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Bioengineering

सुधार 3 डी Hydrogel के लिए प्राथमिक Glial कोशिकाओं की संस्कृतियों में इन विट्रो Neuroinflammation के मॉडलिंग

Published: December 8, 2017 doi: 10.3791/56615
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,3, 1,2,4, 3, 1,2,5
1Department of Psychiatry, University of Alberta, 2Alberta Innovates-Health Solutions Interdisciplinary Team in Smart Neural Prostheses (Project SMART), University of Alberta, 3Department of Chemical and Materials Engineering, University of Alberta, 4Division of Physical Medicine and Rehabilitation, University of Alberta, 5Centre for Neuroscience, University of Alberta

Summary

इस के साथ साथ, हम astrocytes, microglia, और oligodendrocytes सहित चूहे मस्तिष्क व्युत्पंन glia कोशिकाओं, की 3 डी संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । हम प्राथमिक सेल संस्कृति, methacrylated hyaluronic एसिड (हामा) hydrogel संश्लेषण, HAMAphoto-बहुलकीकरण और कोशिका encapsulation, और फोकल और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए नमूना प्रसंस्करण का प्रदर्शन ।

Abstract

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में, कई तीव्र चोटों और neurodegenerative विकारों, साथ ही प्रत्यारोपित उपकरणों या एक ही परिणाम में कार्य परिणाम को बढ़ाने के लिए इंजीनियर: अतिरिक्त सूजन gliosis की ओर जाता है, cytotoxicity, और/ एक glial निशान है कि सामूहिक चोट ख़राब या स्वस्थ वसूली को रोकने के गठन । मॉडल glial निशान गठन और अध्ययन भड़काऊ प्रक्रियाओं के लिए एक प्रणाली बनाने के इरादे के साथ, हम आवास प्राथमिक प्रसंस्कृत glial कोशिकाओं में सक्षम एक 3 डी सेल पाड़ उत्पन्न किया है: microglia कि विदेशी शरीर की प्रतिक्रिया को विनियमित और शुरू भड़काऊ घटना, astrocytes कि एक रेशेदार निशान फार्म का जवाब है, और oligodendrocytes है कि आम तौर पर भड़काऊ चोट के लिए कमजोर कर रहे हैं । वर्तमान काम एक विस्तृत कदम दर कदम विधि निर्माण, संस्कृति के लिए प्रदान करता है, और एक hyaluronic एसिड की सूक्ष्म लक्षण वर्णन-encapsulated चूहे मस्तिष्क व्युत्पंन glial कोशिकाओं के साथ 3 डी hydrogel पाड़ आधारित । इसके अलावा, सेल encapsulation और फोकल इम्यूनोफ्लोरेसेंस और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा hydrogel पाड़ के लक्षण वर्णन के लिए प्रोटोकॉल का प्रदर्शन कर रहे हैं, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से क्षमता को सक्रिय सब्सट्रेट के साथ पाड़ को संशोधित करने के साथ, बेहतर सेल एकीकरण के लिए एक वाणिज्यिक बेसल लेमिना मिश्रण का निगमन ।

Introduction

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की सूजन लंबे समय तक तीव्र (जैसे, कोरोनरी स्ट्रोक, दर्दनाक मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी की चोट) और जीर्ण (जैसे अल्जाइमर, पार्किंसंस, और हटिंगटन के रोगों) सीएनएस चोट की एक बानगी माना गया है, लेकिन तेजी से neurodegenerative और neuropsychiatric विकारों के लिए एक कारण योगदानकर्ता के रूप में मांयता प्राप्त है । निरंतर या अनुचित सूजन तंत्रिका चोट और ग्रासलेल्या पैदा कर सकता है (जैसे कई स्केलेरोसिस), और नकारात्मक मस्तिष्क के विकास को प्रभावित (उदा, एक प्रकार का पागलपन, आत्मकेंद्रित) और मूड राज्यों (जैसे, अवसाद, चिंता , द्विध्रुवी विकार) । इसके अलावा, उपंयास उपचारात्मक प्रत्यारोपण उपकरणों का उपयोग रणनीतियों (जैसे, मस्तिष्क कंप्यूटर-इंटरफेस1,2,3, गहरी मस्तिष्क उत्तेजना4,5, intraspinal microstimulation6,7,8,9,10) डिवाइस और एक में जिसके परिणामस्वरूप सीएनएस के बीच इंटरफेस पर एक पूर्वानुमान भड़काऊ प्रतिक्रिया उत्पन्न सुरक्षात्मक ऊतक प्रतिक्रिया है कि प्रत्यारोपण के जीवनकाल में प्रभावकारिता या डिवाइस विफलता के नुकसान का कारण बन सकता है11. सीएनएस में सूजन आम तौर पर microglia द्वारा शुरू की जाती है, जो ऊतक निगरानी के लिए जिंमेदार सीएनएस के निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में कार्य और विदेशी शरीर की प्रतिक्रिया बढ़ते (12की समीक्षा की) । एक अपमान की गंभीरता पर निर्भर करता है, microglia संकेत और एक चोट साइट के लिए अतिरिक्त सेल प्रकार की भर्ती । विशेष रूप से, microglia सक्रिय astrocytes, जो बारी में माध्यमिक भड़काऊ कोशिकाओं के रूप में कार्य और एक घने सुरक्षात्मक बाधा फार्म के लिए एक चोट साइट13,14शामिल हैं । Microglia भी परिधीय प्रतिरक्षा प्रणाली की कोशिकाओं में एक गतिविधि झरना शुरू कर सकते हैं, जो BBB के टूटने में परिणाम के लिए प्रतिरक्षा घुसपैठ की अनुमति कर सकते है (संदर्भ में समीक्षा की15) ।

सीएनएस में प्रत्यारोपित उपकरणों के मामले में, ऊतक क्षति डिवाइस प्रविष्टि के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विदेशी डिवाइस के जारी उपस्थिति से उत्पंन एक प्रक्रिया glial scarring शुरू हो सकता है । इस प्रक्रिया में, microglia करने के लिए और पैदा चोट के स्थल पर माइग्रेट । उंहोंने यह भी भड़काऊ कारकों की रिहाई के लिए संभावित खतरों बेअसर और अतिरिक्त glial कोशिकाओं की भर्ती शुरू करते हैं । बाद में, सक्रिय astrocytes hypertrophic हो जाते हैं और एक सतत रेशेदार बाधा के रूप में प्रत्यारोपित डिवाइस encapsulating शुरू16. भड़काऊ संकेत भी प्रत्यारोपण के आसपास के क्षेत्र से ंयूरॉन प्रक्रियाओं की वापसी को बढ़ावा देने के लिए कार्य करता है और अंततः fibroblasts रंगरूटों विकासशील glial निशान17को सुदृढ़ करने के लिए । oligodendrocytes, myelin में न्यूरॉन्स आवरण के लिए जिंमेदार कंडक्टर बढ़ाने के लिए, इस प्रक्रिया को जीवित नहीं है और दूर कोशिकाओं के निशान से प्रत्यारोपण से विभाजित है18. Glial scarring बहुत समारोह और प्रत्यारोपित उपकरणों के जीवनकाल कम कर देता है, विशेष रूप से इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग के लिए, और अंत में तंत्रिका इंटरफेस की कार्यक्षमता को सीमित करने के लिए कार्य करता है19.

कई दृष्टिकोण सीएनएस20,21,22,23में प्रत्यारोपित उपकरणों की असंगति और इंटरफेस गतिविधि को बढ़ाने के लिए शोषण किया गया है । एक व्यापक समीक्षा इन तंत्रिका इंटरफेस के24के अनुरूप डिजाइन पर उपलब्ध है । सबसे प्रमुख रणनीतियों जैसे polyelthyleneglycol (खूंटी), polylactic-co-glycolic एसिड (PLGA)25, या ऐसे पाली के रूप में प्रवाहकीय पॉलिमर के साथ इलेक्ट्रोड को बढ़ाने के रूप में संगत कोटिंग्स के साथ इलेक्ट्रोड आसपास शामिल (ईथीलीन dioxythiophene) (PEDOT), और polypyrrole (PPy)26,27,28,29,30,31. सक्रिय कोटिंग्स भी तंत्रिका ऊतक कोलेजन, fibronectins, और hyaluronic एसिड सहित extracellular मैट्रिक्स से व्युत्पंन लाइगैंडों का उपयोग कर विकास के लिए cues प्रदान करने के लिए नियोजित किया गया है३२,३३,३४ ,३५,३६,३७. इन कोटिंग्स की है और आगे का पता लगाया गया है विकास फैक्टर रिलीज़ सिस्टम के साथ प्राकृतिक सेल स्राव का अनुकरण करने के लिए30,३८,३९,४०,४१ , ४२ , ४३ , ४४ , ४५ , ४६ , ४७ , ४८ , ४९ , ५०. साथ ही, कुछ अनुसंधान समूहों इलेक्ट्रोड ज्यामिति, लचीलापन, और संरचना remodel करने के लिए उपकरण और ऊतक के बीच यांत्रिक बेमेल कम करने के लिए चुना है५१,५२,५३ ,५४,५५,५६,५७. कुल मिलाकर, इन रणनीतियों अगली पीढ़ी तंत्रिका चेहरे उपकरणों में कई होनहार सुधार करने के लिए नेतृत्व किया है, लेकिन दीर्घकालिक अनुकूलता एक पर जा रहे मुद्दे और प्रगति जटिल और समय लेने वाली vivo मॉडल में बाधा हो सकती है .

पशु मॉडल आधारित दृष्टिकोण प्रयोगात्मक प्रवाह को सीमित कर सकते हैं और इलेक्ट्रोड के परीक्षण के लिए संगतता की लागत में वृद्धि. इन विट्रो में पारंपरिक सेल संस्कृति तकनीक का उपयोग दृष्टिकोण एक अधिक लागत प्रभावी विकल्प प्रदान करते हैं, लेकिन डिवाइस और ऊतक५८के बीच बातचीत की जटिलता के बहुत दोहराऊंगा करने के लिए असफल । विशेष रूप से, 2 डी सेल संस्कृति का उपयोग सतह कोटिंग्स के परीक्षण इलेक्ट्रोड ज्यामिति की मॉडलिंग और यांत्रिक बेमेल और micromotion के प्रभाव को एक मेजबान युक्ति विफलता५९ के लिए योगदान देने के लिए योगदान सोचा , ६०.

2 डी सेल संस्कृति से जुड़ी समस्याओं को दूर करने के लिए, तंत्रिका कोशिकाओं की hydrogel संस्कृतियों अनुप्रयोगों की एक विस्तृत विविधता के लिए विकसित किया गया है, औषधीय अध्ययन६१, तंत्रिका कोशिका विभेद६२प्रत्यक्ष करने के लिए, रोग को समझने के लिए रास्ते६३,६४, या मॉडल सेल प्रवास, neuroprotection, या मॉडल ऊतक microenvironments६१के लिए अंय सेल प्रकार के साथ सह संस्कृति में स्तरित । Hydrogels आसानी से विभिंन आकारों में गठित कर रहे है और geometries प्राथमिक या अमर कोशिका संस्कृतियों के कई प्रकार को शामिल कर सकते हैं, और उच्च ऐसे फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के रूप में सामांयतः इस्तेमाल किया तकनीकों द्वारा विश्लेषण के लिए उत्तरदाई हैं । glial scarring प्रक्रिया का एक मॉडल बनाने के लिए, हम हाल ही में विकसित किया है और एक hyaluronic एसिड आधारित 3 डी hydrogel प्रणाली glial प्रतिक्रिया के उच्च प्रवाह परीक्षण के लिए प्रत्यारोपित इलेक्ट्रोड (चित्रा 1)६५के लिए विशेषता । इस प्रणाली के कई विशिष्ट लाभ हैं: 1) प्राथमिक glial कोशिकाओं (microglia, astrocytes, और oligodendrocytes) एक 3 डी मैट्रिक्स hyaluronic एसिड, जो एक अंतर्जात extracellular मैट्रिक्स घटक है के पॉलिमर से बना में समझाया जाता है; 2) मैट्रिक्स कठोरता ' देखते ' हो सकता है मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी के ऊतकों के यांत्रिक गुणों बहलाना; और 3) कोशिकाओं में मैट्रिक्स में समझाया जा सकता है एक तेजी से बेंच-शीर्ष दृष्टिकोण हरी बत्ती के साथ photopolymerization का उपयोग कर, encapsulation के दौरान विषाक्तता सीमित. इस प्रणाली के प्रमुख विशेषताओं में सक्षम बनाता है vivo reसंगतता: डिवाइस ऊतक के लिए एक तुलनीय तरीके से hydrogel में डाला जाता है, और प्रत्यारोपित उपकरणों के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया मानकों६५की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए निगरानी कर रहे हैं. इन उपकरणों और विभिंन संरचनाओं और बिजली उत्तेजना दालों की hydrogel कोटिंग्स के बीच यांत्रिक बेमेल शामिल हैं । इस सिस्टम में oligodendrocyte और संबंधित पुरोगामी भी शामिल हैं, जो अक्सर मौजूद रहते हैं और glial निशान में भर्ती होते हैं । उनकी क्षति, मृत्यु, और microglia द्वारा phagocytosis भड़काऊ चोट का अत्यधिक संकेत कर रहे हैं और एक मॉडल के रूप में कम scarring या वसूली, वे फिर से प्रदर्शन करने की क्षमता है-न्यूरॉन्स की myelination६६.

साथ ही हम संश्लेषण और संकर hyaluronic एसिड hydrogels के गठन के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तहखाने झिल्ली योगों के साथ संयुक्त के लिए एक विधि का वर्णन सेल निगम में सुधार होगा । इसके अलावा, हम प्राथमिक प्रसंस्कृत glial कोशिकाओं के शामिल (microglia, astrocytes, और oligodendrocytes) और संस्कृति के विकास का विश्लेषण immunocytochemistry और फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर प्रदर्शित करेगा ।

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Protocol

1 दिन से मस्तिष्क ऊतक निष्कर्षण के लिए प्रोटोकॉल Sprague Dawley चूहा पिल्ले, decapitation द्वारा euthanized, अलबर्टा विश्वविद्यालय में पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. Microglia और Astrocyte अलगाव६७,६८

नोट: अलगाव और सेल संस्कृति के लिए सभी मीडिया ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए एक पानी के स्नान में पहले से गरम है । है हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) 1% पेनिसिलिन-streptomycin (पी एस) है । है हैम f12 पोषक तत्व मिश्रण (DMEM/f12) के साथ सभी है Dulbecco संशोधित ईगल मीडिया 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन-streptomycin (पी एस) के साथ पूरक है । केवल trypsin कमी FBS के साथ मिश्रण । इस प्रोटोकॉल में सभी सामग्री बाँझ (फिल्टर, शराब, खरीदा, और autoclaved) कर रहे हैं और कदम संख्या १.८ के बाद हर कदम रोकनेवाला तकनीक के साथ एक सुरक्षा कैबिनेट में किया जाता है.

  1. प्रति मस्तिष्क, पूर्व गर्मी HBSS के 15 मिलीलीटर और १२.५ मिलीलीटर DMEM/F12 में ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए ५० मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूबों, और लगभग 2 मिलीलीटर ०.२५% trypsin के साथ 1 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) में एक 15 मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब । DMEM/F12 के एक अतिरिक्त 25 मिलीलीटर गर्मी । गर्म trypsin के बारे में 10 मिनट से पहले एंजाइमी गतिविधि की हानि को रोकने के लिए उपयोग करें ।
  2. पर्याप्त बाँझ में गर्म HBSS डालो, 6 और 10 सेमी संस्कृति व्यंजन सतह को कवर करने के लिए । हर दो दिमाग के लिए १ १० सेमी डिश तैयार प्लस एक अतिरिक्त 6 मुख्यमंत्री पकवान ।
  3. प्रत्येक 10 सेमी2 डिश (चित्रा 2a) में 2 दिमाग तक प्लेस ।
  4. एक विच्छेदी खुर्दबीन के नीचे, घुमावदार और सीधे संदंश का उपयोग करने के लिए midline साथ cortices अलग, और मस्तिष्क स्टेम के साथ सेरिबैलम । यह पैदावार मस्तिष्क प्रति ऊतक के तीन वर्गों (चित्रा बीसी) ।
  5. छील पतली, अर्द्ध पारदर्शी, ऊतक ऊतक के प्रत्येक खंड से रक्त वाहिकाओं युक्त की परत (मेनिन्जेस) और त्याग, शेष ऊतक एक अलग संस्कृति डिश में स्थानांतरित । पतली ऊतक कटौती से उजागर परतों को समझ, संदंश के साथ, और ध्यान से प्रमुख भागों तक खींच ' बंद लटक रहे है ' मस्तिष्क ऊतक । अंत में धीरे से इस भाग को दूर tugging । चित्र 2c-2E के प्रतिनिधि छवियों के लिए पहले, दौरान, और इस चरण के बाद देखें ।
  6. एक सुरक्षा कैबिनेट में, शेष HBSS संस्कृति पकवान, ध्यान से ऊतक को बनाए रखने से हटा दें । Macerate ऊतक के साथ एक स्केलपेल और स्थानांतरण ऊतक trypsin के साथ पूर्व गर्म 15 मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए ।
  7. एक ३७ ° c स्नान में 25 मिनट के लिए इस ट्यूब की मशीन ऊतक enzymatically को पचाने के लिए ।
  8. ५०० x जी पर कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए नीचे ट्यूब केंद्रापसारक, और बाहर supernatant डालना ।
  9. एक 10 मिलीलीटर सीरम पिपेट का उपयोग करना, trypsin को निष्क्रिय करने के लिए गर्म DMEM/F12 के 10 मिलीलीटर जोड़ें और समाधान 5 बार ऊतक को तोड़ने के लिए triturate ।
  10. ५०० x जी पर कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए नीचे ट्यूब केंद्रापसारक, और बाहर supernatant डालना ।
  11. एक 10 मिलीलीटर सीरम पिपेट का प्रयोग, फिर से गर्म DMEM के 10 मिलीलीटर/F12 में गोली सस्पेंड और एक ५० मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब के लिए समाधान हस्तांतरण ।
  12. एक 10 एमएल एक 18 गेज सुई के साथ सिरिंज का उपयोग करना, समाधान triturate 3 बार.
  13. इस समाधान के १२.५ मिलीलीटर की वृद्धि में वितरित गर्म DMEM/
  14. पिपेट एक 12 अच्छी तरह से थाली में triturated समाधान की 1 मिलीलीटर वेतन वृद्धि (मस्तिष्क प्रति 1) ।
  15. ३७ ° c और 5% कं2में एक humidified सेल संस्कृति मशीन में मशीन । मीडिया को तीन दिन बाद बदलें, और मीडिया को हर बाद तीन दिन ताज़ा करें । 2 सप्ताह के बाद, कोशिकाओं प्रयोगों के लिए एकत्र किया जा सकता है ।

2. Macromer संश्लेषण६९

  1. एक ५० मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में ३७५ मिलीग्राम hyaluronic एसिड (हेक्टेयर) नमक का वजन और आसुत पानी की ३७.५ मिलीलीटर जोड़ें ।
  2. 1 मिनट के लिए एक भंवर के साथ समाधान फ्लश और मिश्रण sonicate जब तक यह समरूप प्रकट होता है और अपने जेल की तरह चिपचिपापन खो देता है । इस प्रक्रिया में 6 ज लग सकता है ।
  3. एक चुंबकीय हलचल बार (३८ mm) के साथ एक १०० मिलीलीटर चोंच के लिए समाधान स्थानांतरण, और कमरे के तापमान पर जोरदार हलचल ।
  4. ध्यान से अनुमापन ५.० मीटर NaOH में मिश्रण हा और पीएच कागज के साथ उपाय जब तक पीएच 8 और 12 के बीच स्थिर ।
  5. संग्रह के दौरान नाइट्रोजन द्वारा कंबल ताजा methacrylic एनहाइड्राइड (एमए, ९४%), के 3 मिलीलीटर ले लीजिए ।
    नोट: एमए (दिन) लंबी अवधि के लिए वातावरण के संपर्क में है, यह अपनी जेट खो देंगे ।
    चेतावनी: MA के सभी उपयोग एक धुएं डाकू में किया जाना चाहिए ।
  6. मिश्रण हा समाधान में मा के २०० µ l को जोड़ें । प्रतिक्रिया 8 नीचे समाधान का पीएच कम करती है ।
  7. चरण २.४ करने के लिए २.६ 3 मिलीलीटर के समाधान के लिए जोड़ा गया है जब तक दोहराएँ । इस प्रक्रिया में 1-2 ज तक का समय लग सकता है ।
  8. मिश्रण के बिना, 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर जारी रखने के लिए प्रतिक्रिया की अनुमति दें ।
  9. एक ५०० मिलीलीटर चोंच में शीत इथेनॉल (ेतोः) के ४०० मिलीलीटर के लिए स्थानांतरण समाधान और 4 डिग्री सेल्सियस पर 24-72 एच के लिए वर्षण की अनुमति दें । ५६
  10. समाधान के प्रमुख हिस्से को ध्यान से निपटाने के लिए अलग चोंच में नहीं, और एक ५० मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में हाला इकट्ठा । यदि आवश्यक हो, तो यह 2-4 ट्यूबों में वितरित किया जा सकता है ।
  11. २०० x जी में कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए एक केंद्रापसारक में ट्यूबों और supernatant के निपटान के केंद्रापसारक ।
  12. ऊपर ठंडा ेतोः के साथ ट्यूब, मिश्रण 1 मिनट के लिए एक भंवरर के साथ समाधान, और दोहराएं कदम 2.10-2.11 ।
  13. बाँझ पानी के 25 मिलीलीटर जोड़ें, 1 मिनट के लिए एक भंवर के साथ समाधान मिश्रण, sonicate (> 20 kHz) 1 घंटे के लिए, और 4 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी रात भर ।
  14. एक में समाधान प्लेस-८० ° c फ्रीजर 15 मिनट के लिए या जब तक जमे हुए या तरल नाइट्रोजन में फ्लैश फ्रीज ।
    चेतावनी: तरल नाइट्रोजन का उपयोग करते समय, सुरक्षात्मक दस्ताने, एक चेहरा ढाल, और एक एप्रन का उपयोग करें ।
  15. फ्रीज ट्यूब (नीचे ०.१ mBar और-30 डिग्री सेल्सियस) 24-48 एच के लिए जब तक एक बर्फ की तरह पाउडर का उत्पादन किया जाता है ।
  16. इस बिंदु पर, 1के माध्यम से शुद्धता के लिए नमूना परीक्षण एच परमाणु चुंबकीय अनुनाद, जहां methacrylate प्रोटॉन की मात्रा (चोटियों पर ६.१ और ५.६ पीपीएम), मिथाइल प्रोटॉन के सापेक्ष (१.९ पीपीएम), पर हा रीढ़ की पुष्टि की जा सकती है । मिथाइल प्रोटॉन को ९५% methacrylate का न्यूनतम अनुपात स्वीकार्य है । ६९

3. जेल गठन और 3 डी encapsulation६५

  1. Coverslip और मोल्ड तैयारी
    1. एक ५० मिलीलीटर आसुत पानी 2% 3 के समाधान-(Trimethoxysilyl) एक ५० मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में propyl methacrylate बनाओ ।
    2. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए समाधान और रॉक में 18 मिमी ग्लास coverslips रखें । अप करने के लिए ५० coverslips एक बार में जोड़ा जा सकता है ।
    3. १०० मिलीलीटर के 3 यूरिन में प्रत्येक को सूई देकर coverslips कुल्ला कर पानी से धो लें ।
    4. एक desiccator और ओवन के साथ रात भर ४० डिग्री सेल्सियस पर एक निर्वात में coverslips सूखी ।
    5. जल्दी संदंश के साथ ७०% ेतोः में व्यक्तिगत coverslips विसर्जित कर दिया ।
    6. सुखाने के बिना, एक 12 अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से एक coverslip ड्रॉप ।
    7. प्रत्येक अच्छी तरह से बाँझ महाप्राण पानी (प्रति अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर) के साथ धो लें ।
    8. बाँझ 2 µ जी/mL पाली-एल के 1 मिलीलीटर जोड़ें-lysine (पीएलएल) के लिए एक अच्छी तरह से और > 2 एच के लिए मशीन ।
    9. महाप्राण पीएलएल समाधान और coverslips शुष्क हवा के लिए अनुमति देते हैं ।
    10. विसर्जित polydimethyl siloxane (PDMS) molds ( चित्रा 1देखें) ७०% ेतोः में, और एक coverslip के केंद्र पर एक जगह है, और हवा सूखी और मोल्ड और ग्लास के बीच एक सील बनाने की अनुमति ।
      1. एक फ्लैट तली हुई polystyrene डिश में एक 10:1 अनुपात में PDMS premix रिएजेंट कास्टिंग द्वारा PDMS मोल्ड तैयार करते हैं । तैयार PDMS की मात्रा एक शीट लगभग 1 मिमी मोटी उपज के लिए चुना जाता है । PDMS में कुओं फार्म, 10 के एक भीतरी व्यास के साथ एक सर्कल पंच के साथ चादरें काट ।
  2. सेल की तैयारी
    नोट: प्रोटोकॉल में सभी कदम एक सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ तकनीक के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं. फास्फेट बफर खारा (पंजाब) समाधान सभी कदम के लिए पीएच ७.४ के लिए समायोजित किया है ।
    1. हामा में सेल encapsulation से पहले 24 एच, 2 सप्ताह प्राथमिक संस्कृतियों के लिए मध्यम ताज़ा 12 अच्छी तरह से प्लेटों में (१.१५ कदम से) । DMEM/F12 (10% FBS और 1% PS) मध्यम प्रति अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    2. प्रत्येक 12 के लिए अच्छी तरह से कोशिकाओं की थाली पतला trypsin के १२.५ मिलीलीटर तैयार (०.२५% trypsin-EDTA DMEM/f12 मीडिया के साथ 30% पतला), और 25 मिलीलीटर DMEM/f12 (10% FBS और 1% PS) और गर्म में ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक पानी में स्नान ।
    3. एक 10 मिलीलीटर सीरम पिपेट का उपयोग कर प्लेटों से वातानुकूलित माध्यम लीजिए (> अच्छी तरह से प्रति ०.५ मिलीलीटर), अच्छी तरह से तरल शेष महाप्राण, और एक मशीन में 20-30 मिनट के लिए पतला trypsin (०.०७५% trypsin-EDTA) के प्रति अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर के साथ प्रतिस्थापित (३७ ° c, 5% CO2) तक इस हिसाब से धाराप्रवाह सेल लेयर प्लेट से अलग होता है ।
    4. एक 1 मिलीलीटर पिपेट के साथ निलंबित सेल सामग्री पुनर्प्राप्त (एक एकल फ्लोटिंग टुकड़ा के रूप में प्रकट होता है) और एक 15 मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में इकट्ठा । DMEM/F12 (10% FBS और 1% पी एस) के एक समकक्ष मात्रा के साथ पतला, और कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए २०० x g पर केंद्रापसारक, supernatant खारिज ।
    5. 10 मिलीलीटर गर्म DMEM/F12 (10% FBS और 1% PS) में सेल गोली reसस्पेंड, कोशिकाओं एक 10 मिलीलीटर पिपेट के साथ 5 बार triturate, और 2 मिनट के लिए २०० x g पर केंद्रापसारक ।
    6. supernatant, 5 मिलीलीटर गर्म DMEM/F12 में कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर सकते हैं, और एक ५० मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण ।
    7. एक 18 गेज सुई के साथ एक 10 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करना, सेल समाधान 3 बार triturate, और एक ४० µm कोशिका छलनी के माध्यम से निलंबन एक नया शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में फिल्टर ।
    8. सेल निलंबन के 10 µ एल लीजिए, गर्म DMEM/F12 में 1:100 पतला, और एक स्वचालित सेल काउंटर के साथ कोशिकाओं की गणना
    9. encapsulation कदम तक एक ३७ ° c पानी स्नान में मशीन ।
  3. सेल encapsulation
    नोट: प्रोटोकॉल में सभी कदम एक सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ तकनीक के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं.
    1. DMEM/f12 और १२.५ मिलीलीटर की वातानुकूलित DMEM/f12 मीडिया सेल की तैयारी के दौरान एकत्र की प्रत्येक 12-अच्छी प्लेट के लिए 3d hydrogels गर्म १२.५ मिलीलीटर ।
    2. ०.५% wt के अंतिम एकाग्रता के लिए आवश्यक methacrylated hyaluronic एसिड (हामा) की मात्रा तौलना/(2% wt/vol) के एक एकाग्रता पर बाँझ फ़िल्टर पंजाब में इस हामा भंग; एक एकाग्रता 4 बार अंतिम एकाग्रता की तुलना में अधिक कोशिकाओं और अन्य रिएजेंट के अलावा समायोजित करने के लिए उपयोग किया जाता है. hydrogels की १ १२ अच्छी थाली की आवश्यकता है ~ ३५० µ l पंजाबियों के साथ 7 मिलीग्राम हामा.
    3. Sonicate (> 20 kHz) समाधान जब तक हामा पूरी तरह से ६० मिनट के लिए भंग है ।
    4. दोनों triethanolamine (चाय) और 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) के व्यक्तिगत 10% समाधान तैयार है, और Eosin Y (EY) के 1 मिलीलीटर aliquots में बाँझ पंजाबियों पीएच ७.४ के एक मिमी समाधान ।
    5. १ १२ अच्छी तरह से थाली के लिए, एक अंतिम १.४ मिलीलीटर 1 x 10 7 कोशिकाओं के मिश्रण बनाने के लिए, ०.५% wt/vol हामा (३५० µ l की 2% wt/vol), ०.१% चाय (14 µ l of 10%), ०.१% NVP (14 µ l of 10%), and ०.०१ mm EY (14 µ l of 1 mm) , और 20% बेसल लेमिना मिश्रण (२८० µ l of stock). शेष मात्रा पंजाबियों की है ।
    6. धीरे एक 1 मिलीलीटर टिप के साथ एक PDMS मोल्ड में समाधान और पिपेट १०० µ एल मिश्रण ।
    7. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एक संलग्न 20 सेमी x 20 सेमी x 20 सेमी बॉक्स में एक उच्च तीव्रता हरे एलईडी प्रकाश (~ ५२० एनएम, ६० मेगावाट, के लिए नमूने बेनकाब) ।
    8. एक 12 अच्छी थाली के लिए गर्म वातानुकूलित DMEM/F12 के प्रति अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    9. अंगूठे और तर्जनी के बीच प्रत्येक coverslip को समझ, धीरे PDMS घुमावदार चिमटी के साथ बंद मोल्ड छील जेल विस्थापित करने के लिए सावधान नहीं किया जा रहा है, और यह एक अच्छी तरह से वातानुकूलित माध्यम के साथ जगह है ।
    10. प्रत्येक अच्छी तरह से एक अतिरिक्त 1 मिलीलीटर गर्म DMEM/
    11. ३७ ° c पर 5% सह 2 सप्ताह के लिए2 के साथ प्लेट्स मशीन, ताज़ा सेल मीडिया प्रत्येक कुओं से मीडिया के 1 मिलीलीटर pipetting द्वारा हर हफ्ते और 1 मिलीलीटर DMEM के साथ की जगह/

4. माइक्रोस्कोपी

  1. Immunocytochemistry
    नोट: एक औंधा फोकल माइक्रोस्कोप छवि के लिए इस्तेमाल किया गया था इन नमूनों और ImageJ प्रक्रिया और छवियों को प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. Microglia, astrocytes, oligodendrocytes, और नाभिक, हामा संस्कृति में 3 सप्ताह के बाद लेबल किया जाएगा ।
    1. एक ३७ ° c स्नान में पहले से गरम 10% पंजाबियों बफर formalin (पीएच ७.०) ।
      चेतावनी: हालांकि formalin एक धुएं डाकू के बाहर इस्तेमाल किया जा सकता है, इस सामग्री को ऊतक के साथ प्रतिक्रियाशील है, और देखभाल और दस्ताने हमेशा के साथ संभालना चाहिए । इसे अलग से निपटाना चाहिए ।
    2. प्लेटों से ध्यान से महाप्राण मीडिया और पिपेट के 1 मिलीलीटर 10% formalin के लिए एक अच्छी तरह से ।
    3. 20 मिनट के लिए एक 5% CO2 में ३७ ° c पर प्लेट्स की मशीन ।
    4. प्रत्येक थाली से महाप्राण तरल, पिपेट पंजाब के 2 मिलीलीटर (पीएच ७.४) में एक अच्छी तरह से, और 15 मिनट के लिए मशीन ।
    5. दोहराएं चरण 4.1.4 दो बार ।
    6. प्लेटों से महाप्राण तरल, 10% सामांय हार्स सीरम (एन एच एस) और ०.५% ट्राइटन X-१०० के साथ पंजाब के प्रति अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर, और ंयूनतम गति से धीरे रॉक) 1 एच के लिए जोड़ें ।
    7. दोहराएं चरण 4.1.4 तीन बार ।
    8. महाप्राण लिक्विड और पंजाब में निम्न मिश्रण की अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर जोड़ें: खरगोश-कैल्शियम बाध्यकारी एडाप्टर अणु (Iba1) 1:1000, चिकन glial fibrillary प्रोटीन (GFAP) 1:5000, माउस 2 ', 3 '-चक्रीय-nucelotide 3 '-phophodiesterase (CNPase) 1:1000, 1% एन एच एस , आणि ०.१ टक्के सेल वेध surfactant. 4 ° c रात भर में मशीन, धीरे के रूप में संभव के रूप में थाली का घोड़ा ।
    9. दोहराएँ चरण 4.1.4 के बीच में 1 एच की गर्मी के साथ तीन बार.
    10. महाप्राण तरल और 1 मिलीलीटर जोड़ें पंजाब में निंनलिखित मिश्रण के प्रति अच्छी तरह से: ६४७ एनएम उत्साहित गधा विरोधी खरगोश एंटीबॉडी 1:200, ५४६ एनएम उत्साहित बकरी विरोधी चिकन एंटीबॉडी 1:200, ४८८ एनएम उत्साहित गधा विरोधी माउस एंटीबॉडी 1:200, 1% एन एच एस, 1:1000 नीले परमाणु दाग । 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी, धीरे थाली कमाल ।
    11. दोहराएं चरण ४ ३ के बीच में 1 एच की मशीन के साथ बार ।
    12. hydrogels, महाप्राण बफर बनाए रखने के लिए, और उंहें सेल बढ़ते मध्यम के ०.५ मिलीलीटर में विसर्जित कर दिया बढ़ते माध्यम से बाहर 1 min. पिपेट और धीरे जेल के शीर्ष पर एक coverslip जगह है, कांच के बीच एक परत बनाने । hydrogel के सूखने को रोकने के लिए coverslips के खुला पक्ष को बढ़ते मध्यम की एक छोटी राशि जोड़ें ।
      नोट: समस्या निवारण प्रयोजनों के लिए, जैल कदम 4.1.11 पर imaged किया जा सकता है । आगे प्रसंस्करण से पहले उचित लेबलिंग को देखने के लिए ।
  2. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM)
    नोट: hydrogel कल्पना करने के लिए, एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप इन नमूनों की छवि के लिए इस्तेमाल किया गया था ।
    1. पूर्व-२.५% glutaraldehyde का एक निर्धारण मिश्रण और पंजाब में 2% paraformaldehyde (०.१ मीटर) एक ३७ ° c पानी के स्नान में गर्मी ।
      चेतावनी: इन रिएजेंट ऊतकों के साथ अत्यधिक प्रतिक्रियाशील हैं, और देखभाल और दस्ताने के साथ नियंत्रित किया जाना चाहिए । वे एक धुएं डाकू में जितना संभव हो संभाला और अलग से निपटारा किया जाना चाहिए ।
    2. सेल कल्चर प्लेट्स से महाप्राण मध्यम और पूर्व गरम निर्धारण मिश्रण के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    3. 20 मिनट के लिए एक 5% CO2 में ३७ ° c पर प्लेट्स की मशीन ।
    4. रात भर में प्लेटें 4 डिग्री सेल्सियस (फ्रिज/
    5. महाप्राण ने कुएँ से निर्धारण समाधान निकाला और १ मिलीलीटर पंजाबियों को जोड़ेगा ।
    6. प्रत्येक थाली से महाप्राण तरल, एक अच्छी तरह से, और 15 मिनट के लिए मशीन में पंजाब के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
    7. दोहराएं चरण 4.2.6 दो बार ।
    8. पंजाबियों को महाप्राण और प्रत्येक वेल में 1% आज़मियम tetraoxide के 1 मिलीलीटर को पंजाब में बफर करें ।
      नोट: जब तक नमूने सूख रहे हैं, इस कदम और बाद में सभी कदम एक धुएं हुड में प्रदर्शन कर रहे हैं ।
    9. निर्धारण की अनुमति दें 30 min. आज़मियम वाष्प तरल से एक ही थाली में अन्य नमूनों को ठीक कर सकते हैं के लिए होने के लिए; इसलिए, इस चरण से पहले तदनुसार पार्टीशन नमूने ।
      सावधानी: आज़मियम tetraoxide अत्यधिक ऊतक और अस्थिर के साथ प्रतिक्रियाशील है । यह खतरनाक है और दस्ताने के साथ धुएं डाकू में नियंत्रित किया जाना चाहिए । इसे और किसी भी तत्काल धोया अलग से निपटारा किया जाना चाहिए ।
    10. दोहराएं चरण 4.2.6 तीन बार ।
    11. महाप्राण तरल और नीचे दी गई सूची में निर्जलीकरण मिश्रण जोड़ने के क्रम में, और मशीन (कमरे के तापमान) संकेत समय के लिए । धीरे से शुरू इथेनॉल जोड़ने (ेतोः) के बाद फिर hexamethyldisilazane (HMDS) । प्रत्येक वृद्धि के लिए तालिका 2 देखें ।
      नोट: जब HMDS जोड़ने, coverslips दृढ़ता से प्लास्टिक का पालन कर सकते है और बहुत से हटाने के लिए मुश्किल हो गया है । इस HMDS के पहले आवेदन के बाद गिलास स्लिप के नीचे एक छोटा प्लास्टिक का प्लेटफार्म रखकर रोका जा सकता है. दूसरी ेतोः की मशीन के बाद, नमूना बाहर लिया जा सकता है और कुछ सेकंड के लिए तरल नाइट्रोजन में बुझती नमूना फ्रैक्चर फ्रीज करने के लिए ।
    12. ध्यान से सूखे नमूनों को हटाने और डबल पक्षीय प्रवाहकीय टेप के साथ इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप डिटेल स्कैनिंग पर नमूने माउंट ।
    13. धूम कोट सोने की एक ंयूनतम राशि के साथ नमूने । एक धारक में नमूने प्लेस और 15 mA में 2 मिनट के लिए मशीन संचालित ।

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Representative Results

एक उच्च प्रवाह में तंत्रिका ऊतक मेजबान प्रतिक्रिया और glial निशान मॉडल करने के लिए, इन विट्रो प्रणाली एक मैट्रिक्स सामग्री है कि संगत है के साथ एक 3 डी सेल पाड़ की आवश्यकता है, सीटू गठन में एक साइटोटोक्सिक घटना के दौरान नहीं झेलना पड़ता है, और परिवर्तनीय है के साथ सक्रिय घटकों के लिए उदार प्रतिक्रिया गाइड । इस अंत करने के लिए, हम एक 3 डी सेल पाड़ hyaluronic एसिड पर आधारित प्रणाली बनाया है, और एक प्राथमिक मिश्रित glial सेल जनसंख्या encapsulated सेल सेल बातचीत और glial bioreactivity अध्ययन । कोशिकाओं और पाड़ का एक संक्षिप्त दृश्य अध्ययन किया गया था । कोशिका उपजनसंख्याों की आकृति विज्ञान, जिसमें oligodendrocytes (CNPase in green), microglia (लाल रंग में Iba1), और astrocytes (पीले रंग में GFAP), फोकल immunofluorescent माइक्रोस्कोपी (चित्रा 3Ai-ii-सीआई-ii) द्वारा दर्शाए गए हैं. संयुक्त पाड़ और सेल आकृति विज्ञान भी SEM द्वारा दिखाए जाते हैं (चित्रा 3Aiii-iv-Ciii-iv). इन छवियों में, दोनों कम (मैं और iii), और उच्च (द्वितीय और चतुर्थ) संकल्प प्रतिनिधि छवियों को दिखाया जाता है । एक 2d पीएलएल coverslip कोटिंग (चित्रा 3) एक 3 डी ०.५% w/v हामा पाड़ (चित्र3) की तुलना में था, और ०.५% w/v हामा में 20% v/v बेसल लेमिना मिश्रण का एक मिश्रण (आंकड़ा2 सी) । यह 2d और 3 डी सेल संस्कृति में रूपात्मक मतभेदों को प्रदर्शित करने के लिए किया गया था, साथ ही पाड़ को एक जैविक लेमिना शुरू करने के प्रभाव । पूरक जानकारी में एक 3d पुनर्निर्माण भी उपलब्ध है ।

किसी 3d प्लेटफ़ॉर्म की शुरूआत के साथ परिवर्तित प्रत्येक कक्ष प्रकार की कक्ष आकृति विज्ञान । 2d अनुयाई संस्कृति में (पीएलएल-लेपित ग्लास coverslips), oligodendrocytes आमतौर पर दौर दिखाई दिया और छोटे नेटवर्क आमतौर पर हल्के से लेबल GFAP प्रक्रियाओं के साथ जोड़ने का गठन किया । Microglia अंय कक्षों की तुलना में छोटे थे और छोटे शाखाकरण प्रक्रियाएं थी जो उनके कक्ष निकायों (< 20 µm) से दूर नहीं फैली थीं । Astrocytes अधिक विविध आकार के थे, कुछ छोटे सेल निकायों और व्यापक पतली, प्रक्रियाओं शाखाओं के साथ एक रेडियल आकृति विज्ञान, जबकि दूसरों को एक चपटा उपस्थिति और कुछ व्यापक प्रक्रियाओं है कि कोट सतह के साथ रेशेदार थे । 3d हामा संस्कृति में, oligodendrocytes छोटे क्षेत्रों में शाखाओं में बंद होने वाले समूहों में दिखाई दिया । Microglia कुछ प्रक्रियाओं के साथ गोल थे, और astrocytes या तो गोल थे या एक ही क्लस्टर से नेटवर्क में रेडियल से बंटी । आम तौर पर, इन कोशिकाओं को एकल अंक से बड़ा हुआ है या अंय कोशिकाओं है, जो 2d संस्कृति के विपरीत है और मैट्रिक्स के माध्यम से सीमित गतिशीलता का संकेत है के साथ संपर्क करने के बिना हामा के क्षेत्रों में रहने के लिए दिखाई दिया । जब एक बेसल लेमिना मिश्रण के 20% वी/वी फोटो-बहुलकीकरण मिश्रण करने के लिए जोड़ा गया था, सभी glial 3 डी मंच के साथ एकीकृत प्रकार, और अधिक व्यापक, इंटरैक्टिव शाखाओं में बंटी संरचनाओं का गठन किया । Oligodendrocytes विस्तारित बल्ब गैर के समान रेडियल प्रक्रियाओं-बेसल लेमिना मिश्रण morphologies, लेकिन इसके अतिरिक्त astrocyte पाड़ भर में बंटी प्रक्रियाओं के पतले परस्पर नेटवर्क के साथ प्रक्रियाओं का विस्तार दिखाई दिया । Microglia इन सेल नेटवर्क के बीच फैलाया, पतली प्रक्रियाओं के साथ बाहर फैल रहे थे और ऊतक में अपनी आकृति विज्ञान के साथ सुसंगत । कुल मिलाकर, morphologies glia के सभी तीन प्रकार के सुझाव को हामा में एकीकृत-बेसल लेमिना मिश्रण आज़ादी से, संभवतः या तो वृद्धि हुई पालन के माध्यम से मिश्रित सब्सट्रेट या पाड़ को फिर से तैयार करने की क्षमता में वृद्धि के माध्यम से ।

जब SEM द्वारा मनाया, कक्ष आकृति विज्ञान के लिए फोकल माइक्रोग्राफ पुष्टि देखा गया था । हमा मैट्रिक्स सतह के नीचे बेहोशी से देखा 10-50 µm pores के साथ एक चिकनी सतह के रूप में दिखाई दिया । कोशिकाएँ हामा की सतह तक अनुयाई थीं और नीचे परतों में भी बेहोशी दिखाई दे रही थीं. इन glia 2d संस्कृति में उल्लेख किया उन लोगों के तुलनीय morphologies फार्म नहीं था, लेकिन एक बेसल लेमिना मिश्रण के अलावा के साथ, व्यापक नेटवर्किंग मनाया गया । microglia के छोटे समूहों के साथ मोटी astrocyte फाइबर, दोनों हमा-बेसल लेमिना मिश्रण सतह पर मनाया और एक निर्बाध तरीके से मैट्रिक्स के माध्यम से विस्तार किया गया । यह बेहोशी के रूप में देखा जा सकता है मैट्रिक्स कोशिकाओं के आसपास जोड़, सुझाव है कि कोशिकाओं पाड़ को बदलने के लिए अपने वांछित संरचनाओं में गठन हो सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: methacrylated hyaluronic एसिड की योजनाबद्ध (हामा)-3 डी सेल संस्कृति और photopolymerization प्रोटोकॉल आधारित. Glial कोशिकाओं (2 सप्ताह प्राथमिक चूहा मस्तिष्क संस्कृति) एक गिलास coverslip पर एक polydimethylsiloxane (PDMS) मोल्ड में हमा और pipetted के साथ मिलाया जाता है । यह मिश्रण एक उच्च तीव्रता हरी एलईडी प्रकाश को उजागर करने के लिए 5 मिनट के लिए hydrogel polymerize है । मोल्ड हटा दिया जाता है और जेल मीडिया में मशीन है । प्रतिनिधि कोशिकाओं microglia (लाल), astrocytes (पीला), और oligodendrocytes (हरा) शामिल हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: दिन के विच्छेदन 1 Sprague Dawley चूहा पिल्ला मस्तिष्क । पूरे मस्तिष्क की छवियां (एक), cortices और सेरिबैलम (ख), मेनिन्जेस (सी) के साथ एक एकल प्रांतस्था के विच्छेदन, मेनिन्जेस के साथ संदंश के छीलने (घ), और meninge मुक्त प्रांतस्था (ई) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: Immunofluorescent फोकल (i-ii) और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन (iii-iv) 2d पीएलएल कोटिंग्स (A), हमा (B), और हमा-बेसल लेमिना मिक्सचर (C) पर मिश्रित glia कोशिका की आबादी का माइक्रोग्राफ । लोअर (i, iii) और उच्चतर (ii, iv) आवर्धन छवियां दिखाई जाती हैं । लेबल microglia के लिए लाल रंग में Iba1, astrocytes के लिए पीला में GFAP, CNPase के लिए हरे रंग में oligodendrocytes, और एक Hoechst परमाणु दाग शामिल हैं । स्केल बार्स = 25 µm के लिए फोकल छवियां और ५० (iii) और इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ स्कैनिंग के लिए 20 µm (iv) । Hydrogels थे ०.५% w/v, और बेसल लेमिना मिश्रण 20% मात्रा से था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

पूरक चित्रा 1:3 डी immunofluorescent micrographic मिश्रित glia कोशिका आबादी के साथ हामा-बेसल लेमिना मिश्रण का पुनर्निर्माण हामा-बेसल लेमिना मिश्रण । लेबल microglia के लिए लाल रंग में Iba1, astrocytes के लिए पीला में GFAP, CNPase के लिए हरे रंग में oligodendrocytes, और एक Hoechst परमाणु दाग शामिल हैं । Hydrogels थे ०.५% w/v, और Getrex 20% मात्रा द्वारा किया गया था । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

हामा बेसल लेमिना nvp चाय ey
कार्य एकाग्रता ०.५% w/ 20% v/ ०.१०% ०.१०% .01 मिमी
12-खैर प्लेट 2% w/ १००% w/ १०% वि. वि./ १०% वि. वि./ 1 मिमी
१.४ मिलीलीटर कुल ३५० µ l २८० µ l 14 µ l 14 µ l 14 µ l

तालिका 1: कक्ष encapsulation का उदाहरण ।

घटक सामग्री मशीन समय
ेतोः 30% 30 min
ेतोः ५०% 30 min
ेतोः ७०% 30 min
ेतोः ९०% 20 मिनट
ेतोः १००% 20 मिनट
ेतोः १००% 20 मिनट
ेतोः: HMDS 75:25 20 मिनट
ेतोः: HMDS 50:50:00 20 मिनट
ेतोः: HMDS 25:75 20 मिनट
hmds १००% 20 मिनट
hmds १००% रात

तालिका 2: निर्जलीकरण में ेतोः और HMDS की क्रमिक वृद्धि ।

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Discussion

मॉडल glial bioreactivity और glial scarring प्रक्रिया के लिए एक 3d संस्कृति प्रणाली पैदा करने के लक्ष्य की ओर, हम एक प्रणाली है कि प्राथमिक प्रसंस्कृत microglia, astrocytes और oligodendrocytes का समर्थन कर सकते है और सेल के मजबूत लक्षण वर्णन सक्षम बनाता है विकसित की है आकृति विज्ञान और सेल-सेल बातचीत । दिखाया माइक्रोग्राफ से, प्रत्येक कोशिका प्रकार की आकृति विज्ञान 2d, 3 डी-हामा, और 3 डी हमा-बेसल लेमिना मिश्रण प्लेटफार्मों के साथ अलग था । 2d प्रणाली में, आकृति विज्ञान अलग सतह के विमान के साथ पक्षपाती था, लेकिन जब 3 डी हामा की तुलना में, microglia और astrocytes मैट्रिक्स के अंदर आम तौर पर छोटे थे, oligodendrocyte समूहों के अपवाद के साथ । स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ में, कोशिकाओं को आम तौर पर हामा पर अधिक गोल आकार के थे । यह मोटे तौर पर कोशिकाओं को समझाया जा रहा है के कारण हो सकता है, सीमित क्षमता के साथ गतिवान और मुक्त आंदोलन और प्रक्रियाओं के विकास के लिए मैट्रिक्स को संशोधित करने के लिए । हामा में कोशिका वृद्धि आम तौर पर दोनों astrocytes और oligodendrocytes के लिए रेडियल था । हालांकि इन कोशिकाओं प्रक्रियाओं को विस्तारित, उनके संगठन का सुझाव है कि मैट्रिक्स और अंय कोशिकाओं के साथ बातचीत करने की क्षमता भर में उनके आंदोलन सीमित था । इसके अलावा, पिछले काम फ्रीज-खंडित हामा दिखाया गया है जुड़े नेटवर्किंग के बिना छिद्रित हो, जो वृद्धि६५,७०की इस कमी की व्याख्या कर सकते हैं । यह संभव हो सकता है कि इन कोशिकाओं में से कुछ photopolymerization जीवित नहीं था, मैट्रिक्स में संरक्षित शेष है, लेकिन व्यवहार्यता व्यवस्थित हमारे पिछले काम में मूल्यांकन किया गया था, और ८०% (०.५% डब्ल्यू/वी) एक सप्ताह के पाठ्यक्रम पर बने६५।

3 डी संस्कृति में मैट्रिक्स के साथ सेल बातचीत में सुधार करने के लिए, हम एक सुसंगत और परिवर्तनीय मैट्रिक्स घटक के रूप में एक बेसल लेमिना मिश्रण की शुरुआत की । मैट्रिक्स के साथ सेल एकीकरण के लिए स्पष्ट रूप से सुधार होना पाया गया था, सभी प्रकार के सेल के साथ व्यापक प्रक्रियाओं दिखा दोनों 2d संस्कृति और 3 डी हामा की तुलना में । बेसल लेमिना मिश्रण एक किस्म बेसल लेमिना घटकों के शामिल है और मुख्य रूप से तंत्रिका स्टेम सेल के पुरोगामी७१के glial भेदभाव का समर्थन करने के लिए तैयार है । यह अप्रत्याशित नहीं था कि glial कोशिकाओं बेसल लेमिना मिश्रण करने के लिए जवाब दिया है, और बाद में आसपास के 3 डी मैट्रिक्स, लेकिन एकीकरण की हद तक एक स्वस्थ ऊतक पर्यावरण की तरह पता चलता है । हामा के लिए हमा-बेसल लेमिना मिश्रण की तुलना, hydrogel आकृति विज्ञान स्पष्ट रूप से अलग दिखाई नहीं देता है, इसलिए कोशिकाओं को और अधिक सक्रिय रूप से यह मॉडलिंग हो सकता है । इस सक्रिय घटक जोड़ने की सादगी को देखते हुए, यह अकल्पनीय के लिए अलग laminas और/या प्रोटीन cues का उपयोग करने के लिए संस्कृति की स्थिति के पक्ष में ंयूरॉंस नहीं है । एक संभावित भविष्य की दिशा में, इस प्रणाली को प्रभावित myelination या न्यूरो-भड़काऊ चोट मॉडलों की एक किस्म के लिए मिश्रित glia के साथ संयोजन के रूप में तंत्रिका progenitors से ंयूरॉंस अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

गंभीर और हानिकारक सीएनएस चोट या भौतिक अस्वीकृति की स्थिति में, निवासी ऊतक neurodegeneration और ग्रासलेल्या को ख़राब करने में सक्षम भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को आरंभ करता है । यह आमतौर पर एक glial निशान के गठन में परिणाम के लिए चोट की साइट विभाजन है, जो पुनर्जनन रोकता है । इस अध्ययन में, तरीकों एक methacrylated फोटो-पॉलिमर hyaluronic एसिड के लिए glial निशान गठन के पीछे प्रारंभिक सेलुलर प्रतिक्रिया मॉडलिंग के इरादे से आधारित 3 डी पाड़ के लिए विस्तृत थे; microglial जेट, astrocyte भर्ती और अतिवृद्धि, और oligodendrocyte चोट और वापसी । एक 3 डी सेल पाड़ सभी तीन glial सेल प्रकार को शामिल करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, और आगे एक बहु घटक बेसल लेमिना मिश्रण के साथ संशोधित किया गया था । यह निर्धारित किया गया था, द्वारा फोकल और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग, कि कोशिकाओं को हामा में समझाया गया और बेहतर करने के लिए एकीकृत कर रहे थे जब बेसल लेमिना मिश्रण पेश किया गया था. इन परिणामों के कई उपंयास अनुप्रयोगों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । अकेले हामा को सह संस्कृति प्रणाली बनाने की सेवा कर सकते हैं, जहां इरादा कोशिका बातचीत या अध्ययन के लिए सेल की सीमा है दिसतील दवा एक दवा प्रसार सीमित मैट्रिक्स के रूप में जेल का उपयोग कर वितरण । हामा मैट्रिक्स में बेसल लेमिना मिश्रण शामिल Hydrogels तीव्र सूजन, gliosis, या glial scarring मॉडलिंग करने में सक्षम पर्यावरण की तरह एक और अधिक सुसंगत ऊतक के लिए अनुमति देते हैं, और glial के आगे उच्च प्रवाह लक्षण वर्णन करता है bioreactivity प्रत्यारोपण, दवा और डिवाइस के विकास के लिए, और अन्य रणनीतियों को कम करने और भड़काऊ चोट की वसूली करने के लिए ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक NSERC, CFI, AIHS, अलबर्टा स्वास्थ्य सेवाओं, और मस्तिष्क अनुसंधान के लिए Davey बंदोबस्ती से वित्तीय सहायता के लिए आभारी हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Materials for HAMA synthesis and photopolymerization
Hyaluronic acid (HA) Sigma-Aldrich 53747-10G Streptococcus equi, MW: 1.5 - 1.8 X 10^6
Methacrylic anhydride (MA) Sigma-Aldrich 275585-100ML
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 221465-25G
Ethanol (EtOH) Commerical Alcohols Inc. Anhydrous
Phosphate buffered saline (pH 7.4) tablets Fisher Scientific 18912014
Triethanolamine (TEA) Sigma-Aldrich 90279-100ML
1-Vinyl-2pyrrolidinone (NVP) Sigma-Aldrich V3409-5G
EosinY (EY) Sigma-Aldrich E6003-25G
Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate Sigma-Aldrich 440159-100ML
Beaker (100 mL) Corning 1000-100
Beaker (500 mL) Corning 1000-600
pH paper (Labstick) Sigma-Aldrich 9580
Name Company Catalog Number Comments
2. Materials for glial cell isolation and cell culture
P1-2 Sprague Dawley rat pups Charles River CD Sprague Dawley rat strain code 001
Dissector scissors - slim blades (small) Fine Science Tools 14081-09
Surgical scissors - Toughcut (large) Fine Science Tools 14130-17
Fine forceps (Dumont #5) Fine Science Tools 11521-10
Curved fine forceps (Dumont #7) Fine Science Tools 11271-30
Hank's balanced salt solution (HBSS) Gibco 14170-112
Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) Gibco 11320-033
Penicillin-streptomycin (PS) Gibco 15140-122
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 12483-020
0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Gibco 25200-072
Poly-L-lysine (PLL) Sigma-Aldrich P-6282
50 mL conical centrifuge tube Fisher Scientific 05-539-13
15 mL conical centrifuge tube Fisher Scientific 05-539-5
12 well Tissue culture treated plates (Cellstar) Greiner Bio-One 665 108
10 mL serological pipette Fisher Scientific 13-676-10F
25 mL serological pipette Fisher Scientific 12-676-10K
Petri dish (60 mm X 15 mm) Fisher Scientific FB0875713A
Petri dish (100 mm X 15 mm) Fisher Scientific FB0875712
Microscope Coverslip (18 mm) Fisher Scientific 12-545-100 18CIR
Name Company Catalog Number Comments
3. Materials for microscopy (confocal and scanning electron microscopy)
Mouse monoclonal anti-CNPase abcam ab6319
Rabbit anti-Iba1 Wako Laboratory Chemicals 019-17741
Chicken anti-GFAP abcam ab4674
Hoechst 33342 Fisher Scientific 62249
Fluoromount-G Fisher Scientific 00-4958-02
Formalin Sigma Aldrich HT501128-4L Buffered (10%)
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
Horse Serum Gibco 16050-122
Paraformaldehyde Electon Microscopy Sciences 157-8 Buffered (8%)
Guteraldehyde Electon Microscopy Sciences 16019 Buffered (8%)
Osmium tetraoxide Electon Microscopy Sciences 19152 Buffered (2%)
Hexamethyldilazane (HMDS) Electon Microscopy Sciences 16700
Ethanol (EtOH) Electon Microscopy Sciences 15055 Anhydrous
Microscope Slide (25 X 75 X 1 mm) VWR International 48311-703

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References

  1. Shih, J. J., Krusienski, D. J., Wolpaw, J. R. Brain-Computer Interfaces in Medicine. Mayo Clin. Proc. 87, 268-279 (2012).
  2. Kennedy, P. R., Bakay, R. A. Restoration of neural output from a paralyzed patient by a direct brain connection. Neuroreport. 9, 1707-1711 (1998).
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