Summary
Burada, biz fare 3D kültür için bir protokol beyin kaynaklı glia hücreleri, astrocytes, microglia ve oligodendrocytes de dahil olmak üzere mevcut. Biz birincil hücre kültürü, methacrylated hyaluronik asit (HAMA) hidrojel sentezi, HAMAphoto polimerizasyon ve hücre saklamasını ve confocal ve tarama elektron mikroskobik görüntüleme için işleme örnek göstermektedir.
Abstract
Merkezi sinir sistemi, çok sayıda akut yaralanmalar ve nörodejeneratif hastalıklar, de yerleştirilmiş cihazlar veya Biyomalzeme mühendislik işlevi sonuç aynı sonucu geliştirmek için: aşırı iltihap gliosis, sitotoksisite, yol açar ve/veya topluca yaralanma azdırmak veya sağlıklı kurtarma engelleyen bir gliyal yara oluşumu. Bir sistem modeli gliyal yara oluşumu ve çalışma inflamatuar işlemlere oluşturma niyetiyle, bir 3D cep iskele birincil kültürlü gliyal hücreler muhafazasında üretilip: yabancı cisim yanıt düzenleyen ve başlatmak microglia inflamatuvar olay, fibröz skar oluşturmak için yanıt astrocytes ve inflamatuar yaralanma genellikle açık olan oligodendrocytes. Mevcut çalışma gliyal hücreler beyin kaynaklı imalat, kültür ve hyaluronik asit tabanlı 3D hidrojel iskele kapsüllenmiş fare ile mikroskopik karakterizasyonu için detaylı bir adım-adım yöntemi sağlar. Ayrıca, hücre saklama ve hidrojel iskele confocal ayirt ve elektron mikroskobu tarama tarafından karakterizasyonu protokollerde, yanı sıra ile iskele biyoaktif yüzeylerde ile değiştirmek için kapasite içinde gösterilen Gelişmiş hücre Tümleştirme ticari Bazal lamina karışıma birleşme.
Introduction
Merkezi sinir sistemi (MSS) iltihabı uzun akut damgasını kabul (örneğin, iskemik inme, travmatik beyin ve omurilik yaralanma) ve kronik (örneğin Alzheimer, Parkinson'ın ve Huntington hastalıkları) CNS yaralanma, Ama giderek nörodejeneratif ve nöropsikiyatrik bozukluklar için nedensel bir katkı olarak kabul edilmektedir. Sürekli veya uygunsuz inflamasyon, sinir hasarı ve demiyelinizasyon (örneğin multipl skleroz) neden ve olumsuz etkisi beyin gelişimi (örneğin, şizofreni, otizm) ve ruh Birleşik (örneğin, depresyon, anksiyete bipolar bozukluk). , Daha fazla implante edilebilir cihazlar kullanarak yeni tedavi stratejileri (örn., beyin-bilgisayar-arabirimleri1,2,3, derin beyin stimülasyonu4,5, kesici microstimulation6,7,8,9,10) aygıt ve sonuçlanan CNS arasında arayüz, tahmin edilebilir bir enflamatuar yanıt oluşturmak bir koruyucu doku yanıt implant11ömrü boyunca etkinlik ya da aygıt hatası kaybına neden olabilir. MSS iltihap genellikle hangi doku gözetim ve yabancı cisim yanıt (gözden geçirilmiş12) Montaj sorumlu CNS yerleşik bağışıklık hücreleri olarak işlev microglia tarafından başlatılır. Bir hakaret şiddetine bağlı olarak, hücre microglia sinyal ve işe ek türleri bir yaralanma sitesine. Özellikle, microglia sırayla ikincil inflamatuar hücreler ve form bir yaralanma sitesi13,14içerecek şekilde yoğun bir koruyucu bariyer olarak hareket astrocytes etkinleştirin. Microglia de bir aktivite cascade periferik bağışıklık sistemi, bağışıklık infiltrasyon (başvuru15dakika içinde gözden) izin vermek için BBB arıza neden olabilir hücrelerdeki başlatabilir.
Aletler MSS söz konusu olduğunda, aygıt ekleme yanı sıra yabancı aygıt devam eden varlığı ortaya çıkan doku hasarı gliyal skarlasma olarak adlandırdığı bir işlem başlatabilir. Bu süreçte microglia göç ve yaralanma sitesinde çoğalırlar. Onlar da serbest bırakılması inflamatuar amil-e doğru potansiyel tehditleri etkisiz hale getirmek ve ek gliyal hücreler işe başlatın. Daha sonra aktif astrocytes Hipertrofik olmak ve sürekli lifli bariyer16oluşturmak için implante cihazın Kapsüllenen başlar. İnflamatuar sinyalizasyon da implant çevresinde nöronal işlemleri geri çekilmesi teşvik için hizmet vermektedir ve sonunda fibroblastlar gelişmekte olan gliyal yara17güçlendirmek için acemi. Gürültülerinden, geliştirmek için miyelin nöronlarda kaplama için sorumlu oligodendrocytes bu işlem hayatta yapmak ve uzak hücreler yara18tarafından implant bölümlendirilir. Büyük ölçüde gliyal skarlasma işlevi ve boyu implant cihazları, özellikle kayıt elektrotları, azaltır ve sonuçta Sinirsel arayüzleri19işlevselliği sınırlamaya yönelik hizmet vermektedir.
Birkaç yaklaşım Biyouyumluluk ve CNS20,21,22,23implant cihazlarının arabirimi etkinliği artırmak için istismar. Kapsamlı bir inceleme bu Sinirsel arayüzleri24Biyouyumlu tasarım üzerinde kullanılabilir. Polyelthyleneglycol (PEG), polylactic-co-glikolik asit (PLGA)25, gibi uyumlu kaplamalar ile elektrodu çevreleyen veya elektrot Poli (etilen gibi iletken polimerler ile arttırmak en önemli stratejileri içerir dioxythiophene) (PEDOT) ve polypyrrole (PPy)26,27,28,29,30,31. Biyoaktif kaplamalar da collagens, fibronectins ve hyaluronik asit32,33,34 de dahil olmak üzere hücre dışı matrisler türetilmiş ligandlar kullanarak sinir dokusu büyüme için yardım sağlamak için istihdam edilmiştir ,35,36,37. Bu kaplama bioactivity daha fazla büyüme faktörü yayın sistemleri ile doğal hücre salgıları30,38,39,40,41 taklit etmek için araştırdı , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50. aynı anda, bazı araştırma grupları elektrot geometri, esneklik ve kompozisyon aygıt ve doku51,52,53 arasında mekanik uyumsuzluk azaltmak için yeni model için seçtiniz ,54,55,56,57. Tamamen, bu stratejileri çok umut verici gelişmeler için kurşun nesil sinirsel interfacial içinde ancak uzun vadeli uyumluluk bir devam konudur ve ilerleme karmaşık ve zaman alıcı içinde vivo modelleri tarafından engel aygıtlarınızda .
Hayvan modeli tabanlı yaklaşımlar deneysel işlem hacmi sınırlamak ve elektrot Biyouyumluluk test maliyetleri artırmak. Vitro geleneksel hücre kültürü teknikleri daha düşük maliyetli bir alternatif teklif ama aygıt ve doku58arasındaki etkileşimi karmaşıklık çoğunu özetlemek başarısız kullanarak yaklaşıyor. Özellikle, yüzey kaplama elektrot geometri modellenmesi ve mekanik uyuşmazlığı ve aygıt hatası59 için katkıda bulunan bir ana bilgisayar yanıt üretme için katkıda bulunmak için düşündüm micromotion etkisi 2D hücre kültürü sınırları kullanarak sınama , 60.
2D hücre kültürü ile ilişkili sorunların üstesinden gelmek için sinir hücreleri kültürleri hidrojel çok çeşitli uygulamalar, farmakolojik çalışmalar61, hastalığı anlamak için sinir hücre farklılaşması62, yönlendirmek için geliştirilmiştir yollar63,64veya diğer hücre tipleri modeli hücre geçiş, neuroprotection, veya modeli doku microenvironments61ile içinde katmanlı Co kültür. Hydrogels farklı boyutlarda kolayca kurulur ve geometriler birincil veya ölümsüzleştirdi hücre kültürleri çeşitli tiplerde dahil edebilirsiniz ve son derece confocal floresan mikroskopisi gibi yaygın olarak kullanılan teknikleri göre analiz için mükellef bulunmaktadır. Gliyal skarlasma sürecinin bir model oluşturmak için biz son zamanlarda geliştirilen ve hyaluronik asit tabanlı 3D hidrojel sistem yüksek üretilen iş için implante elektrotlar (şekil 1)65gliyal yanıt test etmek için karakterize. Bu sistem birçok farklı avantajı vardır: 1) birincil gliyal hücreler (microglia, astrocytes ve oligodendrocytes) bir endojen hücre dışı matriks bileşenidir; hyaluronik asit polimerleri oluşan bir 3D matris içinde kapsüllü 2) matris sertlik ' beyin ya da omurilik doku mekanik özelliklerini yeniden oluşturmak için ayarlanan'; ve 3) hücreleri ile yeşil ışık, toksisite sarma sırasında sınırlama photopolymerization kullanarak hızlı bir tezgah üstü yaklaşım matris içinde kapsüllenir. Anahtar şekil-in vivo Biyouyumluluk bu sistemi sağlar: cihazlar doku karşılaştırılabilir şekilde hidrojel eklenen ve yerleştirilmiş cihazlar hücresel yanıt parametreleri65geniş bir yelpazesi için izlenir. Bu cihazlar ve çeşitli yapıları ve elektrik stimülasyon bakliyat hidrojel kaplamalar arasında mekanik uyuşmazlığı içerir. Bu sistem de oligodendrocyte ve çoğu kez mevcut ve gliyal izleri işe ilgili precursors içerir. Onların hasar, ölüm ve fagositoz microglia tarafından son derece tahrik edici yaralanma işaret etmektedir ve skarlasma veya kurtarma manken azaltılmış gibi onlar re-myelination nöronlar66göstermek için kapasitesine sahip.
Burada sentez ve hücre birleşme geliştirmek için piyasada bulunan membran formülasyonları ile kombine hibrid hyaluronik asit hydrogels oluşumu için bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca, biz birincil kültürlü gliyal hücreler (microglia, astrocytes ve oligodendrocytes) birleşme ve kültür büyüme immunocytochemistry ve confocal mikroskobu kullanarak analizini gösterecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokol 1 gün Sprague Dawley rat pups, işten çıkarma tarafından ötenazi beyin dokusu çıkarılması için hayvan bakım ve kullanım komite toplantısında Alberta Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Microglia ve Astrocyte izolasyonların67,68
Not: Yalıtım ve hücre kültürü için tüm medya için bir su banyosu 37 ° C'de ısıtılmış. Hank'in dengeli tuz solüsyonu (HBSS) % 1 penisilin-streptomisin (PS) vardır. Tüm Dulbecco'nın kartal medya besin karışımı (DMEM/F12) % 10 fetal sığır serum (FBS) ve % 1 penisilin-streptomisin (PS) ile desteklenmiş Ham'ın F12 ile değiştirilmiş. Tripsin ile tek karışımları FBS eksikliği. Bu iletişim kuralı tüm malzemeler steril (filtre, alkol, satın alınan ve autoclaved) ve her adım adım sayısını 1.8 sonraki bir biyogüvenlik aseptik teknik ile kabine içinde gerçekleştirilir.
- Beyin 15 mL HBSS ve 12,5 mL DMEM/F12 için 50 mL konik santrifüj tüpleri 37 ° C'de ve yaklaşık 2 mL % 0.25 tripsin 1 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) 15 mL konik santrifüj tüpü ile ön ısı. DMEM/F12 bir ek 25 mL ısı. Sıcak tripsin 10 dk önceden enzimatik aktivite kaybını önlemek için kullanın.
- Yeterince sıcak HBSS steril, 6 dökün ve 10 cm kültür yemekleri yüzey kapsayacak. Her iki beyin için bir 10 cm çanak artı bir ek 6 cm yemek hazırlamak.
- En çok 2 beyin her 10 cm2 tabak (şekil 2A) yerleştirin.
- Diseksiyon mikroskop altında eğri ve düz forseps cortices orta hat ve beyincik beyin sapı ile ayırmak için kullanın. Bu doku beyin (şekil 2B) başına üç bölümden verir.
- İnce, yarı saydam Katmanı (meninkslerde) kan damarlarının her bölümünde bulunan doku ve atma, kalan doku ayrı kültür çanak içine transfer içeren doku kabuğu. Forseps ile doku kesim tarafından maruz ince tabakalar tutun ve önemli bölümleri 'beyin dokusu asılı olan kadar' dikkatlice çekin. Son olarak bu bölümü çekiştirmeye tarafından yavaşça kaldırın. Şekil 2Cgörmek-2E temsilcisi resimleri öncesinde, sırasında ve sonra bu adımı.
- Bir biyogüvenlik kabini, kalan HBSS dikkatle doku istinat kültür çanak kaldırın. Bir neşter ile doku macerate ve Önceden ısıtılmış 15 mL tüp tripsin ile doku aktarmak.
- Bu tüp 25 dk 37 ° C banyo doku enzimatik sindirimi için kuluçkaya.
- 500 x g oda sıcaklığında 2 min için de aşağı tüp santrifüj kapasitesi ve süpernatant dökmek.
- 10 mL serolojik pipet kullanarak doku kırmaya tripsin devre dışı bırakın ve çözüm 5 kere triturate için sıcak DMEM/F12 10 mL ekleyin.
- 500 x g oda sıcaklığında 2 min için de aşağı tüp santrifüj kapasitesi ve süpernatant dökmek.
- 10 mL serolojik pipet kullanarak, pelet sıcak DMEM/F12 10 mL yeniden askıya alma ve çözüm bir 50 mL konik santrifüj tüpü aktarın.
- 10 mL 18 gauge iğne ile kullanarak, çözüm 3 kez triturate.
- Sıcak DMEM/F12 beyin başına 12.5 mL artışlarla içine bu çözüm dağıtmak.
- Triturated çözüm artırımlarıyla 1 mL 12 iyi plaka (1 başına beyin) içine pipet.
- 37 ° C ve % 5 CO2oksijen hücre kültür kuluçka kuluçkaya. Üç gün sonra ortamı değiştirin ve medya sonraki üç günde yenileyin. 2 hafta sonra hücreleri deneyler için toplanabilir.
2. Macromer sentez69
- Hyaluronik asit (HA) tuz 375 mg 50 mL konik santrifüj tüpü tartmak ve 37,5 mL distile su ekleyin.
- Bir vortexer 1 dk için Çözümle boşaltır ve homojen görünür ve jel gibi viskozite kaybeder kadar karışımı solüsyon içeren temizleyicide. Bu oluşum-ebilmek almak 6 h.
- 100 mL kabı ile bir manyetik transferi çözüm (bar 38 mm) ilave edin ve oda sıcaklığında karistirin.
- PH 8 ile 12 arası stabilize kadar karıştırma HA ve ölçü ile pH kağıt içine 5.0 M NaOH dikkatle titre.
- 3 mL taze metakrilik anhidrit (MA, % 94'ü), azot tarafından depolama sırasında blanketed toplamak.
Not: Anne uzun süreler için atmosfere maruz kalmaktadır (gün), onun reaktivite kaybedersiniz.
Dikkat: Tüm kullanım ma bir duman mahallede yapılmalıdır. - MA 200 µL karıştırma HA çözüm içine ekleyin. Reaksiyon 8 aşağıda çözüm pH düşürür.
- MA 3 mL eklendi çözüm için 2,4-2,6 tamamlayana dek. Bu işlemin en fazla 1-2 saat sürebilir.
- Reaksiyon gecede 4 ° C'de olmadan devam etmek izin verir.
- Yağış 24-72 saat için 4 ° C'de izin ve çözüm 400 mL soğuk etanol (alkol) 500 mL kabı transfer 56
- Dikkatli bir şekilde çözüm büyük kısmını bertarafı için ayrı bir kabı içine dikkatle boşaltmak ve çökelti 50 mL konik santrifüj tüpü içinde toplamak. Bu gerekirse 2-4 tüplerde dağıtılmış olabilir.
- Oda sıcaklığında ve süpernatant atmayın 2 dk santrifüj 200 x g, tüpler santrifüj kapasitesi.
- Soğuk alkol ile tüp kontör, çözüm için 1 dk vortexer karıştırın ve adım 2.10-2,11 tekrarlayın.
- 25 mL steril deiyonize su ekleyin, 1 dk. için bir vortexer ile çözüm mix, solüsyon içeren temizleyicide (> 20 kHz) için 1 h ve 4 ° C'de gecede kuluçkaya.
- Çözüm 15 dk ya kadar donmuş-80 ° C dondurucuya yerleştirin veya flaş dondurma içinde sıvı nitrojen.
Dikkatli olun: kullanırken sıvı azot, koruyucu eldiven, bir yüz kalkanı ve bir önlük. - Bir kar gibi toz üretilen kadar (aşağıda 0.1 mBar ve -30 ° C) tüp 24-48 h için kuru dondurmak.
- Bu noktada, örnek 1H Nükleer manyetik rezonans, nerede HA omurga metakrilat proton (6.1 ve 5.6 ppm, tepeler), metil proton (1.9 ppm), göreli miktarı teyit edilmesi yoluyla saflık için sınayın. En az % 95 metakrilat metil proton için kabul edilebilir olduğu. 69
3. jel oluşumu ve 3D kapsülleme65
-
Coverslip ve kalıp hazırlama
- %2 50 mL distile su çözeltisi yapmak 3-(Trimethoxysilyl) propil metakrilat 50 mL konik santrifüj tüpü içinde.
- Çözüm ve kaya oda sıcaklığında 1 h için 18 mm cam coverslips yeri. En fazla 50 coverslips bir kez eklenebilir.
- Coverslips seri olarak her 100 mL deiyonize su 3 şişeler içinde daldırma durulayın.
- Bir vakum bir desiccator ve fırın ile bir gecede 40 ° C'de coverslips kuru.
- Hızlı bir şekilde bırakın bireysel coverslips % 70 alkol Forseps ile.
- Kurutma olmadan, her coverslip bir 12 iyi plaka bir kuyunun içine bırakın.
- Yıkama ve her şey steril deiyonize su (iyi başına 1 mL) ile Aspire edin.
- Her şey için 1 mL steril 2 µg /mL Poli-L-lizin (PLL) ekleyin ve için kuluçkaya > 2 h.
- PLL çözüm Aspire edin ve kuru hava coverslips sağlar.
- (Bkz: şekil 1) polydimethyl siloxane (PDMS) kalıpları %70 alkol ve üzerine her coverslip, merkezi yerde bırakın ve hava için kuru sağlar ve bir mühür kalıp ve cam arasında oluşturun.
- 10:1 oranında bir düz oturaklı polistiren tabakta PDMS Premiks reaktifler döküm tarafından PDMS kalıpları hazırlamak. Hazırlanan PDMS miktarı yaklaşık 1 mm kalınlığında bir levha verim için seçilir. Bir iç çapı 10 daire yumrukla sayfalarıyla kesmek PDMS formu wells için.
-
Hücre hazırlık
Not: Tüm adımlar protokolündeki bir biyogüvenlik kabini içinde steril tekniği ile gerçekleştirilir. Fosfat tamponlu tuz (PBS) çözüm pH 7.4 için tüm adımları için ayarlanır.- HAMA, hücre katma önce 24 saat 12 de levha 2 hafta birincil kültürler (Kimden adım 1,15) için orta yenileyin. 1 mL DMEM/F12 ekleyin (% 10 FBS ve % 1 PS) orta iyi başına.
- Hücreleri her 12-şey plaka için 12,5 mL seyreltik tripsin (% 0.25 tripsin-EDTA Seyreltilmiş % 30 DMEM/F12 medya ile) ve 25 mL DMEM/F12 hazırlamak (% 10 FBS ve % 1 PS) ve sıcak su banyosu içinde 37 ° C'de.
- Bir 10 mL serolojik pipet (> 0.5 mL iyi başına) kullanarak plakaları şartına orta toplamak, iyice kalan sıvı Aspire edin ve 1 mL seyreltik tripsin (%0.075 tripsin-EDTA) 20-30 dk bir kuluçka (37 ° C, % 5 CO2) kuyu başına kadar eski yerine koymak ile Konfluent hücre katmanı plaka ayırır.
- Askıya alınan hücre malzemesi (tek kayan bir görünür) 1 mL pipet ile yeniden elde etmek ve bir 15 mL konik santrifüj tüpü toplamak. Seyreltik DMEM/F12 eşdeğer hacmi ile (% 10 FBS ve % 1 PS) ve 200 x g, santrifüj süpernatant atarak oda sıcaklığında 2 dk için.
- Resuspend hücre Pelet 10 ml sıcak DMEM/F12 (% 10 PS) FBS ve % 1, 5 kez 10 mL pipet içeren hücreleri triturate ve santrifüj kapasitesi 200 x g 2 min için de.
- Süpernatant dikkatle boşaltmak, 5 mL hücrelerde yeniden askıya DMEM/F12 sıcak ve hücreleri 50 mL konik santrifüj tüpü aktarın.
- 10 mL 18 gauge iğne ile kullanarak, hücre çözümü 3 kez triturate ve süspansiyon bir 40 µm hücre elekten yeni konik santrifüj tüpüne filtre.
- Hücre süspansiyon 10 µL toplamak, 1: 100 sıcak DMEM/F12 ve bir otomatik hücre sayacı ile hücreleri hesaplama sulandırmak
- Bir 37 ° C su banyosunda kapsülleme adım kadar kuluçkaya.
-
Hücre kapsülleme
Not: Tüm adımlar protokolündeki bir biyogüvenlik kabini içinde steril tekniği ile gerçekleştirilir.- 3D için her 12-şey plaka hydrogels DMEM/F12 12,5 mL ve klimalı DMEM/F12 medya hücre hazırlık sırasında toplanan 12,5 mL sıcak.
- Methacrylated hyaluronik asit (HAMA) % 0.5 wt/vol. son bir konsantrasyon dağıtılması için bir konsantrasyon (% 2 wt/Vol); steril süzülmüş PBS bu HAMA gereken miktarı tartmak son konsantrasyonu 4 kat daha yüksek bir konsantrasyon hücreleri ve diğer Kimyasalları ilavesi karşılamak için kullanılmaktadır. Bir hydrogels 12 iyi tabak ~ 350 µL PBS 7 mg HAMA ile gerektirir.
- Solüsyon içeren temizleyicide (> 20 kHz) HAMA için 60 dk tamamen eriyene kadar çözümler.
- Bireysel % 10 çözümleri, Trietanolamin (çay) ve 1-vinil-2-pyrrolidinone (Long) ve 1 mM çözeltilerine Eozin Y (EY) 1 mL aliquots steril PBS pH 7.4 hazırlayın.
- Bir 12 de plaka, 1 x 10 son 1.4 mL karışımı7 hücreleri, % 0.5 wt/vol HAMA olun % 0,1 (350 µL % 2 wt/Vol), çay (14 µL % 10), % 0,1 NVP (14 µL % 10) ve 0,01 mM EY (1 mm 14 µL) ve % 20 Bazal lamina karışımı (280 µL stokunun). PBS kalan birimdir.
- Yavaşça çözüm mix ve 100 µL 1 mL ucu ile her PDMS kalıp içine pipet.
- Yüksek yoğunluklu yeşil LED ışık örnekleri ortaya çıkarmak (~ 520 nm, 60 mW, bir kapalı 20 cm x 20 cm x 20 cm kutu) oda sıcaklığında 5 min için.
- 1 mL sıcak şartına DMEM/F12 kuyu başına 12 iyi plakasına ekleyin.
- Her coverslip başparmak ve işaret parmağı arasında kavramak, yavaş yavaş jel yerinden değil dikkatli olmak eğri cımbızla PDMS kalıp soyulmak ve şartına orta ile bir kuyuya yerleştirin.
- Ek bir 1 mL ekleyin DMEM/F12 için her şey sıcak.
- Tabak %5 CO2 37 ° C'de 2 pipetting 1 mL her kuyulardan medya tarafından her hafta hücre ortam serinletici ve 1 mL DMEM/F12 ile değiştirme hafta kuluçkaya.
4. mikroskobu
-
Immunocytochemistry
Not: Bu örnekler görüntü için bir ters confocal mikroskobu kullanıldı ve ImageJ işlemek ve resimleri görüntülemek için kullanıldı. Microglia, astrocytes, oligodendrocytes ve çekirdeği,-ecek var olmak etiket-HAMA kültür 3 hafta sonra.- % 10 PBS tamponlanmış formalin (pH 7,0) 37 ° C banyosunda ısıtın.
Dikkat: formalin duman kukuIeta dışında kullanılabilir olsa da, bu malzeme doku ile reaktif ve bakım ve eldiven ile her zaman ele olmalıdır. Bu ayrı ayrı elden olmalıdır. - Dikkatle her şey için plakaları ve pipet 1 mL % 10 formalin medya Aspire edin.
- Plakayı 20 dk için % 5 CO2 37 ° C'de kuluçkaya.
- Her plaka sıvı Aspire edin, PBS (pH 7,4) 2 mL her kuyuya pipet ve 15dk için kuluçkaya.
- 4.1.4 iki kez tekrarlayın.
- Tabakları sıvı Aspire edin, PBS kuyu ile % 10 normal at serum (NHS) ve % 0,5 triton X-100 başına 1 mL ekleyin ve hafifçe en düşük hızda rock) 1 h için.
- 4.1.4 üç kez tekrarlayın.
- Sıvı Aspire edin ve PBS aşağıdaki karışımı kuyu başına 1 mL ekleyin: tavşan iyonize kalsiyum bağlama bağdaştırıcısı molekül (Iba1) 1:1, 000, gliyal fibrillary protein (GFAP'nin) 1:5, 000 tavuk, 2', 3'-döngüsel-nucelotide 3'-phophodiesterase (CNPase) 1:1, 000, % 1 NHS fare , ve % 0.1 Perfore yüzey aktif hücre. 4 ° C'de gecede, plaka mümkün olduğunca hafifçe sallanır kuluçkaya.
- 4.1.4 üç kez 1 h incubations ile arasındaki adımları yineleyin.
- Sıvı Aspire edin ve PBS içinde aşağıdaki karışımı kuyu başına 1 mL ekleyin: 647 nm heyecanlı eşek Anti-tavşan antikor 1: 200, 546 nm heyecanlı keçi Anti-tavuk antikor 1: 200, 488 nm heyecanlı eşek Anti-fare antikor 1: 200, %1 NHS, 1:1,000 mavi nükleer leke. 1 h, yavaşça plaka sallanan için oda sıcaklığında kuluçkaya.
- 4 üç kez 1 h incubations ile arasındaki adımları yineleyin.
- Hydrogels korumak için arabellek, Aspire edin ve onları 0.5 mL hücre montaj orta 1 dk. pipet montaj orta dışarı bırakın ve yavaşça bir coverslip cam arasındaki bir katmanda oluşturma jel, üstüne yerleştirin. Montaj orta küçük bir miktar hidrojel kurutma önlemek için coverslips açığa tarafına ekleyin.
Not: sorun giderme amacıyla, jelleri 4.1.11 adımda yansıması. daha fazla işleme önce uygun etiketleme görmek için.
- % 10 PBS tamponlanmış formalin (pH 7,0) 37 ° C banyosunda ısıtın.
-
Tarama elektron mikroskobu (SEM)
Not:, bu örnekler görüntüye bir Taramalı elektron mikroskobu hidrojel görselleştirmek için kullanıldı.- %2.5 oxazolidin ve % 2 paraformaldehyde PBS (0,1 M) içinde 37 ° C su banyosunda sabitleştirici karışımı ön ısı.
Dikkat: Bu reaktifler kurcalayarak büyük ölçüde reaktif ve bakım ve eldiven ile ele alınmalıdır. Onlar bir duman mahallede mümkün olduğu kadar ele ve ayrı ayrı bertaraf. - Hücre kültür plakaları ortamından Aspire edin ve 1 mL Önceden ısıtılmış sabitleştirici karışımı ekleyin.
- Plakayı 20 dk için % 5 CO2 37 ° C'de kuluçkaya.
- Tabakları gecede 4 ° C (buzdolabı/soğutucu) yerleştirin.
- Kuyulardan sabitleştirici çözüm Aspire edin ve PBS 1 mL ekleyin.
- Her plaka sıvı Aspire edin, PBS 2 mL her kuyuya ekleyin ve 15dk için kuluçkaya.
- 4.2.6 iki kez daha tekrarlayın.
- PBS Aspire edin ve her şey için PBS içinde tamponlanmış % 1 Osmiyum tetraoxide 1 mL ekleyin.
Not: örnekleri kurutulmuş kadar bu adımı ve sonraki adımların tümünü bir duman mahallede gerçekleştirilir. - Fiksasyon 30 dk. Osmiyum buharı sıvı üzerinden diğer örnekleri aynı plaka tamir edebilir için gerçekleşmesi izin; Bu nedenle, bölme örnekleri buna göre bu adım önce.
Dikkat: Osmiyum tetraoxide yüksek doku ile reaktif ve uçucu. Tehlikeli ve eldiven ile duman örtünün içinde ele alınmalıdır. O ve herhangi bir anında yıkanmış ayrı ayrı bertaraf olmalıdır. - 4.2.6 üç kez tekrarlayın.
- Sıvı Aspire edin ve aşağıdaki listeden, sırayla dehydrating karışımları eklemek ve belirtilen süre (oda sıcaklığında) kuluçkaya. Etanol (alkol), daha sonra hexamethyldisilazane (HMDS) takip yavaş yavaş ekleyerek başlayın. İçin her artırma bkz. Tablo 2 .
Not: HMDS eklerken, coverslips güçlü plastik için uygun ve kaldırmak çok zor hale. Bu HMDS ilk uygulama sonra cam kayma altında küçük bir plastik platform yerleştirerek önlenebilir. İkinci alkol kuluçka sonra numune çıkartılır ve kırık örnek dondurmak birkaç saniye için sıvı azot söndürülür. - Dikkatlice kurutulmuş örnekleri kaldırmak ve Taramalı elektron mikroskobu koçanları olan çift taraflı iletim tipi bant üzerinde örnekleri monte.
- Sputter altın en az miktarda örnekleriyle kat. Örnekleri yer tutucu ve 15 2 min için makine işletmek anne.
- %2.5 oxazolidin ve % 2 paraformaldehyde PBS (0,1 M) içinde 37 ° C su banyosunda sabitleştirici karışımı ön ısı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sinir dokusu ana bilgisayar yanıt ve yüksek işlem hacmi gliyal yara modellemek için bir 3D cep iskele ile Biyouyumlu, sitotoksik bir olay in situ oluşumu sırasında uğramak değil ve değiştirilebilir bir matris malzeme içinde vitro sistemi gerektirir hayırsever tepki gösterecek biyoaktif bileşenler ile. Bu amaçla, biz hyaluronik asit esaslı bir 3D cep iskele sistemi oluşturulmuş ve hücre-hücre etkileşimleri ve gliyal bioreactivity çalışmaya birincil karma gliyal hücre nüfus kapsüllü. Hücreleri ve İskele kısa bir görsel çalışma gerçekleştirildi. Oligodendrocytes (CNPase) yeşil de dahil olmak üzere hücre altgrupları morfolojisi microglia kırmızı (Iba1), astrocytes (sarı GFAP'nin), confocal immünfloresan mikroskobu (şekil 3Ai-II-CI-II) tarafından gösterilir. Kombine iskele ve hücre morfolojisi Ayrıca SEM (şekil 3Aiii-IV - Ciii-IV) tarafından gösterilir. Bu Albümdeki hem düşük (i ve III) ve yüksek (II ve IV) çözünürlük temsili fotoğraf gösterilir. 2D bir PLL coverslip kaplama (şekil 3A) bir 3D % 0,5 w/v HAMA İskele (şekil 3B) ve % 20 v/v Bazal lamina karışım % 0,5 w/v HAMA (şekil 3 c) karışımı için karşılaştırıldı. Bu 2D ve 3D hücre kültürü yanı sıra, bir biyolojik lamina için iskele tanıtma etkisini morfolojik farklılıkları göstermek için yapılmıştır. 3D bir yeniden yapılanma da ek bilgiler mevcuttur.
Hücre morfolojisi her hücre türü bir 3D platform giriş ile değişti. 2D yapisan kültür (PLL kaplı cam coverslips), oligodendrocytes genellikle yuvarlak ortaya çıktı ve GFAP'nin işlemler etiketi genellikle hafifçe ile bağlantı kurulan küçük ağ. Microglia diğer hücrelere küçük ve hücre vücutlarını uzak geçmemektedir küçük dallanma süreçleri vardı (< 20 µm). Astrocytes daha turnuvalarda, bazı diğerleri basık bir görünüm ve yüzey kat birkaç geniş süreçleri ile fibröz iken daha küçük hücre gövdeleri ve geniş ince, dallanma süreçler, Radyal bir Morfoloji olması şeklinde idi. 3D HAMA kültüründe oligodendrocytes daha küçük küreler dallı kümeler halinde ortaya çıktı. Microglia kaç işlemlerle yuvarlak ve astrocytes yuvarlak ya da Radyal tek bir küme gelen ağların içine dallanmış. Genel olarak, bu hücreler tek puan geçmek ya da HAMA yapmadan alanlarında kalır göründü başvurun diğer hücrelerle olan farklı olarak 2D kültür ve matrix ile sınırlı mobilite düşündüren. % 20 v/v Bazal lamina karışımı fotoğraf-polimerizasyon karışıma eklendiğinde, tüm gliyal alt türlerinden 3D platform ile entegre ve daha kapsamlı, etkileşimli dallı yapıları kurdu. Oligodendrocytes soğanlı işlemleri için sigara Bazal lamina karışım türleri Morfoloji Radyal benzer genişletilmiş ama Ayrıca süreçleri boyunca ince birbirine bağlı ağlar iskele dallanma astrocyte süreçlerin genişletmek için ortaya çıktı. Microglia ince işlemlerle daha tutarlı bir doku onların morfolojisi ile yayılmış bu hücre ağlar arasında dağınık. Genel olarak, özgürce HAMA Bazal lamina karışım içine entegre glia, potansiyel olarak karma maddeyi ya artan bağlılık yoluyla veya artan iskele yeni model yeteneği ile tüm üç türleri türleri Morfoloji öneririz.
SEM tarafından gözlenen zaman hücre morfolojisi confocal Filmler doğrulamaktadır görüldü. HAMA matris 10-50 µm gözenekli hafifçe yüzeyin altında görülen pürüzsüz bir yüzey ortaya çıktı. Hücrelerin HAMA yüzeyine yapışık ve ayrıca hafifçe katmanları altında görünür. Bu glia Bazal lamina karışımı eklenmesiyle, geniş ağ gözlemlendi ancak bu 2D kültüründe kaydetti karşılaştırılabilir türleri Morfoloji formu değil. Kalın astrocyte lifleri, microglia daha küçük kümeleri ile hem HAMA Bazal lamina karışım yüzey ve matris ile sorunsuz bir şekilde genişletme tespit edildi. Bu hafifçe hücreleri kendi istediğiniz biçimler kurulan için iskele değiştirme düşündüren hücrelerin etrafında katlanmış matris olarak görülebilir.
Şekil 1: şematik methacrylated hyaluronik asit (HAMA)-tabanlı 3D hücre kültür ve photopolymerization protokol. Gliyal hücreler (2 hafta birincil sıçan beyin kültür) HAMA ile karışık ve cam coverslip üzerinde polydimethylsiloxane (PDMS) kalıp içine pipetted. Bu karışımı bir yüksek yoğunluklu yeşil LED ışığı hidrojel 5 min için polimerize maruz kalmaktadır. Kalıp kaldırılır ve jel ortamda inkübe. Temsilcisi hücreler microglia (kırmızı), astrocytes (sarı) ve oligodendrocytes (yeşil) içerir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: 1. gün Sprague Dawley rat yavru beyin diseksiyon. Bütün beyin(a)cortices ve beyincik (B), meninkslerde (C), peeling meninkslerde forseps (D) ile tek bir korteks ve meninge ücretsiz korteks (E) diseksiyon görüntülerini. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: İmmünfloresan confocal (ı-II) ve elektron (III-IV) Filmler karışık glia hücre popülasyonlarının 2D PLL kaplamalar(a), (B) HAMA ve HAMA Bazal lamina karışımı (C), tarama. (İ, III) daha düşük ve daha yüksek (II, IV) büyütme resim gösterilir. Etiketleri Iba1 için microglia, GFAP'nin astrocytes, CNPase oligodendrocytes için yeşil ve bir Höchst nükleer leke için sarı kırmızılı içerir. Ölçek çubukları confocal görüntüler için 25 µm ve 50 (III) ve elektron Filmler tarama için 20 µm (IV) =. Hydrogels % 0,5 w/v, ve Bazal lamina karışımı Hacmen % 20 idi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tamamlayıcı şekil 1: 3D immünfloresan micrographic yeniden inşası HAMA Bazal lamina karışımı ile karışık glia hücre popülasyonlarının HAMA Bazal lamina karışımı. Etiketleri Iba1 için microglia, GFAP'nin astrocytes, CNPase oligodendrocytes için yeşil ve bir Höchst nükleer leke için sarı kırmızılı içerir. Hydrogels % 0,5 w/v, ve Getrex Hacmen % 20 idi. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
| HAMA | Bazal Lamina | NVP | ÇAY | EY | |
| Çalışma konsantrasyonu | %0,5 w/v | % 20 v/v | %0.10 | %0.10 | .01 mM |
| 12-şey plaka | % 2 w/v | % 100 w/v | % 10 v/v | % 10 v/v | 1 mM |
| 1.4 mL toplam | 350 ΜL | 280 ΜL | 14 ΜL | 14 ΜL | 14 ΜL |
Tablo 1: Örnek hücre kapsüllemenin.
| Bileşen | İçerik | Kuluçka süresi |
| Alkol | % 30 | 30 dk |
| Alkol | % 50 | 30 dk |
| Alkol | % 70 | 30 dk |
| Alkol | % 90 | 20 dk |
| Alkol | % 100 | 20 dk |
| Alkol | % 100 | 20 dk |
| EtOH:HMDS | 75:25 | 20 dk |
| EtOH:HMDS | 50:50:00 | 20 dk |
| EtOH:HMDS | 25:75 | 20 dk |
| HMDS | % 100 | 20 dk |
| HMDS | % 100 | Bir gecede |
Tablo 2: Yavaş yavaş artışlarla alkol ve su kaybı HMDS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modeli gliyal bioreactivity 3D kültür sisteme ve gliyal skarlasma işlemi üreten hedefe doğru biz birincil kültürlü microglia, astrocytes ve oligodendrocytes destekleyebilir ve sağlam hücre karakterizasyonu sağlayan bir sistem geliştirdik morfoloji ve hücre-hücre etkileşimler. Gösterilen Filmler her hücre türünün morfolojisi 2D, 3D-HAMA ve 3D HAMA Bazal lamina karışımı platformları ile belirgin farklı. 2D sistem Morfoloji belirgin yüzey düzlemde önyargılı ama 3D HAMA karşılaştırıldığında, microglia ve astrocytes oligodendrocyte kümeleri dışında Matrix'in genellikle küçük edildi. Tarama elektron Filmler içinde hücreleri genellikle daha fazla boyunca üzerinde HAMA şeklinde idi. Bu büyük ölçüde matris için hareket ve serbest dolaşımı ve büyüme süreçleri değiştirmek için sınırlı kapasite ile kapsüllü hücreleri nedeniyle olabilir. HAMA hücre akıbet hem astrocytes hem de oligodendrocytes için tipik olarak Radyal. Bunlar hücreleri iken genişletilmiş işlemler, kendi kuruluş öneririz hareketlerinden matris ve yetenek sahip diğer hücrelerin etkileşim boyunca sınırlıydı. Buna ek olarak, önceki çalışma donma kırılmış HAMA bu eksikliği sonucu65,70açıklayabilir birbirine bağlı ağ desteği olmadan, gözenekli olmasını göstermiştir. Bazı bu hücre için matrisin içinde korunmuş kalan photopolymerization, hayatta değildi, canlılığı sistematik olarak değerlendirildi ancak bizim önceki iş ve % 80'i (% 0,5 w/v) bir hafta65boyunca kaldı mümkün olabilir.
3D kültür matris hücre etkileşim artırmak için biz bir Bazal lamina karışımı bir Biyouyumlu ve değiştirilebilir matris bileşeni olarak tanıttı. Matris hücre entegrasyon belirgin, kapsamlı işlemleri 2D kültür ve 3D HAMA göre gösterilen tüm hücre tipleri ile gelişmiş olabilir bulundu. Bazal lamina karışımı bir değişiklik bazal lamina bileşenlerden oluşur ve öncelikle nöral kök hücre öncüleri71gliyal farklılaşma desteklemek için formüle edilmiştir. Gliyal hücreler Bazal lamina karışımı ve daha sonra çevredeki 3D matris cevap verdi ama entegrasyon ölçüde sağlıklı bir doku gibi çevre öneriyor beklenmedik değildi. HAMA HAMA Bazal lamina karışıma karşılaştırarak, hidrojel Morfoloji belirgin farklı görünmüyor, bu nedenle hücreleri daha fazla aktif olarak bu remodeling olabilir. Bu biyoaktif bileşen ekleme kolaylık göz önüne alındığında, bu kültür koşulları nöronlar için lehine farklı laminas ve/veya protein ipuçları kullanmak için düşünülemez değil. Bir potansiyel gelecek yönde bu sistem etkili myelination veya nöro-inflamatuar yaralanma modelleri çeşitli karışık glia ile birlikte sinirsel ataları nöronlar ayırt etmek için kullanılabilir.
Ciddi ve zararlı CNS yaralanma veya biomaterial reddedilmesi durumunda, yerleşik doku inflamatuar reaksiyonları ateş ve demiyelinizasyon exacerbating yetenekli başlatır. Bu genellikle sitenin yenilenme engelleyen yaralanma bölümlemek için gliyal yara oluşumuna neden olur. Bu çalışmada, ilk hücresel yanıt gliyal yara oluşumu arkasında modelleme niyeti ile bir methacrylated fotoğraf polimerli hyaluronik asit tabanlı 3D iskele için yöntemleri ayrıntılı; mikroglial reaktivite, astrocyte işe alım ve hipertrofisi ve oligodendrocyte yaralanma ve para çekme. Bir 3D cep iskele tüm üç gliyal hücre tipleri dahil etmek için dizayn edilmiştir ve daha bir çok bileşenli Bazal lamina karışımı ile güncellenmiştir. Bu confocal ve tarama elektron görüntüleme, hücre içinde HAMA kapsüllü ve daha iyi Bazal lamina karışımı tanıttığında entegre başardık mikroskobu tarafından belirlendi. Bu sonuçlar için birkaç yeni uygulamalar neden olabilir. HAMA tek başına burada hücre-hücre etkileşim için sınırlama niyeti olduğu veya çalışma yeteneklerini ilaç dağıtım jel bir uyuşturucu yüklü Difüzyon sınırlı matrisi kullanarak ortak kültür sistemleri oluşturmak için hizmet verebilir. Hydrogels Bazal lamina karışımı HAMA matris birleşmeyle daha tutarlı bir doku benzeri ortamda akut iltihabı, gliosis veya gliyal skarlasma modelleme yetenekli olanak ve daha da yüksek üretilen iş karakterizasyonu gliyal sağlar bioreactivity implantlar, uyuşturucu ve aygıt geliştirme ve azaltmak ve inflamatuar yaralanma kurtarmak için diğer stratejileri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar için finansal destek NSERC, CFI, AIHS, Alberta sağlık hizmetleri ve Davey bağış beyin araştırmaları için minnettarız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Materials for HAMA synthesis and photopolymerization | |||
| Hyaluronic acid (HA) | Sigma-Aldrich | 53747-10G | Streptococcus equi, MW: 1.5 - 1.8 X 10^6 |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 275585-100ML | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| Ethanol (EtOH) | Commerical Alcohols Inc. | Anhydrous | |
| Phosphate buffered saline (pH 7.4) tablets | Fisher Scientific | 18912014 | |
| Triethanolamine (TEA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| 1-Vinyl-2pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | |
| EosinY (EY) | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 440159-100ML | |
| Beaker (100 mL) | Corning | 1000-100 | |
| Beaker (500 mL) | Corning | 1000-600 | |
| pH paper (Labstick) | Sigma-Aldrich | 9580 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2. Materials for glial cell isolation and cell culture | |||
| P1-2 Sprague Dawley rat pups | Charles River | CD Sprague Dawley rat strain code 001 | |
| Dissector scissors - slim blades (small) | Fine Science Tools | 14081-09 | |
| Surgical scissors - Toughcut (large) | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11521-10 | |
| Curved fine forceps (Dumont #7) | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14170-112 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
| Penicillin-streptomycin (PS) | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 12483-020 | |
| 0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Gibco | 25200-072 | |
| Poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P-6282 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-5 | |
| 12 well Tissue culture treated plates (Cellstar) | Greiner Bio-One | 665 108 | |
| 10 mL serological pipette | Fisher Scientific | 13-676-10F | |
| 25 mL serological pipette | Fisher Scientific | 12-676-10K | |
| Petri dish (60 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri dish (100 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Microscope Coverslip (18 mm) | Fisher Scientific | 12-545-100 18CIR | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3. Materials for microscopy (confocal and scanning electron microscopy) | |||
| Mouse monoclonal anti-CNPase | abcam | ab6319 | |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako Laboratory Chemicals | 019-17741 | |
| Chicken anti-GFAP | abcam | ab4674 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | |
| Fluoromount-G | Fisher Scientific | 00-4958-02 | |
| Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Buffered (10%) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Paraformaldehyde | Electon Microscopy Sciences | 157-8 | Buffered (8%) |
| Guteraldehyde | Electon Microscopy Sciences | 16019 | Buffered (8%) |
| Osmium tetraoxide | Electon Microscopy Sciences | 19152 | Buffered (2%) |
| Hexamethyldilazane (HMDS) | Electon Microscopy Sciences | 16700 | |
| Ethanol (EtOH) | Electon Microscopy Sciences | 15055 | Anhydrous |
| Microscope Slide (25 X 75 X 1 mm) | VWR International | 48311-703 |
References
- Shih, J. J., Krusienski, D. J., Wolpaw, J. R. Brain-Computer Interfaces in Medicine. Mayo Clin. Proc. 87, 268-279 (2012).
- Kennedy, P. R., Bakay, R. A. Restoration of neural output from a paralyzed patient by a direct brain connection. Neuroreport. 9, 1707-1711 (1998).
- Kennedy, P. R., Bakay, R. A., Moore, M. M., Adams, K., Goldwaithe, J. Direct control of a computer from the human central nervous system. IEEE Trans. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 8, 198-202 (2000).
- Mayberg, H. S., et al. Deep Brain Stimulation for Treatment-Resistant Depression. Neuron. 45, 651-660 (2005).
- Dougherty, D. D., et al. A Randomized Sham-Controlled Trial of Deep Brain Stimulation of the Ventral Capsule/Ventral Striatum for Chronic Treatment-Resistant Depression. Biol. Psychiatry. 78, 240-248 (2015).
- Bamford, J. A., Marc Lebel, R., Parseyan, K., Mushahwar, V. K. The Fabrication, Implantation, and Stability of Intraspinal Microwire Arrays in the Spinal Cord of Cat and Rat. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 25, 287-296 (2017).
- Holinski, B. J., et al. Intraspinal microstimulation produces over-ground walking in anesthetized cats. J. Neural Eng. 13, 056016 (2016).
- Toossi, A., Everaert, D. G., Azar, A., Dennison, C. R., Mushahwar, V. K. Mechanically Stable Intraspinal Microstimulation Implants for Human Translation. Ann. Biomed. Eng. 45, 681-694 (2017).
- Saigal, R., Renzi, C., Mushahwar, V. K. Intraspinal microstimulation generates functional movements after spinal-cord injury. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 12, 430-440 (2004).
- Lau, B., Guevremont, L., Mushahwar, V. K. Strategies for generating prolonged functional standing using intramuscular stimulation or intraspinal microstimulation. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 15, 273-285 (2007).
- Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. J. Neurosci. Methods. 148, 1-18 (2005).
- Sierra, A., et al. Surveillance, phagocytosis, and inflammation: how never-resting microglia influence adult hippocampal neurogenesis. Neural Plast. 2014, 610343 (2014).
- Holm, T. H., Draeby, D., Owens, T. Microglia are required for astroglial Toll-like receptor 4 response and for optimal TLR2 and TLR3 response. Glia. 60, 630-638 (2012).
- Gao, Z., et al. Reciprocal modulation between microglia and astrocyte in reactive gliosis following the CNS injury. Mol. Neurobiol. 48, 690-701 (2013).
- Jin, X., Yamashita, T. Microglia in central nervous system repair after injury. J. Biochem. (Tokyo). 159, 491-496 (2016).
- Griffith, R. W., Humphrey, D. R. Long-term gliosis around chronically implanted platinum electrodes in the Rhesus macaque motor cortex. Neurosci. Lett. 406, 81-86 (2006).
- Biran, R., Martin, D. C., Tresco, P. A. Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays. Exp. Neurol. 195, 115-126 (2005).
- Fawcett, J. W., Asher, R. A. The glial scar and central nervous system repair. Brain Res. Bull. 49, 377-391 (1999).
- Szarowski, D. H., et al. Brain responses to micro-machined silicon devices. Brain Res. 983, 23-35 (2003).
- Park, D. -W., et al. Graphene-based carbon-layered electrode array technology for neural imaging and optogenetic applications. Nat. Commun. 5, 5258 (2014).
- McAllister, J. P., et al. Biocompatibility of Penetrating Recording Electrode Arrays Implanted Chronically in the Feline Visual Cortex. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 1528 (2005).
- Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. J. Neurochem. 109, 117-125 (2009).
- Chung, H., et al. In vivo Biocompatibility and Stability of Polyimide Microelectrode Array for Retinal Stimulation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 5072 (2003).
- Aregueta-Robles, U. A., Woolley, A. J., Poole-Warren, L. A., Lovell, N. H., Green, R. A. Organic electrode coatings for next-generation neural interfaces. Front. Neuroengineering. 7, (2014).
- Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24, 4337-4351 (2003).
- Yang, J., et al. Ordered surfactant-templated poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) conducting polymer on microfabricated neural probes. Acta Biomater. 1, 125-136 (2005).
- Ludwig, K. A., et al. Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) polymer coatings facilitate smaller neural recording electrodes. J. Neural Eng. 8, 014001 (2011).
- Kim, D. -H., Abidian, M., Martin, D. C. Conducting polymers grown in hydrogel scaffolds coated on neural prosthetic devices. J. Biomed. Mater. Res. A. 71, 577-585 (2004).
- George, P. M., et al. Fabrication and biocompatibility of polypyrrole implants suitable for neural prosthetics. Biomaterials. 26, 3511-3519 (2005).
- Stauffer, W. R., Cui, X. T. Polypyrrole doped with 2 peptide sequences from laminin. Biomaterials. 27, 2405-2413 (2006).
- Green, R. A., Lovell, N. H., Wallace, G. G., Poole-Warren, L. A. Conducting polymers for neural interfaces: challenges in developing an effective long-term implant. Biomaterials. 29, 3393-3399 (2008).
- Gumbiner, B. M. Cell adhesion: the molecular basis of tissue architecture and morphogenesis. Cell. 84, 345-357 (1996).
- Chan, G., Mooney, D. J. New materials for tissue engineering: towards greater control over the biological response. Trends Biotechnol. 26, 382-392 (2008).
- Green, R. A., Lovell, N. H., Poole-Warren, L. A. Impact of co-incorporating laminin peptide dopants and neurotrophic growth factors on conducting polymer properties. Acta Biomater. 6, 63-71 (2010).
- Green, R. A., Lovell, N. H., Poole-Warren, L. A. Cell attachment functionality of bioactive conducting polymers for neural interfaces. Biomaterials. 30, 3637-3644 (2009).
- Koss, K. M., Unsworth, L. D. Neural tissue engineering: Bioresponsive nanoscaffolds using engineered self-assembling peptides. Acta Biomater. 44, 2-15 (2016).
- Koss, K. M., et al. Brain biocompatibility and microglia response towards engineered self-assembling (RADA)4 nanoscaffolds. Acta Biomater. 35, 127-137 (2016).
- Evans, A. J., et al. Promoting neurite outgrowth from spiral ganglion neuron explants using polypyrrole/BDNF-coated electrodes. J. Biomed. Mater. Res. A. 91, 241-250 (2009).
- Yu, X., Bellamkonda, R. V. Tissue-engineered scaffolds are effective alternatives to autografts for bridging peripheral nerve gaps. Tissue Eng. 9, 421-430 (2003).
- Houweling, D. A., Lankhorst, A. J., Gispen, W. H., Bär, P. R., Joosten, E. A. Collagen containing neurotrophin-3 (NT-3) attracts regrowing injured corticospinal axons in the adult rat spinal cord and promotes partial functional recovery. Exp. Neurol. 153, 49-59 (1998).
- Wells, M. R., et al. Gel matrix vehicles for growth factor application in nerve gap injuries repaired with tubes: a comparison of biomatrix, collagen, and methylcellulose. Exp. Neurol. 146, 395-402 (1997).
- Barras, F. M., Pasche, P., Bouche, N., Aebischer, P., Zurn, A. D. Glial cell line-derived neurotrophic factor released by synthetic guidance channels promotes facial nerve regeneration in the rat. J. Neurosci. Res. 70, 746-755 (2002).
- Fine, E. G., Decosterd, I., Papaloïzos, M., Zurn, A. D., Aebischer, P. GDNF and NGF released by synthetic guidance channels support sciatic nerve regeneration across a long gap. Eur. J. Neurosci. 15, 589-601 (2002).
- Burdick, J. A., Ward, M., Liang, E., Young, M. J., Langer, R. Stimulation of neurite outgrowth by neurotrophins delivered from degradable hydrogels. Biomaterials. 27, 452-459 (2006).
- Piantino, J., Burdick, J. A., Goldberg, D., Langer, R., Benowitz, L. I. An injectable, biodegradable hydrogel for trophic factor delivery enhances axonal rewiring and improves performance after spinal cord injury. Exp. Neurol. 201, 359-367 (2006).
- Jain, A., Kim, Y. -T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27, 497-504 (2006).
- Taylor, S. J., Sakiyama-Elbert, S. E. Effect of controlled delivery of neurotrophin-3 from fibrin on spinal cord injury in a long term model. J. Control. Release Off. J. Control. Release Soc. 116, 204-210 (2006).
- Jhaveri, S. J., et al. Release of nerve growth factor from HEMA hydrogel-coated substrates and its effect on the differentiation of neural cells. Biomacromolecules. 10, 174-183 (2009).
- Lee, A. C., et al. Controlled release of nerve growth factor enhances sciatic nerve regeneration. Exp. Neurol. 184, 295-303 (2003).
- Matsumoto, K., et al. Neurite outgrowths of neurons with neurotrophin-coated carbon nanotubes. J. Biosci. Bioeng. 103, 216-220 (2007).
- Khaled, I., et al. A Flexible Base Electrode Array for Intraspinal Microstimulation. IEEE Trans. Biomed. Eng. 60, 2904 (2013).
- David-Pur, M., Bareket-Keren, L., Beit-Yaakov, G., Raz-Prag, D., Hanein, Y. All-carbon-nanotube flexible multi-electrode array for neuronal recording and stimulation. Biomed. Microdevices. 16, 43-53 (2014).
- Hsu, H. -L., et al. Flexible UV-ozone-modified carbon nanotube electrodes for neuronal recording. Adv. Mater. Deerfield Beach Fla. 22, 2177-2181 (2010).
- Lacour, S. P., et al. Flexible and stretchable micro-electrodes for in vitro and in vivo neural interfaces. Med. Biol. Eng. Comput. 48, 945-954 (2010).
- Lin, C. -M., Lee, Y. -T., Yeh, S. -R., Fang, W. Flexible carbon nanotubes electrode for neural recording. Biosens. Bioelectron. 24, 2791-2797 (2009).
- Richter, A., et al. A simple implantation method for flexible, multisite microelectrodes into rat brains. Front. Neuroengineering. 6, 6 (2013).
- Rousche, P. J., et al. Flexible polyimide-based intracortical electrode arrays with bioactive capability. IEEE Trans. Biomed. Eng. 48, 361-371 (2001).
- Polikov, V. S., Block, M. L., Fellous, J. -M., Hong, J. -S., Reichert, W. M. In vitro model of glial scarring around neuroelectrodes chronically implanted in the CNS. Biomaterials. 27, 5368-5376 (2006).
- Sohal, H. S., Clowry, G. J., Jackson, A., O'Neill, A., Baker, S. N. Mechanical Flexibility Reduces the Foreign Body Response to Long-Term Implanted Microelectrodes in Rabbit Cortex. PloS One. 11, e0165606 (2016).
- Moshayedi, P., et al. The relationship between glial cell mechanosensitivity and foreign body reactions in the central nervous system. Biomaterials. 35, 3919-3925 (2014).
- Hopkins, A. M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. 3D in vitro modeling of the central nervous system. Prog. Neurobiol. 125, 1-25 (2015).
- Pöttler, M., Zierler, S., Kerschbaum, H. H. An artificial three-dimensional matrix promotes ramification in the microglial cell-line, BV-2. Neurosci. Lett. 410, 137-140 (2006).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. 0, 42-51 (2014).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12, 207-218 (2014).
- Jeffery, A. F., Churchward, M. A., Mushahwar, V. K., Todd, K. G., Elias, A. L. Hyaluronic acid-based 3D culture model for in vitro testing of electrode biocompatibility. Biomacromolecules. 15, 2157-2165 (2014).
- Fitch, M. T., Silver, J. CNS Injury, Glial Scars, and Inflammation. Exp. Neurol. 209, 294-301 (2008).
- Churchward, M. A., Todd, K. G. Statin treatment affects cytokine release and phagocytic activity in primary cultured microglia through two separable mechanisms. Mol. Brain. 7, 85 (2014).
- Lai, A. Y., Todd, K. G. Differential regulation of trophic and proinflammatory microglial effectors is dependent on severity of neuronal injury. Glia. 56, 259-270 (2008).
- Hachet, E., Van Den Berghe, H., Bayma, E., Block, M. R., Auzély-Velty, R. Design of biomimetic cell-interactive substrates using hyaluronic acid hydrogels with tunable mechanical properties. Biomacromolecules. 13, 1818-1827 (2012).
- Eslami, M., Javadi, G., Agdami, N., Shokrgozar, M. A. Expression of COLLAGEN 1 and ELASTIN Genes in Mitral Valvular Interstitial Cells within Microfiber Reinforced Hydrogel. Cell J (Yakhteh). , (2015).
- Shaltouki, A., Peng, J., Liu, Q., Rao, M. S., Zeng, X. Efficient Generation of Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells in Defined Conditions. STEM CELLS. 31, 941-952 (2013).
