Summary
Häri, presenterar vi ett protokoll för 3D kulturen i rat brain-derived gliaceller, inklusive astrocyter, mikroglia och oligodendrocyter. Vi visar primär cellkultur, methacrylated (HAMA) hydrogel hyaluronsyresyntesen, HAMAphoto-polymerisation och cell inkapsling och prov bearbetning för confocal och scanning electron mikroskopbilder.
Abstract
I det centrala nervsystemet, många akuta skador och neurodegenerativa sjukdomar, samt som inopererade enheter eller biomaterial konstruerad för att förbättra funktion leder till samma resultat: överskott inflammation leder till gliosis, cytotoxicitet, eller bildandet av ett gliaceller ärr som kollektivt förvärra skadan eller förhindra hälsosam återhämtning. Med avsikt att skapa ett system att modellera gliaceller ärr bildning och studie inflammatoriska processer, vi har genererat en 3D cell byggnadsställning kan bostäder primära odlade gliaceller: mikroglia som reglerar främmande kropp svaret och initiera den inflammatorisk händelse, astrocyter som svarar på bildar ett fibröst ärr och oligodendrocyter som är vanligtvis sårbara för inflammatorisk skada. Den nuvarande arbetet ger en detaljerad steg för steg metod för tillverkning, kultur och mikroskopisk karakterisering av en hyaluronsyra-baserat 3D hydrogel Rullställning med inkapslade rat brain-derived gliaceller. Ytterligare, protokoll för karakterisering av cell inkapsling och hydrogel ställningen av confocal immunofluorescens och svepelektronmikroskopi styrkas samt kapacitet att ändra ställningen med bioaktiva substrat, med införlivandet av en kommersiell basala lamina blandning till förbättrad cell integration.
Introduction
Inflammation i centrala nervsystemet (CNS) har länge ansetts vara ett signum för akut (t.ex., ischemisk stroke, traumatisk hjärnskada och ryggmärgsskada) och kronisk (t.ex. Alzheimers, Parkinsons och Huntingtons sjukdomar) CNS skada, men känns alltmer som en kausal bidragsgivare till neurodegenerativa och neuropsykiatriska funktionsnedsättningar. Ihållande eller olämpligt inflammation kan orsaka neurala skada och demyelinisering (t ex multipel skleros), och negativt påverka hjärnans utveckling (t.ex., schizofreni, autism) och mood states (t.ex., depression, ångest bipolär sjukdom). Ytterligare, nya terapeutiska strategier använder implanterbara produkter (t.ex., hjärna-dator-gränssnitt1,2,3, djupa hjärnan stimulering4,5, intraspinala microstimulation6,7,8,9,10) generera en förutsägbar inflammatorisk reaktion i gränssnittet mellan enheten och CNS resulterar i en skyddande vävnad svar som kan orsaka förlust av effekt eller enhet misslyckande under hela livstiden för implantatet11. Inflammation i CNS initieras vanligen av mikroglia, som fungera som bosatt immuncellerna i CNS ansvarar för övervakning av vävnad och montering främmande kropp svaret (granskade12). Beroende på svårighetsgraden av en förolämpning, cell mikroglia signalen och rekrytera ytterligare typer till en skada. Specifikt, aktivera mikroglia astrocyterna, som i sin tur fungerar som sekundära inflammatoriska celler och bildar en tät skyddande barriär ska innehålla en skada plats13,14. Mikroglia kan också initiera en aktiviteten kaskad i cellerna i perifera immunförsvaret, vilket kan leda till nedbrytning av BBB att tillåta immun infiltration (ses i referens15).
När det gäller produkter som implanteras i CNS, kan vävnadsskada som följd av enheten införande samt den fortsatta närvaron av utländska enheten initiera en process som kallas gliaceller ärrbildning. I denna process, mikroglia migrera till och föröka sig på platsen för skadan. De initierar också frisättningen av inflammatoriska faktorer att neutralisera potentiella hot och rekrytera ytterligare gliaceller. Därefter aktiverade astrocyter blivit hypertrofisk och börjar kapsla in den implanterade enheten för att bilda en kontinuerlig fibrösa barriär16. Inflammatoriska signalering tjänar också till att främja tillbakadragande av neuronala processer från närheten av implantatet och så småningom rekryterar fibroblaster för att förstärka den framkallande gliaceller ärr17. Oligodendrocyter, ansvarig för mantlar nervceller i myelin att förbättra konduktans, överlever inte denna process och avlägsna celler är partitionerade från implantatet av ärr18. Gliaceller ärrbildning kraftigt minskar funktion och livslängd av inopererade enheter, särskilt för inspelning elektroder, och i slutändan tjänar till att begränsa funktionaliteten av neurala gränssnitt19.
Flera metoder har utnyttjats för att öka av biokompatibilitet och gränssnitt aktiviteten av implantat i CNS20,21,22,23. En omfattande översyn är tillgänglig på biokompatibla utformningen av dessa neurala gränssnitt24. De mest framträdande strategierna inkluderar kring elektroden med kompatibel beläggningar såsom polyelthyleneglycol (PEG), polylactic-co-glykolsyra syror (PLGA)25, eller förbättra elektroden med ledande polymerer såsom poly (etylen dioxythiophene) (PEDOT), och Polypyrrol (PPy)26,27,28,29,30,31. Bioaktiva beläggningar har också använts för att ge ledtrådar för neural vävnadstillväxt med hjälp av ligander som härrör från extracellulära matriser inklusive kollagen, fibronectins och hyaluronsyror32,33,34 ,35,36,37. Bioaktiviteten av dessa beläggningar har utforskats vidare med tillväxtfaktor release system att efterlikna naturliga cell sekret30,38,39,40,41 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50. samtidigt, vissa forskargrupper har valt för att renovera den elektrod geometri, flexibilitet och sammansättning för att minska den mekaniska obalansen mellan enheten och vävnad51,52,53 ,54,55,56,57. Sammantaget har dessa strategier lett till många lovande förbättringar i nästa generations neurala gränsskiktspänning enheter, men de långsiktiga kompatibiliteten är ett pågående problem och framsteg kan hämmas av komplexa och tidskrävande i vivo modeller .
Djur modell-baserade metoder kan begränsa den experimentella genomströmningen och öka kostnaderna för testning elektrod biokompatibilitet. Närmar sig med konventionell cellkultur tekniker erbjuda ett mer kostnadseffektivt alternativ men misslyckas med att sammanfatta mycket av komplexiteten i interaktionen mellan enheten och vävnad58 in vitro . I synnerhet testning av ytbeläggningar som använder 2D cell kultur gränser modellering av elektroden geometri och mekaniska obalans och mikrorörelse tros bidra till att generera en värdrespons bidrar till enheten misslyckande59 inflytande , 60.
För att övervinna problemen med 2D cellkultur, har hydrogel kulturer av neurala celler utvecklats för en mängd olika applikationer, farmakologiska studier61, för direkt neurala cell differentiering62, att förstå sjukdomen vägar63,64, eller skiktad i samtidig kultur med andra celltyper modell cellmigration, neuroprotektion, eller modell vävnad mikromiljö61. Hydrogeler bildas lätt i olika storlekar och geometrier kan införliva många typer av primär eller förevigade cellkulturer, och är mycket mottagliga för analys av vanliga tekniker såsom confocal fluorescensmikroskopi. För att skapa en modell av gliaceller ärrbildning processen, har vi nyligen utvecklat och kännetecknas ett hyaluronsyra baserat 3D hydrogel system för hög genomströmning tester av gliaceller svar till implanterade elektroder (figur 1)65. Detta system har flera tydliga fördelar: 1) primära gliaceller (mikroglia, astrocyter och oligodendrocyter) är inkapslade i en 3D matrix består av polymerer av hyaluronsyra, som är en endogen extracellulärmatrix komponent; (2) matrix styvheten kan ställas 'in' för att återskapa de mekaniska egenskaperna av hjärnan eller ryggmärgsvävnad; och 3) celler kan vara inkapslade i matrisen i en snabb bänk strategi med fotopolymerisation med grönt ljus, begränsar toxicitet under inkapsling. Detta system möjliggör nyckel dragen av i vivo biokompatibilitet: enheter infogas i hydrogel på ett jämförbart sätt att vävnad och cellulära svaret på implantat ska övervakas för en rad olika parametrar65. Dessa inkluderar mekaniska mismatch mellan enheter och hydrogel beläggningar av olika strukturer och elektrisk stimulering pulser. Detta system innehåller också oligodendrocyte och relaterade prekursorer, som ofta närvarande och rekryterade i gliaceller ärr. Deras skador, dödsfall och fagocytos av mikroglia är ett starkt tecken på inflammatorisk skada och som en modell minskar ärrbildning eller återhämtning, de har kapacitet att demonstrera re-myelinisering av nervceller66.
Häri beskriver vi en metod för syntes och bildandet av hybrid hyaluronsyra hydrogels kombinerat med kommersiellt tillgängliga basalmembranet formuleringar att förbättra cell inkorporering. Vidare kommer vi att Visa införlivandet av primära odlade gliaceller (mikroglia, astrocyter och oligodendrocyter) och analys av kultur tillväxt med hjälp av immuncytokemi och konfokalmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet för hjärnans vävnad utvinning från dag 1-Sprague Dawley råttungar, euthanized genom halshuggning, godkändes av djur vård och användning kommittén vid University of Alberta.
1. mikroglia och Astrocyten isoleringar67,68
Obs: Alla medier för isolering och cellodling är förvärmd till 37 ° C i ett vattenbad. Hanks balanserad saltlösning (HBSS) har 1% penicillin-streptomycin (PS). Alla Dulbecco's modified örnens media med Hams F12 näringsämne blandning (DMEM/F12) kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin (PS). Endast blandningar med trypsin saknar FBS. Alla material i detta protokoll är sterilt (filter, alkohol, köpta och autoklaveras) och varje steg efter steg nummer 1,8 utförs i en biosäkerhet skåp med aseptisk teknik.
- Per hjärnan, Förvärm 15 mL HBSS och 12,5 mL DMEM/F12 till 37 ° C i 50 mL koniskt centrifugrör och cirka 2 mL av 0,25% trypsin med 1 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) i en 15 mL koniskt centrifugrör. Värm en ytterligare 25 mL DMEM/F12. Varma trypsin ca 10 min tidigare använda för att förhindra förlust av enzymaktivitet.
- Häll tillräckligt varm HBSS i steril, 6 och 10 cm kultur rätter att täcka ytan. Förbereda en 10 cm maträtt för varje två hjärnor plus en ytterligare 6 cm skålen.
- Placera upp till 2 hjärnor i varje 10 cm2 skålen (figur 2A).
- I dissektion Mikroskop, Använd böjda och raka pincetten för att separera cortices längs mittlinjen och lillhjärnan med hjärnstammen. Detta ger tre sektioner av vävnad per hjärnan (figur 2B).
- Skala tunna, halvgenomskinliga, lagret (hjärnhinnan) vävnad som innehåller blodkärl från varje avsnitt av vävnad och kassera, överföra återstående vävnaden till en separat kultur maträtt. Ta tag i tunna lager som exponeras av vävnad nedskärningar, med hjälp av tången, och dra försiktigt tills stora delar 'hängande utanför' hjärnvävnaden. Ta slutligen bort denna del av försiktigt rycka. Se figur 2 c-2E för representativa bilder av före, under och efter detta steg.
- I en biosäkerhet skåp, ta bort den återstående HBSS från kultur skålen, noggrant behålla vävnaden. Lös upp vävnaden med en skalpell och överföra vävnad till pre värmde 15 mL röret med trypsin.
- Inkubera denna tube för 25 min i ett 37 ° C bad att smälta vävnaden enzymatiskt.
- Centrifugera röret ner 500 x g under 2 minuter vid rumstemperatur och häll ut supernatanten.
- Med serologisk pipett 10 mL, tillsätt 10 mL varm DMEM/F12 för att inaktivera trypsin och pulverisera lösningen 5 gånger att bryta upp vävnaden.
- Centrifugera röret ner 500 x g under 2 minuter vid rumstemperatur och häll ut supernatanten.
- Med pipett 10 mL serologiska resuspendera pelleten i 10 mL varm DMEM/F12 och överför lösningen till en 50 mL konisk centrifugrör.
- Med en 10 mL spruta med en 18 gauge kanyl, pulverisera lösningen 3 gånger.
- Fördela denna lösning i steg om 12,5 mL varm DMEM/F12 per hjärna.
- Pipettera 1 mL steg om den triturated lösningen i en 12 väl platta (1 per hjärnan).
- Inkubera vid 37 ° C och 5% CO2i en befuktade cell kultur inkubator. Ersätta media efter tre dagar och uppdatera media varje efterföljande tre dagar. Efter 2 veckor, kan cellerna samlas för experiment.
2. Macromer syntes69
- Väg 375 mg hyaluronsyra (HA) salt i en 50 mL konisk centrifugrör och tillsätt 37,5 mL destillerat vatten.
- Spola lösningen med en vortexer för 1 min och Sonikera blandningen tills det visas homogen och förlorar dess gel-liknande viskositet. Denna process kan ta 6 h.
- Överför lösningen till en 100 mL-bägare med en magnetisk rör bar (38 mm) och rör kraftigt vid rumstemperatur.
- Noggrant titrera 5,0 M NaOH i blandande HA och mäta med pH-papper tills pH stabiliserar mellan 8 och 12.
- Samla 3 mL färsk metakrylsyra bauxit (MA, 94%), hissad av kväve under lagring.
Obs: MA utsätts för atmosfären för lång varaktighet (dagar), förlorar dess reaktivitet.
Varning: All användning av MA bör göras i dragskåp. - Tillsätt 200 µL av MA i blandande HA lösningen. Reaktionen sänker pH i lösningen nedan 8.
- Upprepa steg 2.4-2.6 tills de 3 mL av MA har lagts till lösningen. Denna process kan ta upp till 1-2 h.
- Låt reaktionen att fortsätta över natten vid 4 ° C, utan att blanda.
- Överför lösningen till 400 mL kall etanol (EtOH) i en 500 mL-bägare och låt nederbörd för 24-72 h vid 4 ° C. 56
- Försiktigt Dekantera den största delen av lösningen till en separat bägare för bortskaffande, och samla upp fällningen i en 50 mL konisk centrifugrör. Detta kan distribueras i 2-4 rör, om det behövs.
- Centrifugera rören vid 200 x g i en centrifug för 2 min i rumstemperatur och Kassera supernatanten.
- Fyll röret med kall EtOH, blanda lösningen med en vortexer för 1 min och upprepa steg 2.10-2.11.
- Tillsätt 25 mL sterilt avjoniserat vatten, blanda lösningen med en vortexer för 1 min, Sonikera (> 20 kHz) för 1 h, och inkubera vid 4 ° C över natten.
- Placera lösningen i-80 ° C frys i 15 min eller tills fryst eller flash frysa i flytande kväve.
Varning: När du använder flytande kväve, Använd skyddshandskar, ansiktsskydd och ett förkläde. - Frysa torra röret (under 0,1 mBar och -30 ° C) för 24-48 h tills ett snö-liknande pulver produceras.
- Vid denna punkt, testa prov för renhet via 1H kärnmagnetisk resonans, där mängden form protoner (toppar på 6,1 och 5,6 ppm), i förhållande till metyl protoner (1,9 ppm), på HA ryggrad kan bekräftas. En lägsta kapitaltäckningsgrad av 95% till metyl protoner är acceptabelt. 69
3. gel bildandet och 3D inkapsling65
-
Täckglas och mögel förberedelse
- Gör en 50 mL destillerat vattenlösning 2% 3-(Trimetoxysilyl) propyl form i en 50 mL konisk centrifugrör.
- Plats 18 mm glas coverslips i lösning och rock för 1 h i rumstemperatur. Upp till 50 coverslips kan läggas på en gång.
- Skölj coverslips av seriellt doppa varje i 3 bägare 100 mL avjoniserat vatten.
- Torka av coverslips i ett vakuum vid 40 ° C över natten med en torkapparat och ugn.
- Snabbt fördjupa enskilda coverslips i 70% EtOH med pincett.
- Släppa varje täckglas i en väl 12 väl platta utan torkning.
- Tvätta och sug upp varje brunn med sterilt avjoniserat vatten (1 mL per brunn).
- Tillsätt 1 mL steril 2 µg/ml poly-L-lysin (PLL) till varje brunn och inkubera i > 2 h.
- Aspirera PLL lösningen och låt coverslips luft torka.
- Sänk polydimethyl siloxan (PDMS) formar (se figur 1) i 70% EtOH och förlägger en vid mitten av varje täckglas, och låt lufttorka och skapa en tätning mellan mögel och glas.
- Förbereda PDMS formar genom gjutning PDMS premix reagenser i förhållandet 10:1 i en flatbottnad polystyren maträtt. Kvantiteten av PDMS beredd är valt att ge ett ark ca 1 mm tjock. Till formuläret brunnar i den PDMS, skär arken med en cirkel punch med en inre diameter av 10.
-
Cell förberedelse
Obs: Alla steg i protokollet utförs med steril teknik i en biosäkerhet skåp. Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) är justerad till pH 7,4 för alla steg.- 24 h före cellen inkapsling i HAMA, uppdatera mediet för 2 veckors primära kulturerna (från steg 1.15) i de 12 plattorna. Tillsätt 1 mL DMEM/F12 (10% FBS och 1% PS) medium per brunn.
- För varje 12-well platta celler förbereda 12,5 mL utspädd trypsin (0,25% trypsin-EDTA utspädd 30% med DMEM/F12 media) och 25 mL DMEM/F12 (10% FBS och 1% PS) och varm i vid 37 ° C i ett vattenbad.
- Samla luftkonditionerade medium från plattor med 10 mL serologiska pipett (> 0,5 mL per brunn), noggrant avlägsna kvarvarande vätska och ersätta med 1 mL per brunn av utspädd trypsin (0,075% trypsin-EDTA) för 20-30 min i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) tills det konfluenta celllagrar lossnar från plåten.
- Återställa svävande cell material med 1 mL pipett (visas som ett enda flytande stycke) och samla i en 15 mL koniskt centrifugrör. Späd med en motsvarande volym av DMEM/F12 (10% FBS och 1% PS), och centrifugera vid 200 x g under 2 minuter vid rumstemperatur, kasta bort supernatanten.
- Återsuspendera cellpelleten i 10 mL varm DMEM/F12 (10% FBS och 1% PS), pulverisera cellerna 5 gånger med 10 mL pipett och centrifugera 200 x g i 2 min.
- Dekantera supernatanten, Slamma upp cellerna i 5 mL varm DMEM/F12 och överföra cellerna till en 50 mL konisk centrifugrör.
- Med en 10 mL spruta med en 18 gauge nål, pulverisera den cell lösningen 3 gånger och filtrera suspensionen genom ett såll med 40 µm i cellen till en ny koniskt centrifugrör.
- Samla 10 µL cellsuspension, späd 1: 100 i varma DMEM/F12 och räkna celler med en automatisk cell räknare
- Inkubera i 37 ° C vattenbad tills inkapsling steg.
-
Cell-inkapsling
Obs: Alla steg i protokollet utförs med steril teknik i en biosäkerhet skåp.- För varje 12-well platta av 3D varma hydrogels 12,5 mL DMEM/F12 och 12,5 mL av konditionerat DMEM/F12 media insamlade under cell beredning.
- Väg mängden methacrylated hyaluronsyra (HAMA) krävs för en slutlig koncentration av 0,5% wt/vol. upplösa detta HAMA i sterila filtrerade PBS vid en koncentration på (2% wt/vol); en koncentration som är 4 gånger högre än den slutliga koncentrationen utnyttjas för att rymma tillägg av celler och andra reagenser. En 12 väl platta av hydrogels kräver ~ 350 µL PBS med 7 mg HAMA.
- Sonikera (> 20 kHz) lösningar tills HAMA är helt upplöst i 60 min.
- Förbereda enskilda 10% lösningar av både trietanolamin (TEA) och 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP), och en 1 mM lösning av Eosin Y (EY) i 1 mL portioner av steril fosfatbuffrad Koksaltlösning pH 7,4.
- För en 12 väl tavla, göra en slutlig 1,4 mL blandning av 1 x 107 celler, 0,5% wt/vol HAMA (350 μl av 2 wt/volymprocent), 0,1% te (14 µL 10%), 0,1% NVP (14 µL 10%), och 0,01 mM EY (14 µL av 1 mM) , och 20% basala lamina blandning (280 µL av lager). Den återstående volymen är PBS.
- Blanda lösningen försiktigt och Pipettera 100 µL i varje PDMS mögel med en 1 mL spets.
- Exponera prover till en hög intensitet grönt LED-ljus (~ 520 nm, 60 mW, i en sluten 20 x 20 cm x 20 cm låda) under 5 minuter i rumstemperatur.
- Tillsätt 1 mL per brunn av varma luftkonditionerade DMEM/F12 till en 12 väl platta.
- Förstå varje täckglas mellan tummen och pekfingret, långsamt lossnar PDMS mögel med böjd pincett att vara noga med att inte förskjuta gelen och placera det i en brunn med luftkonditionerade medium.
- Lägg till ytterligare 1 mL varm DMEM/F12 till varje brunn.
- Inkubera plattorna vid 37 ° C med 5% CO2 i 2 veckor, uppfriskande cell media varje vecka av spruta 1 mL av media från varje brunnar och ersätta med 1 mL DMEM/F12.
4. mikroskopi
-
Immuncytokemi
Obs: En inverterad confocal mikroskopet användes till bild dessa prover och ImageJ användes för att bearbeta och Visa bilder. Mikroglia, astrocyter, oligodendrocyter och kärnor, kommer att märkas efter 3 veckor i HAMA kultur.- Förvärma 10% PBS-buffrad formalin (pH 7,0) i badkar 37 ° C.
Varning: Även om formalin kan användas utanför dragskåp, detta material är reaktiva med vävnad, och bör hanteras med omsorg och handskar alltid. Det bör avyttra separat. - Aspirera försiktigt media från tallrikar och pipett 1 mL 10% formalin till varje brunn.
- Inkubera plattorna vid 37 ° C i en 5% CO2 för 20 min.
- Avlägsna vätska från varje platta, överför med pipett 2 mL PBS (pH 7,4) i varje brunn och inkubera i 15 min.
- Upprepa steg 4.1.4 två gånger.
- Avlägsna vätska från plattorna, tillsätt 1 mL per brunn PBS med 10% normal häst serum (NHS) och 0,5% triton x-100 och skaka försiktigt på lägsta hastighet) för 1 h.
- Upprepa steg 4.1.4 tre gånger.
- Aspirera vätska och tillsätt 1 mL per brunn av följande blandningen i PBS: kanin Joniserat kalcium bindande adapter molekyl (Iba1) 1:1, 000, kyckling glial fibrillary protein (Fredsgenomförande) 1:5, 000, mus 2', 3'-cykliska-nucelotide 3'-phophodiesterase (CNPase) 1:1, 000, 1% NHS , och 0,1% cell perforering tensid. Inkubera vid 4 ° C över natten, rocking plattan så varsamt som möjligt.
- Upprepa steg 4.1.4 tre gånger med 1 h inkubationer däremellan.
- Aspirera vätska och tillsätt 1 mL per brunn av följande blandningen i PBS: 647 nm upphetsad åsna anti-kanin antikropp 1: 200, 546 nm glada geten anti kyckling antikropp 1: 200, 488 nm upphetsad åsna antimus-antikropp 1: 200, 1% NHS, 1:1,000 blå nukleära fläcken. Odla i rumstemperatur för 1 h, försiktigt skaka plattan.
- Upprepa steg 4 tre gånger med 1 h inkubationer däremellan.
- För att bevara hydrogels, aspirera buffert, och doppa dem i 0,5 mL av cell monteringsmedium för 1 min. pipett ut monteringsmedium och försiktigt placera ett täckglas ovanpå i gel, att skapa ett lager mellan glaset. Lägga till en liten mängd monteringsmedium till avtäckta sida av coverslips att förhindra torkning av hydrogel.
Obs: För felsökningsändamål, geler kan avbildas på steg 4.1.11. att se korrekt märkning före vidare bearbetning.
- Förvärma 10% PBS-buffrad formalin (pH 7,0) i badkar 37 ° C.
-
Svepelektronmikroskopi (SEM)
Obs: För att visualisera hydrogel, ett svepelektronmikroskop användes till bild dessa prover.- Förvärm en fixativ blandning av 2,5% glutaraldehyd och 2% PARAFORMALDEHYD i PBS (0,1 M) i 37 ° C vattenbad.
Varning: Dessa reagenser är mycket reaktiva med vävnader, och bör hanteras med omsorg och handskar. De bör hanteras i dragskåp så mycket som möjligt och omhändertas separat. - Aspirera medium från cell kultur plattorna och tillsätt 1 mL av den förvärmda fixativ blandningen.
- Inkubera plattorna vid 37 ° C i en 5% CO2 för 20 min.
- Placera plåtarna i 4 ° C (kylskåp/kylare) över natten.
- Aspirera fixativ lösningen från brunnarna och tillsätt 1 mL PBS.
- Avlägsna vätska från varje platta, tillsätt 2 mL PBS i varje brunn och inkubera i 15 min.
- Upprepa steg 4.2.6 två gånger.
- Aspirera PBS och tillsätt 1 mL 1% osmium tetraoxide buffras i PBS till varje brunn.
Obs: Tills provet torkas, detta steg och alla efterföljande steg utförs i dragskåp. - Tillåta fixering att uppstå för 30 min. Osmium ånga från vätskan kan fixa andra prover i samma platta; Därför, partitionera prover med detta innan detta steg.
Varning: Osmium tetraoxide är mycket reaktiva med vävnad och flyktiga. Det är farligt och ska hanteras i dragskåp med handskar. Det och någon omedelbar tvättas ska bortskaffas separat. - Upprepa steg 4.2.6 tre gånger.
- Aspirera vätskan och Lägg de uttorkande blandningarna i listan nedan, i ordning och inkubera (rumstemperatur) för den angivna tiden. Börja genom att gradvis lägga till etanol (EtOH) följde därefter hexamethyldisilazane (HMDS). Se tabell 2 för varje ökning.
Obs: När du lägger HMDS, coverslips kan starkt följer plast och bli mycket svårt att avlägsna. Detta kan förhindras genom att placera en liten plast plattform under glas slip efter den första tillämpningen av HMDS. Efter den andra EtOH inkubationen, kan provet tas och härdas i flytande kväve för några sekunder att frysa fraktur provet. - Ta försiktigt bort de torkade proverna och montera proverna på svepelektronmikroskop stubbar med dubbelhäftande konduktiv tejp.
- Fräsande coat av prov med ett minimum av guld. Placera proverna i en hållare och maskinen för 2 min 15 mA.
- Förvärm en fixativ blandning av 2,5% glutaraldehyd och 2% PARAFORMALDEHYD i PBS (0,1 M) i 37 ° C vattenbad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att modellera nervvävnad värd svaret och gliaceller ärret i en hög genomströmning, kräver in vitro system en 3D cell byggnadsställning med ett matrismaterial som är biokompatibla och medför en cytotoxisk händelse under i situ bildandet är modifierbara med bioaktiva komponenter att vägleda välvilliga svar. Därför har vi skapat en 3D cell byggnadsställning baserat på hyaluronsyra, och inkapslade en primär blandad glial cell befolkningen för att studera cell-cell interaktioner och gliaceller bioreactivity. En kort visuell undersökning av celler och byggnadsställning utfördes. Morfologi av cell subpopulations, inklusive oligodendrocyter (CNPase i grönt), mikroglia (Iba1 i rött), och astrocyter (Fredsgenomförande i gult), visas av Immunofluorescerande konfokalmikroskopi (figur 3Ai-ii-Ci-ii). Kombinerade byggnadsställning och cell morfologi visas också av SEM (figur 3Aiii-iv - Ciii-iv). I dessa bilder visas både låg (i och iii), och hög (ii och iv) resolution representativa bilder. En 2D PLL täckglas beläggning (figur 3A) jämfördes med en 3D 0,5% w/v HAMA byggnadsställning (figur 3B), och en blandning av 20% v/v basala lamina blandning i 0,5% w/v HAMA (figur 3 c). Detta gjordes för att demonstrera de morfologiska skillnaderna i 2D och 3D cellkultur, samt effekten av att införa en biologisk lamina till schavotten. En 3D rekonstruktion finns också i den kompletterande Information.
Cellmorfologi av varje celltyp som förändrats med införandet av en 3D plattform. I 2D vidhäftande kultur (PLL-belagda glas coverslips), oligodendrocyter verkade normalt runda och bildade små nätverk brukar ansluta med lätt märkt Fredsgenomförande processer. Mikroglia var mindre än andra celler och hade små förgrenade processer som inte fördjupa långt från sin cell organ (< 20 µm). Astrocyter formades mer mångsidigt, några med en radiell morfologi med mindre cell organ och omfattande tunna, förgrenade processer, medan andra var fibrösa med en tillplattad utseende och några breda processer som belägga ytan. I 3D HAMA kultur, oligodendrocyter dök upp i kluster med Grenade i mindre områdena. Mikroglia var runda med några processer och astrocyter antingen rundade eller Grenade radiellt i nätverk från ett enda kluster. Generellt, dessa celler tycktes har vuxit ur från enstaka punkter eller kvar i områden av HAMA utan att kontakt med andra celler, som är till skillnad från 2D kulturen och tyder på begränsad rörlighet genom matrisen. När 20% v/v i en blandning, basala lamina lades till foto-polymerisation blandningen, alla gliaceller subtyper integrerat med 3D-plattformen, och bildade mer omfattande, interaktiva Grenade strukturer. Oligodendrocyter extended uppsvällda processer radiellt liknar de icke-basala lamina blandning morfologier, men tycktes dessutom förlänga processer längs de tunna sammankopplade nätverk av Astrocyten processer förgrening i hela ställningen. Mikroglia skingrades bland dessa mobilnätverk, med utspridda med tunn processer mer konsekvent med deras morfologi i vävnad. Sammantaget tyder morfologier på alla tre typer av glia integreras i HAMA-basala lamina blandningen fritt, potentiellt via antingen ökad följsamhet till den blandade substraten eller ökad förmåga att omforma schavotten.
När observeras av SEM, sågs cellmorfologi att bekräfta de confocal micrographs. HAMA matrisen framträdde som en slät yta med 10-50 µm porer sett svagt under ytan. Cellerna var anhängare till ytan av HAMA och var också svagt synliga i lager under. Dessa glia inte bildar jämförbara morfologier dem noterade i 2D kultur, men med tillägg av en basala lamina blandning, omfattande nätverk observerades. Tjocka Astrocyten fibrer, med mindre kluster av mikroglia observerades både HAMA-basala lamina blandning yta och sträcker sig genom matrisen på ett smidigt sätt. Detta kan ses svagt som matrisen viks runt cellerna, vilket tyder på att cellerna kan vara att förändra ställningen att formas till deras önskad konformationer.
Figur 1: Schematisk av methacrylated hyaluronsyra (HAMA)-baserat 3D cell kultur och fotopolymerisation protokollet. Gliaceller (2 veckors primära råtta hjärnan kultur) blandas med HAMA och pipetteras i ett Polydimetylsiloxan (PDMS) mögel på ett täckglas. Denna blandning är utsatt för en hög intensitet grön lysdiod att polymerisera av hydrogel för 5 min. Mögel avlägsnas och gelen inkuberas i media. Representativa celler inkluderar mikroglia (röd), astrocyter (gul) och oligodendrocyter (grön). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: dissekering av dag 1 Sprague Dawley råtthjärna pup. Bilder av hela hjärnan (A), dissektion av cortices och lillhjärnan (B), en enda cortex med hjärnhinnorna (C), peeling av hjärnhinnor med pincett (D) och meninge-fri cortex (E). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Immunofluorescerande confocal (i-ii) och skanning elektronmikrografier (iii-iv) av blandade glia cellpopulationer på 2D PLL beläggningar (A), HAMA (B) och HAMA-basala lamina blandning (C). Lägre (i, iii) och högre (ii, iv) förstoring bilder visas. Etiketter inkluderar Iba1 i rött för mikroglia, både i gult för astrocyter, CNPase i grönt för oligodendrocyter och en Hoechst nukleära fläck. Skala barer = 25 µm för confocal bilder och 50 (iii) och 20 µm (iv) för skanning elektronmikrografier. Hydrogeler var 0,5% w/v, och basala lamina blandning var 20% av volymen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande Figur1: 3D Immunofluorescerande Mikrografisk rekonstruktion av HAMA-basala lamina blandning med blandade glia cellpopulationer HAMA-basala lamina blandningen. Etiketter inkluderar Iba1 i rött för mikroglia, både i gult för astrocyter, CNPase i grönt för oligodendrocyter och en Hoechst nukleära fläck. Hydrogeler var 0,5% w/v, och Getrex var 20% av volymen. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
| HAMA | Basala Lamina | NVP | TE | EY | |
| Arbeta koncentration | 0,5% w/v | 20% v/v | 0,10% | 0,10% | .01 mM |
| 12-well Plate | 2% w/v | 100% w/v | 10% v/v | 10% v/v | 1 mM |
| 1.4 mL totalt | 350 ΜL | 280 ΜL | 14 ΜL | 14 ΜL | 14 ΜL |
Tabell 1: Exempel på Cell inkapsling.
| Komponent | Innehåll | Inkubationstid |
| EtOH | 30% | 30 min |
| EtOH | 50% | 30 min |
| EtOH | 70% | 30 min |
| EtOH | 90% | 20 min |
| EtOH | 100% | 20 min |
| EtOH | 100% | 20 min |
| EtOH:HMDS | 75:25 | 20 min |
| EtOH:HMDS | 50:50:00 | 20 min |
| EtOH:HMDS | 25:75 | 20 min |
| HMDS | 100% | 20 min |
| HMDS | 100% | Övernattning |
Tabell 2: Gradvisa ökningar av EtOH och HMDS i uttorkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mot målet att generera en 3D kultur system till modell gliaceller bioreactivity och gliaceller ärrbildning processen, har vi utvecklat ett system som kan stödja primära odlade mikroglia, astrocyter och oligodendrocyter och möjliggör robust karakterisering av cell morfologi och cell-cell interaktioner. Från de micrographs som visas, var morfologi av varje celltyp påtagligt annorlunda med 2D, 3D-HAMA och 3D HAMA-basala lamina blandning plattformar. I 2D-systemet morfologi var tydligt partisk längs med ytan plan, men jämfört med den 3D HAMA, mikroglia och astrocyter var generellt mindre inne i matrisen, med undantag för oligodendrocyte kluster. I de skanning elektronmikrografier var celler generellt mer formad runt på HAMA. Detta kan bero till stor del på de celler som är inkapslade, med begränsad kapacitet att ändra matris för förflyttning och fri rörlighet och tillväxt av processer. Cell utväxt i HAMA var vanligtvis radiella för både astrocyter och oligodendrocyter. Medan dessa celler utökade processer, deras organisation tyder på att deras rörlighet inom hela matrisen och förmågan att interagera med andra celler var begränsad. Tidigare arbete har dessutom visat frysa-brutna HAMA vara porösa utan sammankopplade nätverk, vilket kan förklara denna brist på utväxt65,70. Det kan vara möjligt att några av dessa celler överlevde inte den fotopolymerisation, återstående bevarade i matrisen, men lönsamhet bedömdes systematiskt i vårt tidigare arbete, och förblev 80% (0,5% w/v) under loppet av en vecka65.
För att förbättra cell samspelet med matrisen i 3D kultur, introducerade vi en basala lamina blandning som beståndsdel biokompatibelt och modifierbara matris. Cell-integrering med matrisen hittades förbättras markant, med alla celltyper som visar omfattande processer jämfört med både 2D kultur och 3D HAMA. Basala lamina blandningen består av en rad basala lamina komponenter och är primärt framtagen för att stödja gliaceller differentiering av neurala stamceller prekursorer71. Det var inte oväntat att gliacellerna svarade på basala lamina blandningen, och därefter den omgivande 3D matrisen, men omfattningen av integration tyder på en frisk vävnad-liknande miljö. Jämföra HAMA HAMA-basala lamina blandning, hydrogel morfologi visas inte påtagligt annorlunda, därför celler kan vara mer aktivt remodelling det. Med tanke på enkelheten i att lägga till denna bioaktiva komponent, är det inte otänkbart att använda olika laminas och protein ledtrådar eller för att gynna odlingsbetingelser för nervceller. I en potentiell framtida riktning, kunde detta system användas för att skilja nervceller från neurala stamfäder i samband med blandade glia för en mängd olika effektfulla myelinisering eller neuro-inflammatorisk skada modeller.
I händelse av allvarliga och skadliga CNS-skada eller biomaterial avvisande initierar bosatt vävnaden inflammatoriska reaktioner kan förvärra neurodegeneration och demyelinisering. Detta resulterar vanligtvis i bildandet av ett gliaceller ärr att partitionera platsen för skadan, vilket förhindrar regenerering. I denna studie var metoderna som anges för en methacrylated foto-polymeriseras hyaluronsyra-baserat 3D klätterställning med avsikt att modellering det första cellulära svaret bakom gliaceller ärrbildning; mikrogliala reaktivitet, astrocyt rekrytering och hypertrofi, och oligodendrocyte skada och uttag. En 3D cell byggnadsställning var utformad för att inkorporera alla tre gliaceller celltyper och ändrades ytterligare med en multi-komponent basala lamina blandning. Det bestämdes, confocal och skanning elektronmikroskopi imaging, som att celler var inkapslad i HAMA och kunde bättre att integrera när basala lamina blandningen infördes. Dessa resultat kan leda till flera nya tillämpningar. HAMA ensamma kan tjäna till att skapa samarbete kultur system där avsikten är att begränsa cell till cell interaktion eller studie destillera drogen leverans använder gelen som en drog laddade diffusion begränsad matris. Hydrogeler införliva basala lamina blandningen i matrisen HAMA möjliggör en mer konsekvent vävnad-liknande miljö kan modellering akut inflammation, gliosis eller gliaceller ärrbildning, och möjliggör ytterligare hög genomströmning karakterisering av gliaceller bioreactivity implantat, drog- och enheten utveckling och andra strategier för att minska och återvinna inflammatorisk skada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma för finansiellt stöd från NSERC, CFI, AIHS, Alberta Health Services och Davey begåvningen för hjärnforskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Materials for HAMA synthesis and photopolymerization | |||
| Hyaluronic acid (HA) | Sigma-Aldrich | 53747-10G | Streptococcus equi, MW: 1.5 - 1.8 X 10^6 |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 275585-100ML | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| Ethanol (EtOH) | Commerical Alcohols Inc. | Anhydrous | |
| Phosphate buffered saline (pH 7.4) tablets | Fisher Scientific | 18912014 | |
| Triethanolamine (TEA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| 1-Vinyl-2pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | |
| EosinY (EY) | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 440159-100ML | |
| Beaker (100 mL) | Corning | 1000-100 | |
| Beaker (500 mL) | Corning | 1000-600 | |
| pH paper (Labstick) | Sigma-Aldrich | 9580 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2. Materials for glial cell isolation and cell culture | |||
| P1-2 Sprague Dawley rat pups | Charles River | CD Sprague Dawley rat strain code 001 | |
| Dissector scissors - slim blades (small) | Fine Science Tools | 14081-09 | |
| Surgical scissors - Toughcut (large) | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11521-10 | |
| Curved fine forceps (Dumont #7) | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14170-112 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
| Penicillin-streptomycin (PS) | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 12483-020 | |
| 0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Gibco | 25200-072 | |
| Poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P-6282 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-5 | |
| 12 well Tissue culture treated plates (Cellstar) | Greiner Bio-One | 665 108 | |
| 10 mL serological pipette | Fisher Scientific | 13-676-10F | |
| 25 mL serological pipette | Fisher Scientific | 12-676-10K | |
| Petri dish (60 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri dish (100 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Microscope Coverslip (18 mm) | Fisher Scientific | 12-545-100 18CIR | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3. Materials for microscopy (confocal and scanning electron microscopy) | |||
| Mouse monoclonal anti-CNPase | abcam | ab6319 | |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako Laboratory Chemicals | 019-17741 | |
| Chicken anti-GFAP | abcam | ab4674 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | |
| Fluoromount-G | Fisher Scientific | 00-4958-02 | |
| Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Buffered (10%) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Paraformaldehyde | Electon Microscopy Sciences | 157-8 | Buffered (8%) |
| Guteraldehyde | Electon Microscopy Sciences | 16019 | Buffered (8%) |
| Osmium tetraoxide | Electon Microscopy Sciences | 19152 | Buffered (2%) |
| Hexamethyldilazane (HMDS) | Electon Microscopy Sciences | 16700 | |
| Ethanol (EtOH) | Electon Microscopy Sciences | 15055 | Anhydrous |
| Microscope Slide (25 X 75 X 1 mm) | VWR International | 48311-703 |
References
- Shih, J. J., Krusienski, D. J., Wolpaw, J. R. Brain-Computer Interfaces in Medicine. Mayo Clin. Proc. 87, 268-279 (2012).
- Kennedy, P. R., Bakay, R. A. Restoration of neural output from a paralyzed patient by a direct brain connection. Neuroreport. 9, 1707-1711 (1998).
- Kennedy, P. R., Bakay, R. A., Moore, M. M., Adams, K., Goldwaithe, J. Direct control of a computer from the human central nervous system. IEEE Trans. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 8, 198-202 (2000).
- Mayberg, H. S., et al. Deep Brain Stimulation for Treatment-Resistant Depression. Neuron. 45, 651-660 (2005).
- Dougherty, D. D., et al. A Randomized Sham-Controlled Trial of Deep Brain Stimulation of the Ventral Capsule/Ventral Striatum for Chronic Treatment-Resistant Depression. Biol. Psychiatry. 78, 240-248 (2015).
- Bamford, J. A., Marc Lebel, R., Parseyan, K., Mushahwar, V. K. The Fabrication, Implantation, and Stability of Intraspinal Microwire Arrays in the Spinal Cord of Cat and Rat. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 25, 287-296 (2017).
- Holinski, B. J., et al. Intraspinal microstimulation produces over-ground walking in anesthetized cats. J. Neural Eng. 13, 056016 (2016).
- Toossi, A., Everaert, D. G., Azar, A., Dennison, C. R., Mushahwar, V. K. Mechanically Stable Intraspinal Microstimulation Implants for Human Translation. Ann. Biomed. Eng. 45, 681-694 (2017).
- Saigal, R., Renzi, C., Mushahwar, V. K. Intraspinal microstimulation generates functional movements after spinal-cord injury. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 12, 430-440 (2004).
- Lau, B., Guevremont, L., Mushahwar, V. K. Strategies for generating prolonged functional standing using intramuscular stimulation or intraspinal microstimulation. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 15, 273-285 (2007).
- Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. J. Neurosci. Methods. 148, 1-18 (2005).
- Sierra, A., et al. Surveillance, phagocytosis, and inflammation: how never-resting microglia influence adult hippocampal neurogenesis. Neural Plast. 2014, 610343 (2014).
- Holm, T. H., Draeby, D., Owens, T. Microglia are required for astroglial Toll-like receptor 4 response and for optimal TLR2 and TLR3 response. Glia. 60, 630-638 (2012).
- Gao, Z., et al. Reciprocal modulation between microglia and astrocyte in reactive gliosis following the CNS injury. Mol. Neurobiol. 48, 690-701 (2013).
- Jin, X., Yamashita, T. Microglia in central nervous system repair after injury. J. Biochem. (Tokyo). 159, 491-496 (2016).
- Griffith, R. W., Humphrey, D. R. Long-term gliosis around chronically implanted platinum electrodes in the Rhesus macaque motor cortex. Neurosci. Lett. 406, 81-86 (2006).
- Biran, R., Martin, D. C., Tresco, P. A. Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays. Exp. Neurol. 195, 115-126 (2005).
- Fawcett, J. W., Asher, R. A. The glial scar and central nervous system repair. Brain Res. Bull. 49, 377-391 (1999).
- Szarowski, D. H., et al. Brain responses to micro-machined silicon devices. Brain Res. 983, 23-35 (2003).
- Park, D. -W., et al. Graphene-based carbon-layered electrode array technology for neural imaging and optogenetic applications. Nat. Commun. 5, 5258 (2014).
- McAllister, J. P., et al. Biocompatibility of Penetrating Recording Electrode Arrays Implanted Chronically in the Feline Visual Cortex. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 1528 (2005).
- Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. J. Neurochem. 109, 117-125 (2009).
- Chung, H., et al. In vivo Biocompatibility and Stability of Polyimide Microelectrode Array for Retinal Stimulation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 5072 (2003).
- Aregueta-Robles, U. A., Woolley, A. J., Poole-Warren, L. A., Lovell, N. H., Green, R. A. Organic electrode coatings for next-generation neural interfaces. Front. Neuroengineering. 7, (2014).
- Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24, 4337-4351 (2003).
- Yang, J., et al. Ordered surfactant-templated poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) conducting polymer on microfabricated neural probes. Acta Biomater. 1, 125-136 (2005).
- Ludwig, K. A., et al. Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) polymer coatings facilitate smaller neural recording electrodes. J. Neural Eng. 8, 014001 (2011).
- Kim, D. -H., Abidian, M., Martin, D. C. Conducting polymers grown in hydrogel scaffolds coated on neural prosthetic devices. J. Biomed. Mater. Res. A. 71, 577-585 (2004).
- George, P. M., et al. Fabrication and biocompatibility of polypyrrole implants suitable for neural prosthetics. Biomaterials. 26, 3511-3519 (2005).
- Stauffer, W. R., Cui, X. T. Polypyrrole doped with 2 peptide sequences from laminin. Biomaterials. 27, 2405-2413 (2006).
- Green, R. A., Lovell, N. H., Wallace, G. G., Poole-Warren, L. A. Conducting polymers for neural interfaces: challenges in developing an effective long-term implant. Biomaterials. 29, 3393-3399 (2008).
- Gumbiner, B. M. Cell adhesion: the molecular basis of tissue architecture and morphogenesis. Cell. 84, 345-357 (1996).
- Chan, G., Mooney, D. J. New materials for tissue engineering: towards greater control over the biological response. Trends Biotechnol. 26, 382-392 (2008).
- Green, R. A., Lovell, N. H., Poole-Warren, L. A. Impact of co-incorporating laminin peptide dopants and neurotrophic growth factors on conducting polymer properties. Acta Biomater. 6, 63-71 (2010).
- Green, R. A., Lovell, N. H., Poole-Warren, L. A. Cell attachment functionality of bioactive conducting polymers for neural interfaces. Biomaterials. 30, 3637-3644 (2009).
- Koss, K. M., Unsworth, L. D. Neural tissue engineering: Bioresponsive nanoscaffolds using engineered self-assembling peptides. Acta Biomater. 44, 2-15 (2016).
- Koss, K. M., et al. Brain biocompatibility and microglia response towards engineered self-assembling (RADA)4 nanoscaffolds. Acta Biomater. 35, 127-137 (2016).
- Evans, A. J., et al. Promoting neurite outgrowth from spiral ganglion neuron explants using polypyrrole/BDNF-coated electrodes. J. Biomed. Mater. Res. A. 91, 241-250 (2009).
- Yu, X., Bellamkonda, R. V. Tissue-engineered scaffolds are effective alternatives to autografts for bridging peripheral nerve gaps. Tissue Eng. 9, 421-430 (2003).
- Houweling, D. A., Lankhorst, A. J., Gispen, W. H., Bär, P. R., Joosten, E. A. Collagen containing neurotrophin-3 (NT-3) attracts regrowing injured corticospinal axons in the adult rat spinal cord and promotes partial functional recovery. Exp. Neurol. 153, 49-59 (1998).
- Wells, M. R., et al. Gel matrix vehicles for growth factor application in nerve gap injuries repaired with tubes: a comparison of biomatrix, collagen, and methylcellulose. Exp. Neurol. 146, 395-402 (1997).
- Barras, F. M., Pasche, P., Bouche, N., Aebischer, P., Zurn, A. D. Glial cell line-derived neurotrophic factor released by synthetic guidance channels promotes facial nerve regeneration in the rat. J. Neurosci. Res. 70, 746-755 (2002).
- Fine, E. G., Decosterd, I., Papaloïzos, M., Zurn, A. D., Aebischer, P. GDNF and NGF released by synthetic guidance channels support sciatic nerve regeneration across a long gap. Eur. J. Neurosci. 15, 589-601 (2002).
- Burdick, J. A., Ward, M., Liang, E., Young, M. J., Langer, R. Stimulation of neurite outgrowth by neurotrophins delivered from degradable hydrogels. Biomaterials. 27, 452-459 (2006).
- Piantino, J., Burdick, J. A., Goldberg, D., Langer, R., Benowitz, L. I. An injectable, biodegradable hydrogel for trophic factor delivery enhances axonal rewiring and improves performance after spinal cord injury. Exp. Neurol. 201, 359-367 (2006).
- Jain, A., Kim, Y. -T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27, 497-504 (2006).
- Taylor, S. J., Sakiyama-Elbert, S. E. Effect of controlled delivery of neurotrophin-3 from fibrin on spinal cord injury in a long term model. J. Control. Release Off. J. Control. Release Soc. 116, 204-210 (2006).
- Jhaveri, S. J., et al. Release of nerve growth factor from HEMA hydrogel-coated substrates and its effect on the differentiation of neural cells. Biomacromolecules. 10, 174-183 (2009).
- Lee, A. C., et al. Controlled release of nerve growth factor enhances sciatic nerve regeneration. Exp. Neurol. 184, 295-303 (2003).
- Matsumoto, K., et al. Neurite outgrowths of neurons with neurotrophin-coated carbon nanotubes. J. Biosci. Bioeng. 103, 216-220 (2007).
- Khaled, I., et al. A Flexible Base Electrode Array for Intraspinal Microstimulation. IEEE Trans. Biomed. Eng. 60, 2904 (2013).
- David-Pur, M., Bareket-Keren, L., Beit-Yaakov, G., Raz-Prag, D., Hanein, Y. All-carbon-nanotube flexible multi-electrode array for neuronal recording and stimulation. Biomed. Microdevices. 16, 43-53 (2014).
- Hsu, H. -L., et al. Flexible UV-ozone-modified carbon nanotube electrodes for neuronal recording. Adv. Mater. Deerfield Beach Fla. 22, 2177-2181 (2010).
- Lacour, S. P., et al. Flexible and stretchable micro-electrodes for in vitro and in vivo neural interfaces. Med. Biol. Eng. Comput. 48, 945-954 (2010).
- Lin, C. -M., Lee, Y. -T., Yeh, S. -R., Fang, W. Flexible carbon nanotubes electrode for neural recording. Biosens. Bioelectron. 24, 2791-2797 (2009).
- Richter, A., et al. A simple implantation method for flexible, multisite microelectrodes into rat brains. Front. Neuroengineering. 6, 6 (2013).
- Rousche, P. J., et al. Flexible polyimide-based intracortical electrode arrays with bioactive capability. IEEE Trans. Biomed. Eng. 48, 361-371 (2001).
- Polikov, V. S., Block, M. L., Fellous, J. -M., Hong, J. -S., Reichert, W. M. In vitro model of glial scarring around neuroelectrodes chronically implanted in the CNS. Biomaterials. 27, 5368-5376 (2006).
- Sohal, H. S., Clowry, G. J., Jackson, A., O'Neill, A., Baker, S. N. Mechanical Flexibility Reduces the Foreign Body Response to Long-Term Implanted Microelectrodes in Rabbit Cortex. PloS One. 11, e0165606 (2016).
- Moshayedi, P., et al. The relationship between glial cell mechanosensitivity and foreign body reactions in the central nervous system. Biomaterials. 35, 3919-3925 (2014).
- Hopkins, A. M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. 3D in vitro modeling of the central nervous system. Prog. Neurobiol. 125, 1-25 (2015).
- Pöttler, M., Zierler, S., Kerschbaum, H. H. An artificial three-dimensional matrix promotes ramification in the microglial cell-line, BV-2. Neurosci. Lett. 410, 137-140 (2006).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. 0, 42-51 (2014).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12, 207-218 (2014).
- Jeffery, A. F., Churchward, M. A., Mushahwar, V. K., Todd, K. G., Elias, A. L. Hyaluronic acid-based 3D culture model for in vitro testing of electrode biocompatibility. Biomacromolecules. 15, 2157-2165 (2014).
- Fitch, M. T., Silver, J. CNS Injury, Glial Scars, and Inflammation. Exp. Neurol. 209, 294-301 (2008).
- Churchward, M. A., Todd, K. G. Statin treatment affects cytokine release and phagocytic activity in primary cultured microglia through two separable mechanisms. Mol. Brain. 7, 85 (2014).
- Lai, A. Y., Todd, K. G. Differential regulation of trophic and proinflammatory microglial effectors is dependent on severity of neuronal injury. Glia. 56, 259-270 (2008).
- Hachet, E., Van Den Berghe, H., Bayma, E., Block, M. R., Auzély-Velty, R. Design of biomimetic cell-interactive substrates using hyaluronic acid hydrogels with tunable mechanical properties. Biomacromolecules. 13, 1818-1827 (2012).
- Eslami, M., Javadi, G., Agdami, N., Shokrgozar, M. A. Expression of COLLAGEN 1 and ELASTIN Genes in Mitral Valvular Interstitial Cells within Microfiber Reinforced Hydrogel. Cell J (Yakhteh). , (2015).
- Shaltouki, A., Peng, J., Liu, Q., Rao, M. S., Zeng, X. Efficient Generation of Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells in Defined Conditions. STEM CELLS. 31, 941-952 (2013).
