Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

שיפור תרבויות הידרוג 3D של תאי גליה העיקרי עבור במבחנה דוגמנות של Neuroinflammation

Published: December 8, 2017 doi: 10.3791/56615
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,3, 1,2,4, 3, 1,2,5
1Department of Psychiatry, University of Alberta, 2Alberta Innovates-Health Solutions Interdisciplinary Team in Smart Neural Prostheses (Project SMART), University of Alberta, 3Department of Chemical and Materials Engineering, University of Alberta, 4Division of Physical Medicine and Rehabilitation, University of Alberta, 5Centre for Neuroscience, University of Alberta

Summary

במסמך זה, אנו מציגים עבור התרבות תלת-ממד של עכברוש פרוטוקול תאי המוח-derived עכשיו, דונלד, לרבות האסטרוציטים, מיקרוגלייה oligodendrocytes להפוך. נדגים התרבות התא הראשי, סינתזה הידרוג חומצה היאלורונית methacrylated (חמה), HAMAphoto-הפילמור ותא כימוס, דוגמת עיבוד עבור הדמיה מיקרוסקופית אלקטרונים קונאפוקלית של סריקה.

Abstract

מערכת העצבים המרכזית, רבים פציעות חריפה, הפרעות ניווניות, באותה מידה כמו מושתל התקנים או biomaterials הנדסה לאחור כדי לשפר את התוצאה הפונקציה לאותה התוצאה: דלקת עודף מוביל gliosis, cytotoxicity, ו/או היווצרות צלקת גליה קולקטיבי להחריף פציעה או למנוע שחזור בריא. עם הכוונה ליצירת מערכת דגם גליה הצלקת היווצרות והלימוד תהליכים דלקתיים, יש לנו שנוצר לפיגום תא 3D המסוגל העיקרי בתרבית תאי גליה: מיקרוגלייה לווסת את התגובה גוף זר, ליזום אירוע דלקתיות, האסטרוציטים מגיבים ליצירת צלקת סיביים, ו אוליגודנדרוציטים כי הם בדרך כלל פגיע לפגיעה דלקתית. העבודה הנוכחית מספק שיטה צעד אחר צעד מפורט עבור פבריקציה נוספת, תרבות, מיקרוסקופיים אפיון לפיגום מבוססי חומצה היאלורונית הידרוג 3D עם עכברוש שעברו אנקפסולציה המוח-derived גלייה. יתר על כן, פרוטוקולים עבור אפיון של כימוס תא, לגרדום הידרוג על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי immunofluorescence וסריקת מודגמות, כמו גם היכולת לשנות לגרדום עם מצעים ביו, עם התאגדות של תערובת מסחרית פרופריה הבסיס לאינטגרציה תא משופרת.

Introduction

דלקת של מערכת העצבים המרכזית (CNS) כבר מזמן נחשב סימן היכר של אקוטי (למשל, שבץ איסכמי, מוח טראומטית, פגיעה בחוט השדרה) כרונית (כגון אלצהיימר, פרקינסון של ומחלות של הנטינגטון) פגיעה CNS, אבל הוא מוכר יותר ויותר כתורם סיבתי ועד מנוטלי הפרעות ניווניות. מתמשכת או דלקת לא מתאים יכול לגרום פגיעה עצבית ו demyelination(טרשת נפוצה) , ולהשפיע באופן שלילי התפתחות המוח (למשל, סכיזופרניה, אוטיזם) ומצבי רוח (למשל, דיכאון, חרדה הפרעה דו קוטבית). יתר על כן, הרומן אסטרטגיות טיפוליות באמצעות מכשירי מושתלת (למשל., מוח-מחשב-ממשקים1,2,3, מוחי עמוק גירוי4,5, תוך microstimulation6,7,8,9,10) ליצור תגובה דלקתית צפוי על הממשק בין ההתקן לבין מערכת העצבים וכתוצאה מכך תגובת ומבחינה שיכולים לגרום לאובדן יעילות או התקן כשל במהלך תקופת החיים של השתל11. דלקת מערכת העצבים הוא בדרך כלל ביוזמת מיקרוגלייה, אשר מתפקד בתור תאים חיסוניים תושב של מערכת העצבים אחראי מעקב רקמות והרכבה התגובה גוף זר (שנסקרה12). בהתאם לחומרת עלבון, האות מיקרוגלייה ואת גיוס נוספים התא סוגי פגיעה באתר. באופן ספציפי, מיקרוגלייה להפעיל את האסטרוציטים, אשר בתורו לשמש משני תאים דלקתיים ומהווים מחסום הגנה החוצץ צפופה שתכיל13,אתר פגיעה14. מיקרוגלייה יכול ליזום גם של המפל פעילות התאים של המערכת החיסונית היקפיים, אשר עלולה לגרום להתמוטטות של BBB להתיר חדירה המערכת החיסונית (נבדקה תוך התייחסות15).

במקרה של התקנים מושתל לתוך מערכת העצבים, רקמת נזק הנובע התקן הכניסה, כמו גם המשך הנוכחות של המכשיר זר עשוי ליזום תהליך הנקרא גליה הצטלקות. בתהליך זה, מיקרוגלייה להגר, להתרבות באתר של פציעה. הם גם ליזום שחרורו של גורמים דלקתיים כדי לנטרל איומים פוטנציאליים ולגייס גלייה נוספים. לאחר מכן, האסטרוציטים מופעל הפך היפרטרופית, להתחיל לבצע את המכשיר מושתל להקים מכשול סיביים רציפה16. איתות דלקתיות משמש גם כדי לקדם את נסיגתם של תהליכים עצביים מסביבתן של השתל, בסופו של דבר ומגייסת fibroblasts כדי לחזק את הצלקת גליה המתפתח17. Oligodendrocytes להפוך, אחראי לנדן נוירונים בהמיאלין לשיפור מוליכות, אינם שורדים תהליך זה, התאים רחוקים הם למחיצות של השתל על ידי צלקת18. גליה צלקות במידה רבה מפחית את תפקוד ואת משך חיים של התקנים מושתל, במיוחד עבור הקלטה אלקטרודות, ומגישה בסופו של דבר כדי להגביל את הפונקציונליות של ממשקים עצביים19.

מספר גישות נוצלה כדי להגדיל את התאימות ואת ממשק לפעילות התקנים מושתל22,2321,20,מערכת העצבים המרכזית. סקירה מקיפה זמין על עיצוב ממשקים עצביים אלה24מסתיימים. האסטרטגיות הבולטים כוללים סביב האלקטרודה עם ציפויים תואם כגון polyelthyleneglycol (PEG), חומצות polylactic-co-גליקולי (PLGA)25, או שיפור האלקטרודה עם פולימרים מוליכים כגון פולי (אתילן dioxythiophene) (PEDOT), ו- polypyrrole (PPy)26,27,28,29,30,31. Bioactive ציפויים גם יש כבר מועסקים לספק רמזים על רקמה עצבית באמצעות ליגנדים נגזר מטריצה חוץ-תאית, כולל collagens, fibronectins, חומצות היאלורונית32,33,34 ,35,36,37. Bioactivity של ציפויים אלה נחקרו עוד יותר עם מערכות לשחרור פקטורי גדילה כדי לחקות את התא טבעי הפרשות30,38,39,40,41 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50. בעת ובעונה אחת, כמה קבוצות מחקר שבחרו לעצב מחדש את הגיאומטריה אלקטרודה, גמישות ויכולת הרכב כדי להקטין את ההתאמה מכני בין ההתקן לבין רקמת51,52,53 ,54,55,56,57. בסך הכל, אסטרטגיות אלו הובילו מבטיח שיפורים רבים בהתקנים פנים עצבית הדור הבא, אולם התאימות לטווח ארוך היא נושא מתמשך התקדמות עשוי להיות הכבידו על ידי מודלים מורכב ולגזול vivo .

גישות מבוססות על מודל בעלי חיים ניתן להגביל את התפוקה ניסיוני, להגדיל את עלויות של בדיקות התאימות אלקטרודה. במבחנה ניגש באמצעות תרבית תאים קונבנציונאלי טכניקות מציעים חלופה חסכונית יותר אבל להיכשל כדי לסכם את רוב המורכבות של האינטראקציה בין ההתקן לבין רקמת58. בפרט, בדיקה של ציפוי פני השטח באמצעות גבולות התרבות התא 2D הדגמים של אלקטרודה הגיאומטריה ואת ההשפעה של אי-התאמה מכני, micromotion חשבתי לתרום ליצירת תגובה מארח לתרום התקן כשל59 , 60.

כדי להתגבר על בעיות הקשורות תרבית תאים 2D, הידרוג תרביות של תאים עצביים פותחו עבור מגוון רחב של יישומים, מחקרים61, לכוון תאי העצבים בידול62, כדי להבין את המחלה מסלולים63,64, או שכבתית ב תרבות שיתוף עם סוגי תאים אחרים דגם נדידת תאים, neuroprotection, או דגם רקמה microenvironments61. Hydrogels נוצרות בקלות בגדלים שונים, גיאומטריות ניתן לשלב סוגים רבים ושונים של תרביות תאים ראשי או מונצחים, ויש לבצע ניתוח על ידי טכניקות נפוצות כגון מיקרוסקופ קונפוקלי זריחה. כדי ליצור מודל של תהליך הצטלקות גליה, יש לאחרונה פיתחה ואנו אפיינה מערכת הידרוג 3D מבוסס חומצה היאלורונית לניסויים תפוקה גבוהה של התגובה גליה מושתל אלקטרודות (איור 1)65. מערכת זו היא בעלת מספר יתרונות ברורים: 1) ראשי תאי גליה (מיקרוגלייה, האסטרוציטים, ו אוליגודנדרוציטים) כמוסות במטריצה תלת-ממדית מורכבת של פולימרים של חומצה היאלורונית, המהווה מרכיב אנדוגני מטריצה חוץ-תאית; 2 נוקשות מטריקס) יכול להיות 'מכוון' ליצור מחדש את התכונות המכאניות של המוח או חוט השדרה רקמות; . ו-3) ניתן לכלול תאים המטריצה בגישה ספסל-העליון מהירה באמצעות photopolymerization עם אור ירוק, הגבלת רעילות במהלך אנקפסולציה. מערכת זו מאפשרת תכונות מפתח של הביו ויוו : התקנים מוכנסים את הידרוג בצורה דומה לכל רקמות, ואת התגובה התאית למכשירים מושתל מנוטרים עבור מגוון רחב של פרמטרים65. אלה כוללים מכני אי-התאמה בין התקנים של ציפויים הידרוג של מבנים שונים פולסים גירוי חשמלי. מערכת זו כוללת גם אוליגודנדרוציטים מבשרי קרובים, לעתים קרובות מגויס ב צלקות גליה ובהווה. שלהם נזק, מוות phagocytosis מאת מיקרוגלייה הן מאוד מעידה על פגיעה דלקתית, כמו דוגמנית מופחת הצטלקות או שחזור, יש להם את היכולת להפגין re-myelination של הנוירונים66.

במסמך זה אנו נתאר שיטת סינתזה ועל היווצרות היברידית חומצה היאלורונית hydrogels בשילוב עם ניסוחים קרום המרתף זמינים מסחרית כדי לשפר את התא ההתאגדות. עוד יותר, אנו נדגים שילוב של ראשי תאי גליה בתרבית (מיקרוגלייה, האסטרוציטים, ו אוליגודנדרוציטים) וניתוח של תרבות צמיחה באמצעות immunocytochemistry ומיקרוסקופיה קונפוקלית

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול עבור החילוץ רקמת המוח מ וגורי עכברים ספראג Dawley יום 1 מורדמים ע י עריפת ראשו, אושרה על ידי חיה אכפת ועל שימוש הוועדה באוניברסיטת אלברטה.

1. מיקרוגלייה, ומשום אסטרוציט67,68

הערה: כל המדיה בידוד ותרבות תא טרופה עד 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים. של האנק מאוזנת תמיסת מלח (HBSS) יש 1% פניצילין-סטרפטומיצין (PS). של Dulbecco כל ששינה המדיה של נשר עם F12 של חזיר מזין תערובת (DMEM/F12) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) ו- 1% פניצילין-סטרפטומיצין (PS). תערובות היחיד עם טריפסין חוסר FBS. כל החומרים ב פרוטוקול זה סטרילי (מסנן, אלכוהול, שנרכש, בלוק), בכל שלב לאחר שלב מספר 1.8 מתבצע ב- cabinet עם הטכניקה aseptic אבטחה.

  1. לכל המוח, מראש בחום 15 מ"ל של HBSS ושל מ"ל DMEM/F12 כדי 37 ° C 50 מ ל צנטריפוגה חרוט צינורות ולאחר כ 2 מ של 0.25% טריפסין בחומצה ethylenediaminetetraacetic 1 מ מ (EDTA) בשפופרת צנטרפוגה חרוט 15 מ"ל. חום אוטם 25 נוספים של DMEM/F12. טריפסין חם מראש כ- 10 דקות כדי למנוע אובדן של פעילות אנזימטי.
  2. שופכים HBSS חמים מספיק לתוך סטרילי, 6 מנות תרבות 10 ס מ כדי לכסות את המשטח. להכין צלחת אחת 10 ס מ כל שכל שני בתוספת צלחת נוספת 6 ס מ.
  3. מקם את המוח עד 2 בכל מנה2 10 ס מ (איור 2 א).
  4. תחת מיקרוסקופ לנתיחה, להשתמש מלקחיים מעוקלים וישרים כדי להפריד את cortices לאורך הקו האמצעי, המוח הקטן עם גזע המוח. זה מניב בשלושת המקטעים של רקמות לכל המוח (איור 2B).
  5. קליפה דקה, שקופה למחצה, השכבה (קרומי המוח) של הרקמה המכילה כלי דם של כל מקטע של רקמת להשליך, העברת הרקמה הנותרת לתוך תבשיל תרבות נפרדת. שכבות דק שנחשפו על ידי רקמת החתכים, עם המלקחיים, ומשוך בזהירות עד חלקים עיקריים הם 'נתלה' על רקמת המוח. לבסוף להסיר חלק זה על ידי בעדינות מושכים. ראה איור 2C-2E עבור להחליפן בתמונות של לפני, במהלך, ואחרי שלב זה.
  6. באבטחה הקבינט, הסר את HBSS הנותרים המנה תרבות, בזהירות שמירה על הרקמה. Macerate הרקמה באזמל ולהעביר רקמות ברכבת התחתית ומחוממת מראש 15 מ"ל עם טריפסין.
  7. דגירה הצינורית הזאת במשך 25 דקות באמבט 37 ° C כדי לעכל את הרקמה enzymatically.
  8. Centrifuge את הצינור למטה ב 500 x g למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר, שופכים את תגובת שיקוע.
  9. בעזרת פיפטה סרולוגית 10 מ ל, להוסיף 10 מ של DMEM חמים/F12 כדי להשבית את טריפסין, triturate את הפתרון 5 פעמים, כדי לשבור את הרקמה.
  10. Centrifuge את הצינור למטה ב 500 x g למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר, שופכים את תגובת שיקוע.
  11. באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ ל, מחדש להשעות צניפה לתוך 10 מ"ל של DMEM חמים/F12 ולהעביר את הפתרון 50 מ ל צינור חרוטי צנטריפוגה.
  12. בעזרת מזרק 10 מ"ל מחט בקוטר 18, triturate את הפתרון 3 פעמים.
  13. להפיץ פתרון זה לתוך בהפרשים של מ"ל של DMEM/F12 חם לכל המוח.
  14. פיפטה בהפרשים קבועים של 1 מ"ל של הפתרון triturated לתוך צלחת טוב 12 (1 לכל המוח).
  15. דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2בחממה התרבות תאים humidified. להחליף את המדיה לאחר שלושה ימים, רענון מדיה כל שלושה ימים לאחר מכן. לאחר 2 שבועות, ניתן לאסוף את התאים לניסויים.

2. Macromer סינתזה69

  1. שוקלים 375 מ ג של חומצה היאלורונית (HA) מלח שפופרת צנטרפוגה חרוט 50 מ"ל ולהוסיף 37.5 מ ל מים מזוקקים.
  2. לשטוף את הפתרון עם vortexer עבור 1 דקות, sonicate את התערובת עד שהיא מופיעה הומוגנית מאבד את צמיגות דמוי ג'ל. תהליך זה עשוי להימשך 6-אייץ '.
  3. פתרון העברה גביע 100 מ עם מגנטי מערבבים בר (38 מ מ), ומערבבים נמרצות בטמפרטורת החדר.
  4. Titrate בקפידה 5.0 M NaOH לתוך HA ערבוב למדוד עם נייר pH, עד ה-pH מייצבת בין 8 ל- 12.
  5. לאסוף 3 מ"ל של methacrylic טריים אנהידריד (MA, 94%), כיסה על ידי חנקן במהלך האחסון.
    הערה: MA חשוף לאווירה עבור משך זמן (ימים), היא תאבד את התגובה שלה.
    התראה: שימוש כל אמא צריכה להיעשות בשכונה fume.
  6. להוסיף 200 µL של אמא בתוך תמיסת HA ערבוב. התגובה מוריד את רמת ה-pH של התמיסה מתחת 8.
  7. חזור על שלבים 2.4-2.6 עד mL 3 של MA נוספו הפתרון. תהליך זה עשוי להימשך עד 1-2 שעות.
  8. לאפשר את התגובה להמשיך בין לילה ב 4 ° C, ללא ערבוב.
  9. העברת פתרון עד 400 מ"ל אתנול קר (EtOH) בתוך 500 מ"ל ולאפשר משקעים של 24-72 h-4 מעלות צלזיוס. 56
  10. בזהירות decant החלק העיקרי של הפתרון לתוך גביע נפרדים עבור סילוק, ולאסוף את התמיסה בתוך שפופרת צנטרפוגה חרוט 50 מ. זה עשוי להיות מופץ ב- 2-4 צינורות, במידת הצורך.
  11. Centrifuge הצינורות ב g x 200 ומפרידה למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר, השלך תגובת שיקוע.
  12. למעלה למעלה ברכבת התחתית עם EtOH קרים, מערבבים את הפתרון עם vortexer עבור 1 דקות, וחזור על שלב 2.10-2.11.
  13. להוסיף 25 מיליליטר מים יונים סטרילי, לערבב את הפתרון עם vortexer עבור 1 דקות, sonicate (> 20 קילוהרץ) לשעה דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  14. מקם את הפתרון במקפיא-80 מעלות למשך 15 דקות, או עד קפואים או פלאש להקפיא במצב חנקן נוזלי.
    התראה: בעת השימוש בחנקן נוזלי, השתמש כפפות מגן, מגן הפנים, סינר.
  15. להקפיא יבש הצינור (מתחת mBar 0.1 ו למינוס 30 מעלות) במשך 24-48 שעות עד אבקה כמו שלג הוא מיוצר.
  16. בשלב זה, בדיקת המדגם טוהר באמצעות תהודה מגנטית גרעינית 1H, איפה אפשר לאמת את כמות methacrylate פרוטונים (פסגות ב- 6.1 ו- 5.6 ppm), ביחס מתיל פרוטונים (1.9 ppm), עמוד שידרה HA. יחס מינימלי של 95% methacrylate ל מתיל פרוטונים מקובל. 69

3. ג'ל היווצרות ו 3D כימוס65

  1. Coverslip והכנות עובש
    1. להפוך את פתרון מים 50 מל מזוקק של 2% 3-(Trimethoxysilyl) propyl methacrylate בשפופרת צנטרפוגה חרוט 50 מ ל.
    2. מקום 18 מ מ coverslips זכוכית דקה פתרון ורוק לשעה בטמפרטורת החדר. עד 50 coverslips ניתן להוסיף בבת אחת.
    3. לשטוף coverslips בטבילת אחד ב 3 בקבוקונים של יונים 100 מ"ל מים באופן סדרתי.
    4. יבש את coverslips בוואקום ב 40 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם desiccator ותנור.
    5. במהירות לטבול coverslips בודדים ב- 70% EtOH עם מלקחיים.
    6. ללא ייבוש, ננחת coverslip כל טוב של צלחת טוב 12.
    7. רוחצים את האחות מכל קידוח מים יונים סטרילי (1 מ"ל לכל טוב).
    8. להוסיף 1 מ"ל של סטרילי 2 µg /mL פולי-L-ליזין (PLL) מכל קידוח, תקופת דגירה של > 2 h.
    9. האחות PLL פתרון ולאפשר את coverslips מהאוויר יבש.
    10. לטבול polydimethyl siloxane (PDMS) בתבניות (ראה איור 1) 70% EtOH, ובמקום אחד על המרכז של כל coverslip, ולא לאפשר לאוויר יבש וליצור חותם בין עובש זכוכית.
      1. להכין תבניות PDMS על ידי יציקת ריאגנטים premix PDMS על יחס 10:1 בקערה שהונעו פוליסטירן. כמות PDMS מוכן נבחרה להניב גיליון כ 1 מ"מ עובי. אל טופס בארות PDMS, לחתוך את הסדינים עם אגרוף עיגול בקוטר הפנימי 10.
  2. הכנה תא
    הערה: כל השלבים בפרוטוקול מבוצעים עם סטרילי טכניקה אבטחה בארון. פוספט buffered (PBS) תמיסת מותאם pH 7.4 כל השלבים.
    1. 24 שעןת לפני תא כימוס בחמאת, רענן האמצעי עבור שבוע 2 התרבויות הראשי (מתוך שלב 1.15) לוחית טוב 12. להוסיף 1 מ"ל של DMEM/F12 (10% FBS ו 1%-PS) בינוני לכל טוב.
    2. על כל צלחת. ובכן 12 תאים להכין מ"ל של טריפסין שתדללו (0.25% טריפסין-EDTA מדולל 30% עם מדיה DMEM/F12), 25 מ ל DMEM/F12 (10% FBS ו 1%-PS) חם בצפון ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים.
    3. לאסוף בינוני ממוזגים צלחות באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ ל (> 0.5 מ"ל לכל טוב), ביסודיות תשאף הנוזל הנותר, והחלף 1 מ"ל לכל טוב של טריפסין שתדללו (טריפסין 0.075%-EDTA) למשך 20-30 דקות בתוך אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) עד השכבה תא confluent לניתוק מהצלחת.
    4. לשחזר תא מושעה חומר עם פיפטה 1 מ"ל (נראה כמו חתיכה אחת צף) ולאסוף בשפופרת צנטרפוגה חרוט 15 מ"ל. שתדללו עם אמצעי אחסון שווה של DMEM/F12 (10% FBS ו- 1% PS), ואת צנטריפוגה ב 200 x g למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר, השמטת את תגובת שיקוע.
    5. Resuspend בגדר תא ב- 10 מ"ל לחמם DMEM/F12 (10% FBS ו- 1% PS), triturate את התאים 5 פעמים עם פיפטה 10 מ"ל, צנטריפוגה ב g x 200 למשך 2 דקות.
    6. Decant את תגובת שיקוע, מחדש להשעות את התאים ב 5 מ ל חם DMEM/F12, ולהעביר את התאים שפופרת צנטרפוגה חרוט 50 מ ל.
    7. באמצעות מזרק 10 מ"ל עם מחט מד 18, triturate הפתרון תא 3 פעמים, לסנן את המתלים דרך מסננת תא 40 µm לתוך שפופרת צנטרפוגה חרוט חדש.
    8. לאסוף 10 µL של התא השעיה, לדלל מטריים DMEM חמים/F12, ספירת תאים עם מונה הניתן תא אוטומטיות
    9. דגירה באמבט מים 37 ° C עד שלב אנקפסולציה.
  3. תא כימוס
    הערה: כל השלבים בפרוטוקול מבוצעים עם סטרילי טכניקה אבטחה בארון.
    1. על כל צלחת. ובכן 12 של תלת-ממד hydrogels חמים מ"ל של DMEM/F12, מ"ל של התקשורת DMEM/F12 ממוזגים שנאספו במהלך ההכנה התא.
    2. לשקול את כמות חומצה היאלורונית methacrylated (חמה) הדרוש ריכוז סופי של 0.5% wt/כרך להמיס את חמה ב- PBS מסוננים סטרילי-ריכוז (2% wt/כרך); ריכוז גבוה פי 4 מאשר הריכוז הסופי הוא מנוצל כדי להכיל את התוספת של תאים וחומרים אחרים. אחד 12 טוב צלחת של hydrogels דורש ~ 350 PBS µL עם 7 מ"ג חמה.
    3. Sonicate (> 20 קילוהרץ) פתרונות עד חמה להתמוססות מלאה עבור 60 דקות.
    4. להכין פתרונות ייחודיים 10% של הידרוקסיאתיל (תה) וגם 1-ויניל-2-pyrrolidinone (nvp ב), פתרון 1 מ"מ של Eosin Y (היי) ב- aliquots 1 מ"ל של PBS סטרילי pH 7.4.
    5. עבור 12 אחד טוב צלחת, להכין תערובת mL 1.4 הסופי של עונה 1 פרק 107 תאים, 0.5% wt/כרך חמא (350 µL של 2% wt/כרך), 0.1% תה (14 µL של 10%), 0.1% nvp ב (14 µL של 10%), ו- 0.01 מ מ EY (14 µL של 1 מ מ) , ו- 20% תערובת הבסיס פרופריה (280 µL של מניות). אמצעי האחסון הנותרת היא PBS.
    6. בעדינות לערבב את הפתרון, פיפטה 100 µL לתוך כל עובש PDMS עם טיפ 1 מ"ל.
    7. לחשוף את דגימות אור LED ירוק בעוצמה גבוהה (~ 520 nm, 60 מגה-וואט, סגורים 20 ס"מ x 20 ס"מ x 20 ס"מ תיבת) עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    8. להוסיף 1 מ"ל לכל טוב של DMEM ממוזגים חמים/F12 צלחת טוב 12.
    9. לתפוס כל coverslip בין האגודל לאצבע, לאט מתקלפת כייר PDMS עם פינצטה מעוקל נזהר שלא תחסיר הג'ל, ולמקם אותו לבאר בינונית ממוזגים.
    10. להוסיף 1 מ ל נוספים לחמם DMEM/F12 כדי מכל קידוח.
    11. דגירה צלחות ב 37 ° C עם 5% CO2 2 שבועות, מרעננים את המדיה הנייד בכל שבוע על ידי pipetting 1 מ"ל של מדיה כל בארות והחלפה של 1 מ ל DMEM/F12.

4. מיקרוסקופ

  1. Immunocytochemistry
    הערה: מיקרוסקופ קונפוקלי הפוכה שימש לשיקוף דוגמאות אלה, ImageJ שימש כדי לעבד ולהציג את התמונות. יסומנו כסעיפים מיקרוגלייה, האסטרוציטים, oligodendrocytes להפוך, גרעינים, לאחר 3 שבועות בתרבות חמה.
    1. מחממים 10% באגירה PBS פורמלין (pH 7.0) באמבט 37 º C.
      התראה: למרות פורמלין יכול לשמש מחוץ ברדס fume, חומר זה תגובתי עם רקמה, צריך להיות תמיד להתמודד עם טיפול וכפפות. זה צריך להיות השלך בנפרד.
    2. בזהירות תשאף מדיה צלחות, פיפטה 1 מ"ל של פורמלין 10% מכל קידוח.
    3. דגירה הצלחות ב- 37 מעלות צלזיוס ב CO 5%2 עבור 20 דקות.
    4. האחות הנוזל כל צלחת פיפטה 2 מ"ל ל- PBS (pH 7.4) כל טוב, תקופת דגירה של 15 דקות.
    5. חזור על שלב 4.1.4 פעמיים.
    6. האחות נוזל הזהב, להוסיף 1 מ"ל לכל טוב של PBS עם סרום סוס רגיל 10% (NHS) ו- 0.5% טריטון X-100 אותם בעדינות רוק במהירות מינימלית) לשעה.
    7. חזור על שלב 4.1.4 שלוש פעמים.
    8. האחות הנוזל ולהוסיף 1 מ"ל לכל טוב של התערובת הבאה ב- PBS: ארנב מיונן סידן מחייב מתאם מולקולה (Iba1) 1:1, 000, תרנגולת חלבון גליה fibrillary (GFAP) 1:5, 000, העכבר 2', 3'-מחזורית-nucelotide 3'-phophodiesterase (CNPase) 1:1, 000, 1% NHS , ותא 0.1% המנקב חומרים פעילי שטח. דגירה ב 4 ° C בן לילה, נדנדה את הצלחת בעדינות ככל האפשר.
    9. חזור על שלב 4.1.4 שלוש פעמים עם 1 h incubations שביניהם.
    10. תשאף הנוזל ולהוסיף 1 מ"ל לכל טוב של התערובת הבאה ב- PBS: 647 nm מתרגש חמור נוגדן אנטי-ארנב 1:200, 546 nm מתרגש עז נוגדן אנטי-עוף 1:200, 488 ננומטר מתרגש חמור נוגדן אנטי עכבר 1:200, 1% NHS, 1:1,000 כחולה הכתם גרעינית. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 1 h, נדנדה בעדינות את הצלחת.
    11. חזור על שלב 4 שלוש פעמים עם 1 h incubations שביניהם.
    12. כדי לשמר את hydrogels, תשאף מאגר, לטבול אותם 0.5 מיליליטר תא הרכבה בינונית עבור 1 מינימלית פיפטה את המדיום הרכבה ו הנח בעדינות coverslip על גבי הג'ל, יצירת שכבה בין הזכוכית. להוסיף כמות קטנה של הרכבה בינונית לצד חשפו coverslips כדי למנוע התייבשות הידרוג.
      הערה: לצורך פתרון בעיות, ג'לים יכול לדימות בשלב 4.1.11. כדי לראות תיוג מתאים לפני עיבוד נוסף.
  2. סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM)
    הערה: כדי להמחיש את הידרוג, מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה שימשה תמונה הדוגמיות הללו.
    1. מחממים מראש תערובת לשבועיים של 2.5% גלוטראלדהיד, 2% paraformaldehyde ב- PBS (0.1 M) בתוך אמבט מים 37 º C.
      התראה: ריאגנטים האלה הן מאוד תגובתי עם רקמות, צריך להיות מטופל עם טיפול וכפפות. הם צריכים להיות בשכונה fume במידת האפשר ו מסולק בנפרד.
    2. האחות בינוני מן הלוחות תרבות תא ולהוסיף 1 מ"ל של תערובת מקבע מחומם מראש.
    3. דגירה הצלחות ב- 37 מעלות צלזיוס ב CO 5%2 עבור 20 דקות.
    4. מקם את הצלחות 4 ° C (מקרר/מקרר) בן לילה.
    5. האחות הפתרון מקבע מן הבארות ולהוסיף 1 מ"ל ל- PBS.
    6. האחות הנוזל כל צלחת, להוסיף 2 מ של PBS לבאר כל, תקופת דגירה של 15 דקות.
    7. חזור על שלב 4.2.6 עוד פעמיים.
    8. האחות של PBS ולהוסיף 1 מ"ל של 1% אוסמיום tetraoxide במאגר PBS כדי מכל קידוח.
      הערה: עד דגימות עוברות ייבוש, שלב זה, כל והשלבים מבוצעים בשכונה fume.
    9. לאפשר קיבוע להופיע במשך 30 דקות אדי אוסמיום מן הנוזל יכול לתקן את דגימות אחרות באותה הצלחת; לכן, חלוקת דוגמיות בהתאם לפני צעד זה.
      זהירות: אוסמיום tetraoxide היא מאוד תגובתי עם רקמת והפכפך. זה מסוכן ויש לטפל בשכונה fume עם כפפות. זה וכל מיידית שטף צריך להיות שסולק בנפרד.
    10. חזור על שלב 4.2.6 שלוש פעמים.
    11. וארוקן את הנוזל, להוסיף את תערובות dehydrating המופיעות ברשימה להלן, לפי סדר, דגירה (טמפרטורת החדר) עבור הזמן המצוין. התחל בהוספת בהדרגה אתנול (EtOH) לאחר מכן hexamethyldisilazane (HMDS). עיין בטבלה 2 עבור כל תוספת קבועה.
      הערה: בעת הוספת HMDS, coverslips ניתן חריפה לדבוק הפלסטיק, הופכים קשים מאוד להסיר. זה ניתן למנוע על-ידי הצבת פלטפורמה פלסטיק קטן תחת תגית זכוכית לאחר היישום הראשון של HMDS. לאחר הדגירה EtOH השנייה, המדגם יכול להיות יחוסל, מתרצה בחנקן נוזלי במשך כמה שניות להקפיא שבר הדגימה.
    12. בזהירות להסיר את הדגימות מיובשים והר הדגימות על הספחים לסרוק בעזרת מיקרוסקופ אלקטרון עם כפול סרט מוליך צדדית.
    13. לרעוד. להוציא מעיל הדגימות עם סכום מינימלי של זהב. מניחים את הדגימות בעל ולהפעיל את המכונה למשך 2 דקות בגיל 15 אמא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המודל התגובה מארח רקמה עצבית ו גליה הצלקת תפוקה גבוהה, חוץ גופית בתוך המערכת דורשת לפיגום תא 3D עם חומר מטריקס מסתיימים, לא תישא אירוע ציטוטוקסיות במהלך היווצרות בחיי עיר , ויש ניתנת לשינוי עם רכיבים ביו-אקטיביים להנחות את התגובה נדיב. לשם כך, יש יצרה מערכת לגרדום תא 3D המבוסס על חומצה היאלורונית, ואנו אנקפסולציה אוכלוסיה ראשי תא גליה מעורב ללמוד אינטראקציות תא-תא ו גליה bioreactivity. בוצע מחקר ויזואלי קצרה של תאים, לגרדום. המורפולוגיה של תא subpopulations, כולל oligodendrocytes להפוך (CNPase בצבע ירוק), מיקרוגלייה (Iba1 באדום), האסטרוציטים (GFAP בצהוב), מוצגים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית immunofluorescent (איור 3איי-ii-Ci-ii). מורפולוגיה לגרדום ותא משולב מוצגים גם על ידי SEM (איור 3Aiii-iv - Ciii-iv). בתמונות אלה, מוצגות גם נמוך (i ו- iii), וגם תמונות גבוהה (ii ו- iv) ברזולוציה נציג. ציפוי coverslip PLL 2D (איור 3 א) נמשל 3D 0.5% w/v HAMA גרדום (איור 3B), תערובת של 20% v/v פרופריה הבזליים תערובת ב- 0.5% w/v חמא (איור 3C). זה נעשה כדי להדגים את ההבדלים מורפולוגי 2D, תרבית תאים תלת-ממד, כמו גם ההשפעה של היכרות של הנדן ביולוגי לגרדום. שחזור תלת-ממד זמין גם מידע משלים.

מורפולוגיה תאים של כל סוג התא השתנתה עם כניסתה של פלטפורמה תלת-ממד. בתרבות 2D חסיד (% coverslips. זכוכית מצופים PLL דקה), oligodendrocytes להפוך הופיע בדרך כלל עגול והוא בנוי רשתות קטנות בדרך כלל מתחבר בקלות ראש הנקרא GFAP תהליכים. מיקרוגלייה היו קטנים יותר תאים אחרים והיה שתהליכים מסעף קטן לא כללו רחוק גופם תא (< 20 מיקרומטר). האסטרוציטים יותר diversely מעוצבות, כמה שיש מורפולוגיה רדיאלי עם תהליכים דק, מסעף נרחב, וגופי התא קטן בעוד אחרים היו סיבי עם מראה שעברו שיטוח, כמה תהליכים רחבה מעיל פני השטח. בתרבות HAMA תלת-ממד, הופיעו oligodendrocytes להפוך אשכולות יש הסתעפו לתוך התחומים קטנים. מיקרוגלייה היו עגולות עם כמה תהליכים, האסטרוציטים מעוגל או הסתעפו בצורה רדיאלית לתוך רשתות של אשכול יחיד. באופן כללי, תאים אלה הופיע פעם אחת הנקודות או להישאר באזורים האמה בלי קשר עם תאים אחרים, אשר הוא בניגוד לתרבות 2D והוא רמיזות של ניידות מוגבלת בתוך המטריקס. כאשר 20% v/v תערובת פרופריה הבזליים נוספה לתערובת צילום-פלמור, כל סוגי גליה משולב עם פלטפורמת 3D, נוצר מקיפה יותר, אינטראקטיבי מבנים מסועף. Oligodendrocytes להפוך מורחב דומה בצורה רדיאלית מורפולוגיות תערובת הנדן שאינם הבזליים בולבוסי תהליכים, אך בנוסף הופיעה להרחיב תהליכים לאורך הרשתות מחוברים דק של תהליכים אסטרוציט מסעף ברחבי לגרדום. מיקרוגלייה פוזרו בין רשתות אלה תא, נתקל התפרסו בתהליכים דק יותר עקבי עם מורפולוגיה שלהם בתוך הרקמה. בסך הכל, מורפולוגיות מציע לשלושת הסוגים של עכשיו, דונלד משולב לתוך התערובת פרופריה HAMA-הבזליים בחופשיות, פוטנציאל דרך הדבקות מוגבר או מצע מעורב או באמצעות הגדלת היכולת לשפץ לגרדום.

כאשר הבחינו SEM, מורפולוגיה תאים נראתה כדי לאמת את micrographs קונפוקלי. המטריקס HAMA הופיע בתור משטח חלק עם 10-50 מיקרומטר נקבוביות ראיתי בחולשה מתחת לפני השטח. היו תאים חסיד אל פני השטח האמה היו גם גלוי באופן עמום השכבות שמתחת. עכשיו, דונלד האלה לא יוצרים מורפולוגיות דומות לאלה ציין בתרבות 2D, אך עם התוספת של תערובת פרופריה הבזליים, נצפתה נרחב ברשת. סיבים אסטרוציט עבה, עם אשכולות קטנים יותר של מיקרוגלייה נצפו הן על פני התערובת פרופריה HAMA-הבזליים והארכת במטריקס בצורה חלקה. ניתן לראות באופן עמום כמו המטריקס מקופל מסביב לתאים, רומז כי התאים עשוי להיות שינוי לגרדום כדי הוסב הייצורים החיים הרצוי שלהם.

Figure 1
איור 1: סכימטי של חומצה היאלורונית methacrylated (חמה)-מבוסס פרוטוקול ותרבות photopolymerization 3D תא. תאי גליה (שבוע 2 החולדה הראשית המוח תרבות) מעורבב עם חמה, pipetted לתוך תבנית polydimethylsiloxane (PDMS) על coverslip זכוכית. תערובת זו חשופים נורית LED ירוקה בעוצמה גבוהה פולימריזציה של הידרוג במשך 5 דקות. העובש יוסר ולא בג'ל מודגרת בתקשורת. נציג תאים כוללים מיקרוגלייה (אדום), האסטרוציטים (צהוב), ו אוליגודנדרוציטים (ירוק). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: ניתוח מוח גור של עכברוש ספראג Dawley יום 1. תמונות של כל המוח (A), דיסקציה של cortices, המח (B), קליפה אחת עם קרומי המוח (C), פילינג של קרומי המוח עם מלקחיים (D), ואת קליפת המוח ללא meninge (E). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: Immunofluorescent קונאפוקלית (i-ii), סריקת אלקטרונים (iii-iv) micrographs של אוכלוסיות תאים מעורבת עכשיו, דונלד על PLL 2D ציפויים (A), חמא (B) פרופריה HAMA-הבזליים תערובת (C). התחתונה (i, iii) ו גבוה יותר (השני, הרביעי) מוצגות תמונות ההגדלה. תוויות כוללות Iba1 באדום עבור מיקרוגלייה, GFAP בצהוב האסטרוציטים, CNPase בצבע ירוק עבור oligodendrocytes להפוך של צביעת הכסט גרעינית. גודל ברים = מיקרומטר 25 לתמונות קונאפוקלית ו- 50 (iii) ו 20 מיקרומטר (iv) עבור סריקה micrographs אלקטרון. Hydrogels היו 0.5% w/v, תערובת פרופריה הבזליים היה 20% לפי נפח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

משלימה איור 1: שחזור micrographic immunofluorescent 3D של תערובת חמה-הבזליים פרופריה עם מעורבות עכשיו, דונלד תא אוכלוסיות תערובת פרופריה HAMA-הבזליים. תוויות כוללות Iba1 באדום עבור מיקרוגלייה, GFAP בצהוב האסטרוציטים, CNPase בצבע ירוק עבור oligodendrocytes להפוך של צביעת הכסט גרעינית. Hydrogels היו 0.5% w/v, Getrex היה 20% לפי נפח. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

HAMA הנדן הבזליים NVP תה . היי
ריכוז בעבודה 0.5% w/v 20% v/v 0.10% 0.10% .01 מ מ
12. ובכן צלחת 2% w/v 100% w/v 10% v/v 10% v/v 1 מ מ
mL 1.4 סה 350 ΜL 280 ΜL 14 ΜL 14 ΜL 14 ΜL

טבלה 1: דוגמה תא אנקפסולציה.

רכיב תוכן זמן הדגירה
EtOH 30% 30 דקות
EtOH 50% 30 דקות
EtOH 70% 30 דקות
EtOH 90% 20 דקות
EtOH 100% 20 דקות
EtOH 100% 20 דקות
EtOH:HMDS 75:25 20 דקות
EtOH:HMDS 50:50:00 20 דקות
EtOH:HMDS 25:75 20 דקות
HMDS 100% 20 דקות
HMDS 100% בן לילה

טבלה 2: דרגות הדרגתית של EtOH ושל HMDS להתייבשות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

לקראת המטרה של יצירת מערכת תרבות 3D דגם bioreactivity גליה ותהליך הצטלקות גליה, פיתחנו מערכת יכול לתמוך העיקרי מיקרוגלייה בתרבית, האסטרוציטים ו אוליגודנדרוציטים ומאפשרת חזקים אפיון תא אינטראקציות תא-תא ומורפולוגיה. מ micrographs המוצג, המורפולוגיה של כל סוג התא היה שונה במובהק עם 2D, 3D-חמה ו 3D HAMA-הבזליים פרופריה תערובת פלטפורמות. במערכת דו-מימדית, מורפולוגיה היה מוטה בבירור לאורך המטוס של פני השטח, אבל בהשוואה HAMA תלת-ממד, מיקרוגלייה האסטרוציטים היו בדרך כלל קטן יותר בתוך המטריקס, למעט אוליגודנדרוציטים אשכולות. ב micrographs סריקה אלקטרון, התאים היו בדרך כלל יותר עגול בצורת על האמה. זה עשוי להיות בעיקר בשל התאים להיות אנקפסולציה, עם קיבולת מוגבלת כדי לשנות את מטריצת גפיים, תנועה חופשית ואת הצמיחה של תהליכים. תא תוצר חמאת היה בדרך כלל רדיאלי האסטרוציטים וגם oligodendrocytes להפוך. בעוד תאים אלו תהליכים ארוכים, הארגון מציע כי התנועה שלהם ברחבי מטריקס היכולת לתקשר עם תאים אחרים היה מוגבל. בנוסף, העבודה הקודם הראה שבר-הקפאת HAMA להיות נקבובי ללא רשת מחוברים, שיכול להסביר חוסר תוצר65,70. ייתכן כי חלק תאים אלה לא שרד את photopolymerization, שנותרו שהשתמרו במטריקס, אולם הכדאיות באופן שיטתי נאמד ב קודמים שלנו עובד, ונשאר 80% (0.5% w/v) במהלך השבוע65.

כדי לשפר את האינטראקציה תא עם המטריצה בתרבות תלת-ממד, הצגנו את תערובת הבסיס פרופריה כרכיב מטריקס מסתיימים ומשתנות. תא אינטגרציה עם המטריקס נמצאה כדי להשתפר בצורה ניכרת, עם כל סוגי תאים מציג תהליכים נרחבים לעומת תרבות 2D והן HAMA תלת-ממד. תערובת הבסיס פרופריה כולל רכיבים פרופריה הבזליים מגוון, בעיקר שניסח לתמוך גליה הבידול של תאי גזע עצביים מבשרי71. זה לא היה צפוי כי וזאנה הגיב התערובת פרופריה הבזליים, ובעקבות כך המטריקס 3D שמסביב, אך מידת האינטגרציה מציע סביבה כמו רקמה בריאה. השוואת חמה חמה-הבזליים פרופריה תערובת, המורפולוגיה הידרוג אינו מופיע שונה במובהק, ולכן התאים עשויה להיות יותר פעיל נערכו זה. בהתחשב הפשטות של הוספת רכיב ביו זה, זה לא נתפס להשתמש laminas שונים ו/או רמזים חלבון לטובת תרבות תנאים של נוירונים. כיוון עתידי פוטנציאלי, מערכת זו יכול לשמש כדי להבדיל נוירונים אבות עצבית בשיתוף עם עכשיו, מעורבות דונלד למגוון רחב של myelination מאריכות או פציעה נוירו-דלקתיות מודלים.

במקרה של פציעה CNS חמורה ועלולה לגרום לנזק או דחייה biomaterial, הרקמה תושב יוזם תגובות דלקתיות מסוגל בהחרפת הקשורים ניוון מוחיים ו- demyelination. בדרך כלל התוצאה היא היווצרות צלקת גליה מחיצות האתר של פגיעה, אשר מונע התחדשות. במחקר זה, השיטות שקיבלו הוראות מפורטות עבור methacrylated polymerized-צילום מבוססי חומצה היאלורונית 3D לפיגום מתוך כוונה דגמי הסלולר התגובה הראשונית מאחורי היווצרות צלקת גליה; microglial תגובתיות, גיוס אסטרוציט ו היפרטרופיה, ו אוליגודנדרוציטים פציעה נסיגה. לפיגום תא 3D תוכנן כדי לשלב את כל שלושת סוגי תא גליה, שונתה בהמשך עם תערובת רכיבים רב פרופריה הבזליים. זה היה נחוש, על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים קונאפוקלית של סריקת הדמיה, כי התאים היו במארז של חמאת, כדאי הצליחו לשלב כאשר התערובת פרופריה הבזליים הוצג. תוצאות אלו יכולים להוביל מספר יישומים חדשניים. HAMA לבד עשויה לשמש ליצור מערכות התרבות משותף שבו הכוונה היא להגביל את האינטראקציה לתא או מחקר כימי שזוקק משלוח בסמים באמצעות הג'ל כמו מטריצה מוגבלת של דיפוזיה טעון סמים. Hydrogels הופכים את תערובת הבסיס פרופריה לתוך מאטריקס HAMA לאפשר סביבה כמו רקמות עקבית יותר מסוגל מידול לדלקת חריפה, gliosis או הצטלקות גליה, ומאפשרת יותר תפוקה גבוהה אפיון של גליה bioreactivity שתלים, פיתוח התרופה, התקן של אסטרטגיות אחרות כדי להפחית ולשחזר פגיעה דלקתית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים תמיכה כספית NSERC, CFI, AIHS, שירותי בריאות אלברטה, התרומה דייבי לחקר המוח.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Materials for HAMA synthesis and photopolymerization
Hyaluronic acid (HA) Sigma-Aldrich 53747-10G Streptococcus equi, MW: 1.5 - 1.8 X 10^6
Methacrylic anhydride (MA) Sigma-Aldrich 275585-100ML
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 221465-25G
Ethanol (EtOH) Commerical Alcohols Inc. Anhydrous
Phosphate buffered saline (pH 7.4) tablets Fisher Scientific 18912014
Triethanolamine (TEA) Sigma-Aldrich 90279-100ML
1-Vinyl-2pyrrolidinone (NVP) Sigma-Aldrich V3409-5G
EosinY (EY) Sigma-Aldrich E6003-25G
Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate Sigma-Aldrich 440159-100ML
Beaker (100 mL) Corning 1000-100
Beaker (500 mL) Corning 1000-600
pH paper (Labstick) Sigma-Aldrich 9580
Name Company Catalog Number Comments
2. Materials for glial cell isolation and cell culture
P1-2 Sprague Dawley rat pups Charles River CD Sprague Dawley rat strain code 001
Dissector scissors - slim blades (small) Fine Science Tools 14081-09
Surgical scissors - Toughcut (large) Fine Science Tools 14130-17
Fine forceps (Dumont #5) Fine Science Tools 11521-10
Curved fine forceps (Dumont #7) Fine Science Tools 11271-30
Hank's balanced salt solution (HBSS) Gibco 14170-112
Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) Gibco 11320-033
Penicillin-streptomycin (PS) Gibco 15140-122
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 12483-020
0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Gibco 25200-072
Poly-L-lysine (PLL) Sigma-Aldrich P-6282
50 mL conical centrifuge tube Fisher Scientific 05-539-13
15 mL conical centrifuge tube Fisher Scientific 05-539-5
12 well Tissue culture treated plates (Cellstar) Greiner Bio-One 665 108
10 mL serological pipette Fisher Scientific 13-676-10F
25 mL serological pipette Fisher Scientific 12-676-10K
Petri dish (60 mm X 15 mm) Fisher Scientific FB0875713A
Petri dish (100 mm X 15 mm) Fisher Scientific FB0875712
Microscope Coverslip (18 mm) Fisher Scientific 12-545-100 18CIR
Name Company Catalog Number Comments
3. Materials for microscopy (confocal and scanning electron microscopy)
Mouse monoclonal anti-CNPase abcam ab6319
Rabbit anti-Iba1 Wako Laboratory Chemicals 019-17741
Chicken anti-GFAP abcam ab4674
Hoechst 33342 Fisher Scientific 62249
Fluoromount-G Fisher Scientific 00-4958-02
Formalin Sigma Aldrich HT501128-4L Buffered (10%)
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
Horse Serum Gibco 16050-122
Paraformaldehyde Electon Microscopy Sciences 157-8 Buffered (8%)
Guteraldehyde Electon Microscopy Sciences 16019 Buffered (8%)
Osmium tetraoxide Electon Microscopy Sciences 19152 Buffered (2%)
Hexamethyldilazane (HMDS) Electon Microscopy Sciences 16700
Ethanol (EtOH) Electon Microscopy Sciences 15055 Anhydrous
Microscope Slide (25 X 75 X 1 mm) VWR International 48311-703

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shih, J. J., Krusienski, D. J., Wolpaw, J. R. Brain-Computer Interfaces in Medicine. Mayo Clin. Proc. 87, 268-279 (2012).
  2. Kennedy, P. R., Bakay, R. A. Restoration of neural output from a paralyzed patient by a direct brain connection. Neuroreport. 9, 1707-1711 (1998).
  3. Kennedy, P. R., Bakay, R. A., Moore, M. M., Adams, K., Goldwaithe, J. Direct control of a computer from the human central nervous system. IEEE Trans. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 8, 198-202 (2000).
  4. Mayberg, H. S., et al. Deep Brain Stimulation for Treatment-Resistant Depression. Neuron. 45, 651-660 (2005).
  5. Dougherty, D. D., et al. A Randomized Sham-Controlled Trial of Deep Brain Stimulation of the Ventral Capsule/Ventral Striatum for Chronic Treatment-Resistant Depression. Biol. Psychiatry. 78, 240-248 (2015).
  6. Bamford, J. A., Marc Lebel, R., Parseyan, K., Mushahwar, V. K. The Fabrication, Implantation, and Stability of Intraspinal Microwire Arrays in the Spinal Cord of Cat and Rat. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 25, 287-296 (2017).
  7. Holinski, B. J., et al. Intraspinal microstimulation produces over-ground walking in anesthetized cats. J. Neural Eng. 13, 056016 (2016).
  8. Toossi, A., Everaert, D. G., Azar, A., Dennison, C. R., Mushahwar, V. K. Mechanically Stable Intraspinal Microstimulation Implants for Human Translation. Ann. Biomed. Eng. 45, 681-694 (2017).
  9. Saigal, R., Renzi, C., Mushahwar, V. K. Intraspinal microstimulation generates functional movements after spinal-cord injury. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 12, 430-440 (2004).
  10. Lau, B., Guevremont, L., Mushahwar, V. K. Strategies for generating prolonged functional standing using intramuscular stimulation or intraspinal microstimulation. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 15, 273-285 (2007).
  11. Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. J. Neurosci. Methods. 148, 1-18 (2005).
  12. Sierra, A., et al. Surveillance, phagocytosis, and inflammation: how never-resting microglia influence adult hippocampal neurogenesis. Neural Plast. 2014, 610343 (2014).
  13. Holm, T. H., Draeby, D., Owens, T. Microglia are required for astroglial Toll-like receptor 4 response and for optimal TLR2 and TLR3 response. Glia. 60, 630-638 (2012).
  14. Gao, Z., et al. Reciprocal modulation between microglia and astrocyte in reactive gliosis following the CNS injury. Mol. Neurobiol. 48, 690-701 (2013).
  15. Jin, X., Yamashita, T. Microglia in central nervous system repair after injury. J. Biochem. (Tokyo). 159, 491-496 (2016).
  16. Griffith, R. W., Humphrey, D. R. Long-term gliosis around chronically implanted platinum electrodes in the Rhesus macaque motor cortex. Neurosci. Lett. 406, 81-86 (2006).
  17. Biran, R., Martin, D. C., Tresco, P. A. Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays. Exp. Neurol. 195, 115-126 (2005).
  18. Fawcett, J. W., Asher, R. A. The glial scar and central nervous system repair. Brain Res. Bull. 49, 377-391 (1999).
  19. Szarowski, D. H., et al. Brain responses to micro-machined silicon devices. Brain Res. 983, 23-35 (2003).
  20. Park, D. -W., et al. Graphene-based carbon-layered electrode array technology for neural imaging and optogenetic applications. Nat. Commun. 5, 5258 (2014).
  21. McAllister, J. P., et al. Biocompatibility of Penetrating Recording Electrode Arrays Implanted Chronically in the Feline Visual Cortex. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 1528 (2005).
  22. Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. J. Neurochem. 109, 117-125 (2009).
  23. Chung, H., et al. In vivo Biocompatibility and Stability of Polyimide Microelectrode Array for Retinal Stimulation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 5072 (2003).
  24. Aregueta-Robles, U. A., Woolley, A. J., Poole-Warren, L. A., Lovell, N. H., Green, R. A. Organic electrode coatings for next-generation neural interfaces. Front. Neuroengineering. 7, (2014).
  25. Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24, 4337-4351 (2003).
  26. Yang, J., et al. Ordered surfactant-templated poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) conducting polymer on microfabricated neural probes. Acta Biomater. 1, 125-136 (2005).
  27. Ludwig, K. A., et al. Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) polymer coatings facilitate smaller neural recording electrodes. J. Neural Eng. 8, 014001 (2011).
  28. Kim, D. -H., Abidian, M., Martin, D. C. Conducting polymers grown in hydrogel scaffolds coated on neural prosthetic devices. J. Biomed. Mater. Res. A. 71, 577-585 (2004).
  29. George, P. M., et al. Fabrication and biocompatibility of polypyrrole implants suitable for neural prosthetics. Biomaterials. 26, 3511-3519 (2005).
  30. Stauffer, W. R., Cui, X. T. Polypyrrole doped with 2 peptide sequences from laminin. Biomaterials. 27, 2405-2413 (2006).
  31. Green, R. A., Lovell, N. H., Wallace, G. G., Poole-Warren, L. A. Conducting polymers for neural interfaces: challenges in developing an effective long-term implant. Biomaterials. 29, 3393-3399 (2008).
  32. Gumbiner, B. M. Cell adhesion: the molecular basis of tissue architecture and morphogenesis. Cell. 84, 345-357 (1996).
  33. Chan, G., Mooney, D. J. New materials for tissue engineering: towards greater control over the biological response. Trends Biotechnol. 26, 382-392 (2008).
  34. Green, R. A., Lovell, N. H., Poole-Warren, L. A. Impact of co-incorporating laminin peptide dopants and neurotrophic growth factors on conducting polymer properties. Acta Biomater. 6, 63-71 (2010).
  35. Green, R. A., Lovell, N. H., Poole-Warren, L. A. Cell attachment functionality of bioactive conducting polymers for neural interfaces. Biomaterials. 30, 3637-3644 (2009).
  36. Koss, K. M., Unsworth, L. D. Neural tissue engineering: Bioresponsive nanoscaffolds using engineered self-assembling peptides. Acta Biomater. 44, 2-15 (2016).
  37. Koss, K. M., et al. Brain biocompatibility and microglia response towards engineered self-assembling (RADA)4 nanoscaffolds. Acta Biomater. 35, 127-137 (2016).
  38. Evans, A. J., et al. Promoting neurite outgrowth from spiral ganglion neuron explants using polypyrrole/BDNF-coated electrodes. J. Biomed. Mater. Res. A. 91, 241-250 (2009).
  39. Yu, X., Bellamkonda, R. V. Tissue-engineered scaffolds are effective alternatives to autografts for bridging peripheral nerve gaps. Tissue Eng. 9, 421-430 (2003).
  40. Houweling, D. A., Lankhorst, A. J., Gispen, W. H., Bär, P. R., Joosten, E. A. Collagen containing neurotrophin-3 (NT-3) attracts regrowing injured corticospinal axons in the adult rat spinal cord and promotes partial functional recovery. Exp. Neurol. 153, 49-59 (1998).
  41. Wells, M. R., et al. Gel matrix vehicles for growth factor application in nerve gap injuries repaired with tubes: a comparison of biomatrix, collagen, and methylcellulose. Exp. Neurol. 146, 395-402 (1997).
  42. Barras, F. M., Pasche, P., Bouche, N., Aebischer, P., Zurn, A. D. Glial cell line-derived neurotrophic factor released by synthetic guidance channels promotes facial nerve regeneration in the rat. J. Neurosci. Res. 70, 746-755 (2002).
  43. Fine, E. G., Decosterd, I., Papaloïzos, M., Zurn, A. D., Aebischer, P. GDNF and NGF released by synthetic guidance channels support sciatic nerve regeneration across a long gap. Eur. J. Neurosci. 15, 589-601 (2002).
  44. Burdick, J. A., Ward, M., Liang, E., Young, M. J., Langer, R. Stimulation of neurite outgrowth by neurotrophins delivered from degradable hydrogels. Biomaterials. 27, 452-459 (2006).
  45. Piantino, J., Burdick, J. A., Goldberg, D., Langer, R., Benowitz, L. I. An injectable, biodegradable hydrogel for trophic factor delivery enhances axonal rewiring and improves performance after spinal cord injury. Exp. Neurol. 201, 359-367 (2006).
  46. Jain, A., Kim, Y. -T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27, 497-504 (2006).
  47. Taylor, S. J., Sakiyama-Elbert, S. E. Effect of controlled delivery of neurotrophin-3 from fibrin on spinal cord injury in a long term model. J. Control. Release Off. J. Control. Release Soc. 116, 204-210 (2006).
  48. Jhaveri, S. J., et al. Release of nerve growth factor from HEMA hydrogel-coated substrates and its effect on the differentiation of neural cells. Biomacromolecules. 10, 174-183 (2009).
  49. Lee, A. C., et al. Controlled release of nerve growth factor enhances sciatic nerve regeneration. Exp. Neurol. 184, 295-303 (2003).
  50. Matsumoto, K., et al. Neurite outgrowths of neurons with neurotrophin-coated carbon nanotubes. J. Biosci. Bioeng. 103, 216-220 (2007).
  51. Khaled, I., et al. A Flexible Base Electrode Array for Intraspinal Microstimulation. IEEE Trans. Biomed. Eng. 60, 2904 (2013).
  52. David-Pur, M., Bareket-Keren, L., Beit-Yaakov, G., Raz-Prag, D., Hanein, Y. All-carbon-nanotube flexible multi-electrode array for neuronal recording and stimulation. Biomed. Microdevices. 16, 43-53 (2014).
  53. Hsu, H. -L., et al. Flexible UV-ozone-modified carbon nanotube electrodes for neuronal recording. Adv. Mater. Deerfield Beach Fla. 22, 2177-2181 (2010).
  54. Lacour, S. P., et al. Flexible and stretchable micro-electrodes for in vitro and in vivo neural interfaces. Med. Biol. Eng. Comput. 48, 945-954 (2010).
  55. Lin, C. -M., Lee, Y. -T., Yeh, S. -R., Fang, W. Flexible carbon nanotubes electrode for neural recording. Biosens. Bioelectron. 24, 2791-2797 (2009).
  56. Richter, A., et al. A simple implantation method for flexible, multisite microelectrodes into rat brains. Front. Neuroengineering. 6, 6 (2013).
  57. Rousche, P. J., et al. Flexible polyimide-based intracortical electrode arrays with bioactive capability. IEEE Trans. Biomed. Eng. 48, 361-371 (2001).
  58. Polikov, V. S., Block, M. L., Fellous, J. -M., Hong, J. -S., Reichert, W. M. In vitro model of glial scarring around neuroelectrodes chronically implanted in the CNS. Biomaterials. 27, 5368-5376 (2006).
  59. Sohal, H. S., Clowry, G. J., Jackson, A., O'Neill, A., Baker, S. N. Mechanical Flexibility Reduces the Foreign Body Response to Long-Term Implanted Microelectrodes in Rabbit Cortex. PloS One. 11, e0165606 (2016).
  60. Moshayedi, P., et al. The relationship between glial cell mechanosensitivity and foreign body reactions in the central nervous system. Biomaterials. 35, 3919-3925 (2014).
  61. Hopkins, A. M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. 3D in vitro modeling of the central nervous system. Prog. Neurobiol. 125, 1-25 (2015).
  62. Pöttler, M., Zierler, S., Kerschbaum, H. H. An artificial three-dimensional matrix promotes ramification in the microglial cell-line, BV-2. Neurosci. Lett. 410, 137-140 (2006).
  63. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. 0, 42-51 (2014).
  64. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12, 207-218 (2014).
  65. Jeffery, A. F., Churchward, M. A., Mushahwar, V. K., Todd, K. G., Elias, A. L. Hyaluronic acid-based 3D culture model for in vitro testing of electrode biocompatibility. Biomacromolecules. 15, 2157-2165 (2014).
  66. Fitch, M. T., Silver, J. CNS Injury, Glial Scars, and Inflammation. Exp. Neurol. 209, 294-301 (2008).
  67. Churchward, M. A., Todd, K. G. Statin treatment affects cytokine release and phagocytic activity in primary cultured microglia through two separable mechanisms. Mol. Brain. 7, 85 (2014).
  68. Lai, A. Y., Todd, K. G. Differential regulation of trophic and proinflammatory microglial effectors is dependent on severity of neuronal injury. Glia. 56, 259-270 (2008).
  69. Hachet, E., Van Den Berghe, H., Bayma, E., Block, M. R., Auzély-Velty, R. Design of biomimetic cell-interactive substrates using hyaluronic acid hydrogels with tunable mechanical properties. Biomacromolecules. 13, 1818-1827 (2012).
  70. Eslami, M., Javadi, G., Agdami, N., Shokrgozar, M. A. Expression of COLLAGEN 1 and ELASTIN Genes in Mitral Valvular Interstitial Cells within Microfiber Reinforced Hydrogel. Cell J (Yakhteh). , (2015).
  71. Shaltouki, A., Peng, J., Liu, Q., Rao, M. S., Zeng, X. Efficient Generation of Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells in Defined Conditions. STEM CELLS. 31, 941-952 (2013).

Tags

בביו-הנדסה גיליון 130 תרבית תאים תלת-ממד הידרוג עכשיו ראשי דונלד אסטרוציט מיקרוגלייה אוליגודנדרוציטים neuroinflammation חומצה היאלורונית חמה
שיפור תרבויות הידרוג 3D של תאי גליה העיקרי עבור <em>במבחנה</em> דוגמנות של Neuroinflammation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koss, K. M., Churchward, M. A.,… More

Koss, K. M., Churchward, M. A., Jeffery, A. F., Mushahwar, V. K., Elias, A. L., Todd, K. G. Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (130), e56615, doi:10.3791/56615 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter