Summary
Adjunto, presentamos un protocolo para el cultivo 3D de rata células glia derivado del cerebro, incluyendo astrocitos, microglia y oligodendrocitos. Demostramos cultivo celular primario, síntesis de hidrogel desarrolla el ácido hialurónico (HAMA), encapsulación HAMAphoto-polimerización y de la célula y muestra de procesamiento para la proyección de imagen microscópica electrónica de barrido y confocal.
Abstract
En el sistema nervioso central, numerosas lesiones agudas y enfermedades neurodegenerativas, así como implantados dispositivos o biomateriales diseñados para mejorar el resultado de la función en el mismo resultado: inflamación exceso conduce a gliosis, citotoxicidad, o formación de una cicatriz glial que colectivamente exacerban la lesión o impiden la sana recuperación. Con la intención de crear un sistema modelo cicatriz glial formación y estudio de los procesos inflamatorios, hemos generado un andamio celular 3D capaz de albergar células gliales cultivadas primarias: microglía que regulan la respuesta de cuerpo extraño e iniciar la eventos inflamatorios, astrocitos que responden a la forma de una cicatriz fibrosa y oligodendrocitos que son generalmente vulnerables a lesiones inflamatorias. El presente trabajo proporciona un método paso a paso detallado de la fabricación, la cultura y la caracterización microscópica de un andamio de hidrogel 3D a base de ácido hialurónico con encapsulado rata derivado de células gliales. Además, se demuestran los protocolos para la caracterización de la encapsulación de la célula y el andamio de hidrogel por inmunofluorescencia confocal y microscopía electrónica de barrido, así como la capacidad de modificar el andamio con substratos bioactivos, con incorporación de una mezcla comercial lámina basal a la integración mejorada de la célula.
Introduction
Inflamación del sistema nervioso central (SNC) durante mucho tiempo ha sido considerado como un sello de aguda (p. ej., accidente cerebrovascular isquémico, cerebral y lesión medular) y crónicas (por ejemplo enfermedad de Alzheimer, Parkinson de y las enfermedades de Huntington) lesión del CNS, pero es cada vez más reconocido como una contribución causal a neurodegenerativas y trastornos neuropsiquiátricos. Sostenida o inflamación inadecuada puede causar lesiones neurales y desmielinización (p. ej. , esclerosis múltiple) e influyen negativamente en el desarrollo del cerebro (p. ej., esquizofrenia, autismo) y Estados de ánimo (p. ej., depresión, ansiedad trastorno bipolar). Además, nuevas estrategias terapéuticas utilizando dispositivos implantables (e.g., interfaces cerebro-computadora1,2,3, cerebral profunda estimulación4,5, intraspinal microstimulation6,7,8,9,10) generan una respuesta inflamatoria predecible en la interfaz entre el dispositivo y el SNC, resultando en un respuesta de tejido protector que puede causar pérdida de eficacia o dispositivo falla durante la vida útil de los implantes11. Inflamación en el SNC es típicamente iniciada por microglía, que funcionan como las células inmunes residentes del SNC responsable de vigilancia de tejido y la respuesta de cuerpo extraño (ha comentado12) de montaje. Dependiendo de la gravedad de un insulto, la señal de la microglia y recluta adicional celular tipos a un sitio de la lesión. Específicamente, la microglia activar los astrocitos, que a su vez actúan como células inflamatorias secundarias y forma una barrera protectora densa que contiene una lesión sitio13,14. Microglía también puede iniciar una cascada de actividad en las células del sistema inmune periférico, que puede resultar en la ruptura de la BBB para permitir la infiltración inmunitaria (revisada en la referencia15).
En el caso de dispositivos implantados en el SNC, daño tisular resultante de la inserción de un dispositivo así como la permanencia del dispositivo exterior puede iniciar un proceso llamado el marcar con una cicatriz glial. En este proceso, la microglia migran y proliferan en el sitio de la lesión. También inician la liberación de factores inflamatorios para neutralizar amenazas potenciales y reclutan más células gliales. Posteriormente, astrocitos activados se convierten hipertróficos y comienzan a encapsular el dispositivo implantado para formar una barrera fibrosa continua16. Señalización inflamatoria también sirve para promover la retirada de los procesos neuronales de la vecindad del implante y finalmente contrata a los fibroblastos para reforzar el desarrollo de cicatriz glial17. Los oligodendrocitos, responsables de recubrimiento de las neuronas de mielina para mejorar la conductancia, no sobreviven este proceso y se reparten las células distantes del implante por la cicatriz de18. Cicatriz glial grandemente reduce la función y vida útil de dispositivos implantados, especialmente para electrodos de grabación y en última instancia, sirve para limitar la funcionalidad de los interfaces neuronales19.
Varios acercamientos se han aprovechado para aumentar la biocompatibilidad y actividad del interfaz de dispositivos implantados en el CNS20,21,,,2223. Una extensa revisión está disponible en el diseño biocompatible de estas interfaces neuronales24. Las estrategias más importantes incluyen que rodea el electrodo con capas compatibles tales como polyelthyleneglycol (PEG), ácidos poliláctico-co-glicólico (PLGA)25, o mejorar el electrodo con polímeros conductores como poli (etileno dioxythiophene) (PEDOT) y el polypyrrole (PPy)26,27,28,29,30,31. Recubrimientos bioactivos también han sido empleados para proporcionar claves para el crecimiento del tejido neural con ligandos derivados de matrices extracelulares incluyendo colágenos, fibronectinas y ácidos hialurónico32,33,34 ,35,36,37. La bioactividad de estos recubrimientos se ha explorado más lejos con sistemas de liberación de factor de crecimiento para emular celular natural secreciones30,38,39,40,41 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50. al mismo tiempo, algunos grupos de investigación han optado por remodelar la geometría del electrodo, la flexibilidad y la composición para disminuir el desajuste mecánico entre aparato y tejidos51,52,53 ,54,55,56,57. En conjunto, estas estrategias han dado lugar a muchas mejoras prometedoras en dispositivos interfaciales neurales de próxima generación, sin embargo la compatibilidad a largo plazo es un problema en curso y el progreso puede verse obstaculizado por modelos complejos y lentos en vivo .
Enfoques basados en el modelo animal pueden limitar el rendimiento experimental y aumentan los costos de las pruebas de biocompatibilidad del electrodo. In vitro se aproxima mediante cultivo celular convencional técnicas ofrecen una alternativa más rentable pero no mucho de la complejidad de la interacción entre dispositivo y tejido58recapitular. En particular, pruebas de recubrimientos de superficie con límites de cultura celular 2D el modelado de la geometría del electrodo y la influencia del desajuste mecánico y micromotion pensado para contribuir a generar una respuesta de host contribuyendo al fracaso de dispositivo59 , 60.
Para superar los problemas asociados con el cultivo celular 2D, hidrogel cultivos de células neuronales se han desarrollado para una amplia variedad de aplicaciones, estudios farmacológicos61, para dirigir la célula neuronal diferenciación62, para entender la enfermedad vías63,64, o capas en co-cultivo con otros tipos de células para la migración celular de modelo, neuroprotección, o modelo tejido microambientes61. Los hidrogeles se forman fácilmente en diferentes tamaños y geometrías pueden incorporar varios tipos de cultivos celulares primarios o inmortalizadas y son altamente susceptibles de análisis por técnicas utilizadas como la microscopía de fluorescencia confocal. Para crear un modelo del proceso de cicatrización glial, recientemente hemos desarrollado y caracterizado un sistema de hidrogel 3D basado en ácido hialurónico para alto rendimiento de la prueba de la respuesta glial a electrodos implantados (figura 1)65. Este sistema tiene varias ventajas: 1) primarias células gliales (microglia, astrocitos y oligodendrocitos) están encapsuladas en una matriz 3D compuesto por polímeros de ácido hialurónico, que es un componente de la matriz extracelular endógeno; 2) la rigidez de la matriz puede ser 'afinada' para recrear las propiedades mecánicas del cerebro o el tejido de la médula espinal; y 3) las células pueden ser encapsuladas en la matriz en forma de mesa rápida mediante fotopolimerización con luz verde, limitar la toxicidad durante la encapsulación. Este sistema permite que las características clave de biocompatibilidad en vivo : los dispositivos se insertan en el hidrogel de manera comparable al tejido, y la respuesta celular a dispositivos implantados son supervisados para una amplia gama de parámetros65. Estos incluyen mecánica falta de coincidencia entre los dispositivos y los recubrimientos de hidrogel de diversas estructuras y pulsos de estimulación eléctrica. Este sistema también incluye oligodendrocyte y precursores relacionados, que están a menudo presentes y reclutados en las cicatrices gliales. Su fagocitosis por microglía, daño y muerte son altamente indicativos de lesión inflamatoria y un modelo de reducción de cicatrización o recuperación, tienen la capacidad para demostrar re-mielinización de las neuronas66.
Adjunto describimos un método para la síntesis y formación de híbridos hidrogeles de ácido hialurónico combinados con formulaciones disponibles en el mercado la membrana del sótano para mejorar la incorporación de la célula. Además, demostraremos la incorporación de las células gliales cultivadas primarias (microglia, astrocitos y oligodendrocitos) y análisis del crecimiento de la cultura mediante inmunocitoquímica y microscopía confocal.
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Protocol
El protocolo para la extracción de tejido de cerebro de crías de rata de Sprague Dawley de día 1, sacrificados por decapitación, fue aprobado por el cuidado Animal y uso de la Universidad de Alberta.
1. Microglia y astrositos aislamientos67,68
Nota: Todos los medios para el aislamiento y el cultivo celular es precalentado a 37 ° C en un baño de agua. Una solución salina equilibrada de Hank (HBSS) tiene 1% de penicilina-estreptomicina (PS). Todos Dulbecco modificado de medios del águila con Ham F12 mezcla nutriente (DMEM/F12) es complementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina (PS). Mezclas sólo con tripsina carecen de FBS. Todos los materiales en este protocolo son estéril (filtro, alcohol, comprado y autoclave) y cada paso subsecuente a número de paso 1.8 se realiza en un gabinete con técnica aséptica de bioseguridad.
- Por cerebro, calentar previamente 15 mL de HBSS y 12,5 mL DMEM/F12 a 37 ° C en tubos de centrífuga cónico de 50 mL y 2 mL de tripsina 0.25% con 1 mM dihidratada del ácido (EDTA) en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL aproximadamente. Calentar un adicional 25 mL de DMEM/F12. Tripsina caliente unos 10 minutos antes de usar para evitar la pérdida de actividad enzimática.
- Vierta suficiente HBSS tibia estéril, 6 y 10 cm cultura platos para cubrir la superficie. Preparar un plato de 10 cm para cada dos cerebros y un plato adicional de 6 cm.
- Colocar hasta 2 cerebros en cada plato2 de 10 cm (figura 2A).
- Bajo un microscopio de disección, utilice pinzas curvas y rectas para separar las corticales a lo largo de la línea media y el cerebelo con el tronco cerebral. Esto produce tres secciones de tejido por cerebro (figura 2B).
- Pele la capa delgada, semitransparente, (meninges) del tejido que contiene los vasos sanguíneos de cada sección del tejido y descartar, transferir el tejido restante en un plato de cultura independiente. Agarre las capas delgadas expuestas por los cortes de tejido con pinzas y con cuidado jale hasta porciones principales son 'colgándose de' el tejido cerebral. Finalmente retirar esta parte tirando suavemente. Ver figura 2-2E para imágenes representativas de antes, durante y después de este paso.
- En un gabinete de bioseguridad, quite la HBSS restantes de la placa de cultivo, conservando cuidadosamente el tejido. Macerar el tejido con un bisturí y transferir el tejido al tubo con 15 mL con tripsina.
- Incubar este tubo por 25 min en un baño de 37 ° C para digerir el tejido enzimáticamente.
- Centrifugar el tubo abajo a 500 x g durante 2 min a temperatura ambiente y vaciar el sobrenadante.
- Utilizando una pipeta serológica de 10 mL, añadir 10 mL de DMEM/F12 caliente para inactivar la tripsina y triturate la solución 5 veces para romper el tejido.
- Centrifugar el tubo abajo a 500 x g durante 2 min a temperatura ambiente y vaciar el sobrenadante.
- Con una pipeta serológica de 10 mL, vuelva a suspender el sedimento en 10 mL de DMEM/F12 caliente y transferir la solución a un tubo de centrífuga cónico de 50 mL.
- Utilizando una jeringa de 10 mL con una aguja de 18 calibre, triturate la solución 3 veces.
- Distribuir esta solución en incrementos de 12,5 mL de DMEM/F12 caliente por cerebro.
- Incrementos de pipeta 1 mL de la solución triturada en una placa bien 12 (1 por cerebro).
- Incubar a 37 ° C y 5% de CO2en una incubadora de cultivo celular humidificado. Sustituir los medios de comunicación después de tres días y actualizar los medios de comunicación cada tres días posteriores. Después de 2 semanas, las células se pueden recoger para los experimentos.
2. Macromer síntesis69
- Peso 375 mg de sal de ácido hialurónico (HA) en un tubo de centrífuga cónico de 50 mL y añadir 37,5 mL de agua destilada.
- Enjuague la solución con un Vortex durante 1 minuto y someter a ultrasonidos la mezcla hasta que aparece homogénea y pierde su viscosidad gelatinosa. Este proceso tarda 6 h.
- Solución de transferencia a un vaso de precipitados de 100 mL con un magnético revolver bar (38 mm) y revuelva vigorosamente a temperatura ambiente.
- Valorar cuidadosamente 5.0 M NaOH en la mezcla HA y medida con papel pH hasta que el pH se estabiliza entre 8 y 12.
- Recoger 3 mL de anhídrido metacrílico fresco (MA, 94%), cubierto por el nitrógeno durante el almacenamiento.
Nota: MA es expuesto a la atmósfera durante largos períodos (días), perderá su reactividad.
PRECAUCIÓN: Todo el uso de MA debe realizarse en una campana de humos. - Añadir 200 μL de MA en la solución mezcla de HA. La reacción reduce el pH de la solución por debajo de 8.
- Repita los pasos del 2.4 a 2.6 hasta 3 mL de MA se han añadido a la solución. Este proceso puede tardar hasta 1-2 h.
- Permita que la reacción continúe durante la noche a 4 ° C, sin mezcla.
- Transferir la solución a 400 mL de etanol frío (EtOH) en un vaso de precipitados de 500 mL y permite la precipitación de 24-72 h a 4 ° C. 56
- Cuidadosamente decantar la mayor parte de la solución en un vaso separado para su eliminación y recoger el precipitado en un tubo de centrífuga cónico de 50 mL. Esto puede ser distribuido en tubos de 2-4, si es necesario.
- Centrifugar los tubos a 200 x g en una centrífuga durante 2 min a temperatura ambiente y elimine el sobrenadante.
- Completar el tubo con EtOH frío, mezclar la solución con un Vortex durante 1 minuto y repita paso 2.10-2.11.
- Añadir 25 mL de agua desionizada estéril, mezclar la solución con un Vortex durante 1 minuto, someter a ultrasonidos (> 20 kHz) durante 1 h e incubar a 4 ° C durante la noche.
- Coloque la solución en un congelador de-80 ° C por 15 minutos o hasta que congelado o flash congelar en nitrógeno líquido.
PRECAUCIÓN: Cuando se utiliza el nitrógeno líquido, use guantes, máscara facial y delantal. - Congelar seca el tubo (por debajo de 0,1 mBar y -30 ° C) durante 24-48 h hasta que se produce un nieve como el polvo.
- En este punto, prueba de la muestra de la pureza mediante 1H resonancia magnética, donde se puede confirmar la cantidad de protones de metacrilato (picos en 6.1 y 5.6 ppm), en relación con los protones del metilo (1,9 ppm), en la columna vertebral HA. Una proporción mínima de 95% metacrilato a los protones del metilo es aceptable. 69
3. gel formación y encapsulación 3D65
-
Cubreobjetos y preparación del molde
- Hacer una solución de agua de 50 mL de agua de 2% 3-(trimetoxisilil) metacrilato de propilo en un tubo de centrífuga cónico de 50 mL.
- Coloque el cubreobjetos de vidrio 18 mm en solución y el rock por 1 h a temperatura ambiente. Pueden agregar hasta 50 cubreobjetos a la vez.
- Enjuague el cubreobjetos sumergiendo en serie cada uno en 3 vasos de precipitado de 100 mL de agua desionizada.
- Seque el cubreobjetos en el vacío a 40 ° C durante la noche con un desecador y horno.
- Rápidamente sumergir cada cubreobjetos en el 70% EtOH con fórceps.
- Sin secado, coloque cada cubreobjetos en un pozo de una placa bien 12.
- Lavar y aspirar cada pocillo con agua desionizada estéril (1 mL por pozo).
- Añadir 1 mL de estéril 2 μg/ml poli-l-lisina (PLL) en cada pocillo e incubar durante > 2 h.
- Aspirar solución PLL y seque el cubreobjetos al aire.
- Sumerja el polydimethyl siloxano (PDMS) moldes (ver figura 1) 70% EtOH y el lugar uno en el centro de cada cubreobjetos y deje secar al aire y crear un sello entre el molde y el vidrio.
- Preparar moldes PDMS casting reactivos de premezcla PDMS en una proporción 10:1 en un recipiente de poliestireno fondo plano. Se selecciona la cantidad de PDMS preparado para producir una hoja de aproximadamente 1 mm de espesor. A pozos de forma en el PDMS, cortar las hojas con un golpe de círculo con un diámetro interno de 10.
-
Preparación de la célula
Nota: Todos los pasos del Protocolo se realizan con técnica estéril en un gabinete de bioseguridad. El tampón fosfato salino (PBS) es ajustado a pH 7.4 para todos los pasos.- 24 h antes de la encapsulación de la célula en HAMA, refrescar el medio para el cultivo primario de 2 semanas (de paso 1.15) en las placas bien 12. Añadir 1 mL de DMEM/F12 (10% FBS y 1% PS) medio por pozo.
- Para cada placa de 12 pozos de células preparar 12,5 mL de tripsina diluir (0.25% tripsina-EDTA diluido 30% con medio DMEM/F12) y 25 mL DMEM/F12 (10% FBS y 1% PS) y caliente a 37 ° C en un baño de agua.
- Recoger medio condicionado de placas utilizando una pipeta serológica de 10 mL (> 0,5 mL por pozo) bien aspirar el líquido restante y reemplazar con 1 mL por pozo de tripsina diluir (0.075% tripsina-EDTA) durante 20-30 minutos en una incubadora (37 ° C, 5% CO2) hasta la capa de células confluentes se separa de la placa.
- Recuperar material de la suspensión celular con una pipeta de 1 mL (aparece como una sola pieza flotante) y recoger en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL. Diluir con un volumen equivalente de DMEM/F12 (10% FBS y 1% PS) y centrifugar a 200 x g durante 2 min a temperatura ambiente, descartando el sobrenadante.
- Resuspender el pellet celular en 10 mL caliente DMEM/F12 (10% FBS y 1% PS), triturate las células 5 veces con una pipeta de 10 mL y centrifugar a 200 x g durante 2 minutos.
- Decantar el sobrenadante, resuspender las células en 5 mL caliente DMEM/F12 y transferir las células a un tubo cónico de centrífuga de 50 mL.
- Utilizando una jeringa de 10 mL con una aguja de 18 calibre, triturate la solución celular 3 veces y filtrar la suspensión a través de un tamiz de 40 μm células en un nuevo tubo de centrífuga cónico.
- Recoger 10 μl de suspensión celular, diluya 1: 100 en caliente DMEM/F12 y contar las células con un contador de células automatizado
- Incubar en un baño de agua de 37 ° C hasta el paso de la encapsulación.
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Encapsulación de la célula
Nota: Todos los pasos del Protocolo se realizan con técnica estéril en un gabinete de bioseguridad.- Para cada placa de 12 pozos de 3D hidrogeles caliente 12,5 mL de DMEM/F12 y 12,5 mL del medio DMEM/F12 acondicionado recogido durante la preparación de la célula.
- Pesar la cantidad de ácido de hialurónico desarrolla (HAMA) requerido para una concentración final de 0.5% peso/vol. disolver este HAMA en PBS estéril filtrada en una concentración (2% peso/vol); una concentración 4 veces mayor que la concentración final se utiliza para acomodar la adición de las células y otros reactivos. Un plato bien 12 de hidrogeles requiere ~ 350 μl PBS con 7 mg HAMA.
- Someter a ultrasonidos (> 20 kHz) soluciones hasta que HAMA está completamente disuelto durante 60 min.
- Preparar soluciones individuales de 10% de trietanolamina (TEA) y 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) y una solución de eosina Y (EY) de 1 mM en alícuotas de 1 mL de pH de PBS estéril 7.4.
- Para placa de 12 bien, hacer una mezcla final 1,4 mL de 1 x 107 células, 0.5% wt/vol HAMA (350 μl de la 2% wt/vol), 0.1% TEA (14 μl de 10%), 0.1% NVP (14 μl de 10%) y 0.01 mM EY (14 μl de 1 mM) y mezcla 20% de la lámina basal (280 μl de caldo). El volumen restante es PBS.
- Suavemente mezcle la solución y Pipetear 100 μL en cada molde PDMS con una punta de 1 mL.
- Exponer las muestras a una luz de LED verde de alta intensidad (~ 520 nm, 60 mW, en un cerrado 20 cm x 20 cm x 20 cm caja) por 5 min a temperatura ambiente.
- Añada 1 mL por pozo de DMEM/F12 acondicionado caliente sobre una placa bien 12.
- Sujete cada cubreobjetos entre el pulgar y el índice, retire el molde PDMS con curva pinzas teniendo cuidado de no desplazar el gel lentamente y ponga en un pocillo con medio condicionado.
- Agregar un 1 mL adicional caliente DMEM/F12 a cada pocillo.
- Incube las placas a 37 ° C con 5% CO2 para 2 semanas, actualizar los medios de comunicación de la célula cada semana por Pipetear 1 mL de medios de comunicación de cada pozo y reemplazar con 1 mL DMEM/F12.
4. microscopía
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Inmunocitoquímica
Nota: Se utilizó un microscopio confocal invertido a la imagen de estas muestras y ImageJ fue utilizado para procesar y mostrar las imágenes. Microglia, astrocitos, oligodendrocitos y núcleos, serán marcados después de 3 semanas en la cultura de HAMA.- Precalentamiento con tampón PBS formalina al 10% (pH 7.0) en un baño a 37 ° C.
PRECAUCIÓN: Aunque formalina puede usarse fuera de una campana de humos, este material es reactivo con el tejido y se debe manejar con cuidado y guantes siempre. Se debe disponer por separado. - Aspirar con cuidado los medios de comunicación de las placas y la pipeta 1 mL de formol al 10% a cada pocillo.
- Incubar las placas a 37 ° C en un 5% de CO2 por 20 min.
- Aspirar cuidadosamente el líquido de cada plato, pipetear 2 mL de PBS (pH 7.4) en cada pocillo e incube durante 15 minutos.
- Repita el paso 4.1.4 dos veces.
- Aspirar cuidadosamente el líquido de las placas, añada 1 mL por pocillo de PBS con 10% de suero normal de caballo (NHS) y 0.5% Tritón X-100 y muévalo suavemente a velocidad mínima) durante 1 hora.
- Repita el paso 4.1.4 tres veces.
- Aspirar cuidadosamente el líquido y añada 1 mL por pocillo de la siguiente mezcla en PBS: conejo ionizado calcio-que ata adaptador molécula (Iba1) 1:1, 000, pollo proteína fibrilar glial (GFAP) 1:5, 000, ratón 2', 3' nucelotide-cíclico 3'-phophodiesterase (CNPase) 1:1, 000, 1% NHS , y 0,1% surfactante perforación de la célula. Incubar a 4 ° C durante la noche, oscilando la placa tan suavemente como sea posible.
- Repita el paso 4.1.4 tres veces con incubaciones de 1 h en el medio.
- Aspirar cuidadosamente el líquido y añada 1 mL por pocillo de la siguiente mezcla en PBS: 647 nm emocionado burro anticuerpo de anti-conejo 1: 200, 546 nm emocionado cabra anticuerpos anti-pollo 1: 200, 488 nm emocionado burro anticuerpo de anti-ratón 1: 200, 1% NHS, 1:1,000 azul tinción nuclear. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h, mecer suavemente la placa.
- Repita el paso 4 tres veces con incubaciones de 1 h en el medio.
- Para conservar los hidrogeles, aspirar el tampón y sumergirlos en 0,5 mL de medio de montaje de la célula durante 1 minuto pipeta hacia fuera el medio de montaje y colocar suavemente un cubreobjetos sobre el gel, creando una capa entre el vidrio. Agregue una pequeña cantidad de medio de montaje para el lado descubierto de cubreobjetos para evitar la sequedad del hidrogel.
Nota: Para propósitos de solución de problemas, geles pueden ser reflejados en el paso 4.1.11. Ver etiquetado adecuado antes de proseguir.
- Precalentamiento con tampón PBS formalina al 10% (pH 7.0) en un baño a 37 ° C.
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Microscopía electrónica de barrido (SEM)
Nota: Para visualizar el hidrogel, un microscopio electrónico de barrido se utilizó para estas muestras la imagen.- Precaliente una mezcla fijadora del 2.5% paraformaldehido glutaraldehído y 2% en PBS (0,1 M) en un baño de agua de 37 ° C.
PRECAUCIÓN: Estos reactivos son altamente reactivos con los tejidos y deben ser manejados con cuidado y guantes. Deben ser manejados en una campana de humo tanto como sea posible y desecharse por separado. - Aspirar el medio de las placas de cultivo celular y añadir 1 mL de la mezcla fijadora precalentada.
- Incubar las placas a 37 ° C en un 5% de CO2 por 20 min.
- Coloque las placas en 4 ° C (nevera/refrigerador) durante la noche.
- Aspire la solución fijadora de los pocillos y agregar 1 mL de PBS.
- Aspirar cuidadosamente el líquido de cada plato, añadir 2 mL de PBS en cada pocillo e incube durante 15 minutos.
- Repita el paso 4.2.6 dos veces más.
- Aspire el PBS y añadir 1 mL de tetraóxido de osmio 1% tamponada en PBS a cada pocillo.
Nota: Hasta que se secan las muestras, este paso y todos los pasos posteriores se realizan en una campana de humos. - Permite fijación ocurra para vapores de osmio de 30 min. del líquido pueden fijar otras muestras en el mismo plato; por lo tanto, las muestras de la partición por consiguiente antes de este paso.
PRECAUCIÓN: Tetraóxido de osmio es altamente reactivo con el tejido y volátiles. Es peligroso y debe manejarse en la campana de humos con guantes. Y cualquier inmediato lavado debe ser dispuesto por separado. - Repita el paso 4.2.6 tres veces.
- Aspirar el líquido y agregar la mezcla deshidratante en la lista a continuación, en orden e Incube (temperatura ambiente) durante el tiempo indicado. Comience poco a poco añadiendo etanol (EtOH) siguió entonces hexamethyldisilazane (HMDS). Consulte la tabla 2 para cada incremento.
Nota: Al agregar HMDS, el cubreobjetos pueden fuertemente se adhieren al plástico y se convierten en muy difícil de eliminar. Esto puede evitarse colocando una pequeña plataforma plástica bajo la hoja de vidrio después de la primera aplicación de HMDS. Después de la segunda incubación de EtOH, la muestra puede ser tomada hacia fuera y apagó en nitrógeno líquido durante unos segundos inmovilizar la fractura de la muestra. - Retirar las muestras secadas cuidadosamente y montar las muestras en los talones de microscopio electrónico de barrido con doble cinta adhesiva conductora.
- Farfulle la capa las muestras con una cantidad mínima de oro. Coloque las muestras en un porta y funcionar la máquina durante 2 min a 15 mA.
- Precaliente una mezcla fijadora del 2.5% paraformaldehido glutaraldehído y 2% en PBS (0,1 M) en un baño de agua de 37 ° C.
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Representative Results
Para modelar la respuesta del huésped tejido neural y la cicatriz glial en un alto rendimiento, sistema in vitro requiere un andamiaje celular 3D con un material de matriz que es biocompatible, no incurrir en un evento de citotóxico durante la formación en situ y es modificable con componentes bio-activos para guiar la respuesta benévola. Para ello, hemos creado un sistema de andamio de celular 3D basado en ácido hialurónico y encapsulado en una población de células gliales mixtos primaria para estudiar las interacciones célula-célula y bioreactivity glial. Se realizó un breve estudio visual de las células y andamio. Morfología de las subpoblaciones de células, incluyendo oligodendrocitos (CNPase en verde), microglía (Iba1 en rojo), y astrocitos (GFAP en amarillo), se muestran mediante microscopía confocal inmunofluorescente (figura 3Ai-ii-Ci-ii). También se muestran morfología combinada de andamio y de la célula por SEM (figura 3Aiii-iv - Ciii-iv). En estas imágenes, se muestran bajos (i y iii) y alto (ii y iv) resolución imágenes representativas. Una capa 2D de cubreobjetos PLL (Figura 3A) se comparó con un 3D 0.5% w/v HAMA andamio (figura 3B) y una mezcla de mezcla al 20% v/v lámina basal en 0.5% w/v HAMA (figura 3). Esto se hizo para demostrar las diferencias morfológicas en 2D y 3D de la célula cultura, así como el efecto de la introducción de una lámina biológica al andamio. Una reconstrucción 3D también está disponible en la información complementaria.
Morfología de la célula de cada tipo de célula que cambió con la introducción de una plataforma 3D. En cultura adherente 2D (cubreobjetos de vidrio recubierto de PLL), oligodendrocitos aparecieron normalmente redondos y formadas redes pequeñas generalmente conectando con ligeramente marcados procesos GFAP. Microglia eran más pequeño que otras células y tenía pequeños procesos de ramificación que no extendió lejos de sus cuerpos de la célula (< 20 μm). Los astrocitos fueron formados más diverso, algunos tener una morfología radial con cuerpos celulares pequeños y extensos procesos delgados, ramificados, mientras que otros eran fibrosos con un aspecto aplanado y pocos procesos amplia que cubra la superficie. En la cultura de HAMA 3D, oligodendrocitos aparecieron en racimos que ramificó en esferas más pequeñas. Microglia eran redondos con unos procesos y astrocitos fueron redondeados o ramificados apagado radialmente en las redes de un único clúster. Por lo general, estas células parecen ya de puntos individuales o permanecer en las áreas de la HAMA sin hacer contacto con otras células, que es diferente a la cultura 2D y es sugestivo de movilidad a través de la matriz. Al 20% v/v de una mezcla de lámina basal fue agregada a la mezcla de foto polimerización, todos los subtipos gliales integración con la plataforma 3D y forman estructuras ramificadas más amplia, interactivas. Oligodendrocitos extendido procesos bulbosos radialmente similares a la morfología de la mezcla de lámina no básica, pero además parecen extender procesos a lo largo de las redes interconectadas finas de los procesos de astrositos sucursales en todo el andamio. Microglia se dispersaron entre estas redes celulares, que extendió con finos procesos más coherentes con su morfología en el tejido. En general, las morfologías sugieren los tres tipos de glia integrado en la mezcla de lámina basal HAMA libremente, potencialmente por cualquier mayor adherencia al sustrato mixto o por mayor capacidad para remodelar el andamio.
Cuando por el SEM, morfología de la célula fue considerada para corroborar las micrografías confocales. La matriz de HAMA apareció como una superficie lisa con 10-50 μm poros vistos ligeramente debajo de la superficie. Células eran adherentes a la superficie de la HAMA y débilmente visible en capas por debajo. Estos glia no formó morfologías comparables a los observados en cultura 2D, sin embargo con la adición de una mezcla de la lámina basal, se observó extensa red. Fibras de astrositos gruesas, con pequeños racimos de microglía se observaron tanto en la superficie de mezcla de lámina basal HAMA y extendiéndose a través de la matriz de una manera transparente. Esto puede considerarse ligeramente la matriz plegada alrededor de las células, lo que sugiere que las células pueden alterar el andamio formado en sus conformaciones deseadas.
Figura 1: esquema de desarrolla el ácido hialurónico (HAMA)-basado en protocolo cultura y fotopolimerización 3D celular. Células gliales (cultura de cerebro de rata primaria 2 semanas) se mezclan con HAMA y pipeta en un molde de polidimetilsiloxano (PDMS) en un cubreobjetos de vidrio. Esta mezcla se expone a una luz de LED de alta intensidad verde para polimerizar el hidrogel durante 5 minutos. Se retira el molde y el gel se incuba en los medios de comunicación. Las células representativas incluyen microglía (rojo), astrocitos (amarillos) y oligodendrocitos (verde). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: disección del cerebro de crías de rata de Sprague Dawley de día 1. Imágenes de todo el cerebro (A), la disección de las cortezas y el cerebelo (B), una sola corteza meninges (C), peeling de las meninges con pinzas (D) y la corteza libre de meninge (E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Confocal inmunofluorescente (i-ii) y análisis de micrografías electrónicas (iii-iv) de poblaciones de células de la glia mezclado en capas 2D de PLL (A) y HAMA (B) mezcla de lámina basal HAMA (C). Inferior (i, iii) y superior (ii, iv) se muestran imágenes de la ampliación. Las etiquetas incluyen Iba1 en rojo por microglía, GFAP en amarillo para una tinción nuclear de Hoechst, astrocitos y CNPase en verde de oligodendrocitos. Barras de escala = 25 μm para imágenes confocales y 50 (iii) y 20 μm (iv) análisis de micrografías electrónicas. Los hidrogeles fueron 0.5% w/v, y mezcla de lámina basal fue del 20% por volumen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Suplementario Figura 1: 3D reconstrucción micrográfica inmunofluorescente de mezcla de lámina basal HAMA con mezcla poblaciones de células de la glia mezcla de lámina basal HAMA. Las etiquetas incluyen Iba1 en rojo por microglía, GFAP en amarillo para una tinción nuclear de Hoechst, astrocitos y CNPase en verde de oligodendrocitos. Los hidrogeles fueron 0.5% w/v, y Getrex fue del 20% por volumen. Haga clic aquí para descargar este archivo.
| HAMA | Lámina basal | NVP | TÉ | EY | |
| Concentración de trabajo | 0.5% w/v | 20% v/v | 0.10% | 0.10% | .01 mM |
| Placa de 12 pozos | 2% w/v | 100% w/v | 10% v/v | 10% v/v | 1 mM |
| 1,4 mL Total | 350 ΜL | 280 ΜL | 14 ΜL | 14 ΜL | 14 ΜL |
Tabla 1: Ejemplo de encapsulación de la célula.
| Componente | Contenido | Tiempo de incubación |
| EtOH | 30% | 30 min |
| EtOH | 50% | 30 min |
| EtOH | 70% | 30 min |
| EtOH | 90% | 20 min |
| EtOH | 100% | 20 min |
| EtOH | 100% | 20 min |
| EtOH:HMDS | 75:25 | 20 min |
| EtOH:HMDS | 50:50:00 | 20 min |
| EtOH:HMDS | 25:75 | 20 min |
| HMDS | 100% | 20 min |
| HMDS | 100% | Durante la noche |
Tabla 2: Incrementos graduales de EtOH y HMDS en deshidratación.
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Discussion
Con el objetivo de generar un sistema de cultura 3D modelo bioreactivity glial y el proceso de cicatrización glial, hemos desarrollado un sistema que puede apoyar primaria cultivada microglia, astrocitos y oligodendrocitos y permite la caracterización sólida de células interacciones célula-célula y morfología. De las micrografías muestras la morfología de cada tipo de célula era distintamente diferente con 3D, 2D y 3D-HAMA HAMA Basal lámina mezcla las plataformas. En el sistema 2D, morfología claramente era parcial en el plano de la superficie, pero en comparación con el 3D HAMA, microglia y astrocitos eran generalmente más pequeños dentro de la matriz, con la excepción de racimos de oligodendrocyte. Las micrografías de barrido, las células eran generalmente más redondo en forma de la HAMA. Esto puede deberse en gran medida las células ser encapsuladas, con limitada capacidad para modificar la matriz de locomoción y libre circulación y el crecimiento de los procesos. Consecuencia de la célula en la HAMA era típicamente radial de astrocitos y oligodendrocitos. Si bien estas células procesos extendidos, su organización sugieren que limitaron sus movimientos a lo largo de la matriz y la capacidad de interactuar con otras células. Además, trabajo previo ha demostrado HAMA freeze-fracturada al ser porosos sin redes interconectadas, que pueden explicar esta falta de consecuencia65,70. Es posible que algunas de estas células no sobrevivió a la fotopolimerización, queda preservada en la matriz, sin embargo la viabilidad se evaluó sistemáticamente en nuestro anterior trabajo y seguía siendo el 80% (0.5% w/v) en el transcurso de una semana65.
Para mejorar la interacción de la célula con la matriz de cultura 3D, hemos introducido una mezcla de lámina basal como un componente de la matriz biocompatible y modificables. Integración de la célula con la matriz fue encontrado para ser mejorado, con todos los tipos de células que muestran procesos extensos en comparación con la cultura 2D y 3D HAMA. La mezcla de la lámina basal está compuesta por unos componentes de la lámina basal de variedad y está formulada principalmente para apoyar la diferenciación glial de la célula de vástago neuronales precursores71. No fue inesperado que las células gliales respondieron a la mezcla de la lámina basal y posteriormente la matriz circundante 3D, pero el grado de integración sugiere un ambiente similar a tejido sano. Comparando HAMA HAMA basal mezcla de lámina, la morfología de hidrogel no aparece claramente diferente, por lo tanto, las células pueden ser más activamente remodelación lo. Teniendo en cuenta la simplicidad de agregar este componente bioactivo, no es impensable utilizar diferentes láminas o señales de la proteína para favorecer las condiciones de cultivo para las neuronas. En una posible futura dirección, este sistema podría ser utilizado distinguir neuronas de progenitores neuronales junto con glia mixto para una variedad de modelos de lesión neuro-inflamatorio o mielinización impactante.
En caso de lesión del CNS grave y dañina o rechazo de biomaterial, el tejido residente inicia reacciones inflamatorias capaces de exacerbar la neurodegeneración y desmielinización. Esto normalmente resulta en la formación de una cicatriz glial en el sitio de la lesión, que impide la regeneración de la partición. En este estudio, se detallaron los métodos para un desarrolla foto-polimerizado a base de ácido hialurónico 3D andamio con la intención de modelar la respuesta celular inicial detrás de la formación glial de la cicatriz; reactividad de microglial, reclutamiento de astrositos e hipertrofia y oligodendrocyte lesión y retirada. Un andamio celular 3D fue diseñado para incorporar los tres tipos de células gliales y además fue modificado con una mezcla de varios componentes de lámina basal. Se determinó, por microscopía confocal y análisis de imágenes, que las células fueron encapsuladas en la HAMA y mejor capaces de integrar cuando se introdujo la mezcla de la lámina basal. Estos resultados podrían conducir a varias aplicaciones novedosas. HAMA solo puede servir para crear sistemas de co-cultivo donde se pretende limitar la interacción célula a célula o estudio destilar fármaco usando el gel como matriz limitada difusión cargado de drogas. Hidrogeles, incorporar la mezcla de la lámina basal de la matriz de HAMA permiten un ambiente más consistente de tejido-como capaces de modelar la inflamación aguda, gliosis o cicatrización glial y permite el más alto rendimiento caracterización de glial bioreactivity para implantes, medicamentos y dispositivo de desarrollo y otras estrategias para reducir y recuperar lesiones inflamatorias.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores están agradecidos por el apoyo financiero de NSERC, CFI, AIHS, servicios de salud de Alberta y la Fundación Davey para la investigación del cerebro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Materials for HAMA synthesis and photopolymerization | |||
| Hyaluronic acid (HA) | Sigma-Aldrich | 53747-10G | Streptococcus equi, MW: 1.5 - 1.8 X 10^6 |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 275585-100ML | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| Ethanol (EtOH) | Commerical Alcohols Inc. | Anhydrous | |
| Phosphate buffered saline (pH 7.4) tablets | Fisher Scientific | 18912014 | |
| Triethanolamine (TEA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| 1-Vinyl-2pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | |
| EosinY (EY) | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 440159-100ML | |
| Beaker (100 mL) | Corning | 1000-100 | |
| Beaker (500 mL) | Corning | 1000-600 | |
| pH paper (Labstick) | Sigma-Aldrich | 9580 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2. Materials for glial cell isolation and cell culture | |||
| P1-2 Sprague Dawley rat pups | Charles River | CD Sprague Dawley rat strain code 001 | |
| Dissector scissors - slim blades (small) | Fine Science Tools | 14081-09 | |
| Surgical scissors - Toughcut (large) | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11521-10 | |
| Curved fine forceps (Dumont #7) | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14170-112 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
| Penicillin-streptomycin (PS) | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 12483-020 | |
| 0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Gibco | 25200-072 | |
| Poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P-6282 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-5 | |
| 12 well Tissue culture treated plates (Cellstar) | Greiner Bio-One | 665 108 | |
| 10 mL serological pipette | Fisher Scientific | 13-676-10F | |
| 25 mL serological pipette | Fisher Scientific | 12-676-10K | |
| Petri dish (60 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri dish (100 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Microscope Coverslip (18 mm) | Fisher Scientific | 12-545-100 18CIR | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3. Materials for microscopy (confocal and scanning electron microscopy) | |||
| Mouse monoclonal anti-CNPase | abcam | ab6319 | |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako Laboratory Chemicals | 019-17741 | |
| Chicken anti-GFAP | abcam | ab4674 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | |
| Fluoromount-G | Fisher Scientific | 00-4958-02 | |
| Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Buffered (10%) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Paraformaldehyde | Electon Microscopy Sciences | 157-8 | Buffered (8%) |
| Guteraldehyde | Electon Microscopy Sciences | 16019 | Buffered (8%) |
| Osmium tetraoxide | Electon Microscopy Sciences | 19152 | Buffered (2%) |
| Hexamethyldilazane (HMDS) | Electon Microscopy Sciences | 16700 | |
| Ethanol (EtOH) | Electon Microscopy Sciences | 15055 | Anhydrous |
| Microscope Slide (25 X 75 X 1 mm) | VWR International | 48311-703 |
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