Summary
Her presenterer vi en protokoll for 3D kultur rotte hjerne-avledet glia cellene, inkludert astrocyttene, microglia og oligodendrocytes. Viser vi primære cellekultur, methacrylated hyaluronsyre (HAMA) hydrogel syntese, HAMAphoto-polymerisasjon og celle innkapsling og eksempel behandling for AC confocal og skanning elektron mikroskopiske bildebehandling.
Abstract
I det sentrale nervesystemet, mange akutte skader og nevrodegenerative lidelser, så vel som implantert enheter eller biologisk materiale utviklet for å forbedre funksjonen resultatet i samme utfallet: overflødig betennelse fører til gliosis, cytotoksisitet, og/eller dannelsen av et glial arr som samlet forverre skade eller hindre sunn utvinning. Med hensikten å skape et system for modell glial arr dannelse og studere inflammatoriske prosesser, vi har generert en 3D celle stillaset direktetilknytning primære kulturperler gliacellene: microglia som regulerer fremmedlegeme svaret og starte den provoserende hendelsen, astrocyttene som svarer til danner et fibrøst arr. og oligodendrocytes som er vanligvis utsatt for inflammatorisk skade. Dette arbeidet gir detaljerte trinn for trinn metode for fabrikasjon, kultur og mikroskopiske karakterisering av en hyaluronsyre-basert 3D hydrogel stillaset med innkapslede rotten hjerne-avledet gliacellene. Videre, protokoller for karakterisering av cellen innkapsling og hydrogel stillaset av AC confocal immunofluorescence og skanning elektronmikroskop er bevist, og evnen til å endre stillaset med bioaktive underlag, med innlemmelse av en kommersiell basale lamina blanding for forbedret celle integrasjon.
Introduction
Betennelse i sentralnervesystemet (CNS) har lenge vært ansett som et kjennetegn på akutt (f.eks, iskemiske hjerneslag, traumatisk brain og ryggmargsskade) og kronisk (f.eks Alzheimers, Parkinsons og Huntingtons sykdommer) CNS skade, men er stadig mer anerkjent som kausale bidragsyter til nevrodegenerative og nevropsykiatriske lidelser. Vedvarende eller upassende betennelse kan forårsake neural skade og demyelinisering (f.eks multippel sklerose), og negativt påvirke hjernens utvikling (f.eks, schizofreni, autisme) og affektive tilstander (f.eks, depresjon, angst bipolar lidelse). Videre, romanen strategier bruker implanterbare enheter (f.eks., hjerne-datamaskin-grensesnitt1,2,3, dypt hjernen stimulering4,5, intraspinal microstimulation6,7,8,9,10) genererer en forutsigbar inflammatorisk respons på grensesnittet mellom enheten og CNS resulterer i en beskyttende vev svar som kan føre til tap av effekt eller enheten over levetiden til implantatet11. Betennelse i CNS er vanligvis initiert av microglia, som fungerer som bosatt immunceller av CNS ansvarlig for vev overvåking og montering fremmedlegeme svaret (anmelder12). Avhengig av alvorlighetsgraden av en fornærmelse, celle microglia signalet og rekruttere ytterligere typer til et skade. Spesielt microglia aktivere astrocyttene, som i sin tur fungerer som sekundær inflammatoriske celler og form en tett beskyttende barriere inneholder en skade nettstedet13,14. Microglia kan også starte en aktivitet gjennomgripende i cellene i eksterne immunsystemet, noe som kan resultere i nedbryting av BBB å tillate immun infiltrasjon (omtalt i referanse15).
Ved implantert i CNS, kan vevsskade som følge av innsetting av enheter som fortsatt tilstedeværelse av utenlandske enheten initiere en prosess kalt gliøst. I denne prosessen, microglia overføre til og sprer på stedet av skade. De også starte utgivelsen av inflammatoriske faktorer å nøytralisere potensielle trusler og rekruttere ytterligere gliacellene. Deretter aktivert astrocyttene blir hypertrofisk og begynne innkapsle en implantert enhet for å danne en sammenhengende fibrøs barriere16. Inflammatorisk signalisere tjener også til å fremme tilbaketrekking av neuronal prosesser fra nærheten av implantatet og til slutt rekrutterer fibroblaster å forsterke de utvikle glial arr17. Oligodendrocytes, ansvarlig for vindsperre nerveceller i myelin å forbedre konduktans, overleve ikke denne prosessen og fjerne celler er partisjonert fra implantatet av arr18. Gliøst sterkt reduserer funksjon og levetid implantert enheter, spesielt for opptak elektroder, og til slutt serverer begrense funksjonaliteten til neural grensesnitt19.
Flere tilnærminger har blitt utnyttet for å øke biocompatibility og grensesnitt aktivitet implantert enheter i CNS20,21,22,23. En omfattende vurdering er tilgjengelig på biokompatible utformingen av disse neural grensesnitt24. De mest fremtredende strategiene omfatter rundt elektroden med kompatibel belegg som polyelthyleneglycol (PEG), polylactic-co-glycolic syrer (PLGA)25, eller forbedre elektroden med ledende polymerer som poly (etylen dioxythiophene) (PEDOT), og polypyrrole (PPy)26,27,28,29,30,31. Bioaktive belegg har også vært ansatt å gi signaler for neural vevvekst med ligander avledet fra ekstracellulære matriser inkludert collagens, fibronectins og hyaluronic syren32,33,34 ,35,36,37. Bioactivity av disse belegg har vært utforsket med vekstfaktor utgivelsen systemer å etterligne naturlige celle sekreter30,38,39,40,41 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50. samtidig, noen forskningsgrupper har valgt for å remodel elektrode geometri, fleksibilitet og komposisjon redusere mekanisk misforholdet mellom enheten og vev51,52,53 ,54,55,56,57. Sammen har disse strategiene ført til mange lovende forbedringer i neste generasjons nevrale interfacial enheter, men langsiktig kompatibilitet er en pågående sak og fremdriften kan bli hindret av komplekse og tidkrevende i vivo modeller .
Dyr modell-baserte tilnærminger kan begrense eksperimentelle gjennomstrømningen og øke kostnadene ved testing elektrode biocompatibility. In vitro tilnærminger med konvensjonelle cellekultur teknikker tilbyr et mer kostnadseffektivt alternativ, men ikke recapitulate mye av kompleksiteten av samspillet mellom enheten og vev58. Spesielt testing av overflatebelegg bruker 2D celle kultur grenser modellering av elektroden geometri og påvirkning av mekaniske feil og micromotion som er tenkt å bidra til å generere vert svar bidrar til enheten feil59 , 60.
For å overvinne problemer forbundet med 2D cellekultur, har hydrogel kulturer av neural celler blitt utviklet for en rekke applikasjoner, farmakologiske studier61, for direkte neural cellen differensiering62, å forstå sykdom trasé63,64eller lag i co kultur med andre celletyper modell celle migrasjon, neuroprotection, eller modell vev microenvironments61. Hydrogels er lett dannet i forskjellige størrelser og geometrier kan inkludere mange typer primære eller udødeliggjort cellekulturer, og er svært mottakelig for analyse av brukte teknikker som AC confocal fluorescens mikroskopi. For å opprette en modell av glial arrdannelse prosessen, har vi nylig utviklet og kjennetegnes en hyaluronsyre basert 3D hydrogel system for høy gjennomstrømming testing av glial svaret implanterte elektroder (figur 1)65. Dette systemet har flere forskjellige fordeler: 1) primære gliacellene (microglia, astrocyttene og oligodendrocytes) er innkapslet i en 3D matrise som består av hyaluronsyre, som er en endogen ekstracellulær matrix komponent; 2) matrix stivhet kan være "innstilt" for å gjenskape de mekaniske egenskapene av hjernen eller ryggmargen vev; og 3) celler kan være innkapslet i matrisen i en rask benk toppen tilnærming photopolymerization med grønt lys, begrense toksisitet under innkapsling. Dette systemet muliggjør nøkkel vise egenskaper av i vivo biocompatibility: enheter inn i hydrogel på en tilsvarende måte til vev og cellulær respons til implantert enheter blir overvåket for en rekke parametere65. Disse inkluderer mekanisk misforholdet mellom enheter og hydrogel belegg av ulike strukturer og elektrisk stimulering pulser. Dette systemet omfatter også oligodendrocyte og relaterte forløpere, som er ofte tilstede og rekruttert i glial arr. Deres skade, død og fagocytose av microglia er svært indikativ av inflammatoriske skade som en modell redusert arrdannelse eller gjenoppretting, de har kapasitet til å demonstrere re-myelination av neurons66.
Her beskriver vi en metode for syntese og dannelsen av hybrid hyaluronsyre hydrogels kombinert med kommersielt tilgjengelig kjelleren membran formuleringer å forbedre celle innlemmelse. Videre vil vi vise innlemmelse av primære kulturperler gliacellene (microglia, astrocyttene og oligodendrocytes) og analyse av kultur vekst ved hjelp av immunocytochemistry og AC confocal mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen for hjernen vev utvinning fra dag 1 Sprague Dawley rotte unger, euthanized ved halshogging, ble godkjent av Animal Care og bruk komiteen ved University of Alberta.
1. Microglia og astrocytter isolasjoner67,68
Merk: Alle medier for isolasjon og cellekultur er forvarmet til 37 ° C i et vannbad. Hanks balansert salt løsning (HBSS) har 1% penicillin-streptomycin (PS). Alle Dulbecco endret Eagle's media med Ham F12 næringsstoff blanding (DMEM/F12) er supplert med 10% fosterets bovin serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin (PS). Bare blandinger med trypsin mangler FBS. Alle materialer i denne protokollen er sterilt (filter, alkohol, kjøpt og autoklaveres) hvert trinn etter Trinnummeret 1.8 utføres i en biosafety kabinett med steril teknikk.
- Per hjernen, Forvarm 15 mL HBSS og 12,5 mL DMEM/F12 37 ° c i 50 mL konisk sentrifuge rør, og omtrent 2 mL 0,25% trypsin med 1 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) i en 15 mL konisk sentrifuge rør. Varm en ekstra 25 mL av DMEM/F12. Varm trypsin ca 10 min før du bruker til å hindre tap av enzymatisk aktivitet.
- Hell nok varme HBSS i sterilt, 6 og 10 cm kultur retter å dekke overflaten. Forberede en 10 cm rett for hver to Hjerner pluss en ekstra 6 cm rett.
- Sett opp til 2 hjernen i hver 10 cm2 rett (figur 2A).
- Under disseksjon mikroskop, bruke buede og rette tang for å skille halvdelene langs midtlinjen, og lillehjernen med hjernestammen. Dette gir tre deler av vev per hjernen (figur 2B).
- Skrell tynn, semi-transparent, laget (meninges) av vev som inneholder blodårer fra hver del av vev og kast, overføre gjenværende vevet inn en egen kultur parabol. Forstå de tynne oljelagene utsatt av vev kutt, med tang, og trekk forsiktig til store deler 'henger ned"hjernevev. Til slutt fjerne denne delen av forsiktig slite. Se figur 2C-2E for representant bilder av før, under og etter dette trinnet.
- I en biosafety skap, fjerne de gjenværende HBSS fra kultur fatet, nøye beholde vevet. Macerate vevet med skalpell og overføre vev til forvarmes 15 mL røret med trypsin.
- Inkuber dette røret for 25 min i et 37 ° C bad å fordøye vevet enzymatisk.
- Sentrifuge tuben ned 500 x g i 2 minutter ved romtemperatur og utøse nedbryting.
- Bruker en 10 mL serologisk pipette, legge 10 mL av varm DMEM/F12 å deaktivere trypsin og triturate løsningen 5 ganger å bryte opp vev.
- Sentrifuge tuben ned 500 x g i 2 minutter ved romtemperatur og utøse nedbryting.
- Bruker en 10 mL serologisk pipette, nytt utsette pellets til 10 mL av varm DMEM/F12 og overføre løsningen til en 50 mL konisk sentrifuge rør.
- Bruker en 10 mL sprøyte med en 18 gauge nål, triturate løsningen 3 ganger.
- Distribuere denne løsningen i intervaller på 12,5 mL av varm DMEM/F12 per hjernen.
- Pipetter 1 mL trinn triturated løsningen i en 12 godt plate (1 per hjernen).
- Ruge på 37 ° C og 5% CO2i en fuktet celle kultur inkubator. Erstatt media etter tre dager, og oppdatere media hver påfølgende tre dager. Etter 2 uker kan cellene samles eksperimenter.
2. Macromer syntese69
- Veie 375 mg hyaluronic syre (HA) salt i et 50 mL konisk sentrifuge rør og legge 37,5 mL destillert vann.
- Rødme løsningen med en vortexer for 1 min og sonicate blandingen til det vises homogent og mister sin gel-lignende viskositet. Denne prosessen kan ta 6 h.
- Overføre løsning på en 100 mL kanne med en magnetisk rør bar (38 mm), og røre kraftig ved romtemperatur.
- Nøye sjarmere 5.0 M NaOH i blanding HA og måle pH papir til pH stabiliserer mellom 8 og 12.
- Samle 3 mL frisk methacrylic anhydride (MA, 94%), dekket av nitrogen under lagring.
Merk: MA er utsatt til atmosfæren for lang varighet (dager), vil den miste sin reaktivitet.
Advarsel: All bruk av MA bør gjøres i avtrekksvifte. - Legge til 200 µL av MA i blanding HA løsningen. Reaksjonen senker pH av løsningen under 8.
- Gjenta trinn 2.4 til 2.6 før den 3 mL MA lagt til løsningen. Denne prosessen kan ta opptil 1-2 h.
- At reaksjonen fortsette over natten ved 4 ° C, uten å blande.
- Overføre løsning til 400 mL kaldt etanol (EtOH) i et 500 mL beaker og tillate nedbør 24-72 h på 4 ° C. 56
- Nøye Dekanter av løsningen til et separat beaker for avhending, og samle bunnfall i et 50 mL konisk sentrifuge rør. Dette kan distribueres i 2-4 rør, om nødvendig.
- Sentrifuge rørene på 200 x g i en sentrifuge i 2 minutter ved romtemperatur og kast nedbryting.
- Toppen opp røret med kaldt EtOH, bland løsningen med en vortexer for 1 min, og gjenta trinn 2.10-2.11.
- Legge til 25 mL steril deionisert vann, bland løsningen med en vortexer for 1 min, sonicate (> 20 kHz) 1t, og Inkuber på 4 ° C over natten.
- Løsningen i en-80 ° C fryser i 15 minutter eller til frosset eller flash fryse i flytende nitrogen.
Advarsel: Når du bruker flytende nitrogen, bruk vernehansker og ansiktsskjerm et forkle. - Fryse tørr røret (under 0,1 mBar og 30 ° C) 24-48 h før en snø-lignende pulver er produsert.
- På dette punktet, teste prøven for renhet via 1H kjernefysiske magnetisk resonans, der hvor mye methacrylate protoner (topper på 6.1 og 5,6 ppm), i forhold til metyl protoner (1,9 ppm), på HA ryggraden kan bekreftes. Minimum forholdet 95% methacrylate til metyl protoner er akseptabelt. 69
3. gel dannelse og 3D innkapsling65
-
Dekkglassvæske og Mold forberedelse
- Lage en 50 mL destillert vann løsning på 2% 3-(Trimethoxysilyl) propyl methacrylate i et 50 mL konisk sentrifuge rør.
- Sett 18 mm glass coverslips i løsningen og rock 1t ved romtemperatur. Opptil 50 coverslips kan legges på en gang.
- Skyll coverslips av serielt dipping hvert 3 kanner 100 mL vaskebuffer vann.
- Tørr coverslips i et vakuum ved 40 ° C over natten med desiccator og stekeovn.
- Raskt fordype personlige coverslips i 70% EtOH med tang.
- Uten å tørke, slippe hver dekkglassvæske i et godt av en 12 godt plate.
- Vask og Sug opp hver brønn med sterilt deionisert vann (1 mL per brønn).
- Tilsett 1 mL steril 2 µg /mL poly-L-lysine (PLL) hver brønn og Inkuber > 2T.
- Sug opp PLL løsning og la coverslips til luft tørr.
- Fordype polydimethyl siloxane (PDMS) muggsopp (se figur 1) i 70% EtOH, og sted en midten av hver dekkglassvæske, og la luften tørr og opprette en forsegling mellom mold og glass.
- Forberede PDMS formene ved å kaste PDMS premix reagenser i en 10:1-forhold i en flat bunn polystyren rett. Antall PDMS forberedt er valgt å gi en ark ca 1 mm tykk. Skjemaet brønner i PDMS, kuttet ark med en sirkel punch med en diameter på 10.
-
Cellen forberedelse
Merk: Alle trinn i protokollen utføres med steril teknikk i en biosafety kabinett. Fosfat bufret saltvann (PBS) justeres til pH 7.4 for alle trinnene.- 24 timer før cellen innkapsling i HAMA, Oppdater medium for 2 uke primære kulturer (fra trinn 1.15) i 12 godt platene. Legge 1 mL av DMEM/F12 (10% FBS og 1% PS) middels per brønn.
- For hver 12-vel plate celleområde forberede 12.5 mL av fortynnet trypsin (0,25% trypsin-EDTA utvannet 30% med DMEM/F12 media), og 25 mL DMEM/F12 (10% FBS og 1% PS) og varm i på 37 ° C i et vannbad.
- Samle betinget medium fra platene med en 10 mL serologisk pipette (> 0,5 mL per brønn), grundig Sug opp gjenværende væske og erstatte med 1 mL per brønn av fortynnet trypsin (0.075% trypsin-EDTA) for 20-30 minutter i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) til confluent celle laget løsner fra platen.
- Gjenopprette suspendert celle materiale med en 1 mL pipette (vises som flytende enkeltvis) og samle i et 15 mL konisk sentrifuge rør. Fortynnes med en tilsvarende mengde DMEM/F12 (10% FBS og 1% PS), og sentrifuger 200 x g i 2 minutter i romtemperatur, forkaster nedbryting.
- Resuspend celle pellet i 10 mL varme DMEM/F12 (10% FBS og 1% PS), triturate cellene 5 ganger med en 10 mL pipette, og sentrifuge 200 x g i 2 minutter.
- Dekanter nedbryting, å suspendere cellene i 5 mL varme DMEM/F12, og overføre cellene til en 50 mL konisk sentrifuge rør.
- Bruker en 10 mL sprøyte med en 18 gauge nål, triturate cell løsningen 3 ganger, og filtrere suspensjon gjennom en 40 µm celle sil i en ny konisk sentrifuge tube.
- Samle 10 µL av cellen suspensjon, fortynnes 1: 100 varme DMEM/F12 og telle celler med en automatisert celle teller
- Inkuber i et vannbad 37 ° C til innkapsling trinn.
-
Cellen innkapsling
Merk: Alle trinn i protokollen utføres med steril teknikk i en biosafety kabinett.- For hver 12-vel plate 3D varme hydrogels 12.5 mL DMEM/F12 og 12,5 mL betinget DMEM/F12 media samlet under cellen forberedelse.
- Veie antallet methacrylated hyaluronsyre (HAMA) kreves for en siste konsentrasjon på 0,5% wt/vol. oppløse denne HAMA i sterilt filtrerte PBS i en konsentrasjon av (2% wt/vol); en konsentrasjon 4 ganger høyere enn den endelige konsentrasjonen benyttes til celler og andre. En 12 godt plate av hydrogels krever ~ 350 µL PBS med 7 mg HAMA.
- Sonicate (> 20 kHz) løsninger til HAMA er fullstendig oppløst for 60 min.
- Forbered individuelle 10% løsninger både trietanolamin (te) og 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP), og en 1 mM løsning av Eosin Y (EY) i 1 mL steril PBS pH 7.4 dele.
- For en 12 vel plate, gjør en siste 1,4 mL blanding av 1 x 107 celler, 0,5% wt/vol HAMA (350 µL av 2% wt/vol), 0,1% te (14 µL av 10%), 0,1% NVP (14 µL av 10%), og 0,01 mM EY (14 µL av 1 mM) , og 20% basale lamina blanding (280 µL av lager). Gjenværende volumet er PBS.
- Forsiktig bland løsningen og Pipetter 100 µL i hver PDMS mold med 1 mL tips.
- Utsette å en høy intensitet grønn LED-lys (~ 520 nm, 60 mW, i en lukket 20 cm x 20 cm x 20 cm-boksen) i 5 minutter ved romtemperatur.
- Legge til 1 mL per brønn av varm betinget DMEM/F12 i en 12 godt plate.
- Forstå hver dekkglassvæske mellom tommelen og pekefingeren, sakte løsner PDMS mold med buet pinsett være forsiktig med å fortrenge gel og legg den i en brønn med betinget medium.
- Legge til en ekstra 1 mL varme DMEM/F12 i hver brønn.
- Inkuber plater på 37 ° C med 5% CO2 i 2 uker, forfriskende cellen media hver uke av pipettering 1 mL av media fra hver brønner og erstatte med 1 mL DMEM/F12.
4. mikroskopi
-
Immunocytochemistry
Merk: En invertert AC confocal mikroskop ble brukt å image prøvene og ImageJ ble brukt til å behandle og vise bildene. Microglia, astrocyttene, oligodendrocytes og kjerner, merket etter tre uker i HAMA kulturen.- Forvarm 10% PBS-bufret formalin (pH 7.0) i 37 ° C badekar.
Forsiktig: Formalin kan brukes utenfor avtrekksvifte, dette materialet er reaktiv med vev og skal behandle med omsorg og hansker alltid. Det bør være kast separat. - Nøye Sug opp medier fra platene og pipette 1 mL av 10% formalin i hver brønn.
- Inkuber platene på 37 ° C i en 5% CO2 for 20 min.
- Sug opp væske fra hver plate Pipetter 2 mL PBS (pH 7.4) i hver brønn og ruge i 15 min.
- Gjenta trinn 4.1.4 to ganger.
- Sug opp væske fra plater, legge til 1 mL per brønn på PBS med 10% normal hest serum (NHS) og 0,5% triton X-100 og forsiktig rock på minimum hastighet) 1t.
- Gjenta trinn 4.1.4 tre ganger.
- Sug opp væske og legge 1 mL per brønn av følgende blandingen i PBS: kanin ionisert kalsium-bindende kortet molekyl (Iba1) 1:1, 000, kylling glial fibrillary protein (GFAP) 1:5, 000, mus 2', 3-sykliske-nucelotide 3-phophodiesterase (CNPase) 1:1, 000, 1% NHS , og 0,1% perforating surfactant. Ruge på 4 ° C over natten, rocking platen så forsiktig som mulig.
- Gjenta trinn 4.1.4 tre ganger med 1t incubations i mellom.
- Sug opp væske og legge 1 mL per brønn av følgende blandingen i PBS: 647 nm glade esel anti-kanin antistoff 1:200, 546 nm glade geit anti-kylling antistoff 1:200, 488 nm glade esel anti-musen antistoff 1:200, 1% NHS, 1:1,000 blå kjernefysiske flekken. Inkuber ved romtemperatur 1t, forsiktig rocking platen.
- Gjenta trinn 4 tre ganger med 1t incubations i mellom.
- For å bevare hydrogels, Sug opp buffer, dyppe dem i 0,5 mL av cellen montering medium for 1 min. Pipette ut montering mediet og forsiktig plassere en dekkglassvæske på toppen av gel, skape et lag mellom glasset. Legge en liten mengde montering medium til avdekket side på coverslips å hindre tørking av hydrogel.
Merk: For feilsøking, gels kan avbildes på trinn 4.1.11. se riktig merking før videre behandling.
- Forvarm 10% PBS-bufret formalin (pH 7.0) i 37 ° C badekar.
-
Skanning elektronmikroskop (SEM)
Merk: For å visualisere hydrogel, et scanning elektron mikroskop ble brukt å image prøvene.- Forvarm en etappe, den stabiliserende blanding av 2,5% glutaraldehyde og 2% paraformaldehyde i PBS (0.1 M) i et 37 ° C vannbad.
Advarsel: Disse reagensene er svært reaktivt med vev, og bør behandles med forsiktighet og hansker. De skal håndteres i avtrekksvifte så mye som mulig og avhendes separat. - Sug opp mediet celle kultur platene og tilsett 1 mL av forvarmet etappe, den stabiliserende blandingen.
- Inkuber platene på 37 ° C i en 5% CO2 for 20 min.
- Sett platene i 4 ° C (kjøleskap/kjøligere) over natten.
- Sug opp etappe, den stabiliserende løsningen fra brønnene og tilsett 1 mL av PBS.
- Sug opp væske fra hver plate, Legg 2 mL PBS i hver brønn og ruge i 15 min.
- Gjenta trinn 4.2.6 to ganger.
- Sug opp PBS og tilsett 1 mL 1% osmium tetraoxide bufret i PBS i hver brønn.
Merk: Før prøver er tørket, dette trinnet og alle påfølgende trinnene utføres avtrekksvifte. - Tillate fiksering skje for 30 min. Osmium damp fra væsken kan fikse andre prøver i samme plate; Derfor deling prøver tilsvarende før dette trinnet.
FORSIKTIG: Osmium tetraoxide er svært reaktive med vev og flyktige. Det er farlig og skal håndteres i avtrekksvifte med hansker. Det og noen umiddelbar vasket skal kastes separat. - Gjenta trinn 4.2.6 tre ganger.
- Sug opp væske legge dehydrating blandinger i listen nedenfor, i rekkefølge og ruge (romtemperatur) for den angitte tiden. Begynn med å gradvis legge etanol (EtOH) fulgt deretter hexamethyldisilazane (HMDS). Se tabell 2 for hver økning.
Merk: Når du legger HMDS, coverslips kan sterkt overholde plast og bli svært vanskelig å fjerne. Dette kan forebygges ved å plassere en liten plast plattform under glass slip etter første HMDS. Etter den andre EtOH inkubering, kan prøven tas og slukket i flytende nitrogen i noen sekunder for å fryse brudd prøven. - Nøye fjerne tørket prøvene og montere prøvene på scanning elektron mikroskop stubber med dobbeltsidig ledende tape.
- Frese coat prøvene med et minimum av gull. Sett prøvene i en holder og driver maskinen for 2 min 15 mA.
- Forvarm en etappe, den stabiliserende blanding av 2,5% glutaraldehyde og 2% paraformaldehyde i PBS (0.1 M) i et 37 ° C vannbad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å modellere nevrale vev vert svaret og glial arr i en høy gjennomstrømning, krever i vitro system en 3D celle stillaset med en matrix-materiale som er biokompatible, ikke pådra en cytotoksisk hendelse under i situ dannelse og kan endres med bioaktive komponenter til guide velvillig reaksjon. Dette har vi opprettet et 3D celle stillaset system basert på hyaluronsyre og innkapslet primære blandet glial celle innbyggere å studere celle-celle interaksjoner og glial bioreactivity. En kort visuell studie av celler og stillaset ble utført. Morfologi av cellen subpopulasjoner, inkludert oligodendrocytes (CNPase i grønt), microglia (Iba1 i rødt), og astrocyttene (GFAP gul), vises etter immunofluorescent AC confocal mikroskopi (figur 3Ai-ii-Ci-ii). Kombinert stillaset og celle morfologi vises også av SEM (figur 3Aiii-iv - Ciii-iv). I disse bildene vises både lav (i og iii) og høy (ii og iv) oppløsning representant bilder. En 2D PLL dekkglassvæske belegg (figur 3A) ble sammenlignet med en 3D 0,5% w/v HAMA stillaset (figur 3B), og en blanding av 20% v/v basale lamina blandingen i 0,5% w/v HAMA (Figur 3 c). Dette ble gjort for å demonstrere morfologiske forskjellene i 2D og 3D cellekultur, samt effekten av introdusere en biologisk lamina til stillaset. En 3D rekonstruksjon er også tilgjengelig i den tilleggsinformasjon.
Celle morfologi av hver celle med introduksjonen av en 3D-plattform. I 2D tilhenger kultur (PLL-belagt glass coverslips), oligodendrocytes opptrådte vanligvis runde og dannet små nettverk vanligvis forbinder med lett GFAP prosesser. Microglia var mindre enn andre celler og hadde liten branching prosesser som ikke utvide langt fra deres cellen legemer (< 20 µm). Astrocyttene ble mer diversely formet, noen har en radial morfologi med mindre cellen legemer og omfattende tynne, forgrening prosesser, mens andre var fibrøs med en flat utseende og noen bred prosesser som coat overflaten. I 3D HAMA kultur opptrådte oligodendrocytes i klynger har grenede av i mindre kuler. Microglia var runde med noen prosesser, og astrocyttene er avrundet eller grenede av radielt i nettverk fra en enkelt klynge. Vanligvis disse cellene syntes å har vokst fra enkle punkt eller forbli i områder av HAMA uten å gjøre kontakt med andre celler, som er ulikt 2D kulturen og er ladet av begrenset mobilitet gjennom matrisen. Når 20% v/v av en basal lamina blanding ble lagt til Foto-polymerisasjon blandingen, glial undertypene integrert med 3D-plattformen, og dannet mer omfattende, interaktive forgrenet strukturer. Oligodendrocytes utvidet oppsvulmede prosesser radielt ligner ikke-basale lamina blanding morphologies, men i tillegg syntes å utvide prosesser langs de tynne sammenkoblede nettverkene av astrocytter prosesser forgrening gjennom stillaset. Microglia ble spredt blant disse cellen nettverk, har spredt med tynne prosesser mer i samsvar med deres morfologi i vev. Samlet tyder morphologies alle tre typer av glia integrert i HAMA-basale lamina blandingen fritt, potensielt gjennom enten økt tilslutning til blandet underlaget eller gjennom økt evne til å renovere stillaset.
Når observert av SEM, ble celle morfologi sett å bekrefte AC confocal micrographs. HAMA matrix dukket opp som en glatt overflate med 10-50 µm porene sett svakt under overflaten. Cellene tilhenger på overflaten av HAMAT og var også svakt synlig i lag under. Disse glia ikke danne sammenlignbare morphologies til de i 2D kultur, men med tillegg av en basal lamina blanding, omfattende nettverk ble observert. Tykk astrocytter fibre, med mindre klynger av microglia ble observert både HAMA-basale lamina blanding overflaten og utvide gjennom matrisen på en sømløs måte. Dette kan sees svakt som matrix foldet rundt celler, noe som tyder på at cellene kan endre stillaset å dannet i deres ønskede konformasjonen.
Figur 1: skjematisk methacrylated hyaluronsyre (HAMA)-basert 3D celle kultur og photopolymerization protokollen. Gliacellene (2 uke primære rotte hjernen kultur) er blandet med HAMA og pipetted i polydimethylsiloxane (PDMS) mold på et glass dekkglassvæske. Denne blandingen er utsatt for en høy intensitet grønn LED-lys til danner hydrogel i 5 min. Mold er fjernet og gel er ruges i media. Representant celler inkluderer microglia (rød), astrocyttene (gul) og oligodendrocytes (grønn). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Disseksjon av dag 1 Sprague Dawley rotten pup hjernen. Bilder av hele hjernen (A), Disseksjon av halvdelene og lillehjernen (B), en enkelt cortex med meninges (C), peeling av meninges med tang (D) og meninge-fri cortex (E). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Immunofluorescent AC confocal (i-ii) og skanning elektron (iii-iv) micrographs av blandet glia celle populasjoner 2D PLL belegg (A), HAMA (B) og HAMA-basale lamina blanding (C). Lavere (i, iii) og høyere (ii, iv) forstørrelse bilder vises. Etikettene inkluderer Iba1 i rødt for microglia, GFAP i gult for astrocyttene, CNPase i grønt for oligodendrocytes og en Hoechst kjernefysiske flekk. Skalere barer = 25 µm for AC confocal bilder og 50 (iii) og 20 µm (iv) for skanning elektron micrographs. Hydrogels var 0,5% w/v, og basale lamina blandingen ble 20% av volumet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ekstra figur 1: 3D immunofluorescent micrographic rekonstruksjon av HAMA-basale lamina blanding med blandet glia celle populasjoner HAMA-basale lamina blandingen. Etikettene inkluderer Iba1 i rødt for microglia, GFAP i gult for astrocyttene, CNPase i grønt for oligodendrocytes og en Hoechst kjernefysiske flekk. Hydrogels var 0,5% w/v, og Getrex var 20% av volumet. Klikk her for å laste ned denne filen.
| HAMA | Basal Lamina | NVP | TE | EY | |
| Arbeider konsentrasjon | 0,5% w/v | 20% v/v | 0,10% | 0,10% | .01 mM |
| 12-vel Plate | 2% w/v | 100% w/v | 10% v/v | 10% v/v | 1 mM |
| 1.4 mL totalt | 350 ΜL | 280 ΜL | 14 ΜL | 14 ΜL | 14 ΜL |
Tabell 1: Eksempel på cellen innkapsling.
| Komponent | Innhold | Inkubasjonstiden |
| EtOH | 30% | 30 min |
| EtOH | 50% | 30 min |
| EtOH | 70% | 30 min |
| EtOH | 90% | 20 min |
| EtOH | 100% | 20 min |
| EtOH | 100% | 20 min |
| EtOH:HMDS | 75:25 | 20 min |
| EtOH:HMDS | 50:50:00 | 20 min |
| EtOH:HMDS | 25:75 | 20 min |
| HMDS | 100% | 20 min |
| HMDS | 100% | Overnatting |
Tabell 2: Gradvis intervaller EtOH og HMDS i dehydrering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mot målet å generere en 3D kultur-systemet til modell glial bioreactivity og glial arrdannelse prosessen, har vi utviklet et system som kan støtte primære kulturperler microglia, astrocyttene og oligodendrocytes og aktiverer robust karakteristikk av cellen morfologi og celle-celle interaksjoner. Micrographs vises, var morfologi av hver celle utpreget annerledes med 2D, 3D-HAMA og 3D HAMA-basale lamina blanding plattformer. I 2D-systemet, morfologi var tydelig forutinntatt langs flyet av overflaten, men sammenlignet med 3D HAMA, microglia og astrocyttene var generelt mindre innenfor matrise, med unntak av oligodendrocyte klynger. I de skanning elektron micrographs var celler generelt mer rundt formet på HAMAT. Dette kan skyldes i stor grad cellene som er innkapslet, med begrenset kapasitet endre matrix for bevegelse og fri bevegelse og vekst av prosesser. Cellen utvekst i HAMAT var vanligvis radial både astrocyttene og oligodendrocytes. Mens disse cellene utvidet prosesser, organisasjonen foreslår at deres bevegelse hele matrix og evnen til å samhandle med andre celler var begrenset. I tillegg har tidligere arbeid vist fryse-brukket HAMA skal porøse uten sammenkoblede nettverk, noe som kan forklare denne mangelen utvekst65,70. Det kan hende at noen av disse cellene overlevde ikke photopolymerization, gjenværende bevart i matrisen, men levedyktighet ble systematisk vurdert i våre tidligere arbeid, og forble 80% (0,5% w/v) i løpet av en uke65.
For å forbedre celle samspillet med matrix i 3D kultur, innført vi en basal lamina blanding som biokompatible og modifiserbare matrise komponent. Cellen integrasjon med matrix ble funnet å være kraftig forbedret, med alle celletyper viser omfattende prosessene sammenlignet med både 2D kultur og 3D HAMA. Basal lamina blandingen består av en rekke basale lamina komponenter og er hovedsakelig formulert for å støtte glial differensiering av nevrale stamceller forløpere71. Det var ikke uventet at gliacellene svarte på basale lamina blandingen og omkringliggende 3D matrix, men omfanget av integrasjon foreslår et sunt vev-lignende miljø. Sammenligne HAMA HAMA-basale lamina blanding, hydrogel morfologi vises ikke utpreget annerledes, derfor cellene kan være mer aktivt ombygging det. Vurderer enkelhet av tilføyer denne bioaktive komponenten, er det ikke utenkelig å bruke forskjellige laminas og/eller protein signaler for å favorisere kultur betingelser for neurons. Potensielle fremtidige retning, kan dette systemet brukes til å skille neurons fra nevrale progenitors sammen med blandet glia en rekke slagkraftige myelination eller Nevro-inflammatorisk skade modeller.
Alvorlige og ødeleggende CNS skade eller biomateriale avslag starter bosatt vevet inflammatoriske reaksjoner kan forverre neurodegeneration og demyelinisering. Dette vanligvis resulterer i dannelsen av et glial arr partisjonere stedet for skade som forhindrer regenerasjon. I denne studien var metodene detaljert for en methacrylated bilde-polymerized hyaluronsyre-basert 3D stillaset å modellering den første cellulær responsen bak glial arr-dannelse; microglial reaktivitet, astrocytter rekruttering og hypertrofi, og oligodendrocyte skader og uttak. En 3D-cellen stillaset ble utformet for å omfatte alle tre glial celletyper, og ble ytterligere endret med en multi-komponent basale lamina blanding. Det ble bestemt, av AC confocal og skanning elektronmikroskop imaging at cellene var innkapslet inne HAMAT og kunne integrere når basale lamina blandingen ble innført. Disse resultatene kan føre til flere novel søknader. HAMA alene kan tjene lage co kultur systemer der hensikten er å begrense celle til celle interaksjon eller studie destillere narkotika-leveranser med gel som en narkotika lastet diffusjon begrenset matrise. Hydrogels omfatter basale lamina blandingen i HAMA matrix tillater en mer konsekvent vev-lignende miljø kan modellering akutt betennelse, gliosis eller gliøst, og muliggjør ytterligere høy gjennomstrømming karakterisering av glial bioreactivity implantater, narkotika og enheten utvikling og andre strategier for å redusere og gjenopprette inflammatorisk skade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne er takknemlig for økonomisk støtte fra NSERC, CFI, AIHS, Alberta helsetjenester og Davey begavelse for hjerneforskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Materials for HAMA synthesis and photopolymerization | |||
| Hyaluronic acid (HA) | Sigma-Aldrich | 53747-10G | Streptococcus equi, MW: 1.5 - 1.8 X 10^6 |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 275585-100ML | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| Ethanol (EtOH) | Commerical Alcohols Inc. | Anhydrous | |
| Phosphate buffered saline (pH 7.4) tablets | Fisher Scientific | 18912014 | |
| Triethanolamine (TEA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| 1-Vinyl-2pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | |
| EosinY (EY) | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 440159-100ML | |
| Beaker (100 mL) | Corning | 1000-100 | |
| Beaker (500 mL) | Corning | 1000-600 | |
| pH paper (Labstick) | Sigma-Aldrich | 9580 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2. Materials for glial cell isolation and cell culture | |||
| P1-2 Sprague Dawley rat pups | Charles River | CD Sprague Dawley rat strain code 001 | |
| Dissector scissors - slim blades (small) | Fine Science Tools | 14081-09 | |
| Surgical scissors - Toughcut (large) | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11521-10 | |
| Curved fine forceps (Dumont #7) | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14170-112 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
| Penicillin-streptomycin (PS) | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 12483-020 | |
| 0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Gibco | 25200-072 | |
| Poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P-6282 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-5 | |
| 12 well Tissue culture treated plates (Cellstar) | Greiner Bio-One | 665 108 | |
| 10 mL serological pipette | Fisher Scientific | 13-676-10F | |
| 25 mL serological pipette | Fisher Scientific | 12-676-10K | |
| Petri dish (60 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri dish (100 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Microscope Coverslip (18 mm) | Fisher Scientific | 12-545-100 18CIR | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3. Materials for microscopy (confocal and scanning electron microscopy) | |||
| Mouse monoclonal anti-CNPase | abcam | ab6319 | |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako Laboratory Chemicals | 019-17741 | |
| Chicken anti-GFAP | abcam | ab4674 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | |
| Fluoromount-G | Fisher Scientific | 00-4958-02 | |
| Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Buffered (10%) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Paraformaldehyde | Electon Microscopy Sciences | 157-8 | Buffered (8%) |
| Guteraldehyde | Electon Microscopy Sciences | 16019 | Buffered (8%) |
| Osmium tetraoxide | Electon Microscopy Sciences | 19152 | Buffered (2%) |
| Hexamethyldilazane (HMDS) | Electon Microscopy Sciences | 16700 | |
| Ethanol (EtOH) | Electon Microscopy Sciences | 15055 | Anhydrous |
| Microscope Slide (25 X 75 X 1 mm) | VWR International | 48311-703 |
References
- Shih, J. J., Krusienski, D. J., Wolpaw, J. R. Brain-Computer Interfaces in Medicine. Mayo Clin. Proc. 87, 268-279 (2012).
- Kennedy, P. R., Bakay, R. A. Restoration of neural output from a paralyzed patient by a direct brain connection. Neuroreport. 9, 1707-1711 (1998).
- Kennedy, P. R., Bakay, R. A., Moore, M. M., Adams, K., Goldwaithe, J. Direct control of a computer from the human central nervous system. IEEE Trans. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 8, 198-202 (2000).
- Mayberg, H. S., et al. Deep Brain Stimulation for Treatment-Resistant Depression. Neuron. 45, 651-660 (2005).
- Dougherty, D. D., et al. A Randomized Sham-Controlled Trial of Deep Brain Stimulation of the Ventral Capsule/Ventral Striatum for Chronic Treatment-Resistant Depression. Biol. Psychiatry. 78, 240-248 (2015).
- Bamford, J. A., Marc Lebel, R., Parseyan, K., Mushahwar, V. K. The Fabrication, Implantation, and Stability of Intraspinal Microwire Arrays in the Spinal Cord of Cat and Rat. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 25, 287-296 (2017).
- Holinski, B. J., et al. Intraspinal microstimulation produces over-ground walking in anesthetized cats. J. Neural Eng. 13, 056016 (2016).
- Toossi, A., Everaert, D. G., Azar, A., Dennison, C. R., Mushahwar, V. K. Mechanically Stable Intraspinal Microstimulation Implants for Human Translation. Ann. Biomed. Eng. 45, 681-694 (2017).
- Saigal, R., Renzi, C., Mushahwar, V. K. Intraspinal microstimulation generates functional movements after spinal-cord injury. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 12, 430-440 (2004).
- Lau, B., Guevremont, L., Mushahwar, V. K. Strategies for generating prolonged functional standing using intramuscular stimulation or intraspinal microstimulation. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 15, 273-285 (2007).
- Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. J. Neurosci. Methods. 148, 1-18 (2005).
- Sierra, A., et al. Surveillance, phagocytosis, and inflammation: how never-resting microglia influence adult hippocampal neurogenesis. Neural Plast. 2014, 610343 (2014).
- Holm, T. H., Draeby, D., Owens, T. Microglia are required for astroglial Toll-like receptor 4 response and for optimal TLR2 and TLR3 response. Glia. 60, 630-638 (2012).
- Gao, Z., et al. Reciprocal modulation between microglia and astrocyte in reactive gliosis following the CNS injury. Mol. Neurobiol. 48, 690-701 (2013).
- Jin, X., Yamashita, T. Microglia in central nervous system repair after injury. J. Biochem. (Tokyo). 159, 491-496 (2016).
- Griffith, R. W., Humphrey, D. R. Long-term gliosis around chronically implanted platinum electrodes in the Rhesus macaque motor cortex. Neurosci. Lett. 406, 81-86 (2006).
- Biran, R., Martin, D. C., Tresco, P. A. Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays. Exp. Neurol. 195, 115-126 (2005).
- Fawcett, J. W., Asher, R. A. The glial scar and central nervous system repair. Brain Res. Bull. 49, 377-391 (1999).
- Szarowski, D. H., et al. Brain responses to micro-machined silicon devices. Brain Res. 983, 23-35 (2003).
- Park, D. -W., et al. Graphene-based carbon-layered electrode array technology for neural imaging and optogenetic applications. Nat. Commun. 5, 5258 (2014).
- McAllister, J. P., et al. Biocompatibility of Penetrating Recording Electrode Arrays Implanted Chronically in the Feline Visual Cortex. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 1528 (2005).
- Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. J. Neurochem. 109, 117-125 (2009).
- Chung, H., et al. In vivo Biocompatibility and Stability of Polyimide Microelectrode Array for Retinal Stimulation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 5072 (2003).
- Aregueta-Robles, U. A., Woolley, A. J., Poole-Warren, L. A., Lovell, N. H., Green, R. A. Organic electrode coatings for next-generation neural interfaces. Front. Neuroengineering. 7, (2014).
- Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24, 4337-4351 (2003).
- Yang, J., et al. Ordered surfactant-templated poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) conducting polymer on microfabricated neural probes. Acta Biomater. 1, 125-136 (2005).
- Ludwig, K. A., et al. Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) polymer coatings facilitate smaller neural recording electrodes. J. Neural Eng. 8, 014001 (2011).
- Kim, D. -H., Abidian, M., Martin, D. C. Conducting polymers grown in hydrogel scaffolds coated on neural prosthetic devices. J. Biomed. Mater. Res. A. 71, 577-585 (2004).
- George, P. M., et al. Fabrication and biocompatibility of polypyrrole implants suitable for neural prosthetics. Biomaterials. 26, 3511-3519 (2005).
- Stauffer, W. R., Cui, X. T. Polypyrrole doped with 2 peptide sequences from laminin. Biomaterials. 27, 2405-2413 (2006).
- Green, R. A., Lovell, N. H., Wallace, G. G., Poole-Warren, L. A. Conducting polymers for neural interfaces: challenges in developing an effective long-term implant. Biomaterials. 29, 3393-3399 (2008).
- Gumbiner, B. M. Cell adhesion: the molecular basis of tissue architecture and morphogenesis. Cell. 84, 345-357 (1996).
- Chan, G., Mooney, D. J. New materials for tissue engineering: towards greater control over the biological response. Trends Biotechnol. 26, 382-392 (2008).
- Green, R. A., Lovell, N. H., Poole-Warren, L. A. Impact of co-incorporating laminin peptide dopants and neurotrophic growth factors on conducting polymer properties. Acta Biomater. 6, 63-71 (2010).
- Green, R. A., Lovell, N. H., Poole-Warren, L. A. Cell attachment functionality of bioactive conducting polymers for neural interfaces. Biomaterials. 30, 3637-3644 (2009).
- Koss, K. M., Unsworth, L. D. Neural tissue engineering: Bioresponsive nanoscaffolds using engineered self-assembling peptides. Acta Biomater. 44, 2-15 (2016).
- Koss, K. M., et al. Brain biocompatibility and microglia response towards engineered self-assembling (RADA)4 nanoscaffolds. Acta Biomater. 35, 127-137 (2016).
- Evans, A. J., et al. Promoting neurite outgrowth from spiral ganglion neuron explants using polypyrrole/BDNF-coated electrodes. J. Biomed. Mater. Res. A. 91, 241-250 (2009).
- Yu, X., Bellamkonda, R. V. Tissue-engineered scaffolds are effective alternatives to autografts for bridging peripheral nerve gaps. Tissue Eng. 9, 421-430 (2003).
- Houweling, D. A., Lankhorst, A. J., Gispen, W. H., Bär, P. R., Joosten, E. A. Collagen containing neurotrophin-3 (NT-3) attracts regrowing injured corticospinal axons in the adult rat spinal cord and promotes partial functional recovery. Exp. Neurol. 153, 49-59 (1998).
- Wells, M. R., et al. Gel matrix vehicles for growth factor application in nerve gap injuries repaired with tubes: a comparison of biomatrix, collagen, and methylcellulose. Exp. Neurol. 146, 395-402 (1997).
- Barras, F. M., Pasche, P., Bouche, N., Aebischer, P., Zurn, A. D. Glial cell line-derived neurotrophic factor released by synthetic guidance channels promotes facial nerve regeneration in the rat. J. Neurosci. Res. 70, 746-755 (2002).
- Fine, E. G., Decosterd, I., Papaloïzos, M., Zurn, A. D., Aebischer, P. GDNF and NGF released by synthetic guidance channels support sciatic nerve regeneration across a long gap. Eur. J. Neurosci. 15, 589-601 (2002).
- Burdick, J. A., Ward, M., Liang, E., Young, M. J., Langer, R. Stimulation of neurite outgrowth by neurotrophins delivered from degradable hydrogels. Biomaterials. 27, 452-459 (2006).
- Piantino, J., Burdick, J. A., Goldberg, D., Langer, R., Benowitz, L. I. An injectable, biodegradable hydrogel for trophic factor delivery enhances axonal rewiring and improves performance after spinal cord injury. Exp. Neurol. 201, 359-367 (2006).
- Jain, A., Kim, Y. -T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27, 497-504 (2006).
- Taylor, S. J., Sakiyama-Elbert, S. E. Effect of controlled delivery of neurotrophin-3 from fibrin on spinal cord injury in a long term model. J. Control. Release Off. J. Control. Release Soc. 116, 204-210 (2006).
- Jhaveri, S. J., et al. Release of nerve growth factor from HEMA hydrogel-coated substrates and its effect on the differentiation of neural cells. Biomacromolecules. 10, 174-183 (2009).
- Lee, A. C., et al. Controlled release of nerve growth factor enhances sciatic nerve regeneration. Exp. Neurol. 184, 295-303 (2003).
- Matsumoto, K., et al. Neurite outgrowths of neurons with neurotrophin-coated carbon nanotubes. J. Biosci. Bioeng. 103, 216-220 (2007).
- Khaled, I., et al. A Flexible Base Electrode Array for Intraspinal Microstimulation. IEEE Trans. Biomed. Eng. 60, 2904 (2013).
- David-Pur, M., Bareket-Keren, L., Beit-Yaakov, G., Raz-Prag, D., Hanein, Y. All-carbon-nanotube flexible multi-electrode array for neuronal recording and stimulation. Biomed. Microdevices. 16, 43-53 (2014).
- Hsu, H. -L., et al. Flexible UV-ozone-modified carbon nanotube electrodes for neuronal recording. Adv. Mater. Deerfield Beach Fla. 22, 2177-2181 (2010).
- Lacour, S. P., et al. Flexible and stretchable micro-electrodes for in vitro and in vivo neural interfaces. Med. Biol. Eng. Comput. 48, 945-954 (2010).
- Lin, C. -M., Lee, Y. -T., Yeh, S. -R., Fang, W. Flexible carbon nanotubes electrode for neural recording. Biosens. Bioelectron. 24, 2791-2797 (2009).
- Richter, A., et al. A simple implantation method for flexible, multisite microelectrodes into rat brains. Front. Neuroengineering. 6, 6 (2013).
- Rousche, P. J., et al. Flexible polyimide-based intracortical electrode arrays with bioactive capability. IEEE Trans. Biomed. Eng. 48, 361-371 (2001).
- Polikov, V. S., Block, M. L., Fellous, J. -M., Hong, J. -S., Reichert, W. M. In vitro model of glial scarring around neuroelectrodes chronically implanted in the CNS. Biomaterials. 27, 5368-5376 (2006).
- Sohal, H. S., Clowry, G. J., Jackson, A., O'Neill, A., Baker, S. N. Mechanical Flexibility Reduces the Foreign Body Response to Long-Term Implanted Microelectrodes in Rabbit Cortex. PloS One. 11, e0165606 (2016).
- Moshayedi, P., et al. The relationship between glial cell mechanosensitivity and foreign body reactions in the central nervous system. Biomaterials. 35, 3919-3925 (2014).
- Hopkins, A. M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. 3D in vitro modeling of the central nervous system. Prog. Neurobiol. 125, 1-25 (2015).
- Pöttler, M., Zierler, S., Kerschbaum, H. H. An artificial three-dimensional matrix promotes ramification in the microglial cell-line, BV-2. Neurosci. Lett. 410, 137-140 (2006).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. 0, 42-51 (2014).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12, 207-218 (2014).
- Jeffery, A. F., Churchward, M. A., Mushahwar, V. K., Todd, K. G., Elias, A. L. Hyaluronic acid-based 3D culture model for in vitro testing of electrode biocompatibility. Biomacromolecules. 15, 2157-2165 (2014).
- Fitch, M. T., Silver, J. CNS Injury, Glial Scars, and Inflammation. Exp. Neurol. 209, 294-301 (2008).
- Churchward, M. A., Todd, K. G. Statin treatment affects cytokine release and phagocytic activity in primary cultured microglia through two separable mechanisms. Mol. Brain. 7, 85 (2014).
- Lai, A. Y., Todd, K. G. Differential regulation of trophic and proinflammatory microglial effectors is dependent on severity of neuronal injury. Glia. 56, 259-270 (2008).
- Hachet, E., Van Den Berghe, H., Bayma, E., Block, M. R., Auzély-Velty, R. Design of biomimetic cell-interactive substrates using hyaluronic acid hydrogels with tunable mechanical properties. Biomacromolecules. 13, 1818-1827 (2012).
- Eslami, M., Javadi, G., Agdami, N., Shokrgozar, M. A. Expression of COLLAGEN 1 and ELASTIN Genes in Mitral Valvular Interstitial Cells within Microfiber Reinforced Hydrogel. Cell J (Yakhteh). , (2015).
- Shaltouki, A., Peng, J., Liu, Q., Rao, M. S., Zeng, X. Efficient Generation of Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells in Defined Conditions. STEM CELLS. 31, 941-952 (2013).
