Summary
Hierin presenteren wij een protocol voor de 3D cultuur van rat hersenen-afgeleide glia cellen, met inbegrip van astrocyten, oligodendrocyten en microglia. We tonen primaire celculturen, methacrylated hyaluronzuur (HAMA) hydrogel synthese, HAMAphoto-polymerisatie en cel inkapseling en monster verwerking voor confocale en scanning elektronen microscopische beeldvorming.
Abstract
In het centrale zenuwstelsel, talrijke acute verwondingen en neurodegeneratieve aandoeningen, zo goed als geïmplanteerde apparaten of biomaterialen ontworpen ter verbetering van het resultaat van de functie in dezelfde uitkomst: overmaat ontsteking leidt tot gliosis, cytotoxiciteit, en/of vorming van een gliale litteken dat collectief schade verergeren of voorkomen van gezond herstel. Met de bedoeling van het creëren van een systeem model gliale litteken vorming en studie inflammatoire processen, hebben we een geschikt voor huisvesting van primaire gekweekte gliacellen 3D cel-steiger gegenereerd: microglia die de reactie van het buitenlandse lichaam reguleren en initiëren de inflammatoire gebeurtenis astrocyten die reageren op een vezelig litteken vormen en oligodendrocyten die meestal kwetsbaar voor inflammatoire letsel zijn. Het huidige werk biedt een gedetailleerde stapsgewijze methode voor de fabricage, cultuur en microscopisch karakterisering van een hyaluronzuur-gebaseerde 3D hydrogel steiger met ingekapselde rat gliale cellen van hersenen-afgeleide. Verder, protocollen voor karakterisering van cel inkapselen en de hydrogel steiger door confocal immunofluorescentie en scanning elektronen microscopie zijn aangetoond, evenals de capaciteit om te wijzigen de steiger met bioactieve substraten, met opneming van een commerciële basale lamina mengsel verbeterde cel integratie.
Introduction
Ontsteking van het centrale zenuwstelsel (CNS) heeft lang beschouwd als een stempel van acute (b.v., ischemische beroerte, traumatische hersenen en ruggenmerg letsel) en chronische (zoals Alzheimer, Parkinson van en Huntingtons ziekten) CNS letsel, maar wordt steeds meer erkend als een causale bijdrage aan neurodegeneratieve en neuropsychiatrische aandoeningen. Opgelopen of ongepaste ontsteking kan veroorzaken van neurale letsel en demyelinisatie (bv . multiple sclerose), en negatieve invloed hebben op de ontwikkeling van de hersenen (bijvoorbeeld, schizofrenie, autisme) en stemming Staten (bijvoorbeeld, depressie, angst bipolaire stoornis). Verdere, nieuwe therapeutische strategieën door middel van de implanteerbare hulpmiddelen (bv., hersenen-computer-interfaces1,2,3, diepe brein stimulatie4,5, intraspinal microstimulation6,7,8,9,10) genereren van een voorspelbare inflammatoire respons op het raakvlak tussen het apparaat en de CNS wat resulteert in een beschermende weefsel antwoord dat leiden verlies van niet-werkzaamheid of apparaat gedurende de levensduur van de prothese11 tot kan. Ontsteking in het VNV wordt meestal geïnitieerd door microglia, die fungeren als de resident immuuncellen van het centraal zenuwstelsel die verantwoordelijk zijn voor weefsel surveillance en montage van de vreemd lichaam reactie (herziene12). Afhankelijk van de ernst van een belediging, cel het microglia signaal en werven extra typen naar de site van een schade. In het bijzonder de microglia activeren de astrocyten, die op zijn beurt fungeren als secundaire ontstekingscellen en vormen een dichte, beschermende barrière bevatten een letsel site13,14. Microglia kan ook een cascade van de activiteit in de cellen van de perifere immuunsysteem, die in de verdeling van de BBB resulteren kan zodat immuun infiltratie (herzien in verwijzing15) starten.
In het geval van apparaten de CNS ingeplant, weefselschade ten gevolge van het apparaat, alsmede de voortdurende aanwezigheid van de buitenlandse apparaat kan het starten van een proces genoemd gliale littekens. In dit proces, de microglia migreren naar en verspreiden op de site van letsel. Ze zijn ook starten met de release van inflammatoire factoren te neutraliseren van potentiële bedreigingen en werven extra gliacellen. Vervolgens geactiveerd astrocyten hypertrofische geworden en beginnen encapsulating het geïmplanteerde apparaat om te vormen van een continu vezelig barrière-16. Inflammatoire signalering dient ook om intrekking van neuronale processen uit de omgeving van het implantaat en uiteindelijk werft fibroblasten ter versterking van de ontwikkelingslanden gliale litteken17. De oligodendrocyten, verantwoordelijk voor de bescherming van de neuronen in de myeline te verbeteren geleidingsvermogen, dit proces niet overleven en verre cellen worden gepartitioneerd van het implantaat door de litteken-18. Gliale littekens sterk vermindert de functie en de levensduur van geïmplanteerde apparaten, met name voor opname elektroden, en uiteindelijk dient om de functionaliteit van neurale interfaces19te beperken.
Verschillende benaderingen hebben benut om de biocompatibiliteit en interface activiteit van geïmplanteerde apparaten in de CNS20,21,22,23te verhogen. Een uitgebreide review is beschikbaar op de biocompatibel ontwerp van deze neurale interfaces24. De meest prominente strategieën omvatten rondom de elektrode met compatibele coatings zoals polyelthyleneglycol (PEG), polylactic-co-glycolic zuur (PLGA)25, of verbetering van de elektrode met geleidende polymeren zoals poly (ethyleen dioxythiophene) (PEDOT), en polypyrrole (PPy)26,27,28,29,30,31. Bioactieve coatings zijn ook tewerkgesteld aan aanwijzingen geven voor zenuwweefsel groei met behulp van liganden afgeleid van extracellulaire matrices met inbegrip van collagens, fibronectins en hyaluronic zuren32,33,34 ,35,,36,,37. De topicale van deze coatings is verder onderzocht met groeifactor release systemen te emuleren natuurlijke cel afscheidingen30,38,39,40,41 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50. gelijktijdig, sommige onderzoeksgroepen hebben gekozen om het remodelleren van de elektrode geometrie, flexibiliteit en compositie aan het verlagen van de mechanische wanverhouding tussen apparaat en weefsel51,52,53 ,54,55,56,,57. Over het geheel genomen hebben deze strategieën geleid tot veel veelbelovende verbeteringen in volgende generatie neurale Interfaciale apparaten, maar de lange termijn compatibiliteit een probleem gaande is en vooruitgang kan worden belemmerd door de complexe en tijdrovende in vivo modellen .
Dierlijke modellen gebaseerde benaderingen kunnen beperken de experimentele doorvoer en hogere kosten van de elektrode biocompatibiliteit testen. In vitro benadert met behulp van conventionele celcultuur technieken bieden een meer kosteneffectief alternatief maar niet veel van de complexiteit van de interactie tussen apparaat en weefsel58recapituleren. In het bijzonder, testen van oppervlaktecoatings 2D cel cultuur grenzen met het modelleren van de meetkunde van de elektrode en de invloed van mechanische mismatch en micromotion dacht dat bijdragen aan het genereren van een reactie van de gastheer bij te dragen tot apparaat mislukking59 , 60.
Om te overwinnen problemen in verband met 2D celcultuur, zijn hydrogel culturen van neurale cellen ontwikkeld voor een breed scala aan toepassingen, farmacologische studies61, directe neurale cel differentiatie62, om te begrijpen van de ziekte trajecten63,64, of gelaagde in co-cultuur met andere celtypes model cel migratie, neuroprotectie, of tot en met model weefsel microenvironments61. Hydrogels gemakkelijk worden gevormd in verschillende maten en geometrieën talrijke soorten primaire of vereeuwigd celculturen kunnen opnemen, en zijn zeer vatbaar voor analyse door veelgebruikte technieken zoals confocal fluorescentie microscopie. Als u wilt maken een model van het gliale littekens proces, hebben we onlangs ontwikkeld en een hyaluronzuur gebaseerde 3D hydrogel systeem voor high-throughput testen van de gliale reactie op geïmplanteerde elektroden (Figuur 1)65gekenmerkt. Dit systeem heeft een aantal duidelijke voordelen: 1) primaire gliale cellen (microglia astrocyten en oligodendrocyten) zijn ingekapseld in een 3D matrix samengesteld van polymeren van hyaluronzuur, een onderdeel van de endogene extracellulaire matrix; 2) de stijfheid van de matrix kan worden 'afgestemd' herstellen van de mechanische eigenschappen van hersenen of ruggenmerg weefsel; en 3) cellen kunnen worden samengevat in de matrix in een snelle aanpak van de Bank-top photopolymerization met groen licht, beperking van toxiciteit tijdens inkapseling. Dit systeem maakt zeer belangrijke eigenschappen van in vivo biocompatibiliteit: apparaten worden ingevoegd in de hydrogel op een vergelijkbare wijze aan weefsel, en de cellulaire reactie op geïmplanteerde apparaten op een groot aantal parameters65worden gecontroleerd. Het gaat hierbij om mechanische wanverhouding tussen apparaten en de hydrogel coatings van verschillende structuren en elektrische stimulatie pulsen. Dit systeem omvat ook Oligodendrocyt en verwante precursoren, die vaak aanwezig en aangeworven gliale littekens. Hun schade, dood en fagocytose door microglia zijn zeer indicatief van inflammatoire letsel en als een model verminderd littekens of herstel, zij hebben de capaciteit om aan te tonen van re-myelinisering van neuronen66.
Hierin beschrijven we een methode voor de synthese en de vorming van hybride hyaluronzuur hydrogels gecombineerd met verkrijgbare kelder membraan formuleringen te verbeteren van de opneming van de cel. Verder zullen we laten zien de opneming van primaire gekweekte gliale cellen (microglia astrocyten en oligodendrocyten) en analyse van de groei van de cultuur met immunocytochemie en confocale microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol voor de hersenen weefsel extractie van dag 1 Sprague-Dawley ratten pups, euthanized door onthoofding, werd goedgekeurd door het Animal Care en gebruik Comité bij de Universiteit van Alberta.
1. Microglia en Astrocyt isolatie67,68
Opmerking: Alle media voor isolatie en cultuur van de cel is voorverwarmd tot 37 ° C in een waterbad. Henks evenwichtige zoutoplossing (HBSS) heeft 1% penicilline-streptomycine (PS). Alle Dulbecco van bewerkt Eagle's media met Ham de F12 nutriënten mengsel (DMEM/F12) wordt aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (PS). Enige mengsels met trypsine ontbreken FBS. Alle materialen in dit protocol zijn steriele (filter, alcohol, gekochte en gesteriliseerde met autoclaaf) en elke stap na stap nummer 1.8 is uitgevoerd in een kabinet met aseptische techniek bioveiligheid.
- Verwarm 15 mL HBSS en 12,5 mL DMEM/F12 tot 37 ° C in 50 mL conische centrifuge buizen, en ongeveer 2 mL 0,25% trypsine met 1 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) in een conische centrifuge tube van 15 mL per hersenen. Verwarm een extra 25 mL van DMEM/F12. Warme trypsine ongeveer 10 min voorafgaande te gebruiken ter voorkoming van verlies van enzymatische activiteit.
- Giet genoeg warm HBSS in steriele, 6 en 10 cm cultuur gerechten ter dekking van het oppervlak. Het bereiden van een 10 cm schotel voor elke twee hersenen plus een extra 6 cm schotel.
- Plaats maximaal 2 hersenen in elk 10 cm2 gerecht (figuur 2A).
- Onder een Microscoop dissectie, gebruik pincet gebogen en rechte scheidt de cortices langs de middellijn en het cerebellum met hersenstam. Dit levert drie secties van weefsel per hersenen (figuur 2B).
- Schil de dunne, semi-transparante, laag (hersenvliezen) van weefsel bevattende bloedvaten van elke sectie van de weefsels en negeren, overdracht van de resterende weefsel in een aparte cultuur schotel. Pak de dunne lagen blootgesteld door kortingen op de weefsels, met de Tang, en trek voorzichtig tot grote delen zijn 'opknoping uit' het hersenweefsel. Ten slotte Verwijder dit gedeelte door zachtjes trekken. Zie figuur 2C-2E voor representatieve foto's van vóór, tijdens en na deze stap.
- In een kast bioveiligheid, de resterende HBSS uit de cultuur schotel, zorgvuldig behoud van het weefsel te verwijderen. Het weefsel met een scalpel maceraat en overdracht van weefsel aan de voorverwarmde 15 mL tube met trypsine.
- Deze buis gedurende 25 minuten in een bad van 37 ° C te verteren het weefsel enzymatisch uit te broeden.
- Centrifugeer de buis naar beneden bij 500 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur, en giet het supernatant.
- Met behulp van serologische Pipetteer 10 mL, voeg toe 10 mL warme DMEM/F12 voor inactivering van de trypsine en triturate de oplossing 5 keer te breken van het weefsel.
- Centrifugeer de buis naar beneden bij 500 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur, en giet het supernatant.
- Met behulp van serologische Pipetteer 10 mL, resuspendeer de pellet in 10 mL warme DMEM/F12 en breng de oplossing over in een 50 mL conische centrifugebuis.
- Met een 10 mL injectiespuit met een naald 18 gauge, triturate de oplossing 3 keer.
- Deze oplossing distribueren in stappen van 12,5 mL warme DMEM/F12 per hersenen.
- Pipetteer 1 mL stappen van de triturated oplossing in een 12 goed plaat (1 per hersenen).
- Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2in een bevochtigde cel cultuur incubator. Media na drie dagen vervangen en vernieuwen van media om de volgende drie dagen. Na 2 weken, kunnen de cellen worden verzameld voor experimenten.
2. Macromer synthese69
- Weeg 375 mg hyaluronzuur (HA) zout in een conische centrifugebuis van 50 mL en voeg 37,5 mL gedestilleerd water.
- Spoel de oplossing met een vortexer voor 1 min en bewerk ultrasone trillingen ten het mengsel totdat het lijkt homogene en haar gel-achtige viscositeit verliest. Dit proces duurt 6 uur.
- Overdracht oplossing voor een bekerglas van 100 mL met een magnetische roer bar (38 mm), en roer krachtig bij kamertemperatuur.
- Titreer zorgvuldig 5.0 M NaOH in de mengkamer HA en maatregel met pH-papier totdat de pH tussen 8 en 12 stabiliseert.
- Verzamelen van 3 mL verse methacrylzuur anhydride (MA, 94%), bedekt met stikstof tijdens de opslag.
Opmerking: MA wordt blootgesteld aan de atmosfeer voor lange duur (dagen), dan verliest de reactiviteit.
Let op: Alle gebruik van MA moet gebeuren in een zuurkast. - Voeg 200 µL van MA in de mengoplossing HA. De reactie verlaagt de pH van de oplossing onder 8.
- Herhaal stap 2.4 tot en met 2.6 totdat de 3 mL MA zijn toegevoegd aan de oplossing. Dit kan maximaal 1-2 uur duren.
- Toestaan dat de reactie op blijven 's nachts bij 4 ° C, zonder mengen.
- Breng de oplossing aan 400 mL koude ethanol (EtOH) in een bekerglas van 500 mL en toestaan van neerslag voor 24-72 uur bij 4 ° C. 56
- Zorgvuldig decanteren in het grootste gedeelte van de oplossing in een afzonderlijk bekerglas voor verwijdering, en verzamelen van het precipitaat op in een tube van 50 mL conische centrifuge. Dit kan worden verdeeld in 2-4 buizen, indien nodig.
- Centrifugeer de buizen bij 200 x g in een centrifuge gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en de afzet van de bovendrijvende substantie.
- De buis met koude EtOH herladen, meng de oplossing met een vortexer voor 1 min en herhaalt u stap 2.10-2.11.
- Voeg 25 mL steriel gedeïoniseerd water, meng de oplossing met een vortexer voor 1 min, bewerk ultrasone trillingen ten (> 20 kHz) voor 1 h, en na een nacht bebroeden bij 4 ° C.
- Plaats van de oplossing in een vriezer-80 ° C gedurende 15 minuten of totdat de bevroren of flash bevriezen in vloeibare stikstof.
Let op: Bij het gebruik van vloeibare stikstof, gebruik van beschermende handschoenen, een gelaatsscherm en een schort. - Bevriezen droog de buis (onder 0.1 mBar en -30 ° C) voor 24-48 h totdat een sneeuw-achtige poeder wordt geproduceerd.
- Op dit punt, test het monster voor zuiverheid via 1H nucleaire magnetische resonantie, waar de hoeveelheid methacrylaat protonen (pieken bij 6.1 en 5.6 pag/min), ten opzichte van methyl protonen (1.9 ppm), op de backbone HA kan worden bevestigd. Een minimumverhouding van 95% methacrylaat tot methyl protonen is aanvaardbaar. 69
3. gel vorming en 3D inkapseling65
-
Dekglaasje aan en schimmel voorbereiding
- Maak een 50 mL gedestilleerd water oplossing van 2% 3-(Trimethoxysilyl) propyl methacrylaat in een tube van 50 mL conische centrifuge.
- Plaats 18 mm glas coverslips in oplossing en rock gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Tot 50 coverslips kunnen tegelijk worden toegevoegd.
- Spoel coverslips door serieel dompelen elk in 3 bekerglazen van 100 mL gedeïoniseerd water.
- Droog de coverslips in een vacuüm bij 40 ° C's nachts met een exsiccator en oven.
- Snel het onderdompelen van individuele coverslips in 70% EtOH met een tang.
- Zonder drogen, door elke dekglaasje aan te vallen door een putje van een 12 goed plaat.
- Wassen en gecombineerd elk putje met steriel gedeïoniseerd water (1 mL per putje).
- Voeg 1 mL steriele 2 µg /mL poly-L-lysine (PLL) toe aan elk putje en incubeer gedurende > 2 h.
- Gecombineerd PLL oplossing en laat de coverslips in de lucht droog.
- Siliconenvloeist siloxaan (PDMS) mallen (Zie Figuur 1) in 70% EtOH, en plaats een op het midden van elke dekglaasje aan, onderdompelen en toestaan in de lucht droog en creëren een afdichting tussen de schimmel en glas.
- PDMS mallen voor te bereiden door het gieten van PDMS premix reagentia in een verhouding 10:1 in een platbodem polystyreen schotel. De hoeveelheid PDMS bereid is geselecteerd om de opbrengst van een blad ongeveer 1 mm dik. Formulier putjes in de PDMS, snijden van de platen met een punch van de cirkel met een inwendige diameter van 10.
-
Voorbereiding van de cel
Opmerking: Alle stappen in het protocol worden uitgevoerd met steriele techniek in een kabinet bioveiligheid. De fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) wordt ingesteld op pH 7.4 voor alle stappen.- 24 h vóór de inkapseling van de cel in HAMA, vernieuwen het medium voor de primaire culturen van 2 weken (vanaf stap 1.15) in de 12 goed platen. Voeg vervolgens 1 mL van DMEM/F12 (10% FBS en 1% PS) middellange per putje.
- Voor elke 12-well plaat van cellen bereiden 12,5 mL verdunde trypsine (0,25% trypsine-EDTA verdund 30% met DMEM/F12 media), en 25 mL DMEM/F12 (10% FBS en 1% PS) en warm in bij 37 ° C in een waterbad.
- Geconditioneerde medium ophalen met behulp van serologische Pipetteer 10 mL (> 0,5 mL per putje) platen, grondig gecombineerd resterende vloeistof, en vervangen door 1 mL per putje van verdunde trypsine (0,075% trypsine-EDTA) voor 20-30 min in een incubator (37 ° C, 5% CO2) tot de confluente cellaag is losgekoppeld van de plaat.
- Herstellen van zwevende cel materiaal met een 1 mL Pipet (wordt weergegeven als een zwevende stuk) en verzamelen in een tube van 15 mL conische centrifuge. Verdund met een gelijkwaardige hoeveelheid DMEM/F12 (10% FBS en 1% PS), en centrifuge op 200 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur, teruggooi het supernatant.
- Resuspendeer de pellet cel in 10 mL warm DMEM/F12 (10% FBS en 1% PS), triturate van de cellen 5 keer met een pipet 10 mL en centrifugeer bij 200 x g gedurende 2 minuten.
- De bovendrijvende vloeistof decanteren, resuspendeer de cellen in 5 mL warm DMEM/F12 en de cellen overbrengen in een tube van 50 mL conische centrifuge.
- Met een 10 mL injectiespuit met een naald 18 gauge, triturate van de cel-oplossing 3 keer en filtreer de schorsing door een zeef van 40 µm cel in een nieuwe conische centrifugebuis.
- Verzamelen van 10 µL celsuspensie, Verdun 1:100 in warme DMEM/F12 en cellen tellen met een geautomatiseerde cel counter
- Incubeer in een waterbad 37 ° C tot inkapseling stap.
-
Cel inkapseling
Opmerking: Alle stappen in het protocol worden uitgevoerd met steriele techniek in een kabinet bioveiligheid.- Voor elke 12-well plaat van 3D warme hydrogels 12,5 mL DMEM/F12 en 12,5 mL van de geconditioneerde DMEM/F12 media verzameld tijdens de voorbereiding van de cel.
- Weeg de hoeveelheid methacrylated hyaluronzuur (HAMA) vereist voor een eindconcentratie van 0,5% wt/vol. ontbinden deze HAMA in steriele gefilterde PBS met een concentratie van (2% wt/vol); een concentratie 4 keer hoger dan de uiteindelijke concentratie wordt gebruikt om de toevoeging van cellen en andere reagentia. Een 12 goed plaat van hydrogels vereist ~ 350 µL PBS met 7 mg HAMA.
- Bewerk ultrasone trillingen ten (> 20 kHz) oplossingen tot HAMA volledig voor 60 min opgelost is.
- Individuele oplossingen van 10% van zowel triethanolamine (thee) en 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP), en een 1 mM oplossing van eosine Y (EY) in 1 mL aliquots van steriele PBS pH 7.4 voorbereiden.
- Voor een 12 goed plaat, een definitieve 1,4 mL van het mengsel van 1 x 107 cellen maken, 0,5% wt/vol HAMA (350 µL van 2% wt/vol), 0,1% thee (14 µL van 10%), 0,1% NVP (14 µL van 10%), en 0,01 mM EY (14 µL van 1 mM) , en 20% basale lamina mengsel (280 µL van voorraad). Het resterende volume is PBS.
- Zachtjes Meng de oplossing en Pipetteer 100 µL in elke PDMS schimmel met een tip 1 mL.
- Monsters met een hoge intensiteit groen LED licht bloot (~ 520 nm, 60 mW, in een afgesloten 20 x 20 cm x 20 cm vak) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 1 mL per putje van warme geconditioneerde DMEM/F12 op een 12 goed bord.
- Grijpen elke dekglaasje aan tussen duim en wijsvinger langzaam het PDMS schimmel afschilferen met gebogen pincet voorzichtig niet om te sneuvelen de gel en plaatst u deze in een putje met geconditioneerde medium.
- Voeg een extra 1 mL warm DMEM/F12 aan elk putje.
- Incubeer de platen bij 37 ° C met 5% CO2 voor 2 weken, cel media wekelijks vernieuwen door de media uit elke putten pipetting 1 mL en 1 mL DMEM/F12 te vervangen.
4. microscopie
-
Immunocytochemie
Opmerking: Een omgekeerde confocal microscoop werd gebruikt om het imago van deze monsters en ImageJ werd gebruikt voor het verwerken en weergeven van de afbeeldingen. Microglia, astrocyten, oligodendrocyten en kernen, zal na 3 weken in de HAMA cultuur worden aangeduid.- Verwarm de 10% PBS-gebufferd formaline (pH 7.0) in een bad van 37 ° C.
Let op: Hoewel formaline kan worden gebruikt buiten een zuurkast, dit materiaal is reactief met weefsel, en moet altijd behandelen met zorg en handschoenen. Het moet afzonderlijk vervreemden. - Zorgvuldig gecombineerd media van de platen en de pipet 1 mL 10% formaline aan elk putje.
- Incubeer de platen bij 37 ° C in een 5% CO2 voor 20 min.
- Gecombineerd vloeistof uit elke plaat, Pipetteer 2 mL PBS (pH 7.4) in elk putje en incubeer gedurende 15 minuten.
- Herhaal stap 4.1.4 tweemaal.
- Gecombineerd vloeistof uit de platen, voeg 1 mL per putje van PBS met 10% normale paard serum (NHS) en 0,5% triton X-100 en zachtjes rock met minimale snelheid) gedurende 1 uur.
- Herhaal stap 4.1.4 driemaal.
- Gecombineerd vloeistof en voeg 1 mL per putje van het volgende mengsel in PBS: konijn geïoniseerd calcium-bindende adapter molecuul (Iba1) 1:1, 000, kip gliale fibrillary eiwit (GFAP) 1:5, 000, muis 2', 3'-cyclische-nucelotide 3'-phophodiesterase (CNPase) 1:1, 000, 1% NHS , en 0,1% cel holpijpen oppervlakteactieve stof. Bij 4 ° C na een nacht bebroeden, zo voorzichtig mogelijk het schommelen van de plaat.
- Herhaal stap 4.1.4 driemaal met 1 h incubations tussendoor.
- Gecombineerd vloeistof en voeg 1 mL per putje van het volgende mengsel in PBS: 647 nm opgewonden ezel anti-konijn antilichaam 1:200, 546 nm opgewonden geit anti-kip antilichaam 1:200, 488 nm opgewonden ezel anti-muis antilichaam 1:200, 1% NHS, 1:1,000 blue nucleaire vlek. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, zachtjes het schommelen van de plaat.
- Herhaal stap 4 drie keer met 1 h incubations tussendoor.
- Om te bewaren de hydrogels, buffer, gecombineerd en dompel ze in 0,5 mL van cel montage medium voor 1 min. Pipet uit het montage-medium en zachtjes plaats een dekglaasje aan op de top van de gel, een laag tussen het glas maken. Voeg een kleine hoeveelheid montage medium naar de ongedekte kant van de coverslips om te voorkomen dat het drogen van de hydrogel.
Opmerking: Omwille van probleemoplossing gels kunnen worden beeld bij stap 4.1.11. om te zien de juiste labeling vóór verdere verwerking.
- Verwarm de 10% PBS-gebufferd formaline (pH 7.0) in een bad van 37 ° C.
-
Scanning elektronen microscopie (SEM)
Opmerking: Om te visualiseren de hydrogel, een Scannende Elektronen Microscoop werd gebruikt om het imago van deze monsters.- Verwarm een kleefpoeders mengsel van 2,5% Glutaaraldehyde en 2% paraformaldehyde in PBS (0.1 M) in een waterbad 37 ° C.
Let op: Deze reagentia zijn zeer reactieve met weefsels, en moeten worden behandeld met zorg en handschoenen. Ze moeten worden behandeld in een zuurkast zoveel als mogelijk en afzonderlijk afgevoerd. - Gecombineerd worden overgedragen door de cel cultuur platen en voeg 1 mL van het voorverwarmde kleefpoeders mengsel.
- Incubeer de platen bij 37 ° C in een 5% CO2 voor 20 min.
- Plaats de platen in 4 ° C (koelkast/cooler) 's nachts.
- Gecombineerd de kleefpoeders oplossing uit de putten en voeg 1 mL PBS.
- Gecombineerd vloeistof uit elke plaat, voeg toe 2 mL PBS in elk putje en incubeer gedurende 15 minuten.
- Herhaal stap 4.2.6 twee meer tijden.
- De PBS gecombineerd en voeg 1 mL 1% osmium tetraoxide gebufferd in PBS aan elk putje.
Opmerking: Totdat de monsters worden gedroogd, deze stap en alle volgende stappen worden uitgevoerd in een zuurkast. - Toestaan van fixatie optreden voor 30 min. Osmium damp uit de vloeistof kan het oplossen van andere monsters in de dezelfde plaat; daarom dienovereenkomstig partitioneren monsters voor deze stap.
Let op: Osmium tetraoxide is zeer reactief met weefsel en vluchtige. Het is gevaarlijk en moet worden behandeld in de zuurkast met handschoenen. Het en eventuele onmiddellijke gewassen moet worden afgevoerd afzonderlijk. - Herhaal stap 4.2.6 driemaal.
- Gecombineerd de vloeistof en de dehydraterend mengsels toevoegen in de lijst hieronder, in volgorde, en incubeer (kamertemperatuur) gedurende de aangegeven tijd. Start door geleidelijk toe te voegen ethanol (EtOH) gevolgd dan hexamethyldisilazane (HMDS). Zie tabel 2 voor elk interval.
Opmerking: Bij het toevoegen van HMDS, de coverslips kan sterk houden aan het plastic en zeer moeilijk te verwijderen. Dit kan worden voorkomen door het plaatsen van een kleine plastic platform onder de glazen slip na de eerste toepassing van HMDS. Na de tweede EtOH incubatie, kan het monster worden genomen en uitgeblust in vloeibare stikstof voor enkele seconden om te bevriezen van breuk het monster. - Zorgvuldig verwijderen van de gedroogde monsters en bevestig de monsters op Scannende Elektronen Microscoop stubs met dubbel zijdig geleidende tape.
- Sputter coat de monsters met een minimum bedrag van goud. Leg de monsters in een houder en bedienen van de machine voor 2 min op 15 mA.
- Verwarm een kleefpoeders mengsel van 2,5% Glutaaraldehyde en 2% paraformaldehyde in PBS (0.1 M) in een waterbad 37 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om het model van de reactie van de gastheer zenuwweefsel en het gliale litteken in een hoge doorvoer, vereist in vitro systeem een 3D cel steiger met een matrix-materiaal dat is biocompatibel, niet een cytotoxische gebeurtenis doet oplopen tijdens in situ vorming en is aanpasbaar met bioactieve componenten bij welwillende reactie. Te dien einde hebben we gemaakt van een 3D cel steiger systeem op basis van hyaluronzuur en een primaire gemengde gliale celpopulatie om te studeren-cel interacties en gliale bioreactivity ingekapseld. Een korte visuele studie van cellen en steiger werd uitgevoerd. Morfologie van cel subpopulaties, met inbegrip van de oligodendrocyten (CNPase in het groen), microglia (Iba1 in het rood), en de astrocyten (algemeen kaderakkoord voor vrede in het geel), worden weergegeven door confocale immunefluorescentie microscopie (figuur 3Ai-ii-Ci-ii). Gecombineerde steiger en cel morfologie worden ook getoond door SEM (figuur 3Aiii-iv - Ciii-iv). In deze beelden, zowel laag (i en iii) en hoog (ii en iv) vertegenwoordiger resolutiebeelden staan. Een 2D PLL dekglaasje aan coating (figuur 3A) werd vergeleken met een 3D 0,5% w/v HAMA steiger (figuur 3B), en een mengsel van 20% v/v basale lamina mengsel in 0,5% w/v HAMA (Figuur 3 c). Dit werd gedaan om aan te tonen van de morfologische verschillen in 2D en 3D-celkweek, evenals het effect van de invoering van een biologische lamina naar het schavot. Een 3D-reconstructie is ook beschikbaar in de aanvullende informatie.
De morfologie van de cel van elk celtype veranderd met de introductie van een 3D-platform. In 2D aanhangend cultuur (PLL-gecoat glas coverslips), oligodendrocyten verscheen meestal ronde en gevormde kleine netwerken meestal verbinding maken met licht label GFAP processen. Microglia kleiner waren dan de andere cellen en had kleine vertakkende processen die niet ver van hun cel lichaam deed uitbreiden (< 20 µm). Astrocyten waren meer divers gevormd, sommige met een radiaal morfologie met kleinere cel organen en uitgebreide dunne, vertakkende processen, terwijl anderen waren vezelig met een afgeplatte uiterlijk en enkele globale processen die het oppervlak Coat. In de 3D-HAMA cultuur verscheen oligodendrocyten in clusters hebben vertakt af in kleinere bollen. Microglia waren ronde met enkele processen, en de astrocyten zijn afgerond of vertakt uit radiaal in netwerken van één cluster. In het algemeen, deze cellen leek te zijn ontgroeid van enkele punten of blijven in gebieden van de HAMA zonder contact met andere cellen, die in tegenstelling tot de 2D cultuur en is suggestief met een beperkte mobiliteit via de matrix. Toen 20% (v/v) van een basale lamina mengsel werd toegevoegd aan het foto-polymerisatie mengsel, alle gliale subtypen geïntegreerd met de 3D-platform, en uitgebreidere, interactieve vertakte structuren gevormd. Oligodendrocyten uitgebreid bolvormige processen radiaal vergelijkbaar met de niet-basale lamina mengsel morphologies, maar bovendien leek uit te breiden processen langs de dunne onderling verbonden netwerken van Astrocyt processen vertakking in de steiger. Microglia werden verspreid onder deze cel netwerken, hebben verspreid met dunne processen meer in overeenstemming met hun morfologie in weefsel. Over het algemeen stellen de morphologies voor alle drie de typen van glia geïntegreerd in het HAMA-basale lamina mengsel vrij mogelijk via beide grotere aanhankelijkheid aan de gemengde substraat of door verhoogde capaciteit aan het remodelleren van de steiger.
Wanneer waargenomen door SEM, werd cel morfologie gezien de confocal microfoto bevestigen. De matrix van HAMA verscheen als een glad oppervlak met 10-50 µm poriën gezien flauw onder de oppervlakte. Cellen werden aanhangend op het oppervlak van de HAMA en ook flauw zichtbaar in lagen onder waren. Deze glia vormden geen vergelijkbare morphologies aan die genoteerd in 2D cultuur, maar met de toevoeging van een basale lamina mengsel, intensieve samenwerking in netwerkverband werd waargenomen. Dikke Astrocyt vezels, met kleinere clusters van microglia werden waargenomen, zowel bij de HAMA-basale lamina mengsel oppervlak en uitbreiden via de matrix op een naadloze manier. Dit kan als de matrix gevouwen rond de cellen, wat suggereert dat de cellen kunnen de wijziging van de steiger gevormd in hun gewenste conformaties flauw worden gezien.
Figuur 1: schematische van methacrylated hyaluronzuur (HAMA)-3D cel-cultuur- en photopolymerization-protocol gebaseerd. Gliale cellen (2 week primaire rat hersenen cultuur) worden vermengd met HAMA en afgepipetteerde in een mal Polydimethylsiloxaan (PDMS) op een glas dekglaasje aan. Dit mengsel wordt blootgesteld aan een hoge intensiteit groen LED-licht om te polymeriseren de hydrogel voor 5 min. De mal wordt verwijderd en de gel is uitgebroed in de media. Representatieve cellen omvatten microglia (rood), astrocyten (geel) en oligodendrocyten (groen). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: dissectie van dag 1 Sprague-Dawley ratten pup hersenen. Beelden van hele hersenen (A), dissectie van cortices en cerebellum (B), een enkele cortex met hersenvliezen (C), peeling van de hersenvliezen met een tang (D), en de meninge-vrije cortex (E). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Immunefluorescentie confocal (i-ii) en (iii-iv) electron microfoto van gemengde glia cel populaties op 2D PLL coatings (A) en (B) HAMA HAMA-basale lamina mengsel (C) het scannen. Lager (i, iii) en hogere ii, iv, vergroting beelden worden getoond. Labels zijn Iba1 in het rood voor microglia, GFAP in geel voor astrocyten, CNPase in het groen voor oligodendrocyten en een nucleaire vlek van Hoechst. Schaal bars = 25 µm voor confocal beelden en 50 (iii) en 20 µm (iv) voor het scannen van electron microfoto. Hydrogels waren 0,5% w/v en basale lamina mengsel was 20% van hun volume. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende figuur 1: 3D immunefluorescentie micrographic reconstructie van HAMA-basale lamina mengsel met gemengd glia cel populaties HAMA-basale lamina mengsel. Labels zijn Iba1 in het rood voor microglia, GFAP in geel voor astrocyten, CNPase in het groen voor oligodendrocyten en een nucleaire vlek van Hoechst. Hydrogels waren 0,5% w/v en Getrex was 20% van hun volume. Klik hier om dit bestand te downloaden.
| HAMA | Basale Lamina | NVP | THEE | EY | |
| Werken concentratie | 0,5% w/v | 20% v/v | 0,10% | 0,10% | .01 mM |
| 12-well-Plate | 2% w/v | 100% w/v | 10% (v/v): | 10% (v/v): | 1 mM |
| 1.4 mL totaal | 350 ΜL | 280 ΜL | 14 ΜL | 14 ΜL | 14 ΜL |
Tabel 1: Voorbeeld van cel inkapseling.
| Component | Inhoud | Incubatietijd |
| EtOH | 30% | 30 min |
| EtOH | 50% | 30 min |
| EtOH | 70% | 30 min |
| EtOH | 90% | 20 min |
| EtOH | 100% | 20 min |
| EtOH | 100% | 20 min |
| EtOH:HMDS | 75:25 | 20 min |
| EtOH:HMDS | 50:50:00 | 20 min |
| EtOH:HMDS | 25:75 | 20 min |
| HMDS | 100% | 20 min |
| HMDS | 100% | Overnachting |
Tabel 2: Geleidelijke stappen van EtOH en HMDS in uitdroging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Richting van het doel van het genereren van een 3D cultuur systeem model gliale bioreactivity en het gliale littekens proces, hebben we een systeem dat kan ondersteunen primaire gekweekte microglia, astrocyten en oligodendrocyten en maakt robuuste karakterisering van cel morfologie en cel interacties. Van de microfoto komt te staan, was de morfologie van elk celtype duidelijk verschillend met 2D, 3D-HAMA en 3D HAMA-basale lamina mengsel platforms. In de 2D systeem, morfologie was duidelijk bevooroordeeld langs het vliegtuig van het oppervlak, maar in vergelijking met de 3D HAMA, microglia en astrocyten waren over het algemeen kleiner binnen de matrix, met uitzondering van Oligodendrocyt clusters. In de scanning electron microfoto waren cellen over het algemeen meer ronde vorm op de HAMA. Dit is grotendeels te wijten aan de cellen wordt ingekapseld, met beperkte capaciteit te wijzigen van de matrix voor de motoriek en de vrije verkeer en de groei van processen. Uitvloeisel van de cel in de HAMA was meestal radiaal voor zowel astrocyten en oligodendrocyten. Terwijl deze cellen uitgebreid processen, hun organisatie suggereren dat het verkeer in de matrix en de mogelijkheid tot interactie met andere cellen beperkt. Vorige werk blijkt bovendien bevriezen-gebroken HAMA als poreuze zonder onderling verbonden netwerken, wat dit gebrek aan uitgroei65,70 verklaart wellicht. Het mogelijk dat sommige van deze cellen niet overleven de photopolymerization, nog bewaard gebleven in de matrix, maar levensvatbaarheid evalueerden systematisch onze eerdere werken, en 80% (0,5% m/v) bleef in de loop van een week-65.
Ter verbetering van de interactie van de cel met de matrix in 3D cultuur, we een mengeling van basale lamina geïntroduceerd als onderdeel van een biocompatibel en aanpasbaar matrix. Cel integratie met de matrix bleek aanzienlijk worden verbeterd, met alle celtypes uitgebreide processen ten opzichte van zowel de cultuur van 2D en 3D HAMA weergeeft. De basale lamina mengsel bestaat uit een diverse basale lamina componenten en is vooral geformuleerd ter ondersteuning van gliale differentiatie van neurale stamcellen precursoren71. Het was niet onverwacht dat de gliacellen gereageerd op de basale lamina mengsel, en vervolgens de omliggende 3D matrix, maar de mate van integratie een gezond weefsel-achtige omgeving stelt. Vergelijken HAMA HAMA-basale lamina mengsel, de hydrogel morfologie komt niet duidelijk verschillend, cellen kunnen dus meer actief reorganisatie het. Gezien de eenvoud van het toevoegen van deze bioactieve componenten, is het niet onvoorstelbare met verschillende laminas en/of eiwit signalen te begunstigen kweekomstandigheden voor neuronen. In een mogelijke toekomstige koers, kan dit systeem worden gebruikt om te onderscheiden van de neuronen van neurale progenitoren in combinatie met gemengde glia voor allerlei impactful myelinisering of neuro-inflammatoire letsel modellen.
In het geval van ernstige en schadelijke CNS letsel of biomaterial afwijzing initieert de resident weefsel ontstekingsreacties kunnen verergeren neurodegeneratie en demyelinisatie. Dit resulteert meestal in de vorming van een gliale litteken te partitioneren van de site van verwonding, dat voorkomt regeneratie dat. In deze studie werden de methoden gedetailleerd voor een methacrylated foto-polymeervorm op basis van hyaluronzuur 3D steiger met de bedoeling modellering van de eerste cellulaire reactie achter gliale littekenvorming; microglial reactiviteit, Astrocyt werving en hypertrofie, en Oligodendrocyt letsel en intrekking. Een 3D cel steiger is ontworpen om op te nemen van alle drie soorten van gliale cellen, en is verder bewerkt met een mengsel van multi-component basale lamina. Het was bepaald, door confocale en scanning elektronen microscopie imaging, dat cellen werden ingekapseld in de HAMA en konden beter te integreren toen het basale lamina mengsel werd geïntroduceerd. Deze resultaten kunnen leiden tot verschillende nieuwe toepassingen. HAMA alleen kunnen maken mede cultuur systemen waar de bedoeling is het beperken van cel naar cel interactie of studie distilleren drug levering met behulp van de gel als een drug geladen verspreiding beperkt matrix. Hydrogels integratie van de basale lamina mengsel in de matrix van HAMA toestaan voor een meer consistente weefsel-achtige omgeving geschikt voor het modelleren van acute ontsteking, gliosis of gliale littekens, en laat verder high-throughput karakterisering van gliale bioreactivity implantaten, drugs- en apparaat-ontwikkeling en andere strategieën te verminderen en inflammatoire schade herstellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs zijn dankbaar voor de financiële steun van de NSERC, CFI, AIHS, Alberta gezondheidsdiensten en de Davey Endowment for hersenonderzoek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Materials for HAMA synthesis and photopolymerization | |||
| Hyaluronic acid (HA) | Sigma-Aldrich | 53747-10G | Streptococcus equi, MW: 1.5 - 1.8 X 10^6 |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 275585-100ML | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| Ethanol (EtOH) | Commerical Alcohols Inc. | Anhydrous | |
| Phosphate buffered saline (pH 7.4) tablets | Fisher Scientific | 18912014 | |
| Triethanolamine (TEA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| 1-Vinyl-2pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | |
| EosinY (EY) | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 440159-100ML | |
| Beaker (100 mL) | Corning | 1000-100 | |
| Beaker (500 mL) | Corning | 1000-600 | |
| pH paper (Labstick) | Sigma-Aldrich | 9580 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2. Materials for glial cell isolation and cell culture | |||
| P1-2 Sprague Dawley rat pups | Charles River | CD Sprague Dawley rat strain code 001 | |
| Dissector scissors - slim blades (small) | Fine Science Tools | 14081-09 | |
| Surgical scissors - Toughcut (large) | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11521-10 | |
| Curved fine forceps (Dumont #7) | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14170-112 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
| Penicillin-streptomycin (PS) | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 12483-020 | |
| 0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Gibco | 25200-072 | |
| Poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P-6282 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-5 | |
| 12 well Tissue culture treated plates (Cellstar) | Greiner Bio-One | 665 108 | |
| 10 mL serological pipette | Fisher Scientific | 13-676-10F | |
| 25 mL serological pipette | Fisher Scientific | 12-676-10K | |
| Petri dish (60 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri dish (100 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Microscope Coverslip (18 mm) | Fisher Scientific | 12-545-100 18CIR | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3. Materials for microscopy (confocal and scanning electron microscopy) | |||
| Mouse monoclonal anti-CNPase | abcam | ab6319 | |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako Laboratory Chemicals | 019-17741 | |
| Chicken anti-GFAP | abcam | ab4674 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | |
| Fluoromount-G | Fisher Scientific | 00-4958-02 | |
| Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Buffered (10%) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Paraformaldehyde | Electon Microscopy Sciences | 157-8 | Buffered (8%) |
| Guteraldehyde | Electon Microscopy Sciences | 16019 | Buffered (8%) |
| Osmium tetraoxide | Electon Microscopy Sciences | 19152 | Buffered (2%) |
| Hexamethyldilazane (HMDS) | Electon Microscopy Sciences | 16700 | |
| Ethanol (EtOH) | Electon Microscopy Sciences | 15055 | Anhydrous |
| Microscope Slide (25 X 75 X 1 mm) | VWR International | 48311-703 |
References
- Shih, J. J., Krusienski, D. J., Wolpaw, J. R. Brain-Computer Interfaces in Medicine. Mayo Clin. Proc. 87, 268-279 (2012).
- Kennedy, P. R., Bakay, R. A. Restoration of neural output from a paralyzed patient by a direct brain connection. Neuroreport. 9, 1707-1711 (1998).
- Kennedy, P. R., Bakay, R. A., Moore, M. M., Adams, K., Goldwaithe, J. Direct control of a computer from the human central nervous system. IEEE Trans. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 8, 198-202 (2000).
- Mayberg, H. S., et al. Deep Brain Stimulation for Treatment-Resistant Depression. Neuron. 45, 651-660 (2005).
- Dougherty, D. D., et al. A Randomized Sham-Controlled Trial of Deep Brain Stimulation of the Ventral Capsule/Ventral Striatum for Chronic Treatment-Resistant Depression. Biol. Psychiatry. 78, 240-248 (2015).
- Bamford, J. A., Marc Lebel, R., Parseyan, K., Mushahwar, V. K. The Fabrication, Implantation, and Stability of Intraspinal Microwire Arrays in the Spinal Cord of Cat and Rat. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 25, 287-296 (2017).
- Holinski, B. J., et al. Intraspinal microstimulation produces over-ground walking in anesthetized cats. J. Neural Eng. 13, 056016 (2016).
- Toossi, A., Everaert, D. G., Azar, A., Dennison, C. R., Mushahwar, V. K. Mechanically Stable Intraspinal Microstimulation Implants for Human Translation. Ann. Biomed. Eng. 45, 681-694 (2017).
- Saigal, R., Renzi, C., Mushahwar, V. K. Intraspinal microstimulation generates functional movements after spinal-cord injury. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 12, 430-440 (2004).
- Lau, B., Guevremont, L., Mushahwar, V. K. Strategies for generating prolonged functional standing using intramuscular stimulation or intraspinal microstimulation. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 15, 273-285 (2007).
- Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. J. Neurosci. Methods. 148, 1-18 (2005).
- Sierra, A., et al. Surveillance, phagocytosis, and inflammation: how never-resting microglia influence adult hippocampal neurogenesis. Neural Plast. 2014, 610343 (2014).
- Holm, T. H., Draeby, D., Owens, T. Microglia are required for astroglial Toll-like receptor 4 response and for optimal TLR2 and TLR3 response. Glia. 60, 630-638 (2012).
- Gao, Z., et al. Reciprocal modulation between microglia and astrocyte in reactive gliosis following the CNS injury. Mol. Neurobiol. 48, 690-701 (2013).
- Jin, X., Yamashita, T. Microglia in central nervous system repair after injury. J. Biochem. (Tokyo). 159, 491-496 (2016).
- Griffith, R. W., Humphrey, D. R. Long-term gliosis around chronically implanted platinum electrodes in the Rhesus macaque motor cortex. Neurosci. Lett. 406, 81-86 (2006).
- Biran, R., Martin, D. C., Tresco, P. A. Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays. Exp. Neurol. 195, 115-126 (2005).
- Fawcett, J. W., Asher, R. A. The glial scar and central nervous system repair. Brain Res. Bull. 49, 377-391 (1999).
- Szarowski, D. H., et al. Brain responses to micro-machined silicon devices. Brain Res. 983, 23-35 (2003).
- Park, D. -W., et al. Graphene-based carbon-layered electrode array technology for neural imaging and optogenetic applications. Nat. Commun. 5, 5258 (2014).
- McAllister, J. P., et al. Biocompatibility of Penetrating Recording Electrode Arrays Implanted Chronically in the Feline Visual Cortex. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 1528 (2005).
- Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. J. Neurochem. 109, 117-125 (2009).
- Chung, H., et al. In vivo Biocompatibility and Stability of Polyimide Microelectrode Array for Retinal Stimulation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 5072 (2003).
- Aregueta-Robles, U. A., Woolley, A. J., Poole-Warren, L. A., Lovell, N. H., Green, R. A. Organic electrode coatings for next-generation neural interfaces. Front. Neuroengineering. 7, (2014).
- Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24, 4337-4351 (2003).
- Yang, J., et al. Ordered surfactant-templated poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) conducting polymer on microfabricated neural probes. Acta Biomater. 1, 125-136 (2005).
- Ludwig, K. A., et al. Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) polymer coatings facilitate smaller neural recording electrodes. J. Neural Eng. 8, 014001 (2011).
- Kim, D. -H., Abidian, M., Martin, D. C. Conducting polymers grown in hydrogel scaffolds coated on neural prosthetic devices. J. Biomed. Mater. Res. A. 71, 577-585 (2004).
- George, P. M., et al. Fabrication and biocompatibility of polypyrrole implants suitable for neural prosthetics. Biomaterials. 26, 3511-3519 (2005).
- Stauffer, W. R., Cui, X. T. Polypyrrole doped with 2 peptide sequences from laminin. Biomaterials. 27, 2405-2413 (2006).
- Green, R. A., Lovell, N. H., Wallace, G. G., Poole-Warren, L. A. Conducting polymers for neural interfaces: challenges in developing an effective long-term implant. Biomaterials. 29, 3393-3399 (2008).
- Gumbiner, B. M. Cell adhesion: the molecular basis of tissue architecture and morphogenesis. Cell. 84, 345-357 (1996).
- Chan, G., Mooney, D. J. New materials for tissue engineering: towards greater control over the biological response. Trends Biotechnol. 26, 382-392 (2008).
- Green, R. A., Lovell, N. H., Poole-Warren, L. A. Impact of co-incorporating laminin peptide dopants and neurotrophic growth factors on conducting polymer properties. Acta Biomater. 6, 63-71 (2010).
- Green, R. A., Lovell, N. H., Poole-Warren, L. A. Cell attachment functionality of bioactive conducting polymers for neural interfaces. Biomaterials. 30, 3637-3644 (2009).
- Koss, K. M., Unsworth, L. D. Neural tissue engineering: Bioresponsive nanoscaffolds using engineered self-assembling peptides. Acta Biomater. 44, 2-15 (2016).
- Koss, K. M., et al. Brain biocompatibility and microglia response towards engineered self-assembling (RADA)4 nanoscaffolds. Acta Biomater. 35, 127-137 (2016).
- Evans, A. J., et al. Promoting neurite outgrowth from spiral ganglion neuron explants using polypyrrole/BDNF-coated electrodes. J. Biomed. Mater. Res. A. 91, 241-250 (2009).
- Yu, X., Bellamkonda, R. V. Tissue-engineered scaffolds are effective alternatives to autografts for bridging peripheral nerve gaps. Tissue Eng. 9, 421-430 (2003).
- Houweling, D. A., Lankhorst, A. J., Gispen, W. H., Bär, P. R., Joosten, E. A. Collagen containing neurotrophin-3 (NT-3) attracts regrowing injured corticospinal axons in the adult rat spinal cord and promotes partial functional recovery. Exp. Neurol. 153, 49-59 (1998).
- Wells, M. R., et al. Gel matrix vehicles for growth factor application in nerve gap injuries repaired with tubes: a comparison of biomatrix, collagen, and methylcellulose. Exp. Neurol. 146, 395-402 (1997).
- Barras, F. M., Pasche, P., Bouche, N., Aebischer, P., Zurn, A. D. Glial cell line-derived neurotrophic factor released by synthetic guidance channels promotes facial nerve regeneration in the rat. J. Neurosci. Res. 70, 746-755 (2002).
- Fine, E. G., Decosterd, I., Papaloïzos, M., Zurn, A. D., Aebischer, P. GDNF and NGF released by synthetic guidance channels support sciatic nerve regeneration across a long gap. Eur. J. Neurosci. 15, 589-601 (2002).
- Burdick, J. A., Ward, M., Liang, E., Young, M. J., Langer, R. Stimulation of neurite outgrowth by neurotrophins delivered from degradable hydrogels. Biomaterials. 27, 452-459 (2006).
- Piantino, J., Burdick, J. A., Goldberg, D., Langer, R., Benowitz, L. I. An injectable, biodegradable hydrogel for trophic factor delivery enhances axonal rewiring and improves performance after spinal cord injury. Exp. Neurol. 201, 359-367 (2006).
- Jain, A., Kim, Y. -T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27, 497-504 (2006).
- Taylor, S. J., Sakiyama-Elbert, S. E. Effect of controlled delivery of neurotrophin-3 from fibrin on spinal cord injury in a long term model. J. Control. Release Off. J. Control. Release Soc. 116, 204-210 (2006).
- Jhaveri, S. J., et al. Release of nerve growth factor from HEMA hydrogel-coated substrates and its effect on the differentiation of neural cells. Biomacromolecules. 10, 174-183 (2009).
- Lee, A. C., et al. Controlled release of nerve growth factor enhances sciatic nerve regeneration. Exp. Neurol. 184, 295-303 (2003).
- Matsumoto, K., et al. Neurite outgrowths of neurons with neurotrophin-coated carbon nanotubes. J. Biosci. Bioeng. 103, 216-220 (2007).
- Khaled, I., et al. A Flexible Base Electrode Array for Intraspinal Microstimulation. IEEE Trans. Biomed. Eng. 60, 2904 (2013).
- David-Pur, M., Bareket-Keren, L., Beit-Yaakov, G., Raz-Prag, D., Hanein, Y. All-carbon-nanotube flexible multi-electrode array for neuronal recording and stimulation. Biomed. Microdevices. 16, 43-53 (2014).
- Hsu, H. -L., et al. Flexible UV-ozone-modified carbon nanotube electrodes for neuronal recording. Adv. Mater. Deerfield Beach Fla. 22, 2177-2181 (2010).
- Lacour, S. P., et al. Flexible and stretchable micro-electrodes for in vitro and in vivo neural interfaces. Med. Biol. Eng. Comput. 48, 945-954 (2010).
- Lin, C. -M., Lee, Y. -T., Yeh, S. -R., Fang, W. Flexible carbon nanotubes electrode for neural recording. Biosens. Bioelectron. 24, 2791-2797 (2009).
- Richter, A., et al. A simple implantation method for flexible, multisite microelectrodes into rat brains. Front. Neuroengineering. 6, 6 (2013).
- Rousche, P. J., et al. Flexible polyimide-based intracortical electrode arrays with bioactive capability. IEEE Trans. Biomed. Eng. 48, 361-371 (2001).
- Polikov, V. S., Block, M. L., Fellous, J. -M., Hong, J. -S., Reichert, W. M. In vitro model of glial scarring around neuroelectrodes chronically implanted in the CNS. Biomaterials. 27, 5368-5376 (2006).
- Sohal, H. S., Clowry, G. J., Jackson, A., O'Neill, A., Baker, S. N. Mechanical Flexibility Reduces the Foreign Body Response to Long-Term Implanted Microelectrodes in Rabbit Cortex. PloS One. 11, e0165606 (2016).
- Moshayedi, P., et al. The relationship between glial cell mechanosensitivity and foreign body reactions in the central nervous system. Biomaterials. 35, 3919-3925 (2014).
- Hopkins, A. M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. 3D in vitro modeling of the central nervous system. Prog. Neurobiol. 125, 1-25 (2015).
- Pöttler, M., Zierler, S., Kerschbaum, H. H. An artificial three-dimensional matrix promotes ramification in the microglial cell-line, BV-2. Neurosci. Lett. 410, 137-140 (2006).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. 0, 42-51 (2014).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12, 207-218 (2014).
- Jeffery, A. F., Churchward, M. A., Mushahwar, V. K., Todd, K. G., Elias, A. L. Hyaluronic acid-based 3D culture model for in vitro testing of electrode biocompatibility. Biomacromolecules. 15, 2157-2165 (2014).
- Fitch, M. T., Silver, J. CNS Injury, Glial Scars, and Inflammation. Exp. Neurol. 209, 294-301 (2008).
- Churchward, M. A., Todd, K. G. Statin treatment affects cytokine release and phagocytic activity in primary cultured microglia through two separable mechanisms. Mol. Brain. 7, 85 (2014).
- Lai, A. Y., Todd, K. G. Differential regulation of trophic and proinflammatory microglial effectors is dependent on severity of neuronal injury. Glia. 56, 259-270 (2008).
- Hachet, E., Van Den Berghe, H., Bayma, E., Block, M. R., Auzély-Velty, R. Design of biomimetic cell-interactive substrates using hyaluronic acid hydrogels with tunable mechanical properties. Biomacromolecules. 13, 1818-1827 (2012).
- Eslami, M., Javadi, G., Agdami, N., Shokrgozar, M. A. Expression of COLLAGEN 1 and ELASTIN Genes in Mitral Valvular Interstitial Cells within Microfiber Reinforced Hydrogel. Cell J (Yakhteh). , (2015).
- Shaltouki, A., Peng, J., Liu, Q., Rao, M. S., Zeng, X. Efficient Generation of Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells in Defined Conditions. STEM CELLS. 31, 941-952 (2013).
