Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Forbedret 3D Hydrogel kulturer af primære Glial celler for In Vitro modellering af Neuroinflammation

Published: December 8, 2017 doi: 10.3791/56615
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,3, 1,2,4, 3, 1,2,5
1Department of Psychiatry, University of Alberta, 2Alberta Innovates-Health Solutions Interdisciplinary Team in Smart Neural Prostheses (Project SMART), University of Alberta, 3Department of Chemical and Materials Engineering, University of Alberta, 4Division of Physical Medicine and Rehabilitation, University of Alberta, 5Centre for Neuroscience, University of Alberta

Summary

Heri, præsenterer vi en protokol til rotte 3D kultur hjerne-afledte glia celler, herunder astrocytter, mikroglia og oligodendrocytes. Vi demonstrere primære cellekultur, methacrylated hyaluronsyre (HAMA) hydrogel syntese, HAMAphoto-polymerisation og celle indkapsling og prøve behandling for Konfokal og scanning elektron mikroskopisk billeddannelse.

Abstract

I det centrale nervesystem, mange akutte skader og neurodegenerative sygdomme, såvel som implanterede enheder eller biomaterialer manipuleret til at forbedre funktion resultat i det samme resultat: overskydende betændelse fører til gliosis, cytotoksicitet, og/eller dannelsen af et glial ar, der kollektivt forværre skaden eller forhindre sund opsving. Med hensigten at skabe et system til model glial ar dannelse og undersøgelse inflammatoriske processer, vi har skabt en 3D celle stillads i stand til at boliger primære kulturperler glial celler: mikroglia, der regulerer fremmedlegeme svar og indlede den inflammatorisk begivenhed, astrocytter, der svare til at danne et fibrøst ar og oligodendrocytes, der er typisk udsatte for inflammatoriske skade. Den nuværende arbejde giver et detaljeret trinvis metode til fabrikation, kultur og mikroskopiske karakterisering af hyaluronsyre-baseret 3D hydrogel stillads med indkapslede rotte hjerne-afledte gliaceller. Yderligere, protokoller for karakterisering af celle indkapsling og hydrogel stillads af Konfokal immunofluorescens og scanning Elektron Mikroskopi er demonstreret, samt evnen til at ændre stillads med bioaktive substrater, med inkorporering af en kommerciel basal lamina blanding til forbedret celle integration.

Introduction

Betændelse i centralnervesystemet (CNS) har længe været betragtet som et adelsmærke for akut (fx, iskæmisk slagtilfælde, traumatisk hjerne og rygmarvsskade) og kronisk (f.eks Alzheimers, Parkinson's, og Huntingtons sygdomme) CNS skade, men er i stigende grad anerkendt som en kausal bidragyder til neurodegenerative og neuropsykiatriske lidelser. Vedvarende eller upassende betændelse kan forårsage neurale skade og demyelinering (f.eks. multipel sklerose), og negativt påvirker hjernens udvikling (f.eks., skizofreni, autisme) og stemning stater (f.eks., depression, angst bipolar lidelse). Yderligere, Roman terapeutiske strategier ved hjælp af implantabelt udstyr (fx., hjerne-computer-interfaces1,2,3, dyb brain stimulation4,5, intraspinal microstimulation6,7,8,9,10) generere en forudsigelig inflammatorisk respons på grænsefladen mellem enheden og CNS resulterer i en beskyttende væv svar, der kan forårsage tab af effektivitet eller enhed svigt over levetiden af implantatet11. Betændelse i CNS startes typisk af mikroglia, der fungerer som CNS ansvarlig for overvågning af væv og montering fremmedlegeme svar (gennemgik12) bopæl immunceller. Afhængigt af sværhedsgraden af en fornærmelse, celle mikroglia signal og rekruttere yderligere typer at en skade site. Specifikt, mikroglia aktivere astrocytter, der til gengæld fungerer som sekundær inflammatoriske celler og form en tætte beskyttende barriere til at indeholde en skade site13,14. Mikroglia kan også indlede en aktivitet cascade i cellerne i det perifere immunsystemet, hvilket kan resultere i nedbrydning af BBB at tillade immunsystemet infiltration (gennemgik i reference15).

For udstyr implanteret i CNS, kan vævsskader som følge af indsætning af enheder samt den fortsatte tilstedeværelse af den udenlandske enhed indlede en proces, der kaldes glial ardannelse. I denne proces, mikroglia migrere til og formere sig på stedet for skade. De indlede også frigivelsen af inflammatoriske faktorer til at neutralisere potentielle trusler og rekruttere flere gliaceller. Efterfølgende, aktiveret astrocytter blive hypertrofisk og begynde at indkapsle det indopererede udstyr for at danne en kontinuerlig fibrøst barriere16. Inflammatorisk signalering også tjener til at fremme inddragelse af neuronal processer i nærheden af implantatet og til sidst rekrutter fibroblaster for at styrke den tredje glial ar17. Oligodendrocytes, ansvarlig for kappematerialer neuroner i myelin at forbedre ledningsevne, overlever ikke denne proces og fjerne celler er partitioneret fra implantatet af ar-18. Glial ardannelse kraftigt reducerer funktion og levetid af implanteret udstyr, især for optagelse elektroder, og i sidste ende tjener til at begrænse funktionaliteten af neurale grænseflader19.

Flere metoder er blevet udnyttet til at øge biokompatibilitet og interface aktivitet af implanteret udstyr i CNS20,21,22,23. En omfattende gennemgang er tilgængelige på disse neurale grænseflader24biokompatible design. De mest fremtrædende strategier omfatter omkring elektrode med kompatible belægninger såsom polyelthyleneglycol (PEG), polylactic-co-glycolic syrer (PLGA)25, eller øge elektroden med ledende polymerer såsom poly (ethylen dioxythiophene) (PEDOT), og polypyrrole (PPy)26,27,28,29,30,31. Bioaktive belægninger har også været ansat til at give stikord til neurale væv vækst ved hjælp af ligander afledt af ekstracellulære matricer herunder collagens, fibronectins og hyaluronic syre32,33,34 ,35,36,37. Bioactivity af disse belægninger er blevet yderligere undersøgt med vækstfaktor frigivelse systemer at efterligne naturlige celle sekreter30,38,39,40,41 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50. samtidig nogle forskergrupper har valgt for at remodel elektrode geometri, fleksibilitet og sammensætning til at mindske den mekaniske misforhold mellem enhed og væv51,52,53 ,54,55,56,57. Helt, disse strategier har ført til mange lovende forbedringer i næste generations neurale interfacial enheder, men de langsigtede kompatibilitet er en løbende problem og fremskridt kan blive hæmmet af komplekse og tidskrævende in vivo modeller .

Dyr model-baserede tilgange kan begrænse den eksperimentelle overførselshastighed og øge omkostningerne ved afprøvning elektrode biokompatibilitet. In vitro metoder ved hjælp af konventionelle cellekultur teknikker tilbyder et mere omkostningseffektivt alternativ, men undlader at sammenfatte meget af kompleksiteten i samspillet mellem enhed og væv58. Især testning af overfladebelægning ved hjælp af 2D celle kultur grænser modellering af elektrode geometri og påvirkning af mekanisk misforhold og micromotion menes at bidrage til at generere en vært svar bidrager til enhed fejl59 , 60.

For at overvinde problemerne med 2D cellekultur, er hydrogel kulturer af neurale celler blevet udviklet til en bred vifte af applikationer, farmakologiske undersøgelser61, direkte neurale celle differentiering62, at forstå sygdom veje63,64, eller lagdelte i fælles kultur med andre celletyper model celle migration, neuroprotection, eller model væv microenvironments61. Hydrogels dannes let i forskellige størrelser og geometrier kan indarbejde mange typer af primære eller udødeliggjort cellekulturer, og er meget åbne over for analyse af almindeligt anvendte teknikker såsom Konfokal Fluorescens mikroskopi. For at oprette en model af glial ardannelse processen, har vi for nylig udviklet og karakteriseret en hyaluronsyre baseret 3D hydrogel system for høj overførselshastighed test af implanterede elektroder (figur 1)65glial responsen. Dette system har flere markante fordele: 1) primære glial celler (mikroglia, astrocytter, og oligodendrocytes) er indkapslet i en 3D matrix består af polymerer af hyaluronsyre, som er en komponent, endogene ekstracellulære matrix; 2) matrix stivhed kan være "tunet" for at genskabe de mekaniske egenskaber af hjerne eller rygmarv væv; og 3) celler kan være indkapslet i matrix i en hurtig bænk-top tilgang ved hjælp af photopolymerization med grønt lys, begrænse toksicitet under indkapsling. Dette system muliggør nøglen egenskaber i i vivo biokompatibilitet: anordninger er indsat i hydrogel på en sammenlignelig måde at væv, og den cellulære reaktion på implanterede enheder er overvåget for en lang række parametre65. Disse omfatter mekanisk misforhold mellem enheder og hydrogel belægninger af forskellige strukturer og elektrisk stimulation pulser. Dette system omfatter også oligodendrocyte og relaterede prækursorer, som er ofte til stede og rekrutteret i glial ar. Deres tab, død og fagocytose af mikroglia er yderst betegnende for inflammatoriske skade og som en model reduceret ardannelse eller recovery, de har kapacitet til at vise re-myelination af neuroner66.

Heri beskrives en metode til syntese og dannelsen af hybrid hyaluronsyre hydrogels kombineret med kommercielt tilgængelige basalmembranen formuleringer at forbedre celle indarbejdelse. Yderligere, vil vi vise indarbejdelse af primære kulturperler glial celler (mikroglia, astrocytter, og oligodendrocytes) og analyse af kultur vækst ved hjælp af immuncytokemi og konfokal mikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokol til hjernen væv udvinding fra dag 1 Sprague Dawley rotte pups, aflivet ved halshugning, blev godkendt ved Animal Care og brug Udvalget på University of Alberta.

1. mikroglia og Astrocyte isolering67,68

Bemærk: Alle medier for isolation og cellekultur er forvarmet til 37 ° C i et vandbad. Hanks afbalanceret saltopløsning (HBSS) er 1% penicillin-streptomycin (PS). Alle Dulbecco ændrede Eagles medier med Hams F12 næringsstof blanding (DMEM/F12) er suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin (PS). Kun blandinger med trypsin mangler FBS. Alle materialer i denne protokol er sterile (filter, alkohol, købt, og autoklaveres) og hver trin efter trin nummer 1.8 er udført i et kabinet med aseptisk teknik biosikkerhed.

  1. Per hjernen, pre heat 15 mL HBSS og 12,5 mL DMEM/F12 til 37 ° C i 50 mL konisk centrifugeglas, og ca. 2 mL 0,25% trypsin med 1 mM ethylendiamintetra syre (EDTA) i en 15 mL konisk centrifugeglas. Varme et yderligere 25 mL af DMEM/F12. Varm trypsin ca 10 min før til brug til at forhindre tab af enzymatisk aktivitet.
  2. Hæld nok varmt HBSS i sterilt, 6 og 10 cm kultur retter til at dække overfladen. Forberede en 10 cm parabol for hver to hjerner plus en yderligere 6 cm parabol.
  3. Placere op til 2 hjerner i hver 10 cm2 fad (figur 2A).
  4. Under et mikroskop for dissektion, brug buede og lige pincet til at adskille cortex langs midterlinjen og lillehjernen med hjernestammen. Dette giver tre sektioner af væv per hjernen (figur 2B).
  5. Skræl tynd, semi-gennemsigtig, lag (meninges) af væv, som indeholder blodkar fra hver sektion af væv og udsmid, overførsel af de resterende væv i en separat kultur parabol. Forstå de tynde lag udsat af nedskæringerne, væv, med pincet, og træk forsigtigt indtil større portioner 'hænger ' hjernevæv. Endelig Fjern denne del af forsigtigt tugging. Se figur 2 c-2E for repræsentative billeder af før, under og efter dette trin.
  6. I en biosikkerhed kabinet, skal du fjerne de resterende HBSS fra kultur parabol, omhyggeligt bevare vævet. Udblødte væv med en skalpel og overføre væv til pre varmede 15 mL tube med trypsin.
  7. Inkuber dette rør i 25 min i et 37 ° C bad til at fordøje væv enzymatisk.
  8. Centrifugeres røret ned på 500 x g i 2 min. ved stuetemperatur og hæld supernatanten.
  9. Ved hjælp af 10 mL serologisk pipette, tilsættes 10 mL varm DMEM/F12 til at inaktivere trypsin og hakkede løsningen 5 gange til at bryde op væv.
  10. Centrifugeres røret ned på 500 x g i 2 min. ved stuetemperatur og hæld supernatanten.
  11. Ved hjælp af 10 mL serologisk pipette genopslæmmes pellet i 10 mL varm DMEM/F12 og opløsningen overføres til en 50 mL konisk centrifugeglas.
  12. Ved hjælp af en 10 mL sprøjte med en 18 gauge kanyle, hakkede løsningen 3 gange.
  13. Distribuere denne løsning i intervaller på 12,5 mL varm DMEM/F12 pr. hjerne.
  14. Der afpipetteres 1 mL forhøjelser af triturated løsningen i en 12 godt plade (1 pr. hjerne).
  15. Der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2i en fugtig celle kultur inkubator. Erstatte medier efter tre dage, og opdatere media hver efterfølgende tre dage. Efter 2 uger, kan cellerne afhentes for eksperimenter.

2. Macromer syntese69

  1. 375 mg hyaluronic syre (HA) salt afvejes i en 50 mL konisk centrifugeglas og tilføje 37,5 mL destilleret vand.
  2. Skyl løsning med en vortexer for 1 min og Læg instrumenterne i ultralydsbad blandingen indtil det vises homogen og mister sin gel-lignende viskositet. Denne proces kan tage 6 h.
  3. Overførsel løsning til et 100 mL bægerglas med en magnetisk rør bar (38 mm), og rør kraftigt ved stuetemperatur.
  4. Omhyggeligt titreres 5,0 M NaOH i mikserpulten HA og en foranstaltning med pH papir indtil pH stabiliserer mellem 8 og 12.
  5. Indsamle 3 mL frisk methacrylsyre anhydrid (MA, 94%), tildækket af kvælstof under opbevaring.
    Bemærk: MA er udsat for atmosfæren for lang varighed (dage), det mister sin reaktivitet.
    Forsigtig: Brug af MA bør ske i et stinkskab.
  6. Tilføje 200 µL af MA HA-oploesningen blanding. Reaktionen sænker pH i opløsningen under 8.
  7. Gentag trin 2.4 til 2,6 indtil MA 3 mL er blevet tilføjet til løsningen. Denne proces kan tage op til 1-2 h.
  8. Tillad reaktionen fortsætte natten over ved 4 ° C, uden at blande.
  9. Opløsning overføres til 400 mL koldt ethanol (EtOH) i et 500 mL bægerglas og tillade nedbør for 24-72 h ved 4 ° C. 56
  10. Forsigtigt dekanteres den væsentligste del af løsningen i et separat bægerglas til bortskaffelse, og bundfaldet i en 50 mL konisk centrifugeglas. Dette kan være fordelt i 2-4 rør, hvis nødvendigt.
  11. Der centrifugeres rør på 200 x g i en centrifuge for 2 min. ved stuetemperatur og bortskaffe supernatanten.
  12. Top op tube med kolde EtOH, bland løsningen med en vortexer i 1 minut og Gentag trin 2.10-2.11.
  13. Der tilsættes 25 mL sterilt deioniseret vand, bland løsningen med en vortexer for 1 min, Læg instrumenterne i ultralydsbad (> 20 kHz) for 1 time, og der inkuberes ved 4 ° C natten over.
  14. Placer løsningen i et-80 ° C fryser i 15 min eller indtil frosset eller flash fryse i flydende kvælstof.
    Forsigtig: Når du bruger flydende kvælstof, bruge beskyttelseshandsker, en ansigtsskærm og et forklæde.
  15. Fryse tør tube (under 0.1 mBar og 30 ° C) i 24-48 timer før en sne-lignende pulver er produceret.
  16. På dette tidspunkt, teste prøven for renhed via 1H Kernemagnetisk resonans, hvor mængden af methylmethacrylat protoner (toppe på 6.1 og 5,6 ppm), i forhold til methyl protoner (1.9 ppm), på HA rygraden kan bekræftes. Et minimum 95% methacrylat til methyl protoner er acceptabel. 69

3. gel dannelse og 3D indkapsling65

  1. Coverslip og skimmel forberedelse
    1. Gøre en 50 mL destilleret vand løsning 2% 3-(Trimethoxysilyl) propyl methacrylat i en 50 mL konisk centrifugeglas.
    2. Placer 18 mm glas coverslips i løsning og rock i 1 time ved stuetemperatur. Op til 50 coverslips kan blive tilføjet på én gang.
    3. Skyl coverslips af seriefremstillede dypper hver i 3 bægerglas 100 mL deioniseret vand.
    4. Tørre coverslips i et vakuum ved 40 ° C natten over med en ekssikkator og ovn.
    5. Hurtigt fordybe individuelle coverslips i 70% EtOH med pincet.
    6. Uden at udtørre, dråbe hvert coverslip i et godt af en 12 godt plade.
    7. Vask og Opsug hver brønd med steril deioniseret vand (1 mL pr. brønd).
    8. Tilsæt 1 mL sterilt 2 µg /mL poly-L-lysin (PLL) til hver brønd og Inkuber i > 2 h.
    9. Opsug PLL løsning og tillade coverslips til luft tørre.
    10. Fordyb polydimethyl siloxan (PDMS) forme (Se figur 1) i 70% EtOH, og sted en på midten af hver coverslip, og lad lufttørre og skabe en forsegling mellem mug og glas.
      1. Forberede PDMS forme af casting PDMS premix reagenser i forholdet 10:1 i en fladbundet polystyren parabol. Mængden af PDMS forberedt er valgt at give et ark ca 1 mm tyk. Form brønde i PDMS, skære plader med en cirkel punch med en indre diameter på 10.
  2. Celle forberedelse
    Bemærk: Alle trin i protokollen udføres med steril teknik i en biosikkerhed kabinet. Phosphat bufferet saltvand (PBS) løsning er indstillet til pH 7,4 for alle trin.
    1. 24 timer før celle indkapsling i HAMA, opdatere medium for de 2 uge primære kulturer (fra trin 1,15) i de 12 godt plader. Der tilsættes 1 mL DMEM/F12 (10% FBS og 1% PS) medium pr. brønd.
    2. For hver 12-godt plade af celler forberede 12,5 mL fortyndet trypsin (0,25% trypsin-EDTA fortyndet til 30% med DMEM/F12 medier) og 25 mL DMEM/F12 (10% FBS og 1% PS) og varme i ved 37 ° C i et vandbad.
    3. Indsamle konditioneret medium fra plader ved hjælp af 10 mL serologisk pipette (> 0,5 mL pr. brønd), grundigt Aspirér resterende væske, og erstatte med 1 mL pr. brønd af fortyndede trypsin (0.075% trypsin-EDTA) for 20-30 min i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) indtil de sammenflydende cellelag frigøres fra pladen.
    4. Genskab suspenderede cellestof med 1 mL pipette (vises som en enkelt flydende stykke) og indsamle i en 15 mL konisk centrifugeglas. Fortyndet med et tilsvarende volumen af DMEM/F12 (10% FBS og 1% PS), og der centrifugeres ved 200 x g i 2 min. ved stuetemperatur, udsmid supernatanten.
    5. Resuspend celle toerstoffet i 10 mL varm DMEM/F12 (10% FBS og 1% PS), hakkede celler 5 gange med 10 mL pipette, og der centrifugeres ved 200 x g i 2 min.
    6. Den dekanteres, genopslæmmes celler i 5 mL varm DMEM/F12, og overføre cellerne til en 50 mL konisk centrifugeglas.
    7. Ved hjælp af en 10 mL sprøjte med en 18 gauge kanyle, hakkede celle løsning 3 gange, og suspensionen filtreres på en 40 µm celle sigte i en ny konisk centrifugeglas.
    8. Indsamle 10 µL af cellesuspension, fortyndes 1: 100 i varm DMEM/F12, og tælle celler med en automatiseret celle counter
    9. Inkuber i et 37 ° C vandbad indtil indkapsling trin.
  3. Celle indkapsling
    Bemærk: Alle trin i protokollen udføres med steril teknik i en biosikkerhed kabinet.
    1. For hver 12-godt plade af 3D varm hydrogels 12,5 mL DMEM/F12 og 12,5 mL af konditioneret DMEM/F12 medierne indsamlet under celle forberedelse.
    2. Veje mængden af methacrylated hyaluronsyre (HAMA), der kræves for en endelig koncentration på 0,5% wt/vol. opløse denne HAMA i sterile filtrerede PBS ved en koncentration på (2% wt/vol); en koncentration 4 gange højere end den endelige koncentration er udnyttet til at rumme tilsætning af celler og andre reagenser. En 12 godt plade af hydrogels kræver ~ 350 µL PBS med 7 mg HAMA.
    3. Læg instrumenterne i ultralydsbad (> 20 kHz) løsninger indtil HAMA er helt opløst i 60 min.
    4. Forbered enkelte 10% løsninger over triethanolamin (TEA) og 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) og 1 mM opløsning af Eosin Y (EY) i 1 mL alikvoter af steril PBS pH 7,4.
    5. For en 12 godt plade, gøre en endelige 1,4 mL blanding af 1 x 107 celler, 0,5% wt/vol HAMA (350 µL af 2% wt/vol.), 0,1% te (14 µL af 10%), 0,1% NVP (14 µL af 10%), og 0,01 mM EY (14 µL 1 mm) , og 20% basal lamina blanding (280 µL af materiel). Den resterende mængde er PBS.
    6. Forsigtigt blandes løsningen og afpipetteres 100 µL i hver PDMS mug med 1 mL spids.
    7. Udsætte prøver til en høj intensitet grøn LED lys (~ 520 nm, 60 mW, i en lukket 20 cm x 20 cm x 20 cm boks) i 5 min ved stuetemperatur.
    8. Der tilsættes 1 mL pr. brønd af varme konditioneret DMEM/F12 til en 12 godt plade.
    9. Forstå hver coverslip mellem tommel- og pegefinger, langsomt skrælle PDMS mug med buet pincet er omhyggelig med ikke at fortrænge gel, og læg det i en brønd med konditioneret medium.
    10. Tilføje en yderligere 1 mL varm DMEM/F12 til hver brønd.
    11. Inkuber plader ved 37 ° C med 5% CO2 i 2 uger, forfriskende celle media hver uge af pipettering 1 mL af medier fra hver brønde og erstatte med 1 mL DMEM/F12.

4. mikroskopi

  1. Immuncytokemi
    Bemærk: En inverteret Konfokal mikroskop blev brugt til at afbilde disse prøver og ImageJ blev brugt til at behandle og få vist billederne. Mikroglia, astrocytter, oligodendrocytes og kerner, vil blive mærket efter 3 uger i HAMA kultur.
    1. Forvarm 10% PBS-buffered formalin (pH 7,0) i et 37 ° C bad.
      Forsigtig: Selvom formalin kan bruges uden for et stinkskab, dette materiale er reaktivt med væv, og bør håndtere med omhu og handsker altid. Det bør disponere særskilt.
    2. Omhyggeligt Aspirér medier fra plader og afpipetteres 1 mL 10% formalin til hver brønd.
    3. Inkuber plader ved 37 ° C i en 5% CO2 til 20 min.
    4. Opsug væsken fra hver plade, afpipetteres 2 mL PBS (pH 7,4) i hver brønd og Inkuber i 15 min.
    5. Gentag trin 4.1.4 to gange.
    6. Opsug væske fra pladerne, tilsættes 1 mL pr. brønd PBS med 10% normalt hest serum (NHS) og 0,5% triton X-100 og forsigtigt rock på minimum hastighed) i 1 time.
    7. Gentag trin 4.1.4 tre gange.
    8. Opsug væske og der tilsættes 1 mL pr. brønd af følgende blandingen i PBS: kanin ioniseret calcium-bindende adapter molekyle (Iba1) 1:1, 000, kylling glial fibrillære proteiner (GFAP) 1:5, 000, musen 2', 3'-cyklisk-nucelotide 3'-phophodiesterase (CNPase) 1:1, 000, 1% NHS , og 0,1% celle perforering overfladeaktivt stof. Inkuber ved 4 ° C natten over, vuggende pladen så skånsomt som muligt.
    9. Gentag trin 4.1.4 tre gange med 1 h inkubationer i mellem.
    10. Opsug væske og tilsæt 1 mL pr. brønd af følgende blandingen i PBS: 647 nm ophidset æsel anti-kanin antistof 1:200, 546 nm ophidset ged anti-kylling antistof 1:200, 488 nm ophidset æsel anti-muse-antistof, 1:200, 1% NHS, 1:1,000 blå nukleare pletten. Inkuber ved stuetemperatur i 1 time, blidt rokkende pladen.
    11. Gentag trin 4 tre gange med 1 h inkubationer i mellem.
    12. For at bevare hydrogels, Aspirér buffer, og Fordyb dem i 0,5 mL af celle montering medium i 1 min. Pipette ud montering medium og forsigtigt placerer en coverslip oven på gel, at skabe et lag mellem glasset. Tilføje en lille mængde af montering medium til den udækkede side af coverslips til at forhindre udtørring af hydrogel.
      Bemærk: Til fejlfindingsformål, geler kan være afbildet på trin 4.1.11. at se ordentlig mærkning før videre behandling.
  2. Scanning elektronmikroskopi (SEM)
    Bemærk: For at visualisere hydrogel, en scanning elektron mikroskop blev brugt til at afbilde disse prøver.
    1. Pre heat en Fikseringsvæske blanding af 2,5% glutaraldehyd og 2% PARAFORMALDEHYD i PBS (0,1 M) i et 37 ° C vandbad.
      Forsigtig: Disse reagenser er meget reaktive med væv, og skal håndteres med omhu og handsker. De bør håndteres i et stinkskab så meget som muligt og bortskaffes separat.
    2. Opsug medium fra celle kultur plader og tilsættes 1 mL af forvarmet Fikseringsvæske blandingen.
    3. Inkuber plader ved 37 ° C i en 5% CO2 til 20 min.
    4. Læg pladerne i 4 ° C (køleskab/køler) natten over.
    5. Opsug den Fikseringsvæske løsning fra brøndene og tilsættes 1 mL PBS.
    6. Aspirér væsken fra hver plade, tilsættes 2 mL PBS i hver brønd og Inkuber i 15 min.
    7. Gentag trin 4.2.6 to gange mere.
    8. Opsug PBS og tilsættes 1 mL 1% osmium tetraoxide buffer i PBS i hvert hul.
      Bemærk: Indtil prøver er tørret, udføres dette trin og alle efterfølgende trin i et stinkskab.
    9. Tillad fiksering at forekomme for 30 min. Osmium vapor fra væsken kan fastsætte andre prøver i den samme plade; Derfor, partition prøver derfor før dette trin.
      Forsigtig: Osmium tetraoxide er meget reaktive med væv og flygtige. Det er farligt og bør håndteres i stinkskab med handsker. Det og nogen umiddelbar vasket bør bortskaffes separat.
    10. Gentag trin 4.2.6 tre gange.
    11. Opsug flydende og tilføje de tørring blandinger i listen nedenfor, i orden, og inkuberes (stuetemperatur) for den angivne tid. Start ved gradvist at tilføje ethanol (EtOH) fulgte derefter hexamethyldisilazane (HMDS). Se tabel 2 for hver tilvækst.
      Bemærk: Når du tilføjer HMDS, coverslips kan kraftigt overholde plast og blive meget svært at fjerne. Dette kan forhindres ved at placere en lille plast platform under glas slip efter den første anvendelse af HMDS. Efter den anden EtOH inkubation, kan prøven tages og slukkes i flydende nitrogen for få sekunder til at fryse fraktur prøven.
    12. Forsigtigt fjerne de tørrede prøver og montere prøverne på scanning elektron mikroskop stubbe med dobbeltklæbende ledende tape.
    13. Sputter pels prøver med et minimum af guld. Prøverne i en indehaver og betjene maskine i 2 min på 15 mA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Til model neurale væv vært svar og glial arret i en høj produktivitet, kræver in vitro system en 3D celle stillads med en matrix materiale, der er biokompatible, ikke afholde en cytotoksisk begivenhed i i situ dannelse og kan ændres med bioaktive komponenter til at guide velvillige svar. Til dette formål har vi skabt en 3D celle stillads system baseret på hyaluronsyre og indkapslet en primær blandet glial celler befolkning for at studere celle-celle interaktioner og glial bioreactivity. En kort visuel undersøgelse af celler og stillads blev udført. Morfologi af celle delpopulationer, herunder oligodendrocytes (CNPase i grøn), mikroglia (Iba1 i rød), og astrocytter (GFAP i gult), er vist af immunfluorescent konfokalmikroskopi (figur 3Ai-ii-Ci-ii). Kombinerede stillads og celle morfologi er også vist af SEM (figur 3Aiii-iv - Ciii-iv). I disse billeder vises både lav (i og iii) og høj (ii og iv) opløsning repræsentative billeder. En 2D PLL coverslip belægning (figur 3A) blev sammenlignet med en 3D 0,5% w/v HAMA stillads (figur 3B), og en blanding af 20% v/v basal lamina blanding i 0,5% w/v HAMA (figur 3 c). Dette blev gjort for at demonstrere de morfologiske forskelle i 2D samt 3D cellekultur og effekten af at indføre et biologisk lamina til skafottet. En 3D rekonstruktion er også tilgængelige i de supplerende oplysninger.

Celle morfologi af hver celletype ændret med indførelsen af en 3D platform. I 2D vedhængende kultur (PLL-belagt glas coverslips), oligodendrocytes syntes typisk runde og dannet små netværk normalt forbinder med let mærket GFAP processer. Mikroglia var mindre end andre celler og havde små forgrening processer, der ikke udvide langt fra deres celle organer (< 20 µm). Astrocytter var mere forskelligt formede, nogle har en radial morfologi med mindre celle organer og omfattende tynd, forgrenede processer, mens andre var fiber med en samkopieret udseende og få bred processer, der coat overfladen. I 3D HAMA kultur, oligodendrocytes dukkede op i klynger har forgrenet i mindre kugler. Mikroglia var runde med par processer, og astrocytter var enten afrundet eller forgrenet radialt i netværk fra en enkelt klynge. Generelt, disse celler syntes at have vokset fra enkelt point eller forblive i områder af HAMA uden at gøre kontakt med andre celler, som er i modsætning til den 2D kultur og tyder på begrænset mobilitet gennem matrixen. Når 20% v/v af en basal lamina blanding blev føjet til foto-polymerisering blanding, alle glial undertyper helstøbt hos 3D-platformen og dannet mere omfattende, interaktive forgrenede strukturer. Oligodendrocytes udvidet løgformet processer radialt svarer til ikke-basal lamina blanding morfologier, men syntes derudover at udvide processer langs de tynde sammenkoblede net af astrocyte processer forgrening hele skafottet. Mikroglia blev spredt blandt disse celle netværk, efter at have spredt ud med tynde processer mere i overensstemmelse med deres morfologi i væv. Alt i alt tyder morfologier alle tre typer om glia integreret i HAMA-basal lamina blandingen frit, potentielt gennem enten øget overholdelse af de blandede substrat eller gennem øget evne til at remodel skafottet.

Når observeret af SEM, sås celle morfologi til at underbygge de Konfokal micrographs. Matrixen HAMA optrådte som en glat overflade med 10-50 µm porer set svagt under overfladen. Celler var vedhængende til overfladen af HAMA og var også svagt synlig i lag under. Disse glia ikke danne sammenlignelige morfologier dem, bemærkede i 2D kultur, men med tilføjelsen af en basal lamina blanding, omfattende netværk blev observeret. Tyk astrocyte fibre, med mindre klynger af mikroglia blev observeret både på HAMA-basal lamina blanding overflade og strækker sig gennem matrixen i en problemfri måde. Dette kan ses svagt som matrix foldet rundt om cellerne, hvilket tyder på, at cellerne kan ændre stillads til formes i deres ønskede konformationer.

Figure 1
Figur 1: skematisk af methacrylated hyaluronsyre (HAMA)-baseret 3D celle kultur og photopolymerization protokol. Gliaceller (2 uge primære rotte hjernen kultur) er blandet med HAMA og pipetted i en Polydimethylsiloxan (PDMS) mug på et glas coverslip. Denne blanding er udsat for en høj intensitet grøn LED lys til at polymerisere hydrogel i 5 min. Formen er fjernet og gelen er udruget i medierne. Repræsentative celler omfatter mikroglia (rød), astrocytter (gul) og oligodendrocytes (grøn). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: dissektion af dag 1 Sprague Dawley rotte pup hjernen. Billeder af hele hjernen (A), dissektion af cortex og lillehjernen (B), en enkelt cortex med meninges (C), afskalning af meninges med pincet (D), og den meninge-fri cortex (E). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Immunfluorescent Konfokal (i-ii) og scanning elektron (iii-iv) micrographs af blandet glia cellepopulationer på 2D PLL belægninger (A), HAMA (B) og HAMA-basal lamina blanding (C). Lavere (i, iii) og højere (ii, iv) forstørrelse billeder vises. Etiketter omfatter Iba1 med rødt for mikroglia, GFAP i gul for astrocytter, CNPase i grøn for oligodendrocytes og en Hoechst nukleare pletten. Skalere barer = 25 µm for Konfokal billeder og 50 (iii) og 20 µm (iv) til scanning elektron micrographs. Hydrogels blev 0,5% w/v, og basal lamina blanding blev 20% af volumen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: 3D immunfluorescent mikrografiske rekonstruktion af HAMA-basal lamina blanding med blandet glia cellepopulationer HAMA-basal lamina blanding. Etiketter omfatter Iba1 med rødt for mikroglia, GFAP i gul for astrocytter, CNPase i grøn for oligodendrocytes og en Hoechst nukleare pletten. Hydrogels blev 0,5% w/v, og Getrex blev 20% af volumen. Venligst klik her for at downloade denne fil.

HAMA Basal Lamina NVP TE EY
Arbejde koncentration 0,5% w/v 20% v/v 0,10% 0,10% .01 mM
12-godt plade 2% w/v 100% w/v 10% v/v 10% v/v 1 mM
1,4 mL i alt 350 ΜL 280 ΜL 14 ΜL 14 ΜL 14 ΜL

Tabel 1: Eksempel på celle indkapsling.

Komponent Indhold Inkubationstiden
EtOH 30% 30 min
EtOH 50% 30 min
EtOH 70% 30 min
EtOH 90% 20 min
EtOH 100% 20 min
EtOH 100% 20 min
EtOH:HMDS 75:25 20 min
EtOH:HMDS 50:50:00 20 min
EtOH:HMDS 25:75 20 min
HMDS 100% 20 min
HMDS 100% Overnatning

Tabel 2: Gradvise forhøjelser af EtOH og HMDS i dehydrering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mod mål at skabe en 3D kultur system til model glial bioreactivity og glial ardannelse processen, har vi udviklet et system, der kan understøtte primære kulturperler mikroglia, astrocytter, og oligodendrocytes og giver mulighed for robust karakterisering af celle morfologi og celle-celle interaktioner. Fra micrographs vist, var morfologi af hver celletype udpræget anderledes med 2D, 3D-HAMA og 3D HAMA-Basal lamina blanding platforme. Morfologi var udpræget forudindtaget langs planet for overfladen i 2D-system, men i forhold til den 3D HAMA, mikroglia og astrocytter var generelt mindre inde i matrix, med undtagelse af oligodendrocyte klynger. I de scanning elektron micrographs var celler generelt mere rundt formet på HAMA. Dette kan i vid udstrækning skyldes celler bliver indkapslet, med begrænset kapacitet til at redigere matrixen for bevægelse og fri bevægelighed og vækst af processer. Celle udvækst i HAMA var typisk radial for både astrocytes og oligodendrocytes. Mens disse celler udvidede processer, deres organisation tyder på, at deres bevægelighed i hele matrix og evnen til at interagere med andre celler var begrænset. Tidligere arbejde har derudover vist fryse-brækket HAMA skal være porøs uden sammenkoblede netværk, som kan forklare denne manglende udvækst65,70. Det kan være muligt, at nogle af disse celler overlevede ikke photopolymerization, resterende bevarede i matrixen, men levedygtighed blev systematisk vurderet i vores tidligere arbejde, og forblev 80% (0,5% w/v) i løbet af en uge65.

For at forbedre celle interaktion med matrix i 3D kultur, indførte vi en basal lamina blanding som et biokompatibelt og modificerbare matrix komponent. Celle integration med matrix fandtes at være markant forbedret, med alle celletyper viser omfattende processer i forhold til både 2D kultur og 3D HAMA. Basal lamina blanding består af en række basal lamina komponenter og er primært formuleret for at støtte glial differentiering af neurale stamceller prækursorer71. Det var ikke uventet, at de gliaceller svarede til basal lamina blanding, og efterfølgende den omkringliggende 3D matrix, men omfanget af integration antyder et sundt væv-lignende miljø. Sammenligne HAMA med HAMA-basal lamina blanding, hydrogel morfologi vises ikke tydeligt forskellige, derfor celler kan være mere aktivt remodellering. I betragtning af enkelheden af tilføjer denne bioaktive komponent, er det ikke utænkeligt at bruge forskellige lameller og/eller protein stikord til at favorisere dyrkningsbetingelserne for neuroner. I et potentielle fremtidige retning, kan dette system anvendes til at differentiere neuroner fra neurale stamceller sammenholdt med blandet glia for en række slagkraftige myelination eller neuro-inflammatoriske skade modeller.

I tilfælde af alvorlige og skadelige CNS skade eller biomateriale afvisning indleder den residente væv inflammatoriske reaktioner kan forværre neurodegeneration og demyelinering. Dette typisk resulterer i dannelsen af et glial ar at partitionere stedet for skade, som forhindrer regenerering. I denne undersøgelse, blev metoderne, der detaljeret for et methacrylated foto-polymeriserede hyaluronsyre-baseret 3D stillads med modellering den første cellulære reaktion bag glial ar dannelse; microglial reaktivitet, astrocyte rekruttering og hypertrofi, og oligodendrocyte skade og tilbagetrækning. En 3D celle stillads blev udviklet til at inkorporere alle tre glial celletyper, og blev yderligere ændret med en multi-komponent basal lamina blanding. Det var bestemt af Konfokal og scanning elektronmikroskopi imaging, at celler blev indkapslet i HAMA og var bedre i stand til at integrere når basal lamina blandingen blev indført. Disse resultater kan føre til flere nye applikationer. HAMA alene kan tjene til at skabe fælles kultur systemer hvor hensigten er at begrænse celle til celle interaktion eller undersøgelse destillere medicinafgivelse ved hjælp af gel som en drug indlæst diffusion begrænset matrix. Hydrogels indarbejde basal lamina blandingen i matrixen HAMA, som af modellering akut betændelse, gliosis eller glial ardannelse mulighed for en mere konsekvent væv-lignende miljø, og giver mulighed for yderligere høj overførselshastighed karakterisering af glial bioreactivity til implantater, narkotika og enhed udvikling og øvrige strategier til at reducere og genvinde inflammatoriske skade.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne er taknemmelig for finansiel støtte fra NSERC, RFI, AIHS, Alberta sundhedstjenester og Davey Endowment for Brain Research.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Materials for HAMA synthesis and photopolymerization
Hyaluronic acid (HA) Sigma-Aldrich 53747-10G Streptococcus equi, MW: 1.5 - 1.8 X 10^6
Methacrylic anhydride (MA) Sigma-Aldrich 275585-100ML
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 221465-25G
Ethanol (EtOH) Commerical Alcohols Inc. Anhydrous
Phosphate buffered saline (pH 7.4) tablets Fisher Scientific 18912014
Triethanolamine (TEA) Sigma-Aldrich 90279-100ML
1-Vinyl-2pyrrolidinone (NVP) Sigma-Aldrich V3409-5G
EosinY (EY) Sigma-Aldrich E6003-25G
Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate Sigma-Aldrich 440159-100ML
Beaker (100 mL) Corning 1000-100
Beaker (500 mL) Corning 1000-600
pH paper (Labstick) Sigma-Aldrich 9580
Name Company Catalog Number Comments
2. Materials for glial cell isolation and cell culture
P1-2 Sprague Dawley rat pups Charles River CD Sprague Dawley rat strain code 001
Dissector scissors - slim blades (small) Fine Science Tools 14081-09
Surgical scissors - Toughcut (large) Fine Science Tools 14130-17
Fine forceps (Dumont #5) Fine Science Tools 11521-10
Curved fine forceps (Dumont #7) Fine Science Tools 11271-30
Hank's balanced salt solution (HBSS) Gibco 14170-112
Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) Gibco 11320-033
Penicillin-streptomycin (PS) Gibco 15140-122
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 12483-020
0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Gibco 25200-072
Poly-L-lysine (PLL) Sigma-Aldrich P-6282
50 mL conical centrifuge tube Fisher Scientific 05-539-13
15 mL conical centrifuge tube Fisher Scientific 05-539-5
12 well Tissue culture treated plates (Cellstar) Greiner Bio-One 665 108
10 mL serological pipette Fisher Scientific 13-676-10F
25 mL serological pipette Fisher Scientific 12-676-10K
Petri dish (60 mm X 15 mm) Fisher Scientific FB0875713A
Petri dish (100 mm X 15 mm) Fisher Scientific FB0875712
Microscope Coverslip (18 mm) Fisher Scientific 12-545-100 18CIR
Name Company Catalog Number Comments
3. Materials for microscopy (confocal and scanning electron microscopy)
Mouse monoclonal anti-CNPase abcam ab6319
Rabbit anti-Iba1 Wako Laboratory Chemicals 019-17741
Chicken anti-GFAP abcam ab4674
Hoechst 33342 Fisher Scientific 62249
Fluoromount-G Fisher Scientific 00-4958-02
Formalin Sigma Aldrich HT501128-4L Buffered (10%)
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
Horse Serum Gibco 16050-122
Paraformaldehyde Electon Microscopy Sciences 157-8 Buffered (8%)
Guteraldehyde Electon Microscopy Sciences 16019 Buffered (8%)
Osmium tetraoxide Electon Microscopy Sciences 19152 Buffered (2%)
Hexamethyldilazane (HMDS) Electon Microscopy Sciences 16700
Ethanol (EtOH) Electon Microscopy Sciences 15055 Anhydrous
Microscope Slide (25 X 75 X 1 mm) VWR International 48311-703

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shih, J. J., Krusienski, D. J., Wolpaw, J. R. Brain-Computer Interfaces in Medicine. Mayo Clin. Proc. 87, 268-279 (2012).
  2. Kennedy, P. R., Bakay, R. A. Restoration of neural output from a paralyzed patient by a direct brain connection. Neuroreport. 9, 1707-1711 (1998).
  3. Kennedy, P. R., Bakay, R. A., Moore, M. M., Adams, K., Goldwaithe, J. Direct control of a computer from the human central nervous system. IEEE Trans. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 8, 198-202 (2000).
  4. Mayberg, H. S., et al. Deep Brain Stimulation for Treatment-Resistant Depression. Neuron. 45, 651-660 (2005).
  5. Dougherty, D. D., et al. A Randomized Sham-Controlled Trial of Deep Brain Stimulation of the Ventral Capsule/Ventral Striatum for Chronic Treatment-Resistant Depression. Biol. Psychiatry. 78, 240-248 (2015).
  6. Bamford, J. A., Marc Lebel, R., Parseyan, K., Mushahwar, V. K. The Fabrication, Implantation, and Stability of Intraspinal Microwire Arrays in the Spinal Cord of Cat and Rat. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 25, 287-296 (2017).
  7. Holinski, B. J., et al. Intraspinal microstimulation produces over-ground walking in anesthetized cats. J. Neural Eng. 13, 056016 (2016).
  8. Toossi, A., Everaert, D. G., Azar, A., Dennison, C. R., Mushahwar, V. K. Mechanically Stable Intraspinal Microstimulation Implants for Human Translation. Ann. Biomed. Eng. 45, 681-694 (2017).
  9. Saigal, R., Renzi, C., Mushahwar, V. K. Intraspinal microstimulation generates functional movements after spinal-cord injury. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 12, 430-440 (2004).
  10. Lau, B., Guevremont, L., Mushahwar, V. K. Strategies for generating prolonged functional standing using intramuscular stimulation or intraspinal microstimulation. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 15, 273-285 (2007).
  11. Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. J. Neurosci. Methods. 148, 1-18 (2005).
  12. Sierra, A., et al. Surveillance, phagocytosis, and inflammation: how never-resting microglia influence adult hippocampal neurogenesis. Neural Plast. 2014, 610343 (2014).
  13. Holm, T. H., Draeby, D., Owens, T. Microglia are required for astroglial Toll-like receptor 4 response and for optimal TLR2 and TLR3 response. Glia. 60, 630-638 (2012).
  14. Gao, Z., et al. Reciprocal modulation between microglia and astrocyte in reactive gliosis following the CNS injury. Mol. Neurobiol. 48, 690-701 (2013).
  15. Jin, X., Yamashita, T. Microglia in central nervous system repair after injury. J. Biochem. (Tokyo). 159, 491-496 (2016).
  16. Griffith, R. W., Humphrey, D. R. Long-term gliosis around chronically implanted platinum electrodes in the Rhesus macaque motor cortex. Neurosci. Lett. 406, 81-86 (2006).
  17. Biran, R., Martin, D. C., Tresco, P. A. Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays. Exp. Neurol. 195, 115-126 (2005).
  18. Fawcett, J. W., Asher, R. A. The glial scar and central nervous system repair. Brain Res. Bull. 49, 377-391 (1999).
  19. Szarowski, D. H., et al. Brain responses to micro-machined silicon devices. Brain Res. 983, 23-35 (2003).
  20. Park, D. -W., et al. Graphene-based carbon-layered electrode array technology for neural imaging and optogenetic applications. Nat. Commun. 5, 5258 (2014).
  21. McAllister, J. P., et al. Biocompatibility of Penetrating Recording Electrode Arrays Implanted Chronically in the Feline Visual Cortex. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 1528 (2005).
  22. Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. J. Neurochem. 109, 117-125 (2009).
  23. Chung, H., et al. In vivo Biocompatibility and Stability of Polyimide Microelectrode Array for Retinal Stimulation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 5072 (2003).
  24. Aregueta-Robles, U. A., Woolley, A. J., Poole-Warren, L. A., Lovell, N. H., Green, R. A. Organic electrode coatings for next-generation neural interfaces. Front. Neuroengineering. 7, (2014).
  25. Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24, 4337-4351 (2003).
  26. Yang, J., et al. Ordered surfactant-templated poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) conducting polymer on microfabricated neural probes. Acta Biomater. 1, 125-136 (2005).
  27. Ludwig, K. A., et al. Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) polymer coatings facilitate smaller neural recording electrodes. J. Neural Eng. 8, 014001 (2011).
  28. Kim, D. -H., Abidian, M., Martin, D. C. Conducting polymers grown in hydrogel scaffolds coated on neural prosthetic devices. J. Biomed. Mater. Res. A. 71, 577-585 (2004).
  29. George, P. M., et al. Fabrication and biocompatibility of polypyrrole implants suitable for neural prosthetics. Biomaterials. 26, 3511-3519 (2005).
  30. Stauffer, W. R., Cui, X. T. Polypyrrole doped with 2 peptide sequences from laminin. Biomaterials. 27, 2405-2413 (2006).
  31. Green, R. A., Lovell, N. H., Wallace, G. G., Poole-Warren, L. A. Conducting polymers for neural interfaces: challenges in developing an effective long-term implant. Biomaterials. 29, 3393-3399 (2008).
  32. Gumbiner, B. M. Cell adhesion: the molecular basis of tissue architecture and morphogenesis. Cell. 84, 345-357 (1996).
  33. Chan, G., Mooney, D. J. New materials for tissue engineering: towards greater control over the biological response. Trends Biotechnol. 26, 382-392 (2008).
  34. Green, R. A., Lovell, N. H., Poole-Warren, L. A. Impact of co-incorporating laminin peptide dopants and neurotrophic growth factors on conducting polymer properties. Acta Biomater. 6, 63-71 (2010).
  35. Green, R. A., Lovell, N. H., Poole-Warren, L. A. Cell attachment functionality of bioactive conducting polymers for neural interfaces. Biomaterials. 30, 3637-3644 (2009).
  36. Koss, K. M., Unsworth, L. D. Neural tissue engineering: Bioresponsive nanoscaffolds using engineered self-assembling peptides. Acta Biomater. 44, 2-15 (2016).
  37. Koss, K. M., et al. Brain biocompatibility and microglia response towards engineered self-assembling (RADA)4 nanoscaffolds. Acta Biomater. 35, 127-137 (2016).
  38. Evans, A. J., et al. Promoting neurite outgrowth from spiral ganglion neuron explants using polypyrrole/BDNF-coated electrodes. J. Biomed. Mater. Res. A. 91, 241-250 (2009).
  39. Yu, X., Bellamkonda, R. V. Tissue-engineered scaffolds are effective alternatives to autografts for bridging peripheral nerve gaps. Tissue Eng. 9, 421-430 (2003).
  40. Houweling, D. A., Lankhorst, A. J., Gispen, W. H., Bär, P. R., Joosten, E. A. Collagen containing neurotrophin-3 (NT-3) attracts regrowing injured corticospinal axons in the adult rat spinal cord and promotes partial functional recovery. Exp. Neurol. 153, 49-59 (1998).
  41. Wells, M. R., et al. Gel matrix vehicles for growth factor application in nerve gap injuries repaired with tubes: a comparison of biomatrix, collagen, and methylcellulose. Exp. Neurol. 146, 395-402 (1997).
  42. Barras, F. M., Pasche, P., Bouche, N., Aebischer, P., Zurn, A. D. Glial cell line-derived neurotrophic factor released by synthetic guidance channels promotes facial nerve regeneration in the rat. J. Neurosci. Res. 70, 746-755 (2002).
  43. Fine, E. G., Decosterd, I., Papaloïzos, M., Zurn, A. D., Aebischer, P. GDNF and NGF released by synthetic guidance channels support sciatic nerve regeneration across a long gap. Eur. J. Neurosci. 15, 589-601 (2002).
  44. Burdick, J. A., Ward, M., Liang, E., Young, M. J., Langer, R. Stimulation of neurite outgrowth by neurotrophins delivered from degradable hydrogels. Biomaterials. 27, 452-459 (2006).
  45. Piantino, J., Burdick, J. A., Goldberg, D., Langer, R., Benowitz, L. I. An injectable, biodegradable hydrogel for trophic factor delivery enhances axonal rewiring and improves performance after spinal cord injury. Exp. Neurol. 201, 359-367 (2006).
  46. Jain, A., Kim, Y. -T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27, 497-504 (2006).
  47. Taylor, S. J., Sakiyama-Elbert, S. E. Effect of controlled delivery of neurotrophin-3 from fibrin on spinal cord injury in a long term model. J. Control. Release Off. J. Control. Release Soc. 116, 204-210 (2006).
  48. Jhaveri, S. J., et al. Release of nerve growth factor from HEMA hydrogel-coated substrates and its effect on the differentiation of neural cells. Biomacromolecules. 10, 174-183 (2009).
  49. Lee, A. C., et al. Controlled release of nerve growth factor enhances sciatic nerve regeneration. Exp. Neurol. 184, 295-303 (2003).
  50. Matsumoto, K., et al. Neurite outgrowths of neurons with neurotrophin-coated carbon nanotubes. J. Biosci. Bioeng. 103, 216-220 (2007).
  51. Khaled, I., et al. A Flexible Base Electrode Array for Intraspinal Microstimulation. IEEE Trans. Biomed. Eng. 60, 2904 (2013).
  52. David-Pur, M., Bareket-Keren, L., Beit-Yaakov, G., Raz-Prag, D., Hanein, Y. All-carbon-nanotube flexible multi-electrode array for neuronal recording and stimulation. Biomed. Microdevices. 16, 43-53 (2014).
  53. Hsu, H. -L., et al. Flexible UV-ozone-modified carbon nanotube electrodes for neuronal recording. Adv. Mater. Deerfield Beach Fla. 22, 2177-2181 (2010).
  54. Lacour, S. P., et al. Flexible and stretchable micro-electrodes for in vitro and in vivo neural interfaces. Med. Biol. Eng. Comput. 48, 945-954 (2010).
  55. Lin, C. -M., Lee, Y. -T., Yeh, S. -R., Fang, W. Flexible carbon nanotubes electrode for neural recording. Biosens. Bioelectron. 24, 2791-2797 (2009).
  56. Richter, A., et al. A simple implantation method for flexible, multisite microelectrodes into rat brains. Front. Neuroengineering. 6, 6 (2013).
  57. Rousche, P. J., et al. Flexible polyimide-based intracortical electrode arrays with bioactive capability. IEEE Trans. Biomed. Eng. 48, 361-371 (2001).
  58. Polikov, V. S., Block, M. L., Fellous, J. -M., Hong, J. -S., Reichert, W. M. In vitro model of glial scarring around neuroelectrodes chronically implanted in the CNS. Biomaterials. 27, 5368-5376 (2006).
  59. Sohal, H. S., Clowry, G. J., Jackson, A., O'Neill, A., Baker, S. N. Mechanical Flexibility Reduces the Foreign Body Response to Long-Term Implanted Microelectrodes in Rabbit Cortex. PloS One. 11, e0165606 (2016).
  60. Moshayedi, P., et al. The relationship between glial cell mechanosensitivity and foreign body reactions in the central nervous system. Biomaterials. 35, 3919-3925 (2014).
  61. Hopkins, A. M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. 3D in vitro modeling of the central nervous system. Prog. Neurobiol. 125, 1-25 (2015).
  62. Pöttler, M., Zierler, S., Kerschbaum, H. H. An artificial three-dimensional matrix promotes ramification in the microglial cell-line, BV-2. Neurosci. Lett. 410, 137-140 (2006).
  63. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. 0, 42-51 (2014).
  64. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12, 207-218 (2014).
  65. Jeffery, A. F., Churchward, M. A., Mushahwar, V. K., Todd, K. G., Elias, A. L. Hyaluronic acid-based 3D culture model for in vitro testing of electrode biocompatibility. Biomacromolecules. 15, 2157-2165 (2014).
  66. Fitch, M. T., Silver, J. CNS Injury, Glial Scars, and Inflammation. Exp. Neurol. 209, 294-301 (2008).
  67. Churchward, M. A., Todd, K. G. Statin treatment affects cytokine release and phagocytic activity in primary cultured microglia through two separable mechanisms. Mol. Brain. 7, 85 (2014).
  68. Lai, A. Y., Todd, K. G. Differential regulation of trophic and proinflammatory microglial effectors is dependent on severity of neuronal injury. Glia. 56, 259-270 (2008).
  69. Hachet, E., Van Den Berghe, H., Bayma, E., Block, M. R., Auzély-Velty, R. Design of biomimetic cell-interactive substrates using hyaluronic acid hydrogels with tunable mechanical properties. Biomacromolecules. 13, 1818-1827 (2012).
  70. Eslami, M., Javadi, G., Agdami, N., Shokrgozar, M. A. Expression of COLLAGEN 1 and ELASTIN Genes in Mitral Valvular Interstitial Cells within Microfiber Reinforced Hydrogel. Cell J (Yakhteh). , (2015).
  71. Shaltouki, A., Peng, J., Liu, Q., Rao, M. S., Zeng, X. Efficient Generation of Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells in Defined Conditions. STEM CELLS. 31, 941-952 (2013).

Tags

Bioteknologi spørgsmålet 130 3D cellekultur hydrogel primære glia astrocyte mikroglia oligodendrocyte neuroinflammation hyaluronsyre HAMA
Forbedret 3D Hydrogel kulturer af primære Glial celler for <em>In Vitro</em> modellering af Neuroinflammation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koss, K. M., Churchward, M. A.,… More

Koss, K. M., Churchward, M. A., Jeffery, A. F., Mushahwar, V. K., Elias, A. L., Todd, K. G. Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (130), e56615, doi:10.3791/56615 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter