Summary
Ici, nous présentons un protocole pour la culture 3D du rat encéphales gliales, y compris les astrocytes, la microglie et les oligodendrocytes. Nous démontrons la culture cellulaire primaire, synthèse de l’acide hyaluronique methacrylated (HAMA) hydrogel, HAMAphoto-polymérisation et le cell encapsulation et traitement d’imagerie microscopique confocal et balayage électronique des échantillons.
Abstract
Dans le système nerveux central, nombreuses lésions aiguës et les maladies neurodégénératives, ainsi aussi implanté des dispositifs ou des biomatériaux conçus pour améliorer le résultat de la fonction dans le même résultat : inflammation excès conduit à une gliose, cytotoxicité, et/ou formation d’une cicatrice gliale qui collectivement aggraver une atteinte ou d’empêcher la reprise saine. Dans le but de créer un système de modèle cicatrice gliale formation et l’étude des processus inflammatoires, nous avons généré un échafaudage de cellule 3D capable d’accueillir des cellules gliales cultivés primaires : microglie qui régulent la réponse du corps étranger et initient la événement inflammatoire, astrocytes qui réagissent pour former une cicatrice fibreuse et oligodendrocytes qui sont en général vulnérables aux lésions inflammatoires. Le présent ouvrage offre une méthode détaillée étape par étape pour la fabrication, la culture et caractérisation microscopique d’un échafaudage d’hydrogel 3D à base d’acide hyaluronique avec rat encapsulé encéphales de cellules gliales. En outre, les protocoles pour la caractérisation d’encapsulation de cellules et de l’échafaud hydrogel par immunofluorescence confocale et microscopie électronique à balayage sont démontrés, ainsi que la capacité de modifier l’échafaud avec des substrats bioactifs, avec incorporation d’un mélange commercial de lame basale d’intégration améliorée de cell.
Introduction
L’inflammation du système nerveux central (CNS) a longtemps été considérée comme une caractéristique de l’aigu (par exemple, accident vasculaire cérébral ischémique, traumatisme cérébral et la moelle épinière) et chroniques (p. ex. Alzheimer, Parkinson d’et maladies de la chorée de Huntington) lésion de CNS, mais n’est plus en plus reconnue comme un facteur causal de neurodégénératives et des troubles neuropsychiatriques. Maintenue ou inflammation inappropriée peut causer des blessures neurales et démyélinisation (p. ex. sclérose en plaques) et une influence négative sur le développement du cerveau (par exemple, la schizophrénie, l’autisme) et des États de l’humeur (p. ex., dépression, anxiété le trouble bipolaire). En outre, de nouvelles stratégies thérapeutiques à l’aide de dispositifs implantables (e.g., interfaces cerveau-ordinateur1,2,3, deep brain stimulation4,5, intraspinale microstimulation6,7,8,9,10) générer une réponse inflammatoire prévisible à l’interface entre l’appareil et le système nerveux central, entraînant une réponse de tissu protecteur qui peut provoquer une perte d’efficacité ou dispositif échec au cours de la durée de vie de l' implant11. L’inflammation dans le système nerveux central est généralement initiée par la microglie, qui fonctionnent comme les cellules immunitaires résidents du CNS, responsable de la surveillance des tissus et la réaction au corps étranger (révisé12) de montage. Selon la gravité de l’insulte, le signal de la microglie et les recrues supplémentaires types de cellules à un site de la lésion. Plus précisément, les cellules microgliales activer les astrocytes, qui à leur tour agissent comme des cellules inflammatoires secondaires et forme une barrière protectrice dense pour contenir une blessure site13,14. Microglies peuvent aussi initier une cascade d’activité dans les cellules du système immunitaire périphérique, ce qui peut entraîner la rupture de la BHE afin de permettre l’infiltration immunitaire (revue en référence15).
Dans le cas des dispositifs implantés dans le SNC, les lésions tissulaires résultant d’un dispositif ainsi que la présence continue de l’appareil étranger peuvent enclencher un processus appelé la cicatrice gliale. Dans ce processus, les cellules microgliales migrent vers et se multiplient à l’endroit de la blessure. Ils ont également l’initiative la libération de facteurs inflammatoires pour neutraliser les menaces potentielles et recruter des cellules gliales supplémentaires. Par la suite, astrocytes activés deviennent hypertrophiques et commencent à encapsuler le dispositif implanté pour former une barrière fibreuse continue16. Signalisation inflammatoires sert également à promouvoir le retrait des processus neuronaux de la proximité de l’implant et finalement recrute des fibroblastes pour renforcer le développement de la cicatrice gliale17. Les oligodendrocytes, responsables de gainage des neurones dans la myéline pour améliorer la conductance, ne survivent pas à ce processus et cellules éloignés sont séparés de l’implant par la cicatrice18. Cicatrice gliale grandement réduit la fonction et la durée de vie des dispositifs implantés, notamment pour les électrodes d’enregistrement et en fin de compte sert à limiter les fonctionnalités des interfaces neuronales19.
Plusieurs approches ont été exploités pour augmenter la biocompatibilité et une activité d’interface des dispositifs implantés dans les CNS20,21,22,23. Un examen exhaustif est disponible sur la conception biocompatible de ces interfaces neurales24. Les principales stratégies incluent entourant l’électrode avec revêtements compatibles tels que polyelthyleneglycol (PEG), acides polylactique-co-glycolique (PLGA)25, ou le renforcement de l’électrode avec des polymères conducteurs tels que poly (éthylène dioxythiophene) (PEDOT) et le polypyrrole (PPy)26,27,28,29,30,31. Revêtements bioactifs ont également été employées pour offrir des repères pour la croissance de tissu nerveux à l’aide de ligands dérivés de matrices extracellulaires notamment collagènes et fibronectins des acides hyaluroniques32,33,34 ,35,36,37. La bioactivité de ces revêtements a été approfondie avec facteur de croissance des systèmes de largage d’émuler cellulaire naturel des sécrétions30,38,39,40,41 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50. en même temps, certains groupes de recherche ont opté pour transformer la géométrie de l’électrode, la flexibilité et composition pour diminuer le décalage mécanique entre l’appareil et les tissus51,52,53 ,,du5455,56,,57. Au total, ces stratégies ont entraîné de nombreuses améliorations prometteuses de génération neurones périphériques interfaciales, cependant la compatibilité à long terme est une question de cours et de progrès peuvent être entravé par des modèles complexes et fastidieuses in vivo .
Des approches basées sur le modèle animales peuvent limiter le débit expérimental et augmentent les coûts des tests de biocompatibilité de l’électrode. In vitro les approches à l’aide de culture de cellules classiques techniques offrent une alternative plus rentable, mais ne parviennent pas à une grande partie de la complexité de l’interaction entre l’appareil et les tissus58récapituler. En particulier, essais des revêtements de surface à l’aide de limites de culture cellulaire 2D, la modélisation de la géométrie de l’électrode et l’influence de décalage mécanique et micromotion considéré à générer une réponse de l’hôte qui contribuent au dispositif échec59 , 60.
Pour surmonter les problèmes liés à la culture cellulaire 2D, hydrogel de cultures de cellules nerveuses ont été développés pour une grande variété d’applications, les études pharmacologiques61, pour diriger la différenciation des cellules neurales62, pour comprendre la maladie les voies63,64, ou en couches en culture mixte avec d’autres types de cellules pour la migration de modèle cellulaire, neuroprotection, ou modèle tissu microenvironnements61. Hydrogels sont facilement formés à différentes dimensions et géométries peuvent incorporer de nombreux types de cultures de cellules primaires ou immortalisé et sont très propices à l’analyse de techniques couramment utilisées, telles que la microscopie confocal fluorescence. Pour créer un modèle du processus de cicatrisation glial, nous avons récemment développé et caractérisé un système acide hyaluronique base hydrogel 3D haut débit stable de la réaction gliale à implanté des électrodes (Figure 1)65. Ce système a plusieurs avantages distincts : 1) primaires cellules gliales (cellules microgliales, astrocytes et oligodendrocytes) sont encapsulées dans une matrice 3D composée de polymères d’acide hyaluronique, qui est un composant de la matrice extracellulaire endogène ; 2) la rigidité de la matrice peut être « réglée » pour recréer les propriétés mécaniques du cerveau ou des tissus de la moelle épinière ; et 3) des cellules peuvent être encapsulés dans la matrice dans une approche rapide de la table à l’aide de photopolymérisation avec feu vert, limiter la toxicité au cours de l’encapsulation. Ce système permet aux fonctionnalités clés dans vivo biocompatibilité : dispositifs sont insérées dans l’hydrogel de manière comparable aux tissus, et la réponse cellulaire aux dispositifs implantés sont surveillés pour un large éventail de paramètres65. Il s’agit d’une incompatibilité mécanique entre les périphériques et les revêtements d’hydrogel de diverses structures et les impulsions de stimulation électrique. Ce système comprend également des oligodendrocytes et des précurseurs connexes, qui sont souvent présents et recruté des cicatrices gliales. Leurs dégâts, la mort et la phagocytose par les cellules microgliales sont très révélateurs de lésion inflammatoire et comme un modèle réduit de cicatrices ou récupération, ils ont la capacité de démontrer re-myélinisation des neurones66.
Dans les présentes, nous décrivons une méthode de synthèse et de la formation d’hybrides acide hyaluronique hydrogels combinées avec des formulations de membrane de sous-sol disponible dans le commerce pour améliorer la Constitution de la cellule. En outre, nous allons démontrer l’intégration de primaire des cellules gliales (microglie, astrocytes et oligodendrocytes) et analyse de la croissance de la culture en utilisant l’immunocytochimie et microscopie confocale.
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Protocol
Le protocole pour l’extraction de tissu de cerveau de ratons Sprague Dawley en jour 1, mis à mort par décapitation, a été approuvé par le Comité de l’urbanisme à l’Université de l’Alberta et animalier.
1. la microglie et Isolations de Astrocyte67,68
Remarque : Tous les milieux d’isolement et de culture cellulaire est préchauffé à 37 ° C dans un bain d’eau. Solution saline équilibrée de Hank (HBSS) a 1 % pénicilline-streptomycine (PS). Dulbecco tous modifiés médias d’aigle avec F12 du jambon mélange nutritif (DMEM/F12) est additionné de 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 % la pénicilline-streptomycine (PS). Seuls des mélanges avec de la trypsine manquent FBS. Tous les matériaux dans le présent protocole sont stérile (filtre, alcool, acheté et stérilisés à l’autoclave) et chaque étape après étape numéro 1.8 est réalisée dans une armoire avec une technique aseptique de biosécurité.
- Par cerveau, préchauffer 15 mL de HBSS et 12,5 mL DMEM/F12 à 37 ° C dans des tubes à centrifuger coniques 50 mL et environ 2 mL de 0,25 % de trypsine avec l’acide éthylènediaminetétraacétique 1 mM (EDTA) dans un tube à centrifuger conique 15 mL. Faire chauffer 25 mL supplémentaire de DMEM/F12. Trypsine chaude environ 10 minutes avant l’utilisation pour prévenir la perte de l’activité enzymatique.
- Verser suffisamment chaud HBSS dans 6 stérile et de récipients de culture de 10 cm pour couvrir la surface. Préparer un plat de 10 cm pour chaque deux cerveaux plus un plat supplémentaire de 6 cm.
- Placer jusqu'à 2 cerveaux dans chaque plat de2 10 cm (Figure 2 a).
- Sous le microscope à dissection, utilisez courbes et droites pinces pour séparer le cortex le long de la ligne médiane et le cervelet avec le tronc cérébral. Cela donne trois sections de tissu par le cerveau (Figure 2 b).
- Peler la couche mince et translucide, (méninges) de tissu contenant les vaisseaux sanguins de chacune des sections de tissu et de jeter, transférant les tissus restants dans une boîte de Petri séparées. Saisir les couches minces exposés par les coupes de tissus, avec la pince et tirez doucement jusqu'à ce que les grandes sections sont « accroché » le tissu cérébral. Enfin enlever cette partie en tirant doucement. Voir la Figure 2-2E pour des images représentatives d’avant, pendant et après cette étape.
- Dans une armoire de biosécurité, retirez le HBSS restants de la boîte de Petri, conservant avec soin le tissu. Faire macérer le tissu avec un scalpel et transfert tissu au tube préchauffé 15 mL avec de la trypsine.
- Incuber à ce tube pendant 25 min dans un bain de 37 ° C pour digérer les tissus par voie enzymatique.
- Centrifuger le tube vers le bas à 500 g pendant 2 min à température ambiante et versez le liquide surnageant.
- À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, ajouter 10 mL de chaud DMEM/F12 pour inactiver la trypsine et triturer la solution 5 fois pour briser le tissu.
- Centrifuger le tube vers le bas à 500 g pendant 2 min à température ambiante et versez le liquide surnageant.
- À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, resuspendre le culot dans 10 mL de DMEM chaud/F12 et transvaser la solution dans un tube à centrifuger conique de 50 mL.
- À l’aide d’une seringue de 10 mL avec une aiguille de 18 calibre, triturer la solution 3 fois.
- Distribuer cette solution en incréments de 12,5 mL de DMEM chaud/F12 par le cerveau.
- Pipetter par incréments de 1 mL de la solution triturée dans une plaque 12 puits (1 par le cerveau).
- Incuber à 37 ° C et 5 % de CO2dans un incubateur de culture cellulaire humidifié. Remplacer le support après trois jours et rafraîchir les médias tous les trois jours suivants. Après 2 semaines, les cellules peuvent être collectées pour des expériences.
2. macromère synthèse69
- Peser les 375 mg de sel de l’acide hyaluronique (HA) dans un tube à centrifuger conique 50 mL et ajouter 37,5 mL d’eau distillée.
- Rincer la solution avec un vortexer pendant 1 min et laisser agir le mélange jusqu'à ce qu’il semble homogène et perd sa viscosité gélatineuse. Ce processus peut prendre de 6 h.
- Transférer de solution dans un bécher de 100 mL avec un magnétique remuer bar (38 mm) et agiter vigoureusement à la température ambiante.
- Soigneusement titrer 5,0 M NaOH dans le mélange HA et mesure avec du papier pH que le pH se stabilise entre 8 et 12.
- Collecter 3 mL d’anhydride méthacrylique fraîches (MA, 94 %), ont recouvert par l’azote pendant le stockage.
NOTE : MA est exposée à l’atmosphère de longue durée (jours), il perdra sa réactivité.
ATTENTION : Toute utilisation de MA doit être faite sous une hotte. - Ajouter 200 µL de la solution HA mélange de MA. La réaction abaisse le pH de la solution à moins 8.
- Répétez les étapes 2.4 à 2.6 jusqu'à ce que les 3 mL de MA ont été ajoutés à la solution. Ce processus peut prendre jusqu'à 1-2 h.
- Permettre la réaction de continuer toute la nuit à 4 ° C, sans mélange.
- Transférer la solution à 400 mL d’éthanol froid (EtOH) dans un bécher de 500 mL et permettre les précipitations pendant 24 à 72 h à 4 ° C. 56
- Soigneusement décanter la majeure partie de la solution dans un bécher distinct pour l’élimination et recueillir le précipité dans un tube à centrifuger conique 50 mL. Cela peut être distribué en 2 à 4 tubes, si nécessaire.
- Centrifuger les tubes à 200 x g dans une centrifugeuse pendant 2 min à température ambiante et éliminer le surnageant.
- Remplir le tube avec EtOH froid, mélanger la solution avec un vortexer pendant 1 min et répétez l’étape 2.10-2.11.
- Ajouter 25 mL d’eau désionisée stérile, mélanger la solution avec un vortexer pendant 1 min, soniquer (> 20 kHz) pendant 1 h et incuber une nuit à 4 ° C.
- Placer la solution dans un congélateur à-80 ° C pendant 15 min ou jusqu'à ce que congelés ou flash congélation dans l’azote liquide.
ATTENTION : Lors de l’utilisation de l’azote liquide, utilisez des gants de protection, un masque et un tablier. - Geler sec le tube (en dessous de 0,1 mBar et -30 ° C) pendant 24 à 48 heures une poudre de neige semblable est produite.
- À ce stade, analyser l’échantillon pour la pureté par la résonance magnétique nucléaire 1H, où la quantité de protons de méthacrylate (pics à 6,1 et 5,6 ppm), par rapport aux protons méthyliques (1,9 ppm), du squelette de HA peut être confirmée. Un ratio minimum de méthacrylate de 95 % aux protons méthyliques est acceptable. 69
3. gel Formation et Encapsulation 3D65
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Lamelle couvre-objet et préparation du moule
- Préparer une solution d’eau de 50 mL eau distillée de 2 % 3-(triméthoxysilyl) méthyle propyle dans un tube à centrifuger conique 50 mL.
- Place 18 mm verre couvre-objet dans la solution et rock pendant 1 h à température ambiante. Jusqu'à 50 lamelles peuvent être ajoutés à la fois.
- Rincer les lamelles couvre-objet en plongeant en série chacun dans 3 Béchers de 100 mL d’eau désionisée.
- Sécher les lamelles dans le vide à 40 ° C durant la nuit avec un dessiccateur et four.
- Plonger rapidement les lamelles individuelles dans 70 % EtOH avec une pince.
- Sans la dessécher, déposez chaque lamelle dans un puits d’une plaque bien 12.
- Laver et aspirer chaque puits avec de l’eau désionisée stérile (1 mL / puits).
- Ajouter 1 mL de stérile 2 µg/ml poly-L-lysine (PLL) dans chaque puits et incuber pendant > 2 h.
- Aspirer la solution PLL et permettre les lamelles à l’air sec.
- Plonger les moules de siloxane (PDMS) polydiméthylsiloxanes (voir Figure 1) chez 70 % EtOH et place l’une sur le centre de chaque lamelle et laisser sécher à l’air et créer un joint entre le moule et le verre.
- Préparer les moules PDMS en castant PDMS prémélange réactifs dans un ratio de 10:1 dans un récipient à fond plat en polystyrène. La quantité de PDMS préparé est sélectionnée pour produire une feuille environ 1 mm d’épaisseur. Aux puits de forme dans le PDMS, couper les feuilles avec un poinçon cercle avec un diamètre intérieur de 10.
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Préparation de cellules
Remarque : Toutes les étapes décrites dans le protocole sont effectuées avec la technique stérile dans une armoire de sécurité biologique. Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) est ajustée à pH 7,4 pour toutes les étapes.- 24 h avant l’encapsulation de cellules à HAMA, actualiser le support pour les cultures primaires de 2 semaines (à partir de 1.15 étape) dans les 12 plaques bien. Ajouter 1 mL de DMEM/F12 (10 % de SVF et 1 % de PS) moyen / puits.
- Pour chaque plaque de 12 puits de cellules préparer 12,5 mL de trypsine diluée (0,25 % trypsine-EDTA dilué 30 % avec les médias DMEM/F12) et 25 mL DMEM/F12 (PS de SVF et 1 % de 10 %) et au chaud à 37 ° C dans un bain d’eau.
- Recueillir le milieu conditionné de plaques à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL (> 0,5 mL par puits), soigneusement aspirer le liquide restant et remplacer par 1 mL par puits de trypsine diluée (0,075 % trypsine-EDTA) pendant 20-30 min dans un incubateur (37 ° C, 5 % de CO2) jusqu’au la couche de cellules confluentes se détache de la plaque.
- Récupérer le matériel de suspension cellulaire avec une pipette de 1 mL (apparaît comme une pièce flottante) et de recueillir dans un tube à centrifuger conique 15 mL. Diluer dans un volume équivalent de DMEM/F12 (10 % SVF et 1 % PS) et centrifuger à 200 x g pendant 2 min à température ambiante, jeter le surnageant.
- Remettre le culot dans 10 mL chaud DMEM/F12 (10 % SVF et 1 % PS), triturer les cellules 5 fois avec une pipette de 10 mL et centrifuger à 200 x g pendant 2 min.
- Décanter le liquide surnageant, remettre en suspension les cellules dans 5 mL chaud DMEM/F12 et transférer les cellules dans un tube à centrifuger conique 50 mL.
- À l’aide d’une seringue de 10 mL avec une aiguille de 18 calibre, triturer la solution cellulaire 3 fois et filtrer la suspension à travers un tamis de cellule de 40 µm dans un nouveau tube à centrifuger conique.
- Collecter 10 µL de la suspension cellulaire, diluer 1/100 à chaud DMEM/F12 et nombre de cellules avec un compteur de cellules automatisées
- Incuber dans un bain-marie à 37 ° C avant l’étape de l’encapsulation.
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Encapsulation de cellules
Remarque : Toutes les étapes décrites dans le protocole sont effectuées avec la technique stérile dans une armoire de sécurité biologique.- Pour chaque plaque de 12 puits de 3D hydrogels chaud 12,5 mL de DMEM/F12 et 12,5 mL des milieux conditionnés de DMEM/F12 recueillies au cours de la préparation de cellules.
- Peser la quantité de l’acide hyaluronique methacrylated (HAMA) nécessaire à une concentration finale de 0,5 % wt/vol dissoudre cette HAMA dans une solution PBS stérile filtrée à une concentration de (2 % wt/vol) ; une concentration 4 fois supérieure à la concentration finale est utilisée pour tenir compte de l’ajout de cellules et d’autres réactifs. Une plaque de puits 12 des hydrogels requiert ~ 350 µL PBS avec 7 mg HAMA.
- Soniquer (> 20 kHz) des solutions jusqu'à ce que HAMA est entièrement dissous pendant 60 min.
- Préparer des solutions individuelles de 10 % de triéthanolamine (TEA) et 1-vinyl-2-pyrrolidone (NVP) et une solution de 1 mM d’éosine Y (EY) dans 1 ml de PBS stérile pH 7,4.
- Pour une 12 plaque bien, faire un final 1,4 mL d’un mélange de 1 x 107 cellules, 0,5 % wt/vol HAMA (350 µL de 2 % wt/vol), 0,1 % thé (14 µL de 10 %), 0,1 % NVP (14 µL de 10 %) et de 0,01 mM EY (14 µL de 1 mM) et le mélange de la lame basale de 20 % (280 µL de stock). Le volume restant est de PBS.
- Mélanger la solution en douceur et distribuer 100 µL dans chaque moule PDMS avec une pointe de 1 mL.
- Exposer des échantillons à un voyant vert de forte intensité (~ 520 nm, 60 mW, dans un clos 20 x 20 cm x 20 cm boîte) pendant 5 min à température ambiante.
- Ajouter 1 mL par puits de chaud conditionné DMEM/F12 dans une assiette bien 12.
- Saisir chaque lamelle couvre-objet entre le pouce et l’index, lentement décoller le moule PDMS avec pincette courbée en veillant à ne pas déplacer le gel et placez-le dans un puits avec un milieu conditionné.
- Ajouter 1 mL supplémentaire chaud DMEM/F12 dans chaque puits.
- Incuber les plaques à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 2 semaines, rafraîchissant milieux cellulaires chaque semaine par pipetage 1 mL de médias de chaque puits et remplacez-les par 1 mL DMEM/F12.
4. microscopie
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Immunocytochimie
Remarque : Un microscope confocal inversé a été utilisé pour l’image de ces échantillons et ImageJ a été utilisé pour traiter et afficher les images. Seront étiquetés microglie, les astrocytes, les oligodendrocytes et les noyaux, après 3 semaines dans la culture de HAMA.- Préchauffer 10 % de formol tampon PBS (pH 7.0) dans un bain à 37 ° C.
ATTENTION : Bien que le formol peut être utilisé à l’extérieur de la hotte, ce matériau réagit avec les tissus et devrait être manipuler avec soin et gants toujours. Il faut disposer séparément. - Soigneusement aspirer médias les plaques et la pipette 1 mL de formol 10 % dans chaque puits.
- Incuber les plaques à 37 ° C dans un 5 % CO2 pendant 20 min.
- Aspirer le liquide de chaque plaque, pipette de 2 mL de PBS (pH 7,4) dans chaque puits et incuber pendant 15 min.
- Répétez l’étape 4.1.4 deux fois.
- Aspirer le liquide sur les plaques et ajouter 1 mL par puits de PBS avec 10 % de sérum de cheval normal (NHS) et 0,5 % triton X-100 en faisant doucement tourner à vitesse minimum) pendant 1 h.
- Répétez l’étape 4.1.4 trois fois.
- Aspirer le liquide et ajouter 1 mL par puits du mélange suivant dans du PBS : lapin ionisé liant le calcium adaptateur molécule (Iba1) 1:1, 000, poulet protéine fibrillaire gliale (GFAP) 1:5, 000, souris 2', 3'-cyclique-nucelotide 3'-phophodiesterase (CNPase) 1 / 1 000, 1 % NHS , et 0,1 % de cellules perforante agent tensio-actif. Incuber à 4 ° C durant la nuit, la plaque à bascule aussi doucement que possible.
- Répétez l’étape 4.1.4 trois fois avec les incubations de 1 h entre les deux.
- Aspirer le liquide et ajouter 1 mL par puits du mélange suivant dans du PBS : 647 nm excité âne anticorps de anti-lapin 1 : 200, 546 nm excité chèvre anticorps anti-poulet 1 : 200, 488 nm excité âne anticorps anti-souris 1 : 200, NHS de 1 %, 1 : 1 000 bleuissement nucléaire. Incuber à température ambiante pendant 1 h, poussant doucement la plaque.
- Répétez l’étape 4 trois fois avec les incubations de 1 h entre les deux.
- Afin de préserver les hydrogels, aspirer le tampon et immerge-les dans 0,5 mL de milieu de montage des cellules pour 1 min. Pipette sur le milieu de montage et placer délicatement un lamelle couvre-objet surface du gel, créant une couche entre le verre. Ajouter une petite quantité de milieu de montage sur le côté non couvert les lamelles pour éviter le dessèchement de l’hydrogel.
Remarque : Pour des fins de dépannage, gels peuvent être photographiées à étape 4.1.11. pour voir un étiquetage approprié avant traitement ultérieur.
- Préchauffer 10 % de formol tampon PBS (pH 7.0) dans un bain à 37 ° C.
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Microscopie électronique à balayage (SEM)
NOTE : Pour visualiser l’hydrogel, un microscope électronique à balayage a été utilisé pour l’image de ces échantillons.- Préchauffer un mélange fixateur de paraformaldéhyde glutaraldéhyde et 2 % à 2,5 % dans du PBS (0,1 M) dans un bain-marie à 37 ° C.
ATTENTION : Ces réactifs sont très réactives avec les tissus et doivent être manipulés avec soin et gants. Ils devraient être sous une hotte autant que possible les spécimens et séparément. - Aspirez le milieu à partir des plaques de culture cellulaire et ajouter 1 mL du mélange fixateur préchauffé.
- Incuber les plaques à 37 ° C dans un 5 % CO2 pendant 20 min.
- Placer les plaques à 4 ° C (réfrigérateur/glacière) du jour au lendemain.
- Aspirer la solution de fixation par les puits et ajouter 1 mL de PBS.
- Aspirer le liquide de chaque plaque, ajouter 2 mL de PBS dans chaque puits et incuber pendant 15 min.
- Répétez l’étape 4.2.6 deux fois plus.
- Aspirer le PBS et ajouter 1 mL de tétraoxyde d’osmium 1 % tamponné dans du PBS à chaque puits.
NOTE : Jusqu'à ce que les échantillons sont séchés, cette étape et toutes les étapes subséquentes sont effectuées sous une hotte. - Permettre la fixation de se produire pour vapeur d’Osmium 30 min. de liquide peut fixer les autres échantillons dans la même assiette ; par conséquent, partition échantillons en conséquence avant cette étape.
ATTENTION : Le tétraoxyde d’Osmium est hautement réactif avec tissus et volatile. Il est dangereux et doit être manipulé sous la hotte avec des gants. Il et tout immédiatement lavés devrait être cédées séparément. - Répétez l’étape 4.2.6 trois fois.
- Aspirer le liquide et ajouter les mélanges de déshydratation dans la liste ci-dessous, dans l’ordre et incuber (température ambiante) pour l’heure indiquée. Commencez par ajouter progressivement de l’éthanol (EtOH) suivi ensuite hexaméthyldisilazane (HMDS). Voir le tableau 2 pour chaque incrément.
Remarque : Lorsque vous ajoutez le HMDS, les lamelles peuvent fortement adhérer au plastique et deviennent très difficiles à enlever. Ceci peut être évité en plaçant une petite plate-forme en plastique sous le feuillet de verre après la première application du HMDS. Après la seconde incubation EtOH, l’échantillon peut être souscrite et trempé dans l’azote liquide pendant quelques secondes pour geler la fracture de l’échantillon. - Retirez les échantillons séchés délicatement et monter les échantillons sur les talons de microscope électronique à balayage à ruban conducteur double face.
- Par pulvérisation cathodique enduire les échantillons avec un montant minimum de l’or. Placer les échantillons dans un support et d’actionner la machine pendant 2 min à 15 mA.
- Préchauffer un mélange fixateur de paraformaldéhyde glutaraldéhyde et 2 % à 2,5 % dans du PBS (0,1 M) dans un bain-marie à 37 ° C.
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Representative Results
Pour modéliser la réponse de l’hôte tissu neural et la cicatrice gliale dans un haut débit, système in vitro nécessite un échafaudage de cellule 3D avec un matériel de matrice qui est biocompatible, n’engage pas un événement cytotoxique durant la formation in situ et est modifiable avec les composants bioactifs pour guider l’intervention bienveillante. À cette fin, nous avons créé un système d’échafaudage de cellule 3D basé sur l’acide hyaluronique et encapsulé une population de cellules gliales mixtes primaires afin d’étudier les interactions cellule-cellule et glial bioreactivity. Une brève étude visuelle des cellules et l’échafaudage a été réalisée. Morphologie des sous-populations de cellules, y compris les oligodendrocytes (CNPase en vert), la microglie (Iba1 en rouge), et les astrocytes (GFAP en jaune), la microscopie confocale par immunofluorescence (Figure 3Ai-ii-Ci-ii). Combiné de morphologie échafaudage et cellule sont également indiqués par SEM (Figure 3Aiii-iv - Ciii-iv). Dans ces images, basse (i et iii) et hautes images représentatives (ii et iv) résolution sont affichées. Une couche de lamelle PLL 2D (Figure 3 a) a été comparée à un échafaudage de HAMA de 3D 0,5 % p/v (Figure 3 b) et un mélange de 20 % v/v lame basale mélange dans 0,5 % p/v HAMA (Figure 3). Ceci permet de démontrer les différences morphologiques en culture cellulaire 3D et 2D, ainsi que l’effet d’introduire une lamina biologique à l’échafaud. Une reconstruction 3D est également disponible dans les informations complémentaires.
Morphologie des cellules de chaque type de cellule a changé avec l’introduction d’une plate-forme 3D. Dans la culture adhérente 2D (lamelles de verre enduit de PLL), oligodendrocytes semble généralement ronds et formé de petits réseaux reliant habituellement légèrement marqué GFAP processus. La microglie étaient plus petite que les autres cellules et avait des petits processus de ramifications qui ne s’étend pas loin de leurs corps cellulaires (< 20 µm). Les astrocytes ont été plus diversement façonnés, certains ayant une morphologie radiale avec petits corps cellulaires et vaste processus minces, ramifications, tandis que d’autres étaient fibreux avec un aspect aplati et peu large de processus qui recouvrent la surface. Dans la culture de HAMA 3D, oligodendrocytes est apparu en grappes ayant bifurqué dans des sphères plus petites. La microglie étaient ronds avec peu de processus, et astrocytes ont été arrondis ou bifurquait radialement dans les réseaux à partir d’un seul cluster. Généralement, ces cellules semblent avoir dépassé de guichets uniques ou subsistent dans les zones de la HAMA sans faire contact avec d’autres cellules, qui est à la différence de la culture 2D et est évocatrice d’une mobilité réduite par l’intermédiaire de la matrice. Lorsque 20 % v/v d’un mélange de lame basale a été ajouté au mélange photo-polymérisation, tous les sous-types gliales intégrant à la plate-forme 3D et forment des structures ramifiées plus approfondies et interactives. Oligodendrocytes étendu bulbeux processus radialement semblables aux morphologies mélange lame basale-non, mais semblent en outre étendre les processus sur les réseaux interconnectés fines des processus astrocyte ramification tout au long de l’échafaudage. La microglie étaient dispersés parmi ces réseaux cellulaires, après avoir étalé avec processus minces plus conformes à leur morphologie dans le tissu. Dans l’ensemble, les morphologies suggèrent tous les trois types des cellules gliales, intégré dans le mélange de lame basale-HAMA librement potentiellement travers soit souscrire davantage au substrat mixte, soit par une capacité accrue de remodeler l’échafaud.
Quand observée par SEM, la morphologie cellulaire a semblé corroborer la microscopie confocale. La matrice de HAMA est apparue comme une surface lisse avec 10 à 50 µm pores vus légèrement sous la surface. Les cellules sont adhérentes à la surface de la HAMA et étaient aussi vaguement visibles dans les couches sous. Ces cellules gliales ne faisaient pas de morphologies comparables à celles mentionnées dans la culture 2D, mais avec l’ajout d’un mélange de la membrane basale, une vaste mise en réseau a été observée. Fibres épaisses astrocyte, avec petits amas de cellules microgliales ont été observés sur la surface de mélange de limbe HAMA-basale et qui s’étend à travers la matrice d’une manière transparente. Cela peut considérer vaguement comme la matrice pliée autour des cellules, ce qui suggère que les cellules peuvent être modifier l’échafaud formé dans leurs conformations désirées.
Figure 1 : schéma d’acide hyaluronique methacrylated (HAMA)-Protocole de culture et de la photopolymérisation cellule 3D basé sur. Les cellules gliales (culture de cerveau primaires de rat de 2 semaine) sont mélangés avec HAMA et reversés dans un moule de polydiméthylsiloxane (PDMS) sur une lamelle de verre. Ce mélange est exposé à une lumière de LED haute intensité vert à polymériser l’hydrogel pendant 5 min. Le moule est retiré et le gel est incubé dans les médias. Cellules représentatifs comprennent la microglie (rouge), astrocytes (jaunes) et oligodendrocytes (vert). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Dissection du cerveau de chiot jour1 Sprague Dawley rats. Images du cerveau entier (A), dissection du cortex et du cervelet (B), un seul cortex avec les méninges (C), épluchage des méninges avec une pince (D) et le cortex méningées-gratuit (E). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Par immunofluorescence confocale (i-ii) et numérisation (iii-iv) les micrographies de populations de cellules gliales mixte sur 2D PLL revêtements (A), HAMA (B) et mélange de limbe HAMA-basale (C). Inférieur (i, iii) et supérieur (ii, iv) grossissement images sont affichées. Les labels comprennent Iba1 en rouge pour la microglie, GFAP en jaune pour les astrocytes, CNPase en vert pour les oligodendrocytes et une coloration nucléaire de Hoechst. Barreaux de l’échelle = 25 µm pour images confocales et (iii) de 50 et 20 µm (iv) pour la microscopie électronique à balayage. Hydrogels étaient 0,5 % p/v, et mélange de lame basale était de 20 % par volume. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Supplémentaire Figure 1 : 3D reconstruction micrographique par immunofluorescence de HAMA-basale mélange de limbe avec mélangé les populations de cellules gliales HAMA-basale mélange lamina. Les labels comprennent Iba1 en rouge pour la microglie, GFAP en jaune pour les astrocytes, CNPase en vert pour les oligodendrocytes et une coloration nucléaire de Hoechst. Hydrogels étaient 0,5 % p/v et Getrex était de 20 % par volume. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
| HAMA | Lame basale | NVP | THÉ | EY | |
| Concentration de travail | 0,5 % p/v | 20 % v/v | 0,10 % | 0,10 % | .01 mM |
| Plaque de 12 puits | 2 % w/v | 100 % w/v | 10 % v/v | 10 % v/v | 1 mM |
| 1,4 mL Total | 350 ΜL | 280 ΜL | 14 ΜL | 14 ΜL | 14 ΜL |
Tableau 1 : Exemple d’Encapsulation de cellules.
| Composant | Contenu | Temps d’incubation |
| EtOH | 30 % | 30 min |
| EtOH | 50 % | 30 min |
| EtOH | 70 % | 30 min |
| EtOH | 90 % | 20 min |
| EtOH | 100 % | 20 min |
| EtOH | 100 % | 20 min |
| EtOH:HMDS | 75/25 | 20 min |
| EtOH:HMDS | 50:50:00 | 20 min |
| EtOH:HMDS | 25 : 75 | 20 min |
| HMDS | 100 % | 20 min |
| HMDS | 100 % | Pendant la nuit |
Tableau 2 : Progressive par incréments de EtOH et HMDS en déshydratation.
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Discussion
L’objectif de générer un système de culture 3D pour modèle bioreactivity gliales et le processus de cicatrisation glial, nous avons développé un système qui peut prendre en charge primaire des microglies culture, astrocytes et oligodendrocytes et permet la caractérisation robuste de cellule interactions cellule-cellule et de la morphologie. De la microscopie montré, la morphologie de chaque type de cellule a été distinctement différente avec plates-formes mélange 2D, 3D-HAMA et 3D lamina HAMA-basale. Dans le système 2D, morphologie était partial distinctement le long du plan de la surface, mais par rapport à la 3D HAMA, la microglie et les astrocytes ont été généralement plus petites à l’intérieur de la matrice, à l’exception de grappes d’oligodendrocytes. Les balayage des micrographies, les cellules sont généralement plus en forme de rond sur la HAMA. Cela peut être en grande partie en raison de cellules étant enveloppés, avec une capacité limitée pour modifier la matrice de locomotion et de libre circulation et de croissance des processus. Excroissance de la cellule à l’HAMA a été généralement radiale pour les astrocytes et oligodendrocytes. Alors que ces cellules processus étendus, leur organisation suggèrent que leur mouvement à travers la matrice et la capacité d’interagir avec d’autres cellules était limitée. En outre, les travaux antérieurs ont montré fracturée gel HAMA pour être poreux sans réseaux interconnecté, qui peuvent expliquer ce manque d’excroissance65,70. Il peut être possible que certaines de ces cellules n’ont pas survécu la photopolymérisation, reste préservée dans la matrice, mais la viabilité a été systématiquement évaluée dans notre précédent travaille et restait 80 % (0,5 % p/v) au cours d’une semaine à65.
Afin d’améliorer l’interaction cellulaire avec la matrice dans la culture 3D, nous avons introduit un mélange de lame basale comme un composant de la matrice biocompatible et modifiable. Intégration de la cellule avec la matrice s’est avérée être nettement améliorée, avec tous les types de cellules montrant des processus par rapport à la culture 2D et 3D HAMA. Le mélange de la lame basale comporte une variété lame basale éléments et est principalement formulé pour soutenir la différenciation des cellules souches neurales précurseurs71gliale. Il n’était pas inattendu que les cellules gliales a répondu pour le mélange de la membrane basale et par la suite la matrice 3D environnante, mais le degré d’intégration propose un environnement de tissu sain. Comparer HAMA HAMA-basale mélange de Limbe, la morphologie de l’hydrogel n’apparaît pas distinctement différente, donc les cellules peuvent être plus activement remodelage il. Compte tenu de la simplicité de l’ajout de cette composante bioactive, ce n’est pas inimaginable d’utiliser différents laminas et/ou des indices de protéine à favoriser des conditions de culture pour les neurones. En direction de future potentielle, ce système pourrait être utilisé pour différencier les neurones des progéniteurs neurones en conjonction avec la glie mixte pour une variété de myélinisation percutants ou modèles de lésion neuro-inflammatoires.
En cas de blessure de CNS grave et dommageable ou rejet de biomatériau, le tissu résident initie des réactions inflammatoires pouvant exacerber la neurodégénérescence et la démyélinisation. Cela se traduit généralement par la formation d’une cicatrice gliale de partitionner l’endroit de la blessure, qui empêche la régénération. Dans cette étude, les méthodes ont été détaillées pour les methacrylated polymérisé en photo-à base d’acide hyaluronique 3D échafauds dans le but de modéliser la réaction cellulaire initiale derrière la formation de la cicatrice gliale ; microgliales réactivité, recrutement astrocyte et hypertrophie et blessures de l’oligodendrocyte et retrait. Un échafaudage de cellule 3D a été conçu pour intégrer tous les trois types de cellules gliales et a été modifié avec un mélange de plusieurs composants de la lame basale. Il a été décidé, par microscopie confocale et balayage imaging, qui que les cellules sont encapsulées dans la HAMA et étaient plus aptes à intégrer lors de l’introduction du mélange de la membrane basale. Ces résultats pourraient conduire à plusieurs nouvelles applications. HAMA seul peut servir à créer des systèmes de culture mixte où l’intention est de limiter l’interaction de cellule à cellule ou étude distiller MEDICAMENTS utilisant le gel comme une matrice limitée diffusion chargé de drogue. Hydrogels, incorporer le mélange de la membrane basale dans la matrice de HAMA permettent un environnement tissulaire plus cohérent capables de modeler une inflammation aiguë, gliose ou cicatrice gliale et permet à plus haut débit caractérisation de glial bioreactivity pour les implants, drogue et dispositif de développement et autres stratégies de réduction et de récupérer des lésions inflammatoires.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs sont reconnaissants pour le soutien financier du CRSNG, FCI, AIHS, Alberta Health Services et la dotation de Davey pour la recherche sur le cerveau.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Materials for HAMA synthesis and photopolymerization | |||
| Hyaluronic acid (HA) | Sigma-Aldrich | 53747-10G | Streptococcus equi, MW: 1.5 - 1.8 X 10^6 |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 275585-100ML | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| Ethanol (EtOH) | Commerical Alcohols Inc. | Anhydrous | |
| Phosphate buffered saline (pH 7.4) tablets | Fisher Scientific | 18912014 | |
| Triethanolamine (TEA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| 1-Vinyl-2pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | |
| EosinY (EY) | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 440159-100ML | |
| Beaker (100 mL) | Corning | 1000-100 | |
| Beaker (500 mL) | Corning | 1000-600 | |
| pH paper (Labstick) | Sigma-Aldrich | 9580 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2. Materials for glial cell isolation and cell culture | |||
| P1-2 Sprague Dawley rat pups | Charles River | CD Sprague Dawley rat strain code 001 | |
| Dissector scissors - slim blades (small) | Fine Science Tools | 14081-09 | |
| Surgical scissors - Toughcut (large) | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11521-10 | |
| Curved fine forceps (Dumont #7) | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14170-112 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
| Penicillin-streptomycin (PS) | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 12483-020 | |
| 0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Gibco | 25200-072 | |
| Poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P-6282 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-5 | |
| 12 well Tissue culture treated plates (Cellstar) | Greiner Bio-One | 665 108 | |
| 10 mL serological pipette | Fisher Scientific | 13-676-10F | |
| 25 mL serological pipette | Fisher Scientific | 12-676-10K | |
| Petri dish (60 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri dish (100 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Microscope Coverslip (18 mm) | Fisher Scientific | 12-545-100 18CIR | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3. Materials for microscopy (confocal and scanning electron microscopy) | |||
| Mouse monoclonal anti-CNPase | abcam | ab6319 | |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako Laboratory Chemicals | 019-17741 | |
| Chicken anti-GFAP | abcam | ab4674 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | |
| Fluoromount-G | Fisher Scientific | 00-4958-02 | |
| Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Buffered (10%) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Paraformaldehyde | Electon Microscopy Sciences | 157-8 | Buffered (8%) |
| Guteraldehyde | Electon Microscopy Sciences | 16019 | Buffered (8%) |
| Osmium tetraoxide | Electon Microscopy Sciences | 19152 | Buffered (2%) |
| Hexamethyldilazane (HMDS) | Electon Microscopy Sciences | 16700 | |
| Ethanol (EtOH) | Electon Microscopy Sciences | 15055 | Anhydrous |
| Microscope Slide (25 X 75 X 1 mm) | VWR International | 48311-703 |
References
- Shih, J. J., Krusienski, D. J., Wolpaw, J. R. Brain-Computer Interfaces in Medicine. Mayo Clin. Proc. 87, 268-279 (2012).
- Kennedy, P. R., Bakay, R. A. Restoration of neural output from a paralyzed patient by a direct brain connection. Neuroreport. 9, 1707-1711 (1998).
- Kennedy, P. R., Bakay, R. A., Moore, M. M., Adams, K., Goldwaithe, J. Direct control of a computer from the human central nervous system. IEEE Trans. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 8, 198-202 (2000).
- Mayberg, H. S., et al. Deep Brain Stimulation for Treatment-Resistant Depression. Neuron. 45, 651-660 (2005).
- Dougherty, D. D., et al. A Randomized Sham-Controlled Trial of Deep Brain Stimulation of the Ventral Capsule/Ventral Striatum for Chronic Treatment-Resistant Depression. Biol. Psychiatry. 78, 240-248 (2015).
- Bamford, J. A., Marc Lebel, R., Parseyan, K., Mushahwar, V. K. The Fabrication, Implantation, and Stability of Intraspinal Microwire Arrays in the Spinal Cord of Cat and Rat. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 25, 287-296 (2017).
- Holinski, B. J., et al. Intraspinal microstimulation produces over-ground walking in anesthetized cats. J. Neural Eng. 13, 056016 (2016).
- Toossi, A., Everaert, D. G., Azar, A., Dennison, C. R., Mushahwar, V. K. Mechanically Stable Intraspinal Microstimulation Implants for Human Translation. Ann. Biomed. Eng. 45, 681-694 (2017).
- Saigal, R., Renzi, C., Mushahwar, V. K. Intraspinal microstimulation generates functional movements after spinal-cord injury. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 12, 430-440 (2004).
- Lau, B., Guevremont, L., Mushahwar, V. K. Strategies for generating prolonged functional standing using intramuscular stimulation or intraspinal microstimulation. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 15, 273-285 (2007).
- Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. J. Neurosci. Methods. 148, 1-18 (2005).
- Sierra, A., et al. Surveillance, phagocytosis, and inflammation: how never-resting microglia influence adult hippocampal neurogenesis. Neural Plast. 2014, 610343 (2014).
- Holm, T. H., Draeby, D., Owens, T. Microglia are required for astroglial Toll-like receptor 4 response and for optimal TLR2 and TLR3 response. Glia. 60, 630-638 (2012).
- Gao, Z., et al. Reciprocal modulation between microglia and astrocyte in reactive gliosis following the CNS injury. Mol. Neurobiol. 48, 690-701 (2013).
- Jin, X., Yamashita, T. Microglia in central nervous system repair after injury. J. Biochem. (Tokyo). 159, 491-496 (2016).
- Griffith, R. W., Humphrey, D. R. Long-term gliosis around chronically implanted platinum electrodes in the Rhesus macaque motor cortex. Neurosci. Lett. 406, 81-86 (2006).
- Biran, R., Martin, D. C., Tresco, P. A. Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays. Exp. Neurol. 195, 115-126 (2005).
- Fawcett, J. W., Asher, R. A. The glial scar and central nervous system repair. Brain Res. Bull. 49, 377-391 (1999).
- Szarowski, D. H., et al. Brain responses to micro-machined silicon devices. Brain Res. 983, 23-35 (2003).
- Park, D. -W., et al. Graphene-based carbon-layered electrode array technology for neural imaging and optogenetic applications. Nat. Commun. 5, 5258 (2014).
- McAllister, J. P., et al. Biocompatibility of Penetrating Recording Electrode Arrays Implanted Chronically in the Feline Visual Cortex. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 1528 (2005).
- Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. J. Neurochem. 109, 117-125 (2009).
- Chung, H., et al. In vivo Biocompatibility and Stability of Polyimide Microelectrode Array for Retinal Stimulation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 5072 (2003).
- Aregueta-Robles, U. A., Woolley, A. J., Poole-Warren, L. A., Lovell, N. H., Green, R. A. Organic electrode coatings for next-generation neural interfaces. Front. Neuroengineering. 7, (2014).
- Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24, 4337-4351 (2003).
- Yang, J., et al. Ordered surfactant-templated poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) conducting polymer on microfabricated neural probes. Acta Biomater. 1, 125-136 (2005).
- Ludwig, K. A., et al. Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) polymer coatings facilitate smaller neural recording electrodes. J. Neural Eng. 8, 014001 (2011).
- Kim, D. -H., Abidian, M., Martin, D. C. Conducting polymers grown in hydrogel scaffolds coated on neural prosthetic devices. J. Biomed. Mater. Res. A. 71, 577-585 (2004).
- George, P. M., et al. Fabrication and biocompatibility of polypyrrole implants suitable for neural prosthetics. Biomaterials. 26, 3511-3519 (2005).
- Stauffer, W. R., Cui, X. T. Polypyrrole doped with 2 peptide sequences from laminin. Biomaterials. 27, 2405-2413 (2006).
- Green, R. A., Lovell, N. H., Wallace, G. G., Poole-Warren, L. A. Conducting polymers for neural interfaces: challenges in developing an effective long-term implant. Biomaterials. 29, 3393-3399 (2008).
- Gumbiner, B. M. Cell adhesion: the molecular basis of tissue architecture and morphogenesis. Cell. 84, 345-357 (1996).
- Chan, G., Mooney, D. J. New materials for tissue engineering: towards greater control over the biological response. Trends Biotechnol. 26, 382-392 (2008).
- Green, R. A., Lovell, N. H., Poole-Warren, L. A. Impact of co-incorporating laminin peptide dopants and neurotrophic growth factors on conducting polymer properties. Acta Biomater. 6, 63-71 (2010).
- Green, R. A., Lovell, N. H., Poole-Warren, L. A. Cell attachment functionality of bioactive conducting polymers for neural interfaces. Biomaterials. 30, 3637-3644 (2009).
- Koss, K. M., Unsworth, L. D. Neural tissue engineering: Bioresponsive nanoscaffolds using engineered self-assembling peptides. Acta Biomater. 44, 2-15 (2016).
- Koss, K. M., et al. Brain biocompatibility and microglia response towards engineered self-assembling (RADA)4 nanoscaffolds. Acta Biomater. 35, 127-137 (2016).
- Evans, A. J., et al. Promoting neurite outgrowth from spiral ganglion neuron explants using polypyrrole/BDNF-coated electrodes. J. Biomed. Mater. Res. A. 91, 241-250 (2009).
- Yu, X., Bellamkonda, R. V. Tissue-engineered scaffolds are effective alternatives to autografts for bridging peripheral nerve gaps. Tissue Eng. 9, 421-430 (2003).
- Houweling, D. A., Lankhorst, A. J., Gispen, W. H., Bär, P. R., Joosten, E. A. Collagen containing neurotrophin-3 (NT-3) attracts regrowing injured corticospinal axons in the adult rat spinal cord and promotes partial functional recovery. Exp. Neurol. 153, 49-59 (1998).
- Wells, M. R., et al. Gel matrix vehicles for growth factor application in nerve gap injuries repaired with tubes: a comparison of biomatrix, collagen, and methylcellulose. Exp. Neurol. 146, 395-402 (1997).
- Barras, F. M., Pasche, P., Bouche, N., Aebischer, P., Zurn, A. D. Glial cell line-derived neurotrophic factor released by synthetic guidance channels promotes facial nerve regeneration in the rat. J. Neurosci. Res. 70, 746-755 (2002).
- Fine, E. G., Decosterd, I., Papaloïzos, M., Zurn, A. D., Aebischer, P. GDNF and NGF released by synthetic guidance channels support sciatic nerve regeneration across a long gap. Eur. J. Neurosci. 15, 589-601 (2002).
- Burdick, J. A., Ward, M., Liang, E., Young, M. J., Langer, R. Stimulation of neurite outgrowth by neurotrophins delivered from degradable hydrogels. Biomaterials. 27, 452-459 (2006).
- Piantino, J., Burdick, J. A., Goldberg, D., Langer, R., Benowitz, L. I. An injectable, biodegradable hydrogel for trophic factor delivery enhances axonal rewiring and improves performance after spinal cord injury. Exp. Neurol. 201, 359-367 (2006).
- Jain, A., Kim, Y. -T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27, 497-504 (2006).
- Taylor, S. J., Sakiyama-Elbert, S. E. Effect of controlled delivery of neurotrophin-3 from fibrin on spinal cord injury in a long term model. J. Control. Release Off. J. Control. Release Soc. 116, 204-210 (2006).
- Jhaveri, S. J., et al. Release of nerve growth factor from HEMA hydrogel-coated substrates and its effect on the differentiation of neural cells. Biomacromolecules. 10, 174-183 (2009).
- Lee, A. C., et al. Controlled release of nerve growth factor enhances sciatic nerve regeneration. Exp. Neurol. 184, 295-303 (2003).
- Matsumoto, K., et al. Neurite outgrowths of neurons with neurotrophin-coated carbon nanotubes. J. Biosci. Bioeng. 103, 216-220 (2007).
- Khaled, I., et al. A Flexible Base Electrode Array for Intraspinal Microstimulation. IEEE Trans. Biomed. Eng. 60, 2904 (2013).
- David-Pur, M., Bareket-Keren, L., Beit-Yaakov, G., Raz-Prag, D., Hanein, Y. All-carbon-nanotube flexible multi-electrode array for neuronal recording and stimulation. Biomed. Microdevices. 16, 43-53 (2014).
- Hsu, H. -L., et al. Flexible UV-ozone-modified carbon nanotube electrodes for neuronal recording. Adv. Mater. Deerfield Beach Fla. 22, 2177-2181 (2010).
- Lacour, S. P., et al. Flexible and stretchable micro-electrodes for in vitro and in vivo neural interfaces. Med. Biol. Eng. Comput. 48, 945-954 (2010).
- Lin, C. -M., Lee, Y. -T., Yeh, S. -R., Fang, W. Flexible carbon nanotubes electrode for neural recording. Biosens. Bioelectron. 24, 2791-2797 (2009).
- Richter, A., et al. A simple implantation method for flexible, multisite microelectrodes into rat brains. Front. Neuroengineering. 6, 6 (2013).
- Rousche, P. J., et al. Flexible polyimide-based intracortical electrode arrays with bioactive capability. IEEE Trans. Biomed. Eng. 48, 361-371 (2001).
- Polikov, V. S., Block, M. L., Fellous, J. -M., Hong, J. -S., Reichert, W. M. In vitro model of glial scarring around neuroelectrodes chronically implanted in the CNS. Biomaterials. 27, 5368-5376 (2006).
- Sohal, H. S., Clowry, G. J., Jackson, A., O'Neill, A., Baker, S. N. Mechanical Flexibility Reduces the Foreign Body Response to Long-Term Implanted Microelectrodes in Rabbit Cortex. PloS One. 11, e0165606 (2016).
- Moshayedi, P., et al. The relationship between glial cell mechanosensitivity and foreign body reactions in the central nervous system. Biomaterials. 35, 3919-3925 (2014).
- Hopkins, A. M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. 3D in vitro modeling of the central nervous system. Prog. Neurobiol. 125, 1-25 (2015).
- Pöttler, M., Zierler, S., Kerschbaum, H. H. An artificial three-dimensional matrix promotes ramification in the microglial cell-line, BV-2. Neurosci. Lett. 410, 137-140 (2006).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. 0, 42-51 (2014).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12, 207-218 (2014).
- Jeffery, A. F., Churchward, M. A., Mushahwar, V. K., Todd, K. G., Elias, A. L. Hyaluronic acid-based 3D culture model for in vitro testing of electrode biocompatibility. Biomacromolecules. 15, 2157-2165 (2014).
- Fitch, M. T., Silver, J. CNS Injury, Glial Scars, and Inflammation. Exp. Neurol. 209, 294-301 (2008).
- Churchward, M. A., Todd, K. G. Statin treatment affects cytokine release and phagocytic activity in primary cultured microglia through two separable mechanisms. Mol. Brain. 7, 85 (2014).
- Lai, A. Y., Todd, K. G. Differential regulation of trophic and proinflammatory microglial effectors is dependent on severity of neuronal injury. Glia. 56, 259-270 (2008).
- Hachet, E., Van Den Berghe, H., Bayma, E., Block, M. R., Auzély-Velty, R. Design of biomimetic cell-interactive substrates using hyaluronic acid hydrogels with tunable mechanical properties. Biomacromolecules. 13, 1818-1827 (2012).
- Eslami, M., Javadi, G., Agdami, N., Shokrgozar, M. A. Expression of COLLAGEN 1 and ELASTIN Genes in Mitral Valvular Interstitial Cells within Microfiber Reinforced Hydrogel. Cell J (Yakhteh). , (2015).
- Shaltouki, A., Peng, J., Liu, Q., Rao, M. S., Zeng, X. Efficient Generation of Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells in Defined Conditions. STEM CELLS. 31, 941-952 (2013).
