 캡슐화 기본 혼합된 glial 세포 인구 세포 세포 상호 작용 및 glial bioreactivity 공부 하. 세포와 발판의 간단한 시각적 연구 수행 되었다. Oligodendrocytes (CNPase 녹색에)를 포함 하 여 셀 부분 모집단의 형태 microglia 빨간색에서 (Iba1), 이다 (노란색에서 GFAP), confocal immunofluorescent 현미경 검사 법 (그림 3Ai-ii-Ci-ii)에 의해 표시 됩니다. 결합 된 비 계 및 셀 형태 또한 SEM (그림 3Aiii-4-Ciii iv)으로 표시 됩니다. 이 이미지에서 낮은 (i, iii)와 높은 (ii와 iv) 해상도 대표 이미지를 모두 표시 됩니다. 2D PLL coverslip 코팅 (그림 3A)는 3D 0.5 %w / v 하 비 계 (그림 3B), 및 20 %v / v 기저 lamina 혼합물 0.5 %w / v 마 (그림 3C)의 혼합물에 비해 했다. 이 발판 생물학 lamina 도입의 효과 뿐만 아니라 2D와 3D 세포 배양 형태학 적 차이 설명 하기 위해 수행 되었다. 3 차원 재구성도 추가 정보에 제공 됩니다.
3D 플랫폼의 도입으로 변경 된 각 셀 형식의 세포 형태로 2D 부착 문화 (PLL 코팅 유리 coverslips)에서 oligodendrocytes 일반적으로 라운드 등장 하 고 가볍게 연결 일반적으로 구성 된 소규모 네트워크 표시 GFAP 프로세스. Microglia 다른 세포 보다 작은 되었고 그들의 셀 시체까지 확장 하지 않았다 작은 분기 프로세스를 했다 (< 20 µ m). 이다 했다 더 diversely 모양, 작은 셀 시체와 광범위 한 얇은, 분기 프로세스, 방사형 형태학 동안 다른 병합된 모양 및 표면을 몇 가지 광범위 한 프로세스와 섬유 데 일부. 3D 하 마 문화에서 oligodendrocytes 클러스터 작은 구체로 분기 하는 데에 나타났다. Microglia 했다 몇 가지 프로세스와 라운드 그리고 이다 둥근 또는 단일 클러스터에서 네트워크로 광선으로 분기 했다. 일반적으로, 이러한 셀을 단일 지점에서 능가 하거나 만들기 없이 하 마의 영역에 남아 등장는 달리 2D 문화 이며 매트릭스를 통해 한정 된 기동성의 암시는 다른 세포와 접촉. 20 %v / v 기저 lamina 혼합물의 사진 중 합 혼합물에 추가 되었습니다, 모든 폐해 하위 3D 플랫폼으로 통합 하 고 더 광범위 한, 대화형 분기 구조를 형성. Oligodendrocytes 비 기저 lamina 혼합물 형태학에 광선 유사한 주먹코 프로세스를 확장 하지만 또한 사이토 프로세스는 비 계를 통해 분기의 얇은 상호 연결 된 네트워크에 따라 프로세스를 확장 하 등장. Microglia 얇은 프로세스 조직에 그들의 형태학과 더 일치와 밖으로 확산 하는 데 이러한 세포 네트워크 중 이산 했다. 전반적으로는 형태학 명과 자유롭게 하 마 기저 lamina 혼합물으로 통합의 잠재적으로 혼합된 기판에 어느 증가 준수를 통해 또는 발판을 개장 하는 증가 기능을 통해 모든 3 종류를 제안 합니다.
SEM으로 관찰 하면 세포 형태학 confocal 현미경 확증을 보였다. 하 마 매트릭스 10-50 μ m 모 공 표면 아래 희미하게 볼과 매끄러운 표면으로 등장. 셀 했다은 하 마의 표면에 부착 아래 레이어에 희미하게 표시도 했다. 그러나 광범위 한 네트워킹 관찰 되었다 기저 lamina 혼합물의 추가 함께이 명과 2D 문화에 그 비교 형태학을 형성 하지 않았다. Microglia의 작은 클러스터와 함께 두꺼운 사이토 섬유 모두 하 마 기저 lamina 혼합물 표면 및 원활한 방식으로 매트릭스를 통해 확장에 관찰 되었다. 이 매트릭스는 셀 주변에 접혀 셀 그들의 원하는 conformations로 형성 하는 비 계 변경 될 수 있습니다 제안으로 희미하게 볼 수 있습니다.
그림 1: methacrylated 히 알루 론 산 (하 마)의 도식-3D 세포 배양 및 photopolymerization 프로토콜을 기반으로. Glial 세포 (2 주 기본 쥐 뇌 문화)는 하 마와 함께 혼합 하 고 유리 coverslip에입니다 (PDMS) 형으로 pipetted. 이 혼합물은 5 분 동안 하이드로 겔을 유해 하는 높은 강도 녹색 LED 빛에 노출 됩니다. 곰 팡이 제거 되 고 젤 미디어에서 알을 품는. 대표 셀 등 microglia (빨간색), 이다 (노란색), oligodendrocytes (녹색). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 하루 1 Sprague Dawley 쥐 강아지 뇌의 해 부. 뇌 (A), 외피가 및 소 뇌 (B), meninges (C), 집게 (D)와 meninges의 박 리와 단일 피 질과 meninge 무료 피 질 (E)의 해 부의 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: Immunofluorescent confocal (i-ii) 그리고 혼합된 명과 세포 인구 2D PLL 코팅 (A), 하 마 (B), 그리고 하 마 기저 lamina 혼합 (C)에서 전자 (3 세-4 세) 현미경 검사. (I, iii)과 (ii, iv) 높은 확대 이미지가 표시 됩니다. 레이블은 microglia, GFAP 이다, oligodendrocytes, 그린에서 CNPase 그리고 Hoechst 핵 얼룩에 대 한 노란색 빨간색에 Iba1를 포함합니다. 스케일 바 = confocal 이미지 25 µ m 및 50 (iii) 전자 현미경 스캐닝을 위해 20 µ m (iv). Hydrogels 0.5 %w / v, 그리고 혼합 기저 lamina 볼륨 20% 이었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 1: 3D immunofluorescent 마이크로그래프 개조와 하 마-기저 lamina 혼합물의 혼합 명과 세포 인구 하 마 기저 lamina 혼합물. 레이블은 microglia, GFAP 이다, oligodendrocytes, 그린에서 CNPase 그리고 Hoechst 핵 얼룩에 대 한 노란색 빨간색에 Iba1를 포함합니다. Hydrogels 0.5 %w / v, 그리고 Getrex 볼륨 20% 이었다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
| 하 마 | 기저 Lamina | NVP | 차 | EY | |
| 작업 농도 | 0.5 %w / v | 20 %v / v | 0.10% | 0.10% | .01 mM |
| 12-잘 접시 | 2 %w / v | 100 %w / v | 10 %v / v | 10 %v / v | 1mm |
| 1.4 mL 총 | 350 Μ L | 280 Μ L | 14 Μ L | 14 Μ L | 14 Μ L |
표 1: 세포 캡슐화의 예입니다.
| 구성 요소 | 콘텐츠 | 보육 시간 |
| EtOH | 30% | 30 분 |
| EtOH | 50% | 30 분 |
| EtOH | 70% | 30 분 |
| EtOH | 90% | 20 분 |
| EtOH | 100% | 20 분 |
| EtOH | 100% | 20 분 |
| EtOH:HMDS | 과 | 20 분 |
| EtOH:HMDS | 50:50:00 | 20 분 |
| EtOH:HMDS | 과 | 20 분 |
| HMDS | 100% | 20 분 |
| HMDS | 100% | 하룻밤 |
표 2: EtOH와 탈수에 HMDS의 점진적 증가.
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Discussion
모델 glial bioreactivity 3 차원 문화 시스템 및 glial 흉터 프로세스 생성의 목표를 향해 우리 셀의 강력한 묘사를 가능 하 게 이다 및 oligodendrocytes 기본 교양된 microglia를 지원할 수 있는 시스템을 개발 했습니다. 형태학 및 세포 세포 상호 작용입니다. 표시 하는 현미경 사진에서 각 셀 형식의 형태학이 달랐다 분명히 2D, 3D-하 마, 그리고 3D 하 마 기저 lamina 혼합 플랫폼. 2D 시스템에서의 표면, 평면 형태 치우친 분명히 있었으나 3D 하 마에 비해 microglia 및 이다 oligodendrocyte 클러스터 제외한 매트릭스 안에 일반적으로 더 작은. 스캐닝 전자 현미경에서 세포 했다 일반적으로 더는 하 마에 둥근 모양. 이것은 크게 운동 및 자유로운 이동 및 프로세스의 성장에 대 한 행렬을 수정 하려면 제한 된 용량으로 캡슐화 되 고 셀 원인일 수 있습니다. 하 마에서 셀 파생물 이다와 oligodendrocytes에 대 한 일반적으로 레이디얼 이었다. 이러한 확장된 프로세스 세포, 동안 그들의 조직 제안 매트릭스와 다른 세포와 상호 작용 하는 능력을 통해 그들의 운동을 제한 했다. 또한, 이전 작업 상호 네트워킹, 파생물65,70의이 부족을 설명할 수 없이 다공성 수 하 마 동결 골절을 보이고 있다. 그러나 그것은이 세포의 일부는 매트릭스에 남아 있는 보존 photopolymerization 살아나지 않았다, 생존에 체계적으로 평가 되었다 우리의 이전 일 및 주65의 과정을 통해 80% (0.5 %w / v)를 유지 수도 있습니다.
3D 문화에서 매트릭스와 셀의 상호 작용을 개선 하기 위해, 우리는 생체 대 매트릭스 구성 요소로 혼합 기저 lamina를 도입. 행렬 셀 통합 2D 문화 및 3D 하 마에 비해 광범위 한 프로세스를 보여주는 모든 셀 종류와 현저 하 게 향상 시킬 발견 됐다. 혼합 기저 lamina는 다양 한 기저 lamina 구성 요소를 구성 하 고 주로 신경 줄기 세포 선구자71의 폐해 차별화를 지원 하기 위해 공식화 했다. Glial 세포는 기저 lamina 혼합, 그리고 이후 주변 3D 매트릭스에 응답 하지만 통합의 범위는 건강 한 조직 같은 환경 제안 예기치 않은 일이 아니었다. 하 마 하 마 기저 lamina 혼합물에 비교, 히드로 형태학은 엄연히 다른 표시 되지 않습니다, 그리고 따라서 세포 더 적극적으로 리 모델링 그것 수 있습니다. 이 생리 활성 구성 요소를 추가의 단순, 고려 그것은 뉴런에 대 한 문화 조건 호의를 다른 laminas 단백질 신호 사용할 상상할 수 없는. 잠재적인 미래 방향,이 시스템에서에서 차별화 하는 뉴런 신경 창시자 강렬한 myelination 또는 신경 염증 부상 모델의 다양 한 혼합된 명과 함께에서 사용 될 수 있습니다.
심각 하 고 파괴적인 CNS 상해 또는 소재 거부 시 주민 조직 염증 반응을 악화 neurodegeneration 및 demyelination의 시작 합니다. 이 일반적으로 파티션 재생성을 방지 시키는 상해의 사이트 glial 흉터의 형성에 결과. 이 연구에서 메서드는 methacrylated 사진 생산 히 알루 론 산 기반 3D 비 계 glial 흉터 대형; 뒤에 초기 세포 응답을 모델링 하는 의도로 대 한 자세한 했다 microglial 반응, 사이토 모집과 비 대, 그리고 oligodendrocyte 부상 및 철수 3D 세포 비 계 모든 3 개의 glial 세포 유형, 통합 하도록 설계 되었습니다 그리고 더 기저 lamina 다 성분 혼합물으로 바뀌었습니다. 그것은 confocal 및 스캐닝 전자 현미경 이미징, 세포는 하 마에 캡슐화 된 고 했다 더 나은 때 기저 lamina 혼합물 도입 되었다 통합 하 여, 결정 했다. 이러한 결과 여러 가지 새로운 응용 프로그램에 발생할 수 있습니다. 하 마 혼자 공동 문화 시스템 셀을 상호 작용을 제한 하는 것입니다 의도 또는 연구 모르는 마약 로드 확산 제한 된 매트릭스로 젤을 사용 하 여 약물 전달 봉사 수 있습니다. Hydrogels 하 마 매트릭스에 기저 lamina 혼합물을 통합 보다 일관성 있는 조직 처럼 환경에 대 한 급성 염증, gliosis, 또는 glial 흉터를 모델링할 수 있도록 하 고 폐해의 더 높은 처리량 특성 bioreactivity 임 플 란 트, 약물 및 장치 개발 및 다른 전략을 줄이고 염증 부상 회복.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 NSERC, CFI, AIHS, 알버타 헬스 서비스, 그리고 뇌 연구를 위한 비 기부금에서 재정 지원에 대 한 감사.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Materials for HAMA synthesis and photopolymerization | |||
| Hyaluronic acid (HA) | Sigma-Aldrich | 53747-10G | Streptococcus equi, MW: 1.5 - 1.8 X 10^6 |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 275585-100ML | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| Ethanol (EtOH) | Commerical Alcohols Inc. | Anhydrous | |
| Phosphate buffered saline (pH 7.4) tablets | Fisher Scientific | 18912014 | |
| Triethanolamine (TEA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| 1-Vinyl-2pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | |
| EosinY (EY) | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 440159-100ML | |
| Beaker (100 mL) | Corning | 1000-100 | |
| Beaker (500 mL) | Corning | 1000-600 | |
| pH paper (Labstick) | Sigma-Aldrich | 9580 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2. Materials for glial cell isolation and cell culture | |||
| P1-2 Sprague Dawley rat pups | Charles River | CD Sprague Dawley rat strain code 001 | |
| Dissector scissors - slim blades (small) | Fine Science Tools | 14081-09 | |
| Surgical scissors - Toughcut (large) | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11521-10 | |
| Curved fine forceps (Dumont #7) | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14170-112 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
| Penicillin-streptomycin (PS) | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 12483-020 | |
| 0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Gibco | 25200-072 | |
| Poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P-6282 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-5 | |
| 12 well Tissue culture treated plates (Cellstar) | Greiner Bio-One | 665 108 | |
| 10 mL serological pipette | Fisher Scientific | 13-676-10F | |
| 25 mL serological pipette | Fisher Scientific | 12-676-10K | |
| Petri dish (60 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri dish (100 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Microscope Coverslip (18 mm) | Fisher Scientific | 12-545-100 18CIR | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3. Materials for microscopy (confocal and scanning electron microscopy) | |||
| Mouse monoclonal anti-CNPase | abcam | ab6319 | |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako Laboratory Chemicals | 019-17741 | |
| Chicken anti-GFAP | abcam | ab4674 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | |
| Fluoromount-G | Fisher Scientific | 00-4958-02 | |
| Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Buffered (10%) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Paraformaldehyde | Electon Microscopy Sciences | 157-8 | Buffered (8%) |
| Guteraldehyde | Electon Microscopy Sciences | 16019 | Buffered (8%) |
| Osmium tetraoxide | Electon Microscopy Sciences | 19152 | Buffered (2%) |
| Hexamethyldilazane (HMDS) | Electon Microscopy Sciences | 16700 | |
| Ethanol (EtOH) | Electon Microscopy Sciences | 15055 | Anhydrous |
| Microscope Slide (25 X 75 X 1 mm) | VWR International | 48311-703 |
References
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