Summary
ここで、ラットの 3 D の文化のためのプロトコル脳由来グリア細胞、アストロ サイト、ミクログリア、オリゴデンドロ サイトなどを紹介します。一次電池文化、ならびにヒアルロン酸 (浜) ハイドロゲル合成、HAMAphoto 重合と細胞のカプセル化、共焦点走査型電子顕微鏡画像処理サンプルを紹介しています。
Abstract
同様にイオン注入装置や生体が同じ結果に関数の結果を高めるように設計されて中枢神経系、多数の急性障害と神経変性疾患、: 細胞毒性、神経膠症につながる過剰な炎症および/または総称して怪我を悪化させるまたは健康回復を防ぐグリア瘢痕の形成。初代培養グリア細胞を収容可能 3 D 細胞培養足場を生成、グリア瘢痕形成と研究炎症性プロセスをモデル化するシステムの作成の意図で: ミクログリア異物反応を調節する、開始、炎症性イベント、線維性瘢痕の形成に対応するアストロ サイト、オリゴデンドロ サイト通常炎症性傷害を受けやすい。現在の仕事では、脳グリア細胞作製、カルチャ、およびカプセル化されたラットとヒアルロン酸ベースの 3 D ハイドロゲル足場の微視的構造の評価のための詳細なステップバイ ステップのメソッドを提供します。生理活性基板と足場を変更する能力だけでなく、電池封止材と共焦点の蛍光および走査電顕によるハイドロゲル足場のキャラクタリゼーションのためのプロトコルの実証、さらに、改良されたセル統合商業基底膜の混合物の設立。
Introduction
中枢神経系 (CNS) の炎症は急性の認刻極印を長く考慮された (例えば、虚血性脳卒中、脳外傷、脊髄損傷) および慢性 (例えばアルツハイマー病、パーキンソン病のおよびハンティントンの病気) 中枢神経損傷しかし、ますます、神経変性疾患や神経疾患に因果共同作成者として認識されます。持続的なまたは不適切な炎症神経損傷や髄 (例えば多発性硬化症) が発生し、脳の発達 (例えば、統合失調症、自閉症) と (例えばうつ病、不安の気分状態に悪影響を及ぼす、双極性障害)。さらに、植込み型デバイスを用いた新しい治療戦略 (e.g、脳-コンピューターのインターフェイス1,2,3, 脳深部刺激4,5, 脊柱。微小6,7,8,9,10) デバイスとその結果中枢神経系間のインターフェイスで予測可能な炎症性応答を生成します。11インプラントの寿命にわたる効果やデバイスの障害の損失を引き起こすことができます保護組織の応答です。中枢神経系の炎症通常中枢神経系組織の監視および異物応答 (レビュー12) を取付担当の常駐免疫細胞として機能するミクログリアによって開始されます。侮辱の重大度に応じて、ミクログリアの信号と追加募集細胞傷害のサイトの種類です。具体的には、ミクログリアは二次炎症性細胞と形態傷害サイト13,14を含む密な防護壁として機能するアストロ サイトをアクティブにします。ミクログリアはまた (参照15見直し) 免疫の浸透を許可する BBB の崩壊につながることができます末梢の免疫系の細胞の活動連鎖を開始できます。
中枢神経系に注入デバイス、デバイスの挿入だけでなく、外部デバイスの継続的な存在から生じる組織の損傷がグリア瘢痕と呼ばれるプロセスを開始します。このプロセスで、ミクログリアに移行し、損傷部位で増殖します。彼らはまた、潜在的な脅威を中和して追加のグリア細胞を募集する炎症性因子のリリースを開始します。その後、活性化アストロ サイトは肥大になるし、16の連続的な線維性バリアを形成するため注入装置をカプセル化を開始します。炎症性シグナル伝達もインプラントの周辺から神経突起の撤退を促進するために提供し、発展途上のグリア瘢痕17を補強する線維芽細胞を最終的に募集します。オリゴデンドロ サイトは、コンダクタンスを強化するミエリンのニューロンをシースの責任はこのプロセスを存続しないと傷跡18によってインプラントから離れた場所の細胞が分割されました。グリア瘢痕を大幅機能と記録電極に特に注入デバイスの寿命を低減し、最終的に神経インターフェイス19の機能を制限するのに役立ちます。
いくつかのアプローチは、生体適合性と中枢神経系20,21,22,23埋込デバイスのインターフェイス アクティビティを高めるに悪用されています。広範なレビューはこれらの神経インターフェイス24の生体適合性設計も承ります。最も著名な戦略を含める polyelthyleneglycol (PEG)、ポリ グリコール酸 (PLGA)25など互換性のあるコーティングと電極を囲むまたはポリ (エチレンなどの導電性ポリマー電極を強化dioxythiophene) (PEDOT) とポリピロール (PPy)26,27,28,29,30,31。生体活性コーティングは、配位子に由来するコラーゲン、コラーゲン、ヒアルロン酸32,33,34 など細胞外マトリックスを使用して神経組織の成長のための手がかりを提供するために採用されています。 ,35,36,37。これらのコーティングの生理活性はさらに自然な細胞分泌物30,38,39,40,41をエミュレートする成長因子リリース システムで検討されています。,42,43,44,45,46,47,48,49,50します同時に、いくつかの研究グループ電極形状、柔軟性、および機械的デバイスと組織51,52,53 ミスマッチを減少する組成を改造することを選択した。 ,,5455,56,57。完全に、これらの戦略をリードしている多くの有望な改善、次世代ニューラル界面デバイスでしかし、進行中の問題であり、進行状況は、複雑で時間のかかるin vivoモデルによって妨げられる可能性があります長期的な互換性.
動物モデル ・ ベースのアプローチは、実験のスループットを制限でき、電極生体適合性テストのコストが増加します。従来の細胞培養技術より費用効果が大きい代わりを提供するが、デバイスと組織58間の相互作用の複雑さの多くを要約する失敗を使用して体外に近づきます。特に、電極形状のモデリングと機械の不一致・微動デバイス障害59に貢献ホスト応答の生成に寄与すると考えの影響、2 D セル文化の制限を利用した表面コーティングのテスト,60。
2 D の細胞培養に関連する問題を克服するためにハイドロゲル培養神経細胞のために開発された幅広い用途、薬理学的研究61、直接神経細胞分化62病気を理解するために経路63,64、またはモデル細胞の移動、神経保護、またはモデル組織微小61他の細胞型の層状共培養します。ヒドロゲルはさまざまなサイズで容易に形成して共焦点蛍光顕微鏡などの一般的に使用される手法によって分析に非常に適しているジオメトリ、プライマリまたは不死化細胞培養の様々 なタイプを組み込むことができます。グリア瘢痕化プロセスのモデルを作成するには、最近開発し、注入電極 (図 1)65グリア細胞応答の高スループットをテストするためヒアルロン酸ベースの 3 D ハイドロゲル システムが特徴します。このシステムは、いくつかの明確な利点: 1); の内因性細胞外マトリックス成分であるヒアルロン酸の重合体で構成される 3 D 行列でプライマリのグリア細胞 (ミクログリア、アストロ サイト、オリゴデンドロ サイト) にカプセル化2) 剛性マトリックス ' チューニングできる「脳や脊髄組織の機械的性質を再現するには・ 3) 制限毒性カプセル化の間、緑色の光で光重合を用いた迅速なベンチ トップ アプローチでマトリックスでセルをカプセル化できます。このシステムにより、体内の生体適合性の主な機能: デバイスが組織と対等な方法でヒドロゲルに挿入され、埋込デバイスへの細胞の応答パラメーター65の広い範囲を監視します。機械的デバイスと多彩な構造と電気刺激パルス ハイドロゲル コーティング不一致が含まれます。このシステムでは、オリゴデンドロ サイトとがしばしば存在し、グリア瘢痕の募集関連前駆物質も含まれています。彼らの損傷と死とミクログリアによる貪食が高い炎症性傷害の指標とニューロン66の再髄鞘化を示す能力があるモデルは減少瘢痕または回復。
ここは合成と細胞の混入を改善するために市販の基底膜製剤併用ハイブリッド ヒアルロン酸ゲルの形成について述べる。さらに、初代培養グリア細胞 (ミクログリア、アストロ サイト、オリゴデンドロ サイト) の定款及び各種と共焦点顕微鏡を用いた文化成長の分析を示します。
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Protocol
1 日目スプレイグ ドーリー仔、斬罪に、安楽死から脳組織抽出のためのプロトコルは、動物愛護とアルバータ大学利用委員会によって承認されました。
1. ミクログリアやアストロ サイト分離67,68
メモ: 分離および細胞培養のためのすべてのメディアは水浴中で 37 ° C に予熱します。ハンクの平衡塩溶液 (HBSS) が 1% ペニシリン-ストレプトマイシン (PS)。すべてダルベッコ修飾、栄養混合物 (DMEM/F12) は 10% 牛胎児血清 (FBS) と 1% ペニシリン-ストレプトマイシン (PS) 補われるハムの f12 キーでワシのメディアです。トリプシンと唯一の混合物は、政府短期証券を欠いています。このプロトコルのすべての材料、滅菌 (フィルター、アルコール、購入、およびオートクレーブ) とバイオ セーフティ キャビネットの無菌技術におけるステップ数 1.8 以降のすべてのステップが実行されます。
- 脳あたり 15 mL 12.5 mL DMEM/f12 キー 50 mL コニカル遠沈管、37 ° C と 1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) 15 mL コニカル遠心管中で 0.25% トリプシンの約 2 mL の HBSS 予熱します。DMEM/f12 キーの追加 25 mL を加熱します。暖かいトリプシンは、約 10 分前の酵素活性の損失を防ぐために使用します。
- 滅菌は、6 に十分な暖かい HBSS を注ぐと 10 cm の培養皿表面をカバーします。すべての 2 つの頭脳の 1 つの 10 cm 皿に加えて追加 6 cm 皿を準備します。
- 各 10 cm2皿 (図 2 a) に最大 2 つの脳を配置します。
- 解剖顕微鏡の下で脳幹と小脳正中線に沿って野を分離するのに曲線と直線の鉗子を使用します。これは、脳 (図 2 b) あたりの組織の 3 つのセクションを生成します。
- 組織と別の培養皿に残りのティッシュを転送、破棄の各セクションから血管を含む組織の薄く、半透明な層 (髄膜) の皮をむきます。鉗子で組織カットによって公開される薄層をつかんで、慎重に主要な部分は ' をオフにぶら下がって' 脳組織まで。最後に優しく揺さぶることによりこの部分を削除します。図 2を参照してください-2Eこの手順中に、前後の代表的なイメージに。
- バイオ セーフティ キャビネットの慎重に維持組織培養皿から残り HBSS を削除します。メスで組織を漬け込むし、組織をトリプシンに予め温めておいた 15 mL チューブに転送します。
- この管組織を酵素によって消化する 37 ° C バスで 25 分間、インキュベートします。
- 室内温度で 2 分間 500 x g でダウン チューブを遠心し、上清を注ぐ。
- 10 mL の血清ピペットを使用して、組織を分割する、トリプシンを不活化し、ソリューションを 5 回カップ刻んだ温かみのある DMEM/F12 の 10 mL を追加します。
- 室内温度で 2 分間 500 x g でダウン チューブを遠心し、上清を注ぐ。
- 10 mL の血清ピペットを使用して、暖かい DMEM/F12 の 10 mL にペレットを再停止し、ソリューションを 50 mL の円錐形遠心管に転送します。
- ソリューションを 3 回カップ刻んだ、18 g 針、10 mL の注射器を使用して、します。
- 暖かい DMEM/F12 脳あたり 12.5 mL の単位にこのソリューションを配布します。
- 12 ウェル プレート (1 脳あたり) に摩砕液のピペット 1 mL ずつ。
- 加湿細胞文化のインキュベーターで CO2を 37 ° C、5% で孵化させなさい。3 日後、メディアを交換し、その後三日メディアを更新します。2 週間後、実験用セルを収集できます。
2. Macromer 合成69
- 50 mL の円錐形遠心管中 375 mg ヒアルロン酸 (HA) 塩の重量を量る、37.5 mL の蒸留水を追加します。
- 1 分の vortexer のソリューションをフラッシュし、同種が表示され、そのゲル状の粘性を失うまで混合物を超音波照射します。6 時間かかる場合があります。
- 転写液を 100 mL のビーカーには棒 (38 mm)、攪拌し、室温で積極的にかき混ぜます。
- 慎重に、pH は、8 と 12 の間安定するまでは混合 HA と ph 試験紙で測定に 5.0 メートル naoh 水溶液を滴定します。
- 保管中に窒素で覆われた新鮮なメタクリル酸 (MA、94%)、3 mL を収集します。
注: MA は長期間にわたって大気中にさらされる (日) の反応性が失われます。
注意: MA のすべての使用は、ヒューム フードでされるべきであります。 - 混合の HA ソリューションに MA の 200 μ L を追加します。反応は、8 以下の溶液の pH を低下させます。
- MA の 3 mL がソリューションに追加されるまで、手順 2.4 〜 2.6.1-2 h までかかる場合があります。
- 一晩で 4 ° C、混合せずに続行する反応を許可します。
- ソリューションを 500 mL のビーカーに冷たいエタノール (エタノール) の 400 mL に転送でき、4 ° C で 24-72 時間降水量56
- 慎重に処分、別のビーカーにソリューションの主要な部分をデカントし、50 mL の円錐形遠心管内の沈殿物を収集します。これは、必要に応じて 2 4 管の配布があります。
- 部屋の温度と上澄みの dispose で 2 分間遠心分離機で 200 x g でチューブを遠心します。
- 冷 EtOH でチューブをトップ、ソリューションを混ぜて 1 分 vortexer ステップ 2.10 2.11 を繰り返します。
- 無菌純水 25 mL を追加、ソリューションを混ぜて 1 分 vortexer、超音波 (> 20 kHz) 1 h の 4 ° C で一晩インキュベートし、。
- 15 分間または凍結まで-80 ° C のフリーザーのソリューションを配置またはフラッシュを液体窒素で凍結します。
注意: 液体窒素を使用する場合、保護手袋、顔面シールド、エプロンを使用します。 - 凍結乾燥 (0.1 mBar、-30 ° C) の下 24-48 h 用のチューブ雪のような粉が作成されるまで。
- この時点で HA バックボーンにメタクリル酸陽子 (6.1 5.6 ppm にピーク) メチル プロトン (1.9 ppm、基準の量を確認できる、 1H 核磁気共鳴による純度のサンプルをテストします。95% メタクリル酸メチル プロトンへの最小比は許容されます。69
3. ゲルの形成と 3 D カプセル65
-
Coverslip と金型を製作
- 2% の水溶液 50 mL の蒸留水を作る 3-(構築) プロピル メタクリル酸 50 mL の円錐形遠心管中。
- ソリューションと室温で 1 h の岩に 18 mm ガラス coverslips を配置します。50 coverslips まで一度に追加することができます。
- 直列それぞれ 3 ビーカー 100 mL の脱イオン水に浸漬による coverslips をすすいでください。
- 真空デシケータとオーブンで一晩 40 ° c で coverslips を乾燥させます。
- すぐに 70% の個々 coverslips を浸す鉗子のエタノール。
- 乾燥なし 12 ウェル プレートのウェルに各 coverslip をドロップします。
- 洗浄し、無菌脱イオン水 (井戸あたり 1 mL) の各ウェルを吸引します。
- 各ウェルに滅菌 2 μ g/mL ポリ-L-リジン (PLL) の 1 つの mL を追加し、インキュベート > 2 h。
- PLL ソリューションを吸引し、乾燥空気に coverslips を許可します。
- ジメチルビニル シロキサン (PDMS) 金型 (図 1参照) で 70 %etoh、各 coverslip の中心に 1 つの場所を浸すし、乾いた空気で乾燥させてカビとガラスの間のシールを作成します。
- PDMS の金型を準備するには、平底スチロール皿に 10:1 の比率で PDMS プレミックス試薬を鋳造します。準備 PDMS の数量を選択して、シートの厚さは約 1 mm をもたらします。内径 10 円パンチでシートをカット、PDMS のフォーム井戸。
-
セル準備
注: バイオ セーフティ キャビネットで無菌プロトコルのすべてのステップが実行されます。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ソリューションは、すべてのステップのための pH 7.4 に調整されます。- 浜でセル封止前に 24 h は、12 ウェル プレートで (ステップ 1.15) から 2 週間の一次文化のための媒体を更新します。DMEM/f12 キーの 1 つの mL を追加 (10 %fbs と 1 %ps) ウェルあたり中。
- 細胞の各 12 ウェル プレート準備希薄トリプシン (DMEM/F12 メディアでの 0.25% トリプシン-EDTA 希釈 30%)、12.5 mL、25 mL DMEM/F12 (10 %fbs と 1 %ps)、37 ° c 水のお風呂では暖かい。
- 10 mL の血清ピペット (ウェルあたりの > 0.5 mL) を使用して板から馴化培地を収集、徹底的に残りの液体を吸引し、まで希薄トリプシン (0.075% トリプシン-EDTA) (37 ° C、5% CO2) インキュベーターで 20-30 分のための井戸あたり 1 mL に置き換えますコンフルエントの細胞の層は、プレートからデタッチします。
- (単一の浮動小数点部分として表示される) 1 mL ピペットで物質を懸濁細胞を回復し、15 mL の円錐形遠心分離機管の収集します。DMEM/F12 の相当量に希釈 (10 %fbs と 1 %ps) と 200 x g で上清を廃棄、常温で 2 分間遠心します。
- DMEM/F12 を暖かく 10 mL の細胞ペレットを再懸濁します (10 %fbs と 1 %ps) 5 回 10 mL のピペットで細胞をカップ刻んだし、2 分間 200 × g で遠心分離します。
- 上清をデカント、5 mL の細胞を再停止 DMEM/F12 を暖かいし、50 mL の円錐形遠心管にセルを転送します。
- 18 g 針、10 mL の注射器を使用して、3 回の細胞液をカップ刻んだし、新しい円錐形遠心管にセル 40 μ m ふるい懸濁液をフィルターします。
- 細胞懸濁液の 10 μ L を収集、暖かい DMEM/f12 キー、および自動化された細胞カウンター カウント細胞 1: 100 希釈
- カプセル化のステップまで 37 ° C の水浴で孵化させなさい。
-
電池封止材
注: バイオ セーフティ キャビネットで無菌プロトコルのすべてのステップが実行されます。- 3 D の各 12 ウェル プレートのヒドロゲル暖かい DMEM/F12 12.5 mL とセル準備の中に収集されたエアコン DMEM/F12 メディアの 12.5 mL。
- メタクリ レート化ヒアルロン酸 (浜) を最終濃度 0.5 %wt/巻溶解濃度 (2 %wt/巻); フィルター滅菌 PBS でこの浜に必要な量の重量を量る最終濃度の 4 倍濃度は細胞とその他の試薬の追加に対応するため利用されています。1 ゲル 12 ウェル プレート 7 mg 浜 ~ 350 μ L の PBS を必要があります。
- 超音波 (> 20 kHz) ソリューション浜は 60 分のために完全に溶解するまで。
- トリエタノールアミン (TEA)、1-ビニル-2-ピロリジノン (NVP) の個々 の 10% 溶液と 1 mL 滅菌 PBS pH 7.4 の因数で 1 mM ソリューション エオシン Y (EY) を準備します。
- 1 つ 12 ウェル プレート、ためにを作る 1 x 10 の最終の 1.4 mL 混合7セル、0.5 %wt/巻浜 (2 %wt/巻 350 μ L)、0.1% 紅茶 (10% の 14 μ L)、0.1 %nvp (10% の 14 μ L)、0.01 mm EY (1 mm 14 μ L)、と 20% 混合基底膜 (株式 280 μ L)。残りのボリュームは、PBS です。
- 優しくソリューションをミックスし、それぞれの PDMS 型 1 mL 先端に 100 μ L をピペットします。
- 高輝度緑色 LED ライトのサンプルを公開 (~ 520 nm、60 mW、囲まれた 20 cm × 20 cm × 20 cm のボックスの) 部屋の温度で 5 分間。
- 12 ウェル プレートに暖かいエアコン DMEM/F12 の井戸あたり 1 mL を追加します。
- 各 coverslip の親指と人差し指の間を把握、ゆっくり PDMS 金型をゲルがずれないように注意しながらピンセットではがすし、馴化培地と同様にそれを置きます。
- 追加 1 mL を追加 DMEM/f12 キーを各ウェルに暖かい。
- 5% CO2と 37 ° C でプレートを 2 週間、各井戸からメディアのピペット 1 mL を毎週携帯メディアをリフレッシュし、1 mL DMEM/f12 キーに置き換えるにインキュベートします。
4. 顕微鏡
-
免疫細胞化学
注: 倒立共焦点顕微鏡を用いてこれらのサンプル画像し、ImageJ だった処理し、画像を表示するために使用します。ミクログリアやアストロ サイト、オリゴデンドロ サイト、核は、浜文化で 3 週間後ラベルがされます。- 37 ° C バースの PBS 緩衝ホルマリン 10% (pH 7.0) を予熱します。
注意: ヒューム フード外にホルマリンを使用できます、この材料は、組織と反応は、ケアと手袋を常に処理する必要があります。それは別々 に処分をする必要があります。 - 慎重に各ウェル プレートやピペット 1 mL の 10% ホルマリンからメディアを吸い出しなさい。
- 37 ° c 20 分間 5% CO2で板を孵化させなさい。
- 各板から液体を吸引ピペット 2 mL の PBS (pH 7.4) を各ウェルに、15 分間インキュベートします。
- 4.1.4 の手順を 2 回繰り返します。
- プレートから液体を吸引 10% 通常の馬血清 (NHS) と 0.5% トリトン X-100、PBS の井戸あたり 1 mL を追加して、最低速度でゆっくり岩) 1 時間。
- 4.1.4 のステップを 3 回繰り返します。
- 液を吸引し、PBS で次の混合物の井戸あたり 1 mL を追加: ウサギ イオン化カルシウム結合アダプター分子 (Iba1) 1:1, 000, グリア線維性蛋白 (GFAP) 1:5, 000 を鶏、マウス 2', 3'-サイクリック-nucelotide 3'-ホスホジエステラーゼ (CNPase) 1:1, 000, 1 %nhs、および 0.1% セル穿孔界面活性剤。4 ° C で一晩、プレートをできるだけ穏やかに揺れます。
- 間に、3 回と 1 時間孵化 4.1.4 手順を繰り返します。
- 液を吸引し、PBS で次の混合物の井戸あたり 1 mL を追加: 647 nm 励起ロバ抗家兎抗体 1: 200、546 nm 励起ヤギ抗にわとり抗体 1: 200、488 nm 励起ロバ抗マウス抗体 1: 200、1 %nhs、縮尺ブルー核染色。優しくロッキング プレート、1 時間室温で孵化させなさい。
- 間に 3 回 1 時間孵化とステップ 4 を繰り返します。
- ゲルを保持するには、バッファーを吸引 1 分ピペット メディアをマウントをマウント培の 0.5 mL 中に没頭し、ガラスの間の層を作成するゲルの上に coverslip をそっと置きます。ヒドロゲルの乾燥を防ぐ coverslips の覆いを取られた側に取り付け中の少量を追加します。
注: トラブルシューティング目的のゲルはステップ 4.1.11 でイメージングすることができます。さらに処理する前に適切なラベルを参照してください。
- 37 ° C バースの PBS 緩衝ホルマリン 10% (pH 7.0) を予熱します。
-
走査型電子顕微鏡 (SEM)
注: ヒドロゲルを視覚化し、走査型電子顕微鏡を使用してこれらのサンプル画像します。- 37 ° C の水浴中の PBS (0.1 M) で 2.5%, グルタルアルデヒドおよび 2% パラホルムアルデヒドの固定混合物を予熱します。
注意: これらの試薬は、組織反応性の高いケアと手袋で処理する必要があります。彼らは発煙のフードで可能な限り処理して個別に破棄します。 - 細胞培養皿から培地を吸引し、予熱定着性混合物の 1 つの mL を追加します。
- 37 ° c 20 分間 5% CO2で板を孵化させなさい。
- 一晩 4 ° C (冷蔵庫・ クーラー) でプレートを配置します。
- 井戸から固定液を吸引し、1 mL の PBS を追加します。
- 各板から液体を吸引、2 mL の PBS を各ウェルを追加し、15 分間インキュベートします。
- 4.2.6 のステップを 2 回繰り返します。
- PBS を吸引し、1% オスミウム四酸化各ウェルに PBS でバッファーの 1 つの mL を追加します。
注: サンプルに乾燥するまでこの手順および以降の手順で実行されますヒューム フード。 - 固定液体から 30 分オスミウム蒸気は同じプレートで他のサンプルを修正できるために発生することを許可します。したがって、それに応じてサンプルを分割このステップの前に。
注意: 四酸化オスミウムは高い組織と反応し、揮発性です。それは危険であり、手袋で発煙のフードで処理する必要があります。それと即時洗浄する必要があります処分別途。 - 4.2.6 のステップを 3 回繰り返します。
- 液体を吸引し順番では、下の一覧に脱水の混合物を追加し、示された時間 (室温) 孵化させなさい。まず徐々 にエタノール (エタノール) はそれから続いたヘキサメチルジシラザン (HMDS) を追加します。各増分の表 2を参照してください。
注: HMD を追加する際、coverslips 強くプラスチックに付着できを削除する非常に困難になります。これは、HMD の最初のアプリケーションの後ガラス スリップの下で小さなプラスチック製プラットフォームを配置することによって防ぐことができます。2 番目の EtOH インキュベーション後サンプル撮影でき破壊サンプルを凍結する数秒間液体窒素で急冷します。 - 慎重に乾燥のサンプルを削除し、両面導電性テープと走査型電子顕微鏡関連のスタブ項目にサンプルをマウントします。
- スパッタ コート ゴールドの最小量のサンプルです。ホルダーに試料を置き、15 で 2 分間機械の操作 mA。
- 37 ° C の水浴中の PBS (0.1 M) で 2.5%, グルタルアルデヒドおよび 2% パラホルムアルデヒドの固定混合物を予熱します。
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Representative Results
神経組織のホスト応答と高スループットのグリア瘢痕をモデル化するには、 in vitroシステムはマトリックス材料は生体親和性、その場形成、細胞傷害性のイベントを発生させないとを変更すると 3 D の細胞の足場を必要とします。優しい対応を導くための生理活性成分。このため、ヒアルロン酸に基づく 3 D の細胞の足場システムを作成し、細胞間相互作用とグリア bioreactivity を検討する主な混合グリア細胞人口をカプセル化します。細胞と足場の簡単な視覚的検討がなされました。オリゴデンドロ サイト (緑の CNPase) を含む細胞の亜集団の形態ミクログリア (赤で Iba1)、共焦点蛍光顕微鏡観察 (図 3Ai-ii-Ci ii) によるアストロ サイト (黄色で GFAP) が表示されます。複合足場と細胞形態に SEM (図 3Aiii-iv - Ciii iv) も表示されます。これらの画像は低 (i および iii) と (ii および iv) の高解像度の代表的な画像の両方が表示されます。2D PLL coverslip コーティング (図 3 a) は、3 D 0.5 %w/v 浜足場 (図 3 b) と 0.5 w/v 浜 (図 3) で 20 %v/v の基底膜混合物の混合物と比較しました。これは 2 D、3 D 細胞培養、生物板を足場に導入の効果の形態の違いを示すために行われました。3 D 再構成も補足的な情報をご覧いただけます。
3 D プラットフォームの導入によって変更各細胞型の細胞の形態。2D 付着性文化 (PLL コートガラス coverslips)、オリゴデンドロ サイト登場通常ラウンドと小さなネットワークを形成して軽く接続通常ラベル GFAP プロセス。ミクログリアが他のセルよりも小さいと小さい分岐プロセスの細胞体から遠くを拡張しなかったことがあった (< 20 μ m)。アストロ サイトがもっとまちまち形、他が外観がフラット コート表面いくつかの広範なプロセスと線維性間に小さな細胞体と広範な薄い分岐プロセス、橈骨形態を有するいくつか。3 D 浜文化クラスターの小さな球に分岐したことでオリゴデンドロ サイトが登場しました。ミクログリアにプロセスがほとんどない、円形、アストロ サイトが丸めまたは放射状ネットワーク 1 つのクラスターからに分かれた。一般に、これらの細胞は単一ポイントから手狭にあるまたは残ることがなく浜のエリアの登場する 2D の文化とは異なりは、マトリックスに限られた移動性の挑発的な他の細胞との接触します。20 %v/v の基底膜の混合物は、光重合混合物に追加された、グリア細胞のサブタイプのすべては 3 D のプラットフォームと統合されより広範な対話型の分岐構造を形成します。オリゴデンドロ サイト放射状非基底膜の混合形態に似た球根プロセスを拡張がさらに足場全体分岐アストロ サイト プロセスの薄い相互接続ネットワークに沿ってプロセスを拡張します。ミクログリアは、薄膜プロセス組織の形態とより一貫性と広がることこれらの細胞のネットワークの中で分散していた。全体的には、形態はグリア浜基底板の混合物に自由に統合の潜在的混合基板にいずれかの増加の遵守を介してや足場を改造する能力の増大をすべての 3 つのタイプをお勧めします。
SEM により, 共焦点顕微鏡を確証する細胞の形態が見られました。浜の行列は、10-50 μ m 孔表面の下にかすかに見られる滑らかな表面として登場。細胞、浜の表面に付着とも下にあるレイヤーにかすかに見えていました。これらのグリアは二次元文化に匹敵する形態をしかし、基底膜の混合物の追加により、広範なネットワー キングが認められたはありません。ミクログリアの小規模なクラスターでの厚いアストロ繊維が浜基底板の混合物表面およびマトリックスを介してシームレスに拡張の認められました。これは、セルは、目的の立体構造を形成する足場を変更することが示唆している細胞の周り折り返されているマトリックスとしてかすかに見ることができます。
図 1: ならびにヒアルロン酸 (浜) の概略-ベースの 3 D 細胞培養と光重合プロトコル。グリア細胞 (2 週初代ラット脳文化) は浜と混合され、ガラス基板をポリジメチルシロキサン (PDMS) 金型に戻します。この混合物が 5 分のハイドロゲルを重合する高強度緑 LED ライトにさらされます。金型は削除され、メディアでゲルを培養します。代表的な細胞ミクログリア (赤)、(黄)、アストロ サイト、オリゴデンドロ サイト (緑) があります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 1 日目スプレイグ ドーリー子犬脳の解剖します。(A) 全脳皮質と小脳 (B)、(C) 髄膜、剥離鉗子 (D)、髄膜の単一皮質と硬無料野 (E) の解剖の画像。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:蛍光共焦点 (i ・ ii) と 2D PLL コーティング (A)、(B)、浜と浜基底板の混合物 (C) を混合グリア細胞集団の電子 (iii-iv) 顕微鏡写真をスキャンします。低い (i, iii) および高い (ii、iv) 拡大画像が表示されます。ラベルは、ミクログリア、アストロ サイト、オリゴデンドロ サイトのための緑の CNPase、ヘキスト核染色黄色の GFAP の赤で Iba1 を含まれます。スケール バー = 共焦点画像を 25 μ m、50 (iii) と 20 μ m (iv) の走査電子顕微鏡写真。ヒドロゲル 0.5 %w/v, と基底膜の混合物容積 20% であった。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 1: 蛍光顕微鏡三次元と浜基底板の混合物の混合グリア細胞集団浜基底板混合します。ラベルは、ミクログリア、アストロ サイト、オリゴデンドロ サイトのための緑の CNPase、ヘキスト核染色黄色の GFAP の赤で Iba1 を含まれます。ヒドロゲル 0.5 %w/v、Getrex ボリュームで 20% であった。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
| 浜 | 基底膜 | NVP | 紅茶 | EY | |
| 使用濃度 | 0.5 w/v | 20 %v/v | 0.10% | 0.10% | .01 ミリメートル |
| 12 ウェル プレート | 2 w/v | 100 %w/v | 10 %v/v | 10 %v/v | 1 mM |
| 1.4 mL 合計 | 350 Μ L | 280 Μ | 14 Μ L | 14 Μ L | 14 Μ L |
表 1: 電池封止材の例。
| コンポーネント | コンテンツ | インキュベーション時間 |
| 江藤 | 30% | 30 分 |
| 江藤 | 50% | 30 分 |
| 江藤 | 70% | 30 分 |
| 江藤 | 90% | 20 分 |
| 江藤 | 100% | 20 分 |
| 江藤 | 100% | 20 分 |
| EtOH:HMDS | 75: 25 | 20 分 |
| EtOH:HMDS | 50:50:00 | 20 分 |
| EtOH:HMDS | 25: 75 | 20 分 |
| HMD | 100% | 20 分 |
| HMD | 100% | 一晩 |
表 2: 江藤と脱水で HMD の緩やかな刻み。
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Discussion
モデル グリア bioreactivity 3次元培養システムおよびグリア瘢痕のプロセスを生成する目標に向かって一次培養ミクログリア、アストロ サイト、オリゴデンドロ サイトをサポートし、により、電池の堅牢な評価システムを開発しました。形態と細胞間の相互作用。示されている顕微鏡写真から各セル型の形態が 2 D、3 D 浜および 3 D 浜基底板混合プラットフォームと異なる。2 D システムの形態がはっきりと表面の平面に沿って一方に片寄ったが 3 D の浜に比較すると、ミクログリアやアストロ サイト オリゴデンドロ サイトのクラスターを除いて、行列の内部は一般的に小さかった。走査電子顕微鏡像の詳細は、浜に丸形概ねセル。これは主に歩行し、自由な動きとプロセスの成長の行列を変更する限られた容量でカプセル化された細胞のためにかもしれません。細胞伸長、浜にはアストロ サイト、オリゴデンドロ サイト通常ラジアルだったこれら細胞の拡張のプロセス、組織マトリックスおよび他の細胞と対話する能力を通して彼らの動きが限られていたことを示唆します。さらに、前作は、相互接続ネットワー キング、この伸長65,70の欠如を説明することがなく多孔質する凍結割断浜を示しています。それはこれらの細胞のいくつかは残りの行列の保存、光重合を生存しなかった私たちの前しかし、生存率を体系的に比較検討した作業、および65週にわたって 80% (w/v の 0.5%) のままである、可能かもしれない。
3次元培養でマトリックスと細胞の相互作用を高めるためには、生体適合性と変更可能なマトリックス成分として基底膜の混合物を紹介しました。マトリックス セルの統合された 2D 文化と 3 D 浜に比べて広範なプロセスを表示すべてのセル型が著しく改善された.基底膜混合物は様々 な基底コンポーネントで構成されていて、神経幹細胞前駆体71のグリア分化をサポートするため主に作り出されます。グリア細胞は基底膜の混合物、その後周辺の 3 D マトリックスに答えたが、統合の程度は、健全な組織のような環境を示唆していることは予想外でした。浜基底板の混合物に浜を比較すると、ハイドロゲル形態が明らかに異なる表示されない、したがって細胞よりは積極的にそれ改造があります。この生理活性成分の追加のシンプルさを考慮した、異なる杉やタンパク質の手がかりを使用して、神経細胞の培養条件を有利に想像を絶するはありません。潜在的な将来の方向性でこのシステムは、さまざまなインパクトのある髄鞘形成や神経炎症性損傷モデルの混合グリアと共に神経前駆細胞からニューロンを区別するためにされる可能性があります。
深刻な有害な中枢神経損傷または生体拒絶反応は、居住者の組織炎症反応性神経変性と脱髄を悪化させることができるが開始されます。通常、これは再生を防ぐことができます傷害のサイトを分割するグリア瘢痕の形成に終わります。本研究ではメソッドがならびに光重合ヒアルロン酸ベース 3 D 足場グリア瘢痕の形成の背後にある初期細胞応答のモデル化を意図しての詳細反応性ミクログリア、アストロ サイトの募集や肥大とオリゴデンドロ サイト怪我および撤退。3 D の細胞足場はすべての 3 つのグリア細胞などを組み込むに設計され、さらに基底膜の多成分混合物で変更されました。それ、イメージング、細胞が浜でカプセル化し、基底膜の混合物が導入されたときに統合することができましたと共焦点走査型電子顕微鏡によって決定されました。これらの結果は、いくつかの新しい応用につながる可能性があります。浜だけでは、意図する細胞相互作用を制限することですまたは研究原泉薬ロード拡散限られたマトリクスとしてゲルを使用する薬物送達で共培養システムを作成するのに役立つかもしれない。基底膜の混合物を組み込む浜マトリックス ゲル急性炎症、神経膠症、またはグリア瘢痕をモデリングできる一貫性のある組織のような環境を可能にするおよびグリアのさらに高いスループット特性を有効にbioreactivity インプラント、薬物およびデバイスの開発、およびその他の戦略を削減し、炎症性の損傷を回復します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、金融サポート レベル、CFI、AIHS、アルバータ州健康サービス、および脳研究のため Davey 基金から感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Materials for HAMA synthesis and photopolymerization | |||
| Hyaluronic acid (HA) | Sigma-Aldrich | 53747-10G | Streptococcus equi, MW: 1.5 - 1.8 X 10^6 |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 275585-100ML | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| Ethanol (EtOH) | Commerical Alcohols Inc. | Anhydrous | |
| Phosphate buffered saline (pH 7.4) tablets | Fisher Scientific | 18912014 | |
| Triethanolamine (TEA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| 1-Vinyl-2pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | |
| EosinY (EY) | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 440159-100ML | |
| Beaker (100 mL) | Corning | 1000-100 | |
| Beaker (500 mL) | Corning | 1000-600 | |
| pH paper (Labstick) | Sigma-Aldrich | 9580 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2. Materials for glial cell isolation and cell culture | |||
| P1-2 Sprague Dawley rat pups | Charles River | CD Sprague Dawley rat strain code 001 | |
| Dissector scissors - slim blades (small) | Fine Science Tools | 14081-09 | |
| Surgical scissors - Toughcut (large) | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11521-10 | |
| Curved fine forceps (Dumont #7) | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14170-112 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
| Penicillin-streptomycin (PS) | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 12483-020 | |
| 0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Gibco | 25200-072 | |
| Poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P-6282 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-5 | |
| 12 well Tissue culture treated plates (Cellstar) | Greiner Bio-One | 665 108 | |
| 10 mL serological pipette | Fisher Scientific | 13-676-10F | |
| 25 mL serological pipette | Fisher Scientific | 12-676-10K | |
| Petri dish (60 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri dish (100 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Microscope Coverslip (18 mm) | Fisher Scientific | 12-545-100 18CIR | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3. Materials for microscopy (confocal and scanning electron microscopy) | |||
| Mouse monoclonal anti-CNPase | abcam | ab6319 | |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako Laboratory Chemicals | 019-17741 | |
| Chicken anti-GFAP | abcam | ab4674 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | |
| Fluoromount-G | Fisher Scientific | 00-4958-02 | |
| Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Buffered (10%) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Paraformaldehyde | Electon Microscopy Sciences | 157-8 | Buffered (8%) |
| Guteraldehyde | Electon Microscopy Sciences | 16019 | Buffered (8%) |
| Osmium tetraoxide | Electon Microscopy Sciences | 19152 | Buffered (2%) |
| Hexamethyldilazane (HMDS) | Electon Microscopy Sciences | 16700 | |
| Ethanol (EtOH) | Electon Microscopy Sciences | 15055 | Anhydrous |
| Microscope Slide (25 X 75 X 1 mm) | VWR International | 48311-703 |
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