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Bioengineering

Migliorata 3D idrogel culture di cellule gliali primari In Vitro modellazione del Neuroinflammation

Published: December 8, 2017 doi: 10.3791/56615
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,3, 1,2,4, 3, 1,2,5
1Department of Psychiatry, University of Alberta, 2Alberta Innovates-Health Solutions Interdisciplinary Team in Smart Neural Prostheses (Project SMART), University of Alberta, 3Department of Chemical and Materials Engineering, University of Alberta, 4Division of Physical Medicine and Rehabilitation, University of Alberta, 5Centre for Neuroscience, University of Alberta

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per la cultura 3D del ratto cellule di glia cervello-derivato, tra cui gli astrociti, microglia ed oligodendrociti. Dimostriamo che la cellula primaria cultura, sintesi di idrogel di acido ialuronico methacrylated (HAMA), incapsulamento delle cellule e HAMAphoto-polimerizzazione e campione di elaborazione per l'imaging al microscopio confocale e scansione elettrone.

Abstract

Nel sistema nervoso centrale, numerose lesioni acute e malattie neurodegenerative, come bene come impiantati dispositivi o biomateriali ingegnerizzati per migliorare il risultato della funzione allo stesso risultato: l'infiammazione in eccesso conduce a gliosi, citotossicità, e/o Formazione di una cicatrice gliale che collettivamente aggravare lesioni o impedire il ripristino sano. Con l'intento di creare un sistema di modello cicatrice gliale formazione e studio dei processi infiammatori, abbiamo generato un'impalcatura di cella 3D in grado di ospitare le cellule gliale coltivate primarie: microglia che regolano la reazione da corpo estraneo e avviare la evento infiammatorio, astrociti che rispondere a formare una cicatrice fibrosa e oligodendrociti che sono in genere vulnerabili al danno infiammatorio. Il presente lavoro fornisce un metodo passo passo dettagliato per la fabbricazione, la cultura e la caratterizzazione microscopica di un ponteggio di idrogel 3D a base di acido ialuronico con ratto incapsulato cervello-ha derivato le cellule gliali. Ulteriormente, vengono illustrati i protocolli per la caratterizzazione di incapsulamento delle cellule e l'impalcatura di idrogel di immunofluorescenza confocale e microscopia elettronica a scansione, così come la capacità di modificare il patibolo con substrati bioattivi, con incorporazione di una miscela commerciale lamina basale all'integrazione migliore delle cellule.

Introduction

Infiammazione del sistema nervoso centrale (CNS) lungamente è stato considerato un segno distintivo di acuto (ad es., ictus ischemico, trauma cerebrale e ferita del midollo spinale) e croniche (ad es. morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson di e malattie di Huntington) lesione dello SNC, ma è sempre più riconosciuto come un contributo causale alla malattie neurodegenerative e disordini neuropsichiatrici. Sostenuto o infiammazione inappropriato può causare lesioni neurali e demielinizzazione (ad es. sclerosi multipla) e influenzare negativamente lo sviluppo del cervello (ad esempio, la schizofrenia, autismo) e Stati dell'umore (per esempio, depressione, ansia disturbo bipolare). Inoltre, nuove strategie terapeutiche utilizzando dispositivi impiantabili (ad es., interfacce cervello-computer1,2,3, cerebrale profonda stimolazione4,5, intraspinal microstimulation6,7,8,9,10) generare una risposta infiammatoria prevedibile all'interfaccia tra il dispositivo e il sistema nervoso centrale con conseguente un risposta di tessuto protettivo che può causare la perdita di efficacia o dispositivo guasto per tutta la durata dell' impianto11. Infiammazione del SNC viene in genere avviato da microglia, che fungono da cellule immunitarie residente dello SNC responsabili della sorveglianza del tessuto e la risposta da corpo estraneo (ha commentato12) di montaggio. A seconda della gravità dell'insulto, il segnale di microglia e recluta ulteriore tipi a un sito di lesione delle cellule. In particolare, le microglia attivate gli astrociti, che a loro volta fungono da cellule infiammatorie secondarie e forma una barriera protettiva densa per contenere un infortunio sito13,14. Le microglia possono inoltre avviare una cascata di attività nelle cellule del sistema immunitario periferico, che può provocare la rottura della barriera emato-encefalica per permettere l'infiltrazione immune (rivisto in riferimento15).

Nel caso di dispositivi impiantati nello SNC, danni ai tessuti derivanti dall'inserimento del dispositivo, nonché la continua presenza del dispositivo straniero possono avviare un processo chiamato cicatrici gliali. In questo processo, la microglia migrare e proliferare il sito della lesione. Iniziano anche il rilascio di fattori infiammatori per neutralizzare le minacce potenziali e reclutare altre cellule gliali. Successivamente, gli astrociti attivati diventano ipertrofici e iniziano che incapsula il dispositivo impiantato per formare una barriera fibrosa continua16. Infiammatorie di segnalazione serve anche a promuovere il ritiro di processi neuronali dalle vicinanze dell'impianto e alla fine reclute fibroblasti per rinforzare la cicatrice gliale sviluppo17. I oligodendrocytes, responsabili di guaina neuroni nella mielina per migliorare la conduttanza, non sopravvivono questo processo e cellule distanti sono divisi dall'impianto di cicatrice18. Cicatrici gliali notevolmente riduce la funzione e la durata dei dispositivi impiantati, particolarmente per gli elettrodi di registrazione e in definitiva serve a limitare la funzionalità di interfacce neurali19.

Diversi approcci sono stati sfruttati per aumentare la biocompatibilità e l'attività di interfaccia dei dispositivi impiantati nel CNS20,21,22,23. Una vasta revisione è disponibile sulla progettazione biocompatibile di queste interfacce neurali24. Le strategie più prominenti includono che circonda l'elettrodo con rivestimenti compatibili come polyelthyleneglycol (PEG), acidi polilattico-co-glicolico (PLGA)25, o migliorando l'elettrodo con polimeri conduttivi come poli (etilene dioxythiophene) (PEDOT) e polipirrolo (PPy)26,27,28,29,30,31. Rivestimenti bioattivi sono stati impiegati anche per fornire spunti per la crescita di tessuto neurale utilizzando ligandi derivati da matrici extracellulari inclusi collageni, fibronectins e acidi ialuronici32,33,34 ,35,36,37. La bioattività di questi rivestimenti è stato ulteriormente esplorata con sistemi di rilascio di fattore di crescita per emulare la cellula naturale secrezioni30,38,39,40,41 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50. contemporaneamente, alcuni gruppi di ricerca hanno optato per rimodellare la geometria dell'elettrodo, la flessibilità e la composizione per diminuire la meccanica mancata corrispondenza tra il dispositivo e tessuto51,52,53 ,54,55,56,57. Complessivamente, queste strategie hanno portato a molti promettenti miglioramenti nell'interfacciale neurale, dispositivi di prossima generazione, tuttavia la compatibilità a lungo termine è un problema in corso e progresso può essere ostacolata da lunghi e complessi in vivo modelli .

Gli approcci basati su modello animali possono limitare la velocità di trasmissione sperimentale e aumentare i costi delle prove di biocompatibilità di elettrodo. In vitro si avvicina utilizzando colture cellulari convenzionali tecniche offrono un'alternativa più economica ma non riescono a ricapitolare la complessità dell'interazione tra il dispositivo e tessuto58. In particolare, test dei rivestimenti superficiali utilizzando limiti di cultura cellulare 2D alla modellazione della geometria dell'elettrodo e l'influenza di mancata corrispondenza meccanica e micromotion pensati per contribuire a generare una risposta di host contribuendo al dispositivo guasto59 , 60.

Per superare i problemi associati con coltura cellulare 2D, idrogel culture di cellule neurali sono state sviluppate per una vasta gamma di applicazioni, studi farmacologici61, per dirigere la differenziazione delle cellule neurali62, per capire la malattia percorsi63,64, o a strati in co-coltura con altri tipi di cellule per migrazione delle cellule di modello, neuroprotezione, o modello tessuto microambienti61. Idrogeli si formano facilmente alle diverse dimensioni e geometrie possono incorporare numerosi tipi di colture cellulari primarie o immortalizzate e sono altamente suscettibili di analisi di tecniche comunemente usate come microscopia di fluorescenza confocale. Per creare un modello del processo di cicatrici gliale, abbiamo recentemente sviluppato e caratterizzato un sistema idrogel 3D base di acido ialuronico per high throughput test della risposta gliale a elettrodi impiantati (Figura 1)65. Questo sistema ha diversi vantaggi: 1) primarie cellule gliali (microglia, astrociti e oligodendrociti) vengono incapsulate in una matrice 3D composta da polimeri di acido ialuronico, che è un componente della matrice extracellulare endogeno; 2) la rigidità di matrice può essere 'sintonizzata' per ricreare le caratteristiche meccaniche del cervello o del midollo spinale del tessuto; e 3) le cellule possono essere incapsulate nella matrice in un approccio di banco rapido utilizzo di fotopolimerizzazione con luce verde, limitazione della tossicità durante l'incapsulamento. Questo sistema permette le caratteristiche principali di biocompatibilità in vivo : dispositivi vengono inseriti nell'idrogel in maniera analoga al tessuto, e la risposta cellulare a dispositivi impiantati sono monitorati per una vasta gamma di parametri65. Questi includono meccanica mancata corrispondenza tra i dispositivi e i rivestimenti di idrogel di varie strutture e impulsi di stimolazione elettrica. Questo sistema include anche oligodendrociti e precursori correlati, che sono spesso presenti e reclutati in cicatrici gliali. Loro danno, la morte e la fagocitosi di microglia sono altamente indicativi di lesioni infiammatorie e come un modello ridotto cicatrici o recupero, hanno la capacità di dimostrare re-mielinizzazione dei neuroni66.

Qui descriviamo un metodo per la sintesi e formazione di idrogel di acido ialuronico ibrido combinato con formulazioni disponibili in commercio della membrana dello scantinato per migliorare l'incorporazione delle cellule. Ulteriormente, ci dimostrerà l'incorporazione delle cellule gliale coltivate primarie (microglia, astrociti e oligodendrociti) e analisi della crescita cultura mediante immunoistochimica e microscopia confocale.

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Protocol

Il protocollo per l'estrazione del tessuto di cervello da cuccioli di ratto Sprague Dawley giorno 1, eutanasizzati per decapitazione, è stato approvato dal comitato di impiego presso l'Università di Alberta e cura degli animali.

1. Microglia e astrociti isolamenti67,68

Nota: Tutti i media per isolamento e coltura delle cellule è preriscaldato a 37 ° C in un bagno d'acqua. Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) ha 1% penicillina-streptomicina (PS). Tutti i Dulbecco per volta media dell'Aquila con F12 di Ham miscela nutriente (DMEM/F12) è completato con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina (PS). Sola miscele con tripsina mancano FBS. Tutti i materiali in questo protocollo sono sterile (filtro, alcool, acquistati e autoclavati) e ogni passo dopo passo numero 1.8 viene eseguita in una cappa di biosicurezza con tecnica asettica.

  1. Al cervello, pre-riscaldare 15 mL di HBSS e 12,5 mL DMEM/F12 a 37 ° C in provette centrifuga a fondo conico da 50 mL e circa 2 mL di tripsina 0,25% con 1 millimetro di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in una provetta conica per centrifuga da 15 mL. Riscaldare un ulteriore 25 mL di DMEM/F12. Tripsina calda circa 10 min prima di utilizzare per prevenire la perdita di attività enzimatica.
  2. Versare abbastanza caldo HBSS sterile, 6 e 10 cm cultura piatti per coprire la superficie. Preparare un piatto di 10 cm per ogni due cervelli più un piatto di ulteriori 6 cm.
  3. Inserire fino a 2 cervelli in ogni piatto2 di 10cm (Figura 2A).
  4. Sotto un microscopio di dissezione, è possibile utilizzare pinze curve e rette per separare le cortecce lungo la linea mediana e il cervelletto con tronco cerebrale. Questo produce tre sezioni di tessuto al cervello (Figura 2B).
  5. Sbucciare il sottile strato semi-trasparente, (meningi) di tessuto che contiene i vasi sanguigni da ogni sezione di tessuto e di scartare, trasferendo il tessuto restante in un piatto di cultura separata. Cogliere i sottili strati esposti dai tagli di tessuto, con il forcipe e tirare fino a grandi porzioni sono 'appeso' il tessuto cerebrale. Infine rimuovere questa porzione tirandola delicatamente. Vedere Figura 2-2E per immagini rappresentative di prima, durante e dopo questo passaggio.
  6. In una cappa di biosicurezza, rimuovere il restante HBSS dalla piastra di coltura, con cura mantenendo il tessuto. Macerare il tessuto con un bisturi e trasferimento del tessuto per il tubo da 15 mL pre-riscaldato con tripsina.
  7. Incubare la provetta per 25 min in un bagno di 37 ° C per digerire il tessuto enzimaticamente.
  8. Centrifugare la provetta giù a 500 x g per 2 min a temperatura ambiente e versare il supernatante.
  9. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, aggiungere 10 mL di caldo DMEM/F12 per inattivare la tripsina e triturare la soluzione 5 volte per rompere il tessuto.
  10. Centrifugare la provetta giù a 500 x g per 2 min a temperatura ambiente e versare il supernatante.
  11. Utilizzando una pipetta sierologica 10ml, risospendere il pellet in 10 mL di caldo DMEM/F12 e trasferire la soluzione in un 50 mL provetta conica per centrifuga.
  12. Usando una siringa da 10 mL con un ago 18 calibro, triturare la soluzione 3 volte.
  13. Distribuire questa soluzione in incrementi di 12,5 mL di caldo DMEM/F12 al cervello.
  14. Pipetta con incrementi di 1 mL della soluzione triturata in una piastra ben 12 (1 al cervello).
  15. Incubare a 37 ° C e 5% di CO2in un'incubatrice di coltura cellulare umidificata. Sostituire il supporto dopo tre giorni e aggiornare media ogni tre giorni successivi. Dopo 2 settimane, le cellule possono essere raccolti per esperimenti.

2. possono sintesi69

  1. Pesano 375 mg di sale di acido ialuronico (HA) in una provetta conica per centrifuga da 50 mL e aggiungere 37,5 mL di acqua distillata.
  2. Svuotare la soluzione con un Vortex per 1 min e Sonicare la miscela fino a quando non appare omogeneo e perde la sua viscosità gelatinosa. Questo processo può richiedere 6 h.
  3. Soluzione di trasferimento per un becher da 100 mL con un magnetico mescolare bar (38 mm) e mescolare energicamente a temperatura ambiente.
  4. Attentamente titolare 5,0 M NaOH nella miscelazione HA e misura con carta pH fino a quando il pH si stabilizza tra 8 e 12.
  5. Raccogliere 3 mL di anidride metacrilica fresco (MA, 94%), ricoperte di azoto durante la conservazione.
    Nota: MA è esposto all'atmosfera per lunghi periodi (giorni), perderà la sua reattività.
    Attenzione: Tutti gli utilizzi del MA dovrebbero essere fatto in una cappa aspirante.
  6. Aggiungere 200 µ l di MA nella soluzione di miscelazione HA. La reazione abbassa il pH della soluzione inferiore a 8.
  7. Ripetere i passaggi da 2.4 a 2.6 3ml di MA sono stati aggiunti alla soluzione. Questo processo potrebbe richiedere fino a 1-2 h.
  8. Consentire la reazione di continuare tutta la notte a 4 ° C, senza mescolare.
  9. Trasferire la soluzione a 400 mL di etanolo freddo (EtOH) in un becher da mL 500 e consentire di precipitazione per 24-72 h a 4 ° C. 56
  10. Accuratamente decantare la parte principale della soluzione in un becher separato per lo smaltimento e raccogliere il precipitato in una provetta conica per centrifuga da 50 mL. Questo può essere distribuito in 2-4 tubi, se necessario.
  11. Centrifugare le provette a 200 x g in una centrifuga per 2 min a temperatura ambiente e smaltire il supernatante.
  12. Riempire il tubo con EtOH freddo, mescolare la soluzione con un Vortex per 1 min e ripetere il passo 2.10-2.11.
  13. Aggiungere 25 mL di acqua deionizzata sterile, miscelare la soluzione con un Vortex per 1 min, sottoporre ad ultrasuoni (> 20 kHz) per 1 h e incubare a 4 ° C durante la notte.
  14. Inserire la soluzione in un congelatore-80 ° C per 15 minuti o fino a quando congelato o flash congelato in azoto liquido.
    Attenzione: Quando si utilizza azoto liquido, usare guanti protettivi, una visiera e un grembiule.
  15. Congelare a secco il tubo (inferiore a 0,1 mBar e -30 ° C) per 24-48 h fino a produrre una polvere di neve-come.
  16. A questo punto, testare il campione per la purezza tramite risonanza magnetica 1H nucleare, dove la quantità di protoni in metacrilato (picchi a 6,1 e 5,6 ppm), rispetto a protoni di metile (1,9 ppm), della spina dorsale HA può essere confermata. Un rapporto minimo di 95% di metacrilato di protoni di metile è accettabile. 69

3. gel formazione e incapsulamento 3D65

  1. Vetrino coprioggetti e preparazione di stampo
    1. Fare una soluzione di acqua 50 mL di acqua distillata del 2% 3-(trimetossisilil) metacrilato di propile in una provetta conica per centrifuga da 50 mL.
    2. Lamelle di vetro posto 18 mm in soluzione e rock per 1 h a temperatura ambiente. Fino a 50 vetrini coprioggetti possono essere aggiunti in una sola volta.
    3. Sciacquare le lamelle immergendo in serie ciascuno in 3 bicchieri di 100 mL di acqua deionizzata.
    4. Asciugare i vetrini coprioggetti in un vuoto a 40 ° C durante la notte con un essiccatore e forno.
    5. Immergere rapidamente singoli vetrini coprioggetti in 70% EtOH con il forcipe.
    6. Senza seccare, cadere ogni vetrino coprioggetti in un pozzetto di una piastra ben 12.
    7. Lavare ed aspirare ogni pozzetto con acqua deionizzata sterile (1 mL per pozzetto).
    8. Aggiungere 1 mL di sterile 2 µ g/ml poli-L-lisina (PLL) ad ogni pozzetto e incubare per > 2 h.
    9. Aspirare la soluzione PLL e lasciare asciugare i vetrini coprioggetto per aria.
    10. Immergere polidimetil stampi silossano (PDMS) (Vedi Figura 1) in 70% EtOH e uno posto al centro di ogni vetrino coprioggetti e lasciare asciugare all'aria e creare una guarnizione tra la muffa e il vetro.
      1. Preparare gli stampi PDMS lanciando PDMS premiscela reagenti in un rapporto di 10:1 in un piatto fondo piatto di polistirolo. La quantità di PDMS preparato è selezionata per produrre un foglio di spessore 1 mm circa. Pozzetti di forma nel PDMS, tagliare i fogli con un pugno di cerchio con un diametro interno di 10.
  2. Preparazione delle cellule
    Nota: Tutti i passaggi nel protocollo vengono eseguiti con tecnica sterile in una cappa di biosicurezza. La soluzione di tampone fosfato salina (PBS) è regolata a pH 7.4 per tutti i passaggi.
    1. 24 h prima dell'incapsulamento di cellule a HAMA, aggiorna il supporto per le colture primarie di 2 settimane (da passo 1,15) nelle piastre di bene 12. Aggiungere 1 mL di DMEM/F12 (10% FBS e 1% PS) medio per pozzetto.
    2. Per ogni piatto 12-pozzetti di cellule preparare 12,5 mL di tripsina diluita (tripsina-EDTA diluito 0.25%-30%, con media DMEM/F12) e 25 mL DMEM/F12 (10% FBS e 1% PS) e caldo in a 37 ° C in un bagno d'acqua.
    3. Raccogliere il medium condizionato dalle piastre utilizzando una pipetta sierologica 10ml (> 0,5 mL per pozzetto), accuratamente aspirare il liquido restante e sostituire con 1 mL / pozzetto di tripsina diluita (0,075% tripsina-EDTA) per 20-30 min in un incubatore (37 ° C, 5% CO2) fino al lo strato di cellule confluenti si stacca dalla piastra.
    4. Recuperare materiale sospeso cella con una pipetta da 1 mL (appare come un unico pezzo di galleggiante) e raccogliere in una provetta conica per centrifuga da 15 mL. Diluito con un volume equivalente di DMEM/F12 (10% FBS e 1% PS) e centrifugare a 200 x g per 2 min a temperatura ambiente, scartare il surnatante.
    5. Risospendere il pellet cellulare in 10 mL di caldo DMEM/F12 (10% FBS e 1% PS), triturare le cellule 5 volte con una pipetta da 10 mL e centrifugare a 200 x g per 2 min.
    6. Decantare il supernatante, risospendere le cellule in 5ml caldo DMEM/F12 e trasferire le cellule ad una provetta conica per centrifuga da 50 mL.
    7. Usando una siringa da 10 mL con un ago 18 calibro, triturare la soluzione cella 3 volte e filtrare la sospensione attraverso un setaccio di cella di 40 µm in una nuova provetta conica per centrifuga.
    8. Raccogliere 10 µ l di sospensione cellulare, diluire 1: 100 in DMEM/F12 caldo e cellule di conteggio con un contatore di cellule automatizzato
    9. Incubare a bagnomaria a 37 ° C fino al passo di incapsulamento.
  3. Incapsulamento delle cellule
    Nota: Tutti i passaggi nel protocollo vengono eseguiti con tecnica sterile in una cappa di biosicurezza.
    1. Per ogni piastra 12-pozzetti di 3D idrogeli caldo 12,5 mL di DMEM/F12 e 12,5 mL dei media condizionati di DMEM/F12 raccolti durante la preparazione delle cellule.
    2. Pesare la quantità di methacrylated acido ialuronico (HAMA) necessaria per una concentrazione finale di 0,5% wt/vol sciogliere questo HAMA in PBS sterile filtrata ad una concentrazione di (2% wt/vol); una concentrazione 4 volte superiore la concentrazione finale è utilizzata per ospitare l'aggiunta di cellule e di altri reagenti. Un piatto ben 12 di idrogeli richiede ~ 350 µ l PBS con 7 mg HAMA.
    3. Sottoporre ad ultrasuoni (> 20 kHz) soluzioni HAMA è completamente sciolta per 60 min.
    4. Preparare soluzioni individuali di 10% di trietanolammina (TEA) e di 1-vinile-2-pirrolidinone (NVP) e una soluzione di 1 mM di eosina Y (EY) in aliquote di 1 mL di PBS sterile a pH 7,4.
    5. Per uno 12 piastra bene, fare un finale 1,4 mL di miscela di 1 x 107 cellule, 0,5% wt/vol HAMA (350 µ l 2% wt/vol), 0,1% tè (14 µ l di 10%), 0,1% NVP (14 µ l di 10%) e 0,01 mM EY (14 µ l di 1 mM) e miscela di lamina basale del 20% (280 µ l di brodo). Il volume residuo è PBS.
    6. Delicatamente mescolare la soluzione e pipettare 100 µ l in ogni stampo PDMS con una mancia di 1 mL.
    7. Esporre i campioni ad una luce di LED ad alta intensità verde (~ 520 nm, 60 mW, in un chiuso 20 x 20 cm x 20 cm) per 5 min a temperatura ambiente.
    8. Aggiungere 1 mL per pozzetto di DMEM/F12 condizionato caldo in un piatto ben 12.
    9. Cogliere ogni vetrino coprioggetti tra pollice e indice, lentamente staccare lo stampo PDMS con Pinzette curve facendo attenzione a non spostare il gel e posizionarlo in un pozzo con medium condizionato.
    10. Aggiungere un ulteriore 1 mL caldo DMEM/F12 in ciascun pozzetto.
    11. Incubare le piastre a 37 ° C con 5% CO2 per 2 settimane, rinfrescante cell supporti ogni settimana di pipettaggio 1ml di media da ciascun pozzetto e sostituzione con 1 mL DMEM/F12.

4. microscopia

  1. Immunocitochimica
    Nota: Un microscopio confocale rovesciato è stato utilizzato per questi campioni di immagine e ImageJ è stato utilizzato per elaborare e visualizzare le immagini. Microglia, astrociti, oligodendrociti e nuclei, saranno etichettati dopo 3 settimane della cultura di HAMA.
    1. Preriscaldare la formalina 10% tamponata con PBS (pH 7.0) in un bagnomaria a 37 ° C.
      Attenzione: Sebbene formalina può essere utilizzato all'esterno di una cappa aspirante, questo materiale è reattivo con il tessuto e dovrebbe essere sempre di gestire con cura e guanti. Dovrebbe essere dispose separatamente.
    2. Aspirare accuratamente media dalle piastre e Pipettare 1 mL di formalina al 10% in ciascun pozzetto.
    3. Incubare le piastre a 37 ° C in un 5% di CO2 per 20 min.
    4. Aspirare il liquido da ogni piatto, pipettare 2 mL di PBS (pH 7.4) in ogni pozzetto e incubare per 15 min.
    5. Ripetere due volte il punto 4.1.4.
    6. Aspirare il liquido dalle piastre, aggiungere 1 mL per pozzetto di PBS con 10% di siero di cavallo normale (NHS) e 0,5% triton X-100 e scuotere delicatamente alla velocità minima) per 1 h.
    7. Ripetere il passaggio 4.1.4 tre volte.
    8. Aspirare il liquido e aggiungere 1 mL per pozzetto della seguente miscela in PBS: coniglio ionizzato calcio-legante molecola adattatrice (Iba1) 1:1, 000, pollo proteina fibrillare gliale (GFAP) 1:5, 000, mouse 2', 3'-ciclico-nucelotide 3'-phophodiesterase (CNPasi) 1:1, 000, 1% NHS , e 0,1% delle cellule tensioattivo perforante. Incubare a 4 ° C durante la notte, dondolo la piastra più delicatamente possibile.
    9. Ripetere il passaggio 4.1.4 tre volte con le incubazioni 1h in mezzo.
    10. Aspirare il liquido e aggiungere 1 mL per pozzetto della seguente miscela in PBS: 647 nm eccitato asino anticorpo di anti-coniglio 1: 200, 546 nm eccitato capra dell'anticorpo anti-pollo 1: 200, 488 nm eccitato asino anticorpo anti-topo 1: 200, 1% NHS, 1:1,000 blu macchia nucleare. Incubare a temperatura ambiente per 1 h, delicatamente a dondolo la piastra.
    11. Ripetere il passaggio 4 tre volte con le incubazioni 1h in mezzo.
    12. Per preservare l'idrogel, aspirare il buffer e immergerli in 0,5 mL di mezzo di montaggio delle cellule per 1 min. pipetta fuori il mezzo di montaggio e posizionare delicatamente un vetrino coprioggetto sulla superficie del gel, creando uno strato tra il vetro. Aggiungere una piccola quantità di mezzo di montaggio al lato scoperto di lamelle per evitare l'essiccazione dell'idrogel.
      Nota: Per la risoluzione dei problemi, il gel può essere imaged al punto 4.1.11. per vedere la corretta etichettatura prima del successivo trattamento.
  2. Microscopia elettronica a scansione (SEM)
    Nota: Per visualizzare l'idrogel, un microscopio elettronico a scansione è stato utilizzato per questi campioni di immagine.
    1. Pre-riscaldare una miscela fissativa di 2,5% di glutaraldeide e il 2% paraformaldeide in PBS (0,1 M) in bagnomaria a 37 ° C.
      Attenzione: Questi reagenti sono altamente reattivi con i tessuti e devono essere maneggiati con cura e guanti. Dovrebbero essere trattati in una cappa aspirante quanto più possibile e smaltite separatamente.
    2. Aspirare il mezzo dalle piastre per colture cellulari e aggiungere 1 mL della miscela fissativa pre-riscaldata.
    3. Incubare le piastre a 37 ° C in un 5% di CO2 per 20 min.
    4. Posizionare le piastre a 4 ° C (frigo/refrigeratore) durante la notte.
    5. Aspirare la soluzione fissante dai pozzetti e aggiungere 1 mL di PBS.
    6. Aspirare il liquido da ogni piatto, aggiungere 2 mL di PBS in ciascun pozzetto e incubare per 15 min.
    7. Ripetere il punto 4.2.6 altre due volte.
    8. Aspirare il PBS e aggiungere 1 mL di tetraoxide di osmio 1% tamponata in PBS in ciascun pozzetto.
      Nota: Fino a quando i campioni vengono essiccati, questo passaggio e tutti i passaggi successivi vengono eseguiti in una cappa aspirante.
    9. Consentire la fissazione a verificarsi per 30 min. vapor di osmio dal liquido può risolvere altri campioni nello stesso piatto; Pertanto, di conseguenza partizione campioni prima di questo passaggio.
      Attenzione: Osmio tetraoxide è altamente reattivo con il tessuto e volatile. È pericoloso e deve essere gestita nella cappa con i guanti. Esso e qualsiasi immediato lavati dovrebbe essere smaltito separatamente.
    10. Ripetere il passaggio 4.2.6 tre volte.
    11. Aspirare il liquido e aggiungere le miscele disidratante nell'elenco qui di seguito, in ordine e incubare (temperatura ambiente) per il tempo indicato. Iniziare aggiungendo gradualmente etanolo (EtOH) seguita poi esametildisilazano (HMDS). Vedere la tabella 2 per ogni incremento.
      Nota: Quando si aggiungono HMDS, lamelle fortemente possono aderire alla plastica e diventare molto difficile da rimuovere. Ciò può essere evitato inserendo una piccola piattaforma di plastica sotto lo slittamento di vetro dopo la prima applicazione di HMDS. Dopo la seconda incubazione di EtOH, il campione può essere tolto e raffreddato in azoto liquido per alcuni secondi per congelare il campione di frattura.
    12. Rimuovere i campioni essiccati con cautela e montare i campioni su stub di microscopio elettronico a scansione con biadesivo conduttivo.
    13. Polverizzi ricoprire i campioni con una minima quantità di oro. Posizionare i campioni in un supporto e far funzionare la macchina per 2 min a 15 mA.

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Representative Results

Per modellare la risposta dell'ospite del tessuto neurale e la cicatrice gliale in un throughput elevato, sistema in vitro richiede un'impalcatura cellulare 3D con un materiale di matrice che è biocompatibile e non incorrere in un evento citotossico durante la formazione in situ è modificabile con componenti bioattivi per guidare benevola risposta. A tal fine, abbiamo creato un sistema di ponteggio cella 3D basato sull'acido ialuronico e incapsulato una popolazione delle cellule glial misto primario per studiare le interazioni cellula-cellula e bioreactivity glial. È stato effettuato un breve studio visual delle cellule e dell'impalcatura. Morfologia delle sottopopolazioni di cellule, tra cui oligodendrociti (CNPasi in verde), microglia (Iba1 in rosso), e gli astrociti (GFAP in giallo), vengono visualizzate mediante microscopia confocale immunofluorescente (Figura 3Ai-IC-ii-ii). Combinato dell'impalcatura e morfologia del globulo sono indicate anche da SEM (Figura 3Aiii-iv - Ciii-iv). In queste immagini, sono mostrati sia bassa (i e iii) e alte immagini rappresentative di risoluzione (ii e iv). Un rivestimento di coprioggetto PLL 2D (Figura 3A) è stato confrontato con una 3D impalcatura di HAMA di 0,5% p/v (Figura 3B) e una miscela di miscela di lamina basale 20% v/v in 0,5% w/v HAMA (Figura 3). Questo è stato fatto per dimostrare le differenze morfologiche in 2D e coltura cellulare 3D, così come l'effetto di introdurre una lamina biologica al patibolo. Una ricostruzione 3D è anche disponibile nelle informazioni supplementari.

Morfologia delle cellule di ciascun tipo di cella è cambiato con l'introduzione di una piattaforma 3D. Nella cultura aderente 2D (lamelle di vetro rivestite con PLL), oligodendrociti è apparso in genere rotondi e reti di piccole dimensioni formate solitamente eventualemnte leggermente etichettato GFAP processi. Erano più piccole di altre cellule di microglia e aveva piccoli processi di ramificazioni che non si estendeva lontano da loro corpi cellulari (< 20 µm). Gli astrociti sono stati modellati più vario, alcuni avendo una morfologia radiale con piccoli corpi cellulari e processi estensivi sottili, ramificazioni, mentre altri erano fibrosi con un aspetto bidimensionale e alcuni processi ampi che ricoprono la superficie. Nella cultura HAMA 3D, oligodendrociti apparso nei cluster avendo ramificato fuori in sfere più piccole. Microglia erano in tondo con alcuni processi, e gli astrociti sono stati arrotondati o diramavano radialmente in reti da un unico cluster. Generalmente, queste cellule sono sembrato hanno superato da singoli punti o rimanere nelle zone di HAMA senza fare contatto con altre cellule, che è a differenza della cultura 2D ed è indicativa di mobilità limitata attraverso la matrice. Quando 20% v/v di una miscela di lamina basale è stato aggiunto alla miscela foto-polimerizzazione, tutti i sottotipi gliali integrata con la piattaforma 3D e formano le strutture ramificate più ampie, interattive. Oligodendrociti esteso bulbosi processi radialmente simili a morfologie di miscela la lamina non basale, ma è comparso inoltre di estendere i processi lungo le reti interconnesse sottile dei processi astrociti ramificazione in tutta l'impalcatura. Le microglia sono stati dispersi tra queste reti cellulari, avendo sparso con sottili processi più coerenti con la loro morfologia in tessuto. In generale, le morfologie indicano tutti i tre tipi della glia integrato nella miscela della lamina basale HAMA liberamente, potenzialmente attraverso sia una maggiore aderenza al substrato misto o attraverso una maggiore capacità di rimodellare il patibolo.

Quando osservato da SEM, morfologia delle cellule è stata veduta per corroborare le micrografie confocale. La matrice di HAMA è apparso come una superficie liscia con 10-50 µm pori visti debolmente sotto la superficie. Le cellule erano aderenti alla superficie dell'HAMA ed erano anche debolmente visibili in strati sotto. Queste cellule gliali non formavano morfologie comparabili a quelli celebri in 2D cultura, tuttavia con l'aggiunta di una miscela di lamina basale, è stata osservata la vasta rete. Fibre spesse Astrocita, con piccoli ammassi di microglia sono stati osservati sia in HAMA-basale della lamina miscela superficie e che si estende attraverso la matrice in un modo senza soluzione di continuità. Questo può essere visto debolmente come la matrice piegata intorno alle cellule, suggerendo che le cellule possono essere alterando il patibolo per formare loro conformazioni desiderate.

Figure 1
Figura 1: schema di methacrylated acido ialuronico (HAMA)-cella 3D cultura e fotopolimerizzazione protocollo basato su. Cellule gliali (cultura di cervello del ratto primario 2 settimana) sono mescolate con HAMA e dispensate in uno stampo di polidimetilsilossano (PDMS) su un vetrino coprioggetti. Questa miscela è esposta a una luce di LED ad alta intensità verde per polimerizzare l'idrogel per 5 min. Lo stampo viene rimosso e il gel viene incubato nei media. Rappresentante cellule includono microglia (rossa), (gialli) di astrociti e oligodendrociti (verde). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: dissezione del cervello di pup del ratto di giorno 1 Sprague Dawley. Immagini di tutto il cervello (A), la dissezione di cortecce e del cervelletto (B), una singola corteccia con meningi (C), peeling delle meningi con il forcipe (D) e la corteccia meninge-libero (E). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Immunofluorescenza confocale (i-ii) e scansione micrografi elettronici (iii-iv) di popolazioni di cellule di glia mista su rivestimenti PLL 2D (A), HAMA (B) e miscela di HAMA-basale della lamina (C). Superiore (ii, iv) e inferiore (i, iii) ingrandimento immagini vengono mostrate. Le etichette sono Iba1 in rosso per microglia, GFAP per gli astrociti, CNPasi in verde per gli oligodendrociti e una macchia di Hoechst nucleare in giallo. Scala bar = 25 µm per immagini confocal e 50 (iii) e 20 µm (iv) per la scansione micrografi elettronici. Idrogeli erano 0,5% w/v, e miscela di lamina basale era 20% in volume. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplementare figura 1: 3D ricostruzione immunofluorescente micrografico di HAMA-basale miscela della lamina con glia cella popolazioni miste miscela della lamina basale HAMA. Le etichette sono Iba1 in rosso per microglia, GFAP per gli astrociti, CNPasi in verde per gli oligodendrociti e una macchia di Hoechst nucleare in giallo. Idrogeli erano 0,5% w/v, e Getrex era 20% in volume. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

HAMA Lamina basale NVP TÈ EY
Concentrazione di lavoro 0,5% w/v 20% v/v 0,10% 0,10% .01 mM
12-pozzetti 2% w/v 100% w/v 10% v/v 10% v/v 1 mM
1,4 mL totale 350 Μ l 280 Μ l 14 Μ l 14 Μ l 14 Μ l

Tabella 1: Esempio di incapsulamento di cellule.

Componente Contenuto Tempo di incubazione
EtOH 30% 30 min
EtOH 50% 30 min
EtOH 70% 30 min
EtOH 90% 20 min
EtOH 100% 20 min
EtOH 100% 20 min
EtOH:HMDS 75: 25 20 min
EtOH:HMDS 50:50:00 20 min
EtOH:HMDS 25: 75 20 min
HMDS 100% 20 min
HMDS 100% Pernottamento

Tabella 2: Incrementi graduali di EtOH e HMDS nella disidratazione.

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Discussion

Verso l'obiettivo di generare un sistema di coltura 3D per modello glial bioreactivity e il processo di cicatrizzazione glial, abbiamo sviluppato un sistema che può supportare primaria microglia coltivate, astrociti e oligodendrociti e consente la robusta caratterizzazione della cella interazioni cellula-cellula e morfologia. Da micrografie mostrati, la morfologia di ogni tipo di cellula era distintamente differente con piattaforme di miscela della lamina basale HAMA 2D, 3D-HAMA e 3D. Nel sistema 2D, morfologia era decisamente prevenuto lungo il piano della superficie, ma rispetto al 3D HAMA, microglia e astrociti erano generalmente più piccoli all'interno della matrice, fatta eccezione per i cluster di oligodendrociti. I micrografi elettronici scansione, cellule era generalmente più forma rotonda su il HAMA. Ciò può essere in gran parte dovuto le cellule viene incapsulate, con limitata capacità di modificare la matrice per la locomozione e la libera circolazione e la crescita dei processi. Conseguenza delle cellule in il HAMA era tipicamente radiale per gli astrociti e oligodendrociti. Mentre queste cellule processi estesi, loro organizzazione suggeriscono che il loro movimento in tutta la matrice e la capacità di interagire con altre cellule è stato limitato. Inoltre, il lavoro precedente ha indicato freeze-fratturato HAMA essere poroso senza reti interconnesse, che possono spiegare questa mancanza di conseguenza65,70. È possibile che alcune di queste cellule non è sopravvissuto la fotopolimerizzazione, rimanendo conservata nella matrice, tuttavia attuabilità è stata valutata sistematicamente nel nostro precedente lavoro e rimase 80% (0,5% p/v) nel corso di una settimana65.

Per migliorare l'interazione della cellula con la matrice nella cultura 3D, abbiamo introdotto una miscela di lamina basale come un componente di matrice biocompatibile e modificabile. Integrazione delle cellule con la matrice è stata trovata per essere notevolmente migliorato, con tutti i tipi di cellulari mostrando processi estensivi rispetto alla cultura 2D e il 3D HAMA. La miscela di lamina basale è costituita da un componenti di lamina basale di varietà e principalmente è formulata per supportare il differenziamento di cellule staminali neurali precursori71. Non è stato inaspettato che le cellule glial ha risposto per la miscela di lamina basale e, successivamente, la matrice circostante 3D, ma la portata dell'integrazione suggerisce un ambiente simile a tessuto sano. Confrontando HAMA alla miscela della lamina basale di HAMA, la morfologia di idrogel non appaiono nettamente differente, pertanto le cellule possono essere più attivamente rimodellamento. Considerando la semplicità dell'aggiunta di questo componente bioattivo, non è impensabile utilizzare diverse lamine e/o spunti di proteine per favorire condizioni di coltura per i neuroni. In una direzione futura potenziale, questo sistema potrebbe essere utilizzato per distinguere i neuroni da progenitori neurali in combinazione con glia mista per una varietà di forte impatto mielinizzazione o modelli di lesione neuro-infiammatorie.

In caso di grave e dannosa lesione dello SNC o rifiuto di biomateriale, il tessuto residente avvia reazioni infiammatorie in grado di accentuare la neurodegenerazione e demielinizzazione. In genere questo comporta la formazione di una cicatrice gliale di partizionare il luogo della ferita, che impedisce la rigenerazione. In questo studio, i metodi erano dettagliati per un methacrylated polimerizzati foto basati su acido ialuronico ponteggi 3D con l'intenzione di modellazione della risposta cellulare iniziale dietro formazione di cicatrice gliale; microglial reattività, reclutamento di astrociti e ipertrofia e lesioni del oligodendrocyte e ritiro. Un'impalcatura di cella 3D è stata progettata per incorporare tutti i tre tipi di cellule gliali e venne ulteriormente modificata con una miscela multicomponente lamina basale. È stato determinato, mediante microscopia confocale e scansione di imaging, che che le cellule sono state incapsulate in il HAMA ed erano più in grado di integrare quando è stata introdotta la miscela di lamina basale. Questi risultati potrebbero portare a diverse applicazioni innovative. HAMA da solo può servire a creare sistemi di co-coltura dove l'intenzione è quella di limitare l'interazione cellula-cellula o studio distillare consegna della droga usando il gel come una matrice di limitata diffusione caricato di droga. Idrogeli incorporare la miscela di lamina basale la matrice di HAMA consentono per un ambiente più coerente di tessuto-come in grado di modellare l'infiammazione acuta, il gliosis o cicatrici gliali e consente ulteriore caratterizzazione di alto-rendimento di glial bioreactivity per gli impianti, lo sviluppo del farmaco e dispositivo e altre strategie per ridurre e recuperare lesioni infiammatorie.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Gli autori sono grati per il sostegno finanziario da NSERC, CFI, AIHS, Alberta Health Services e la dotazione di Davey per ricerca del cervello.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Materials for HAMA synthesis and photopolymerization
Hyaluronic acid (HA) Sigma-Aldrich 53747-10G Streptococcus equi, MW: 1.5 - 1.8 X 10^6
Methacrylic anhydride (MA) Sigma-Aldrich 275585-100ML
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 221465-25G
Ethanol (EtOH) Commerical Alcohols Inc. Anhydrous
Phosphate buffered saline (pH 7.4) tablets Fisher Scientific 18912014
Triethanolamine (TEA) Sigma-Aldrich 90279-100ML
1-Vinyl-2pyrrolidinone (NVP) Sigma-Aldrich V3409-5G
EosinY (EY) Sigma-Aldrich E6003-25G
Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate Sigma-Aldrich 440159-100ML
Beaker (100 mL) Corning 1000-100
Beaker (500 mL) Corning 1000-600
pH paper (Labstick) Sigma-Aldrich 9580
Name Company Catalog Number Comments
2. Materials for glial cell isolation and cell culture
P1-2 Sprague Dawley rat pups Charles River CD Sprague Dawley rat strain code 001
Dissector scissors - slim blades (small) Fine Science Tools 14081-09
Surgical scissors - Toughcut (large) Fine Science Tools 14130-17
Fine forceps (Dumont #5) Fine Science Tools 11521-10
Curved fine forceps (Dumont #7) Fine Science Tools 11271-30
Hank's balanced salt solution (HBSS) Gibco 14170-112
Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) Gibco 11320-033
Penicillin-streptomycin (PS) Gibco 15140-122
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 12483-020
0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Gibco 25200-072
Poly-L-lysine (PLL) Sigma-Aldrich P-6282
50 mL conical centrifuge tube Fisher Scientific 05-539-13
15 mL conical centrifuge tube Fisher Scientific 05-539-5
12 well Tissue culture treated plates (Cellstar) Greiner Bio-One 665 108
10 mL serological pipette Fisher Scientific 13-676-10F
25 mL serological pipette Fisher Scientific 12-676-10K
Petri dish (60 mm X 15 mm) Fisher Scientific FB0875713A
Petri dish (100 mm X 15 mm) Fisher Scientific FB0875712
Microscope Coverslip (18 mm) Fisher Scientific 12-545-100 18CIR
Name Company Catalog Number Comments
3. Materials for microscopy (confocal and scanning electron microscopy)
Mouse monoclonal anti-CNPase abcam ab6319
Rabbit anti-Iba1 Wako Laboratory Chemicals 019-17741
Chicken anti-GFAP abcam ab4674
Hoechst 33342 Fisher Scientific 62249
Fluoromount-G Fisher Scientific 00-4958-02
Formalin Sigma Aldrich HT501128-4L Buffered (10%)
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
Horse Serum Gibco 16050-122
Paraformaldehyde Electon Microscopy Sciences 157-8 Buffered (8%)
Guteraldehyde Electon Microscopy Sciences 16019 Buffered (8%)
Osmium tetraoxide Electon Microscopy Sciences 19152 Buffered (2%)
Hexamethyldilazane (HMDS) Electon Microscopy Sciences 16700
Ethanol (EtOH) Electon Microscopy Sciences 15055 Anhydrous
Microscope Slide (25 X 75 X 1 mm) VWR International 48311-703

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Bioingegneria problema 130 coltura cellulare 3D idrogel glia primario astrociti microglia oligodendrociti neuroinfiammazione acido ialuronico HAMA
Migliorata 3D idrogel culture di cellule gliali primari <em>In Vitro</em> modellazione del Neuroinflammation
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Koss, K. M., Churchward, M. A.,… More

Koss, K. M., Churchward, M. A., Jeffery, A. F., Mushahwar, V. K., Elias, A. L., Todd, K. G. Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (130), e56615, doi:10.3791/56615 (2017).

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