Summary
Здесь мы представляем протокол для 3D культуре крысы клеток мозга, полученных глии, включая астроциты, Микроглия и олигодендроциты. Мы демонстрируем культуры главной ячейки, гидрогеля синтез methacrylated гиалуроновой кислоты (HAMA), HAMAphoto полимеризации и ячейки инкапсуляции и образец обработки для конфокальных и сканирования электрона микроскопических изображений.
Abstract
В центральной нервной системе, многочисленные острые травмы и нейродегенеративных расстройств, а также имплантированных устройств или биоматериалов инженерии для повышения функции результат в тот же результат: избыточное воспаление приводит к глиоза, цитотоксичность, и/или формирование глиальных шрам, коллективно усугубляют травмы или предотвратить здоровое восстановление. С целью создания системы для моделирования глиальный рубец образование и исследование воспалительных процессов, мы породили 3D клеток леску вмещать первичной культивировали глиальные клетки: микроглии, регулировать инородного тела ответа и инициировать воспалительные событие, астроциты, которые отвечают сформировать волокнистых шрам и олигодендроциты, которые обычно уязвимы к воспалительным травмы. Настоящая работа обеспечивает подробный пошаговый метод для изготовления, культуры и микроскопическая характеристика леску на основе гиалуроновой кислоты 3D гидрогеля с инкапсулированным крыса мозга производные глиальных клеток. Кроме того демонстрируются протоколы для характеризации клеток инкапсуляции и гидрогеля леса конфокальный иммунофлюоресценции и сканирующей электронной микроскопии, а также способность изменить на эшафот с биоактивными субстратов, с учет коммерческих базальной пластинки смесь Улучшенная ячейка интеграции.
Introduction
Воспаление центральной нервной системы (ЦНС) уже давно считается признаком острого (например, ишемического инсульта, черепно-мозговой и травмы спинного мозга) и хронические (например болезнь Альцгеймера, Паркинсона и болезни Хантингтона) травмы ЦНС, Однако все шире признается как причинная вклад нейродегенеративных и нервно-психиатрическими расстройствами. Устойчивый или неуместным воспаление может вызвать нейронных травмы и демиелинизации (например рассеянный склероз) и негативно повлиять на развитие мозга (например, шизофрения, аутизм) и настроения государств (например, депрессии, тревоги Биполярное расстройство). Кроме того, Роман терапевтические стратегии, с помощью имплантируемых устройств (например., мозг компьютер интерфейсы1,2,3, глубокие мозга стимуляции4,5, межпозвонковые microstimulation6,,78,9,10) создания предсказуемой воспалительной реакции на стыке между устройством и ЦНС, что приводит к ответ защитной ткани, что может привести к потере эффективности или устройство отказа в течение имплантат11. Воспаления в ЦНС инициируется обычно микроглии, который функционировать в качестве резидентов иммунные клетки ЦНС, ответственных за наблюдение ткани и монтаж инородного тела ответа (обзор12). В зависимости от тяжести оскорбления, микроглии сигнал и набирать дополнительные ячейки типы сайт травмы. В частности микроглии активировать астроциты, которые в свою очередь выступают в качестве вторичных воспалительных клеток и формы плотный защитный барьер содержать травмы сайт13,14. Микроглии может также инициировать деятельность Каскад в клетках периферической иммунной системы, которая может привести к срыву BBB разрешить иммунной инфильтрат (обзор в ссылка15).
В случае устройства имплантируется в ЦНС ткани, ущерб от вставки устройства, а также продолжающееся присутствие иностранных устройства может инициировать процесс называют глиальных рубцов. В этом процессе микроглии мигрировать и размножаться на месте травмы. Они также инициировать освобождение воспалительных факторов для нейтрализации потенциальных угроз и набирать дополнительные глиальных клеток. Впоследствии активированные астроциты стать гипертрофических и начать инкапсуляции имплантированный сформировать непрерывный волокнистых барьер16. Воспалительные сигнализации также служит для поощрения вывода нейрональные процессы из окрестностей имплантата и в конечном итоге новобранцев фибробласты для укрепления развивающихся глиальный рубец17. Олигодендроциты, ответственных за обрешетки нейронов в миелина повышения проводимости, не пережить этот процесс и дальних клетки разделены от имплантата шрам18. Глиальные рубцов значительно уменьшает функции и жизни имплантированных устройств, особенно для записи электродов и в конечном счете служит для ограничения функциональности нейронных интерфейсы19.
Чтобы увеличить биосовместимость и действие интерфейса имплантированных устройств в ЦНС20,21,,2223использовались несколько подходов. Обширный обзор доступен на биосовместимых дизайн эти нейронные интерфейсы24. Наиболее известные стратегии включают в себя окружающие электрод с совместимыми покрытий, таких как polyelthyleneglycol (PEG), polylactic-co гликолевой кислоты (PLGA)25, или повышение электрод с электропроводящие полимеры, такие как поли (этилена dioxythiophene) (PEDOT) и политиофен (PPy)26,27,28,,2930,31. Биоактивные покрытия также были использованы для предоставления подсказок для роста нервной ткани, используя лигандов, производный от внеклеточной матрицы, включая коллагены, fibronectins и гиалуроновой кислоты32,33,34 ,35,,3637. Биологическую этих покрытий была изучена далее с фактором роста выпуска систем для имитации природных клеток выделениями30,,3839,40,41 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50. одновременно, некоторые исследовательские группы решили переделывать геометрия электрода, гибкость и композиции для уменьшения механического несоответствия между устройством и ткани51,52,53 ,54,55,56,57. В целом эти стратегии привели к множество многообещающих улучшений в нейронных межфазного устройств следующего поколения, однако долгосрочные совместимость является вопросом продолжается, и прогресс может сдерживаться сложным и длительным в vivo модели .
Животных подходы, основанные на модели можно ограничить экспериментальной пропускную способность и увеличить стоимость тестирования биосовместимость электрода. В vitro подходы с использованием обычных клеточной культуры техники предлагают более экономически эффективные альтернативы, но не резюмировать большую сложность взаимодействия между устройством и ткани58. В частности тестирование поверхности покрытий с использованием 2D клетки культуры ограничения моделирования геометрии электрода и влияние механического несоответствия и micromotion мысли способствовать генерации хоста ответ, способствуя устройство отказа59 , 60.
Преодолеть проблемы, связанные с 2D клеточной культуры, гидрогеля культур нервные клетки были разработаны для широкого спектра приложений, фармакологические исследования61, направлять нейронных клеток дифференциации62, чтобы понять болезнь пути63,64, или слоистых в совместное культуры с другими типами клеток модели миграции клеток, нейропротекторного эффекта, или модель ткани микросреды61. Гидрогели легко образуются в разных размеров и геометрии может включать многочисленные типы первичных или увековечен клеточных культур и очень поддаются анализа часто используемые методы, такие как конфокальный флуоресцентной микроскопии. Для создания модели процесса глиальных рубцов, мы недавно разработали и охарактеризовала систему гиалуроновой кислоты на основе гидрогеля 3D для высокой пропускной способности тестирования глиальных реакции имплантированных электродов (рис. 1)65. Эта система имеет ряд отличительных преимуществ: 1) первичных глиальных клеток (микроглии астроциты и Олигодендроциты), инкапсулированным в 3D-матрицы состоит из полимеров гиалуроновой кислоты, которая является компонентом эндогенного внеклеточная матрица; 2 матрицы жесткости можно «настроить» воссоздать механические свойства головного или спинного тканей; и 3) клетки может быть инкапсулирована в матрице в быстрый настольное подход с использованием фотополимеризации с зеленым светом, ограничение токсичности при инкапсуляции. Эта система позволяет ключевые особенности в vivo биосовместимость: устройств вставляются в гидрогеля на основе сопоставимых ткани, и клеточный ответ на имплантированного устройства контролируются для широкого спектра параметров65. К ним относятся механические несоответствие между устройствами и гидрогеля покрытий различных структур и электрическая стимуляция импульсами. Эта система также включает в себя Олигодендроциты и связанной с прекурсорами, которые часто присутствующих и набранных в глиальных шрамы. Их повреждение, смерть и фагоцитоз, микроглии весьма показательны воспалительных повреждений и как модель уменьшить рубцы или восстановления, они имеют способность продемонстрировать ре миелинизации нейронов66.
Здесь мы описываем метод синтеза и формирование гибридных гидрогели гиалуроновой кислоты в сочетании с коммерчески доступных базальной мембраны составов для улучшения ячейки инкорпорации. Кроме того мы покажем включения первичных культивировали глиальных клеток (микроглии, астроциты и Олигодендроциты) и анализ роста культуры с использованием иммуноцитохимии и confocal микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол для извлечения ткани мозга от 1 день Sprague-Dawley крыса щенков, умерщвлены, обезглавливание, был одобрен животное уход и использование Комитетом в университете Альберты.
1. Микроглия и экзоцитоз изоляции67,68
Примечание: Все средства массовой информации для изоляции и культуры клеток подогревается до 37 ° C на водяной бане. Хэнк сбалансированного солевого раствора (HBSS) имеет 1% пенициллин стрептомицином (PS). Все Дульбекко изменение орла СМИ с ветчиной F12 питательной смеси (DMEM/F12) дополняется плода бычьим сывороточным (ФБС) 10% и 1% пенициллин стрептомицином (PS). Только смеси с трипсином отсутствие FBS. Все материалы в этом протоколе являются стерильные (фильтр, алкоголя, приобретенных и автоклавного твердения) и каждый шаг после шаг номер 1.8 выполняется в области биобезопасности, кабинет с асептической техники.
- В мозг Нагрейте 15 мл HBSS и 12,5 мл DMEM/F12 до 37 ° C в 50 мл конические пробирок и примерно 2 мл 0,25% трипсина с 1 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) в 15 мл конические пластиковых пробирок. Тепло еще 25 мл DMEM/F12. Теплый трипсина около 10 мин до использования для предотвращения утраты ферментативную активность.
- Налить достаточно теплой HBSS в стерильные, 6 и 10 см культуры блюда для покрытия поверхности. Подготовьте одно блюдо 10 см на каждые два мозги плюс дополнительные 6 см блюдо.
- Место до 2 мозги в каждое блюдо2 10 см (рис. 2A).
- Под микроскопом, рассечение Используйте щипцы изогнутые и прямой для разделения коре вдоль средней линии и мозжечка с мозга. Это дает три секции ткани в мозг (рис. 2B).
- Чистить тонкий, полупрозрачные, слой (мозговых оболочек) ткани, содержащие кровеносных сосудов из каждого раздела ткани и удалить, перевода на остальные ткани в отдельной культуры блюдо. Понять тонкие слои, предоставляемые порезов ткани, с щипцами и осторожно потяните до тех пор, пока основные части «висит у» ткани мозга. Наконец, удалите эту часть, нежно дергая. Посмотреть Рисунок 2 c-2E для представителя изображения до, во время и после этого шага.
- В области биобезопасности кабинета удалите оставшиеся HBSS из культуры блюдо, тщательно сохраняя ткани. Размачиваем ткани с помощью скальпеля и передачи ткани к подогретым 15 мл пробке трипсином.
- Инкубируйте этой трубки 25 мин в ванне с 37 ° C ферментативно переваривать ткани.
- Центрифуга трубку вниз на 500 x g на 2 мин при комнатной температуре и вылейте супернатант.
- С помощью Пипетки серологические 10 мл, добавьте 10 мл теплой среде DMEM/F12 инактивирует трипсина и нарезанных решение 5 раз с распадаются на ткани.
- Центрифуга трубку вниз на 500 x g на 2 мин при комнатной температуре и вылейте супернатант.
- С помощью Пипетки серологические 10 мл, вновь приостановить Пелле в 10 мл теплой среде DMEM/F12 и решение передать 50 мл конические пластиковых пробирок.
- С помощью 10 мл шприц с иглой 18 калибр, нарезанных решение 3 раза.
- Распространите это решение в с шагом 12,5 мл теплой среде DMEM/F12 в мозг.
- Пипетка с шагом 1 мл раствора порошкового в 12 хорошо плиту (1 в мозг).
- Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2в инкубатор культуры увлажненные клеток. Заменить СМИ после трех дней и обновить СМИ каждые последующие три дня. После 2 недель клетки могут быть собраны для экспериментов.
2. Macromer синтез69
- Весят 375 мг гиалуроновой кислоты (HA) соли в 50 мл конические пластиковых пробирок и добавьте 37,5 мл дистиллированной воды.
- Очистить решение с Вортекс за 1 мин и sonicate смесь до тех пор, пока она появится однородная и теряет свою вязкость гель как. Этот процесс может занять 6 ч.
- Решение передачи 100 мл стакан с магнитным перемешать бар (38 мм) и размешивать энергично при комнатной температуре.
- Тщательно Титруйте 5.0 M NaOH в HA и измерения рН бумагой, до тех пор, пока pH стабилизирует между 8 и 12.
- Соберите 3 мл ангидрида (MA, 94%), свежие метакриловой покрыты азота во время хранения.
Примечание: Ма подвергается воздействию атмосферы для длительного времени (дней), он будет терять свою реактивности.
Предупреждение: Использование Ма должно быть сделано в зонта. - Добавьте 200 мкл в смешивая раствор ха ма. Реакция понижает рН раствора ниже 8.
- Повторите шаги с 2,4 до 2,6 до 3 мл Ма были добавлены в решение. Этот процесс может занять до 1-2 ч.
- Разрешить реакции продолжать на ночь при 4 ° C, без перемешивания.
- Передача решения в 400 мл холодного этанола (EtOH) в 500 мл стакан и позволяют осадков для 24-72 ч при 4 ° C. 56
- Тщательно сцеживаться основную часть решения в отдельный стакан для утилизации и собрать осадок в 50 мл конические пластиковых пробирок. Это могут быть распределены в 2-4 трубы, при необходимости.
- Центрифуга для трубы на 200 x g в центрифуге на 2 мин при комнатной температуре и распоряжаться супернатант.
- Топ вверх по трубе с холодной EtOH, mix решение с Вортекс за 1 мин и повторите шаг 2.10-2.11.
- Добавить 25 мл стерильного деионизированной воды, перемешать раствор с Вортекс за 1 мин, sonicate (> 20 кГц) за 1 ч и Инкубируйте на 4 ° C на ночь.
- Поместите раствор в холодильнике-80 ° C 15 минут или до тех пор, пока заморожен или флэш замораживание в жидком азоте.
Предупреждение: При использовании жидкого азота, используйте защитные перчатки, щит и фартук. - До тех пор, пока порошок снег как производится заморозить сухой трубки (ниже 0,1 мбар и -30 ° C) для 24-48 ч.
- На данный момент Тестирование образца для чистоты через 1H ЯМР, где количество протонов (пики на 6.1 и 5,6 ppm), метакрилат относительно бромистого протонов (1,9 ppm), на HA позвоночника могут быть подтверждены. Минимальный коэффициент метакрилат 95% для протонов метил является приемлемым. 69
3. крем для формирования 3D инкапсуляции65
-
Coverslip и подготовка плесени
- Сделать 50 мл дистиллированной воды раствор 2% 3-(Trimethoxysilyl) метакрилата пропил в 50 мл конические пластиковых пробирок.
- Место 18 мм стекла coverslips в растворе и рок за 1 ч при комнатной температуре. До 50 coverslips могут быть добавлены сразу.
- Промывайте coverslips серийно окунания в 3 стаканах 100 мл деионизированной воды.
- Сухой coverslips в вакууме при 40 ° C на ночь с эксикаторе и духовкой.
- Быстро погружать отдельные coverslips в 70% EtOH пинцетом.
- Без сушки, падение каждый coverslip в колодец 12 хорошо плиты.
- Вымойте и аспирационная каждой скважины с стерильной дейонизированной водой (1 мл на хорошо).
- Добавить 1 мл стерильного 2 мкг/мл поли L-лизин (PLL) в каждой скважине и проинкубируйте > 2 ч.
- Аспирационная PLL раствор и дайте высохнуть coverslips воздуха.
- Погрузите polydimethyl силоксановые (PDMS) формы (см. Рисунок 1) в 70% EtOH и одно место на центр каждого coverslip и дайте высохнуть на воздухе и уплотнение между плесени и стекла.
- Подготовьте PDMS формы литья PDMS премикс реагенты в соотношении 10:1 в блюдо плоскодонной полистирола. Количество подготовленных PDMS выбран приносить лист толщиной около 1 мм. Для скважин форме PDMS, разрезать листы с удар круг с внутренним диаметром 10.
-
Подготовка клетки
Примечание: Все шаги в протоколе выполняются с стерильных в биобезопасности кабинета. Фосфат буфер солевой раствор (PBS) корректируется рН 7,4 для всех шагов.- за 24 часа до ячейки инкапсуляции в Хаме, обновите среднего для основных культур 2 недели (от шаг 1.15) в 12 хорошо пластины. Добавьте 1 mL DMEM/F12 (10% FBS и 1% PS) средний за хорошо.
- Для каждой пластины 12-ну клеток готовят 12,5 мл разбавленной трипсина (0,25% трипсина ЭДТА разбавленный 30% с СМИ в среде DMEM/F12) и 25 мл DMEM/F12 (10% FBS и 1% PS) и тепло при 37 ° C на водяной бане.
- Собирать с кондиционерами среднего из плит с помощью Пипетки серологические 10 мл (> 0,5 мл на колодец), тщательно аспирационная оставшуюся жидкость и заменить 1 мл на хорошо разбавляют трипсина (0,075% трипсина ЭДТА) для 20-30 мин в инкубаторе (37 ° C, 5% CO2) до вырожденная клеток слой отсоединяется от пластины.
- Восстановление приостановлено клеточный материал с 1 мл пипетки (появляется как единый кусок плавающей) и собирать в 15 мл конические пластиковых пробирок. Разбавляют эквивалентный объем DMEM/F12 (10% FBS и 1% PS) и центрифуги на 200 x g на 2 мин при комнатной температуре, отбрасывая супернатант.
- Ресуспензируйте Пелле клеток в 10 мл теплой среде DMEM/F12 (10% FBS и 1% PS), нарезанных клетки 5 раз с 10 мл пипетки и центрифуги на 200 x g на 2 мин.
- Декант супернатанта, вновь приостановить клетки в 5 мл теплой среде DMEM/F12 и клетки перехода к 50 мл конические пластиковых пробирок.
- Используя шприц 10 мл с иглой 18 калибр, нарезанных ячейки решения 3 раза и фильтр подвеска через сито клеток 40 мкм в новой конические пластиковых пробирок.
- Собирать 10 мкл суспензии клеток, разбавьте 1: 100 в теплой среде DMEM/F12 и подсчет количества ячеек с автоматизированной клеток счетчиком
- Инкубируйте в ванну воды 37 ° C до инкапсуляции шаг.
-
Инкапсуляция ячейки
Примечание: Все шаги в протоколе выполняются с стерильных в биобезопасности кабинета.- Для каждого 12-ну плита 3D гидрогели теплый 12,5 мл DMEM/F12 и 12,5 мл кондиционером DMEM/F12 СМИ, собранных в ходе подготовки клетки.
- Взвесить количество methacrylated гиалуроновой кислоты (HAMA), необходимые для окончательного концентрации 0,5% wt/vol. распустить этот Хама в стерильного отфильтрованного PBS в концентрации (wt/vol 2%); концентрация 4 раза выше, чем конечная концентрация используется для размещения дополнительно клеток и других реагентов. Один из 12 хорошо пластины гидрогелей требует ~ 350 мкл PBS с 7 мг Хама.
- Sonicate (> 20 кГц) решения пока Хама полностью растворится за 60 мин.
- Подготовка индивидуальных 10% растворы триэтаноламин (чай) и 1-Винил-2-pyrrolidinone (НВП) и 1 мм раствор эозина Y (EY) в 1 мл аликвоты стерильных PBS рН 7,4.
- Для одного 12 хорошо пластины, сделать окончательный 1.4 мл смесь из 1 x 107 клеток, 0,5% wt/vol Хама 0,1% (350 мкл wt/vol 2%), чай (14 мкл 10%), 0,1% НВП (14 мкл 10%) и 0,01 мм Еу (14 мкл 1 мм) и 20% базальной пластинки смесь (280 мкл акций). Оставшийся объем-PBS.
- Аккуратно перемешать раствор и Пипетка 100 мкл в каждом PDMS плесень с наконечником, 1 мл.
- Подвергать образцы высокой интенсивности зеленый светодиодный свет (~ 520 Нм, 60 МВт, в закрытых 20 см х 20 см х 20 см коробка) за 5 мин при комнатной температуре.
- Добавьте 1 мл на хорошо теплой кондиционером DMEM/F12 12 хорошо пластины.
- Понять каждый coverslip между большим и указательным пальцами, медленно слезает PDMS плесень с Изогнутый пинцет, соблюдая осторожность, чтобы не вытеснять гель и поместите его в колодец с кондиционером среднего.
- Добавить еще 1 мл теплой среде DMEM/F12 для каждой скважины.
- Инкубируйте пластины при 37 ° C с 5% CO2 на 2 недели, освежающий ячейки СМИ каждую неделю дозирования 1 мл СМИ от каждой скважины и заменив 1 мл DMEM/F12.
4. микроскопия
-
Immunocytochemistry
Примечание: Перевернутый Конфокальный микроскоп был использован для изображения этих образцов и ImageJ был использован для обработки и отображения изображений. Микроглии, астроциты, олигодендроциты и ядра, будут помечены после 3 недель в культуре Хама.- Разогрейте 10% PBS-амортизированное формалина (рН 7,0) в ванну 37 ° С.
Предостережение: Хотя формалин может использоваться за пределами Зонта, этот материал реактивной с ткани и следует обрабатывать с заботой и перчатки всегда. Метод dispose следует отдельно. - Тщательно аспирационная СМИ от плиты и Пипетка 1 мл формалина 10% для каждой скважины.
- Инкубируйте пластины при 37 ° C в 5% CO2 на 20 мин.
- Аспирационная жидкости из каждой пластины, Пипетка 2 мл PBS (рН 7,4) в каждой скважине и Инкубируйте 15 мин.
- Повторите шаг 4.1.4 дважды.
- Аспирационная жидкости из тарелки, добавить 1 мл на хорошо PBS с 10% нормальной лошадь сыворотки (ГСЗ) и 0,5% Тритон X-100 и осторожно покачайте на минимальной скорости) за 1 ч.
- Повторите шаг 4.1.4 три раза.
- Аспирационная жидкости и добавить 1 мл на хорошо следующей смеси в PBS: кролик ионизированного кальция привязки адаптера молекулы (Iba1) 1:1, 000, курица глиальных фибриллово белка (СВМС) 1:5, 000, мышь 2', 3'-циклический nucelotide 3'-phophodiesterase (CNPase) 1:1, 000, 1% ГСЗ , и 0.1% клеточной перфорации ПАВ. Инкубируйте на 4 ° C на ночь, как можно осторожно тряся пластину.
- Повторите шаг 4.1.4 три раза с 1 h инкубаций между ними.
- Аспирационная жидкости и добавить 1 мл на хорошо следующей смеси в PBS: 647 Нм возбужденных осла анти кролик антител 1: 200, 546 Нм возбужденных коза антитела анти курица 1: 200, 488 нм возбужденных осла антитела анти мыши 1: 200, 1% ГСЗ, 1:1,000 синий ядерных пятно. Инкубации при комнатной температуре за 1 ч, осторожно тряся пластину.
- Повторите шаг 4 три раза с 1 h инкубаций между ними.
- Чтобы сохранить гидрогели, аспирационная буфер и погрузить их в 0,5 мл клетки монтажа средних за 1 мин пипетку из монтажа средних и осторожно поместите coverslip поверх геля, создание слоя между стеклом. Добавьте небольшое количество монтажа средне открытые стороны coverslips для предотвращения высыхания гидрогеля.
Примечание: Для устранения неполадок, гели могут отражаться на шаге 4.1.11. чтобы увидеть надлежащей маркировки перед дальнейшей обработкой.
- Разогрейте 10% PBS-амортизированное формалина (рН 7,0) в ванну 37 ° С.
-
Сканирующая электронная микроскопия (SEM)
Примечание: Чтобы визуализировать гидрогеля, сканирующий электронный микроскоп был использован для изображения этих образцов.- Нагрейте смесь фиксирующие параформальдегида глютаральдегид и 2%-2,5% в PBS (0,1 М) в ванну воды 37 ° C.
Предупреждение: Эти реагенты высокой реакционной способностью с тканями и должны быть обработаны с осторожностью и перчатки. Они должны быть обрабатываются в Зонта максимально и утилизировать отдельно. - Аспирационная среднего из плит культуры клеток и добавьте 1 mL подогретую фиксирующие смеси.
- Инкубируйте пластины при 37 ° C в 5% CO2 на 20 мин.
- Поместите пластины в 4 ° C (холодильник/охладитель) на ночь.
- Аспирационная фиксирующие решение из скважин и добавьте 1 mL PBS.
- Аспирационная жидкость от каждой плиты, добавить 2 мл PBS в каждой скважине и Инкубируйте 15 мин.
- Повторите шаг 4.2.6 еще два раза.
- Аспирационная PBS и добавить 1 мл 1% tetraoxide осмий буферизуются в PBS для каждой скважины.
Примечание: Пока образцы высушиваются, этот шаг и все последующие шаги выполняются в зонта. - Разрешить фиксация происходит за 30 мин осмий паров от жидкости может исправить другие образцы в том же пластины; Таким образом, раздел образцы соответственно перед этот шаг.
Предупреждение: Осмий tetraoxide высоко реактивной с ткани и летучих. Это опасно и обрабатываться в Зонта с перчатками. Это и любой немедленно промывают должен быть удален отдельно. - Повторите шаг 4.2.6 три раза.
- Аспирационная жидкости и добавить обезвоживания смеси в списке ниже, в порядке и проинкубируйте указанное время (комнатной температуры). Начнем постепенно добавляя этанола (EtOH), а затем нажмите Гексаметилдисилазан (ГМДО). См таблицу 2 для каждого приращения.
Примечание: При добавлении HMDS, coverslips может решительно придерживаться пластика и стать очень трудно удалить. Это может быть предотвращено путем размещения небольшой пластиковой платформы под стекло скольжения после первого применения HMDS. После инкубации второй EtOH образец можно вынимать и закаленных в жидком азоте за несколько секунд, чтобы заморозить разрушения образца. - Осторожно удалите высушенных образцов и подключить образцы на сканирующий электронный микроскоп заглушки с двухсторонней проводящие ленты.
- Распыления покрытия образцы с минимальным количеством золота. Поместите образцы в держатель и привестись в действие машину за 2 мин в 15 мА.
- Нагрейте смесь фиксирующие параформальдегида глютаральдегид и 2%-2,5% в PBS (0,1 М) в ванну воды 37 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
К модели ответа хоста нервной ткани и глиальный рубец в высокой пропускной способности, в пробирке система требует 3D ячейки леску с матрицы материалом, который биосовместимых, не нести цитотоксических событий во время формирования в situ и изменяемые с биоактивными компонентами для руководства благожелательной реакции. С этой целью мы создали систему эшафот 3D ячейки на основе гиалуроновой кислоты и инкапсулируются первичной смешанные глиальных клеток населения для изучения взаимодействия ячеек и глиальных bioreactivity. Краткий визуальное изучение клеток и леска была выполнена. Морфология субпопуляции клеток, включая Олигодендроциты (CNPase в зеленых), микроглии (Iba1 красным), и астроциты (СВМС в желтый), обозначены immunofluorescent конфокальная микроскопия (Рисунок 3Ai-ii-Ci-ii). Комбинированные подмости и ячейки морфология также показаны SEM (Рисунок 3Aiii-iv - Ciii-iv). В эти образы низкий (i и iii) и высокой (ii и iv) резолюции представитель изображения отображаются. 2D PLL coverslip покрытием (рис. 3A) был по сравнению с 3D Хама леска 0,5% w/v (рис. 3B) и смесь 20% v/v базальной пластинки смеси в 0,5% w/v Хама (рис. 3 c). Это было сделано для демонстрации морфологические различия в 2D и 3D клеточной культуры, а также влияние введения биологических пластинки на эшафот. 3D реконструкция доступен также в дополнительной информации.
Морфология клеток каждого типа клеток, изменилось с введением 3D платформы. В 2D адэрентных культуры (PLL-покрытием стекла coverslips) Олигодендроциты появился обычно круглой и сформированных небольших сетей, обычно соединения с слегка помечены СВМС процессов. Микроглии были меньше, чем другие клетки и небольшие ветвящихся процессов, которые не распространяется далеко от их клеток органов (< 20 мкм). Астроциты были более разнообразно формы, некоторые с радиальным морфология с мелких клеток органов и обширные тонкий, ветвящиеся процессы, в то время как другие были фиброзной с плоский внешний вид и несколько широких процессов, которые пальто поверхности. В 3D культуре Хама Олигодендроциты появился в кластерах, отделилась в меньших сфер. Микроглии были круглыми с несколько процессов, и астроциты были округлые или радиально отделилась в сети из одного кластера. Как правило, эти клетки, как представляется, переросли от единичных точек или оставаться в районах Хама без делать контакт с другими клетками, который в отличие от 2D культуры и наводящий ограниченной мобильности через матрицу. Когда 20% v/v смесью базальной пластинки был добавлен к фото Полимеризация смеси, все подтипы глиальных интегрирована с платформой 3D и сформировали более обширные, интерактивные разветвленной структуры. Олигодендроциты продлен луковичных процессы радиально похож на морфологии смесь не базальной пластинки, но дополнительно представляется распространение процессов вдоль тонких взаимосвязанных сетей экзоцитоз процессов ветвления во всем на эшафот. Микроглии были рассеяны среди этих сотовых сетей, разложив с тонкой процессы более соответствует их морфология в ткани. В целом морфологии предложить все три вида глии, интегрированы в смесь Хама базальной пластинки свободно, потенциально через либо более широкое присоединение к смешанной субстрата или через повышение способности переделывать на эшафот.
Когда под наблюдением SEM, морфологию клеток был замечен подтвердить конфокальной микроскопии. Матрица Хама появился как гладкую поверхность с 10-50 мкм поры видели слегка под поверхностью. Клетки были приверженцами поверхности Хама и также были слегка видны в слоях под. Эти глии не являются сопоставимыми морфологии для тех, кто отметил в 2D культуре, однако с добавлением смеси базальной пластинки, обширные сети было отмечено. Толстые экзоцитоз волокон, с небольших кластеров микроглии наблюдались как на поверхности смеси Хама базальной пластинки и проходящий через матрицу бесшовным способом. Это можно увидеть слегка как матрица, сложенные вокруг клетки, предполагая, что клетки могут изменить эшафот чтобы формируется в их желаемого конформации.
Рисунок 1: схема methacrylated гиалуроновой кислоты (HAMA)-на основе культуры и фотополимеризации Протокол 3D клетки. Глиальные клетки (2 недели основной крыса мозга культура) смешиваются с Хама и накапаны в полидиметилсилоксан (PDMS) плесень на стекло coverslip. Эта смесь подвергается высокой интенсивности зеленый светодиодные для полимеризации гидрогеля на 5 мин. Удалить плесень и гель инкубировали в средствах массовой информации. Представитель клетки включают микроглии (красный), астроциты (желтый) и Олигодендроциты (зеленый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: рассечение 1 день Sprague-Dawley щенка мозга крысы. Образы всего мозга (A), рассечение коре и мозжечок (B), один коры с мозговых оболочек (C), пилинг мозговых оболочек с щипцами (D) и meninge свободный коры (E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Immunofluorescent конфокальная (i-ii) и сканирование микроскопии электрона (iii-iv) смешанного глии клеточных популяций на 2D PLL покрытий (A), HAMA (B) и Хама базальной пластинки смесь (C). Нижний (i, iii) и выше (ii, iv) показано увеличение изображения. Этикетки включают в себя Iba1 в красный для микроглии, СВМС в желтом астроциты, CNPase в зеленый для олигодендроциты, и Hoechst ядерной пятно. Масштаб баров = 25 мкм для конфокальный изображений и 50 (iii) и 20 мкм (iv) для сканирования электронной микроскопии. Гидрогели были 0,5% w/v, и смесь базальной пластинки было 20% по объему. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительные рисунок 1: 3D immunofluorescent микрографические реконструкции Хама базальной пластинки смеси с смешанная популяции клеток глии Хама базальной пластинки смесь. Этикетки включают в себя Iba1 в красный для микроглии, СВМС в желтом астроциты, CNPase в зеленый для олигодендроциты, и Hoechst ядерной пятно. Гидрогели были 0,5% w/v, и Getrex было 20% по объему. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
| ХАМА | Базальной пластинки | НВП | ЧАЙ | EY | |
| Рабочая концентрация | 0,5% w/v | 20% v/v | 0,10% | 0,10% | .01 мм |
| 12-ну пластина | 2% w/v | 100% w/v | 10% v/v | 10% v/v | 1 мм |
| 1.4 мл всего | 350 МКЛ | 280 МКЛ | 14 МКЛ | 14 МКЛ | 14 МКЛ |
Таблица 1: Пример клеток инкапсуляции.
| Компонент | Содержание | Время инкубации |
| EtOH | 30% | 30 мин. |
| EtOH | 50% | 30 мин. |
| EtOH | 70% | 30 мин. |
| EtOH | 90% | 20 мин |
| EtOH | 100% | 20 мин |
| EtOH | 100% | 20 мин |
| EtOH:HMDS | 75: 25 | 20 мин |
| EtOH:HMDS | 50:50:00 | 20 мин |
| EtOH:HMDS | цвету | 20 мин |
| HMDS | 100% | 20 мин |
| HMDS | 100% | Ночлег |
Таблица 2: Постепенно увеличивается EtOH и HMDS в обезвоживания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
К цели создания 3D культуры системы модель глиальных bioreactivity и глиальных рубцов процесса мы разработали систему, которая может поддерживать основной культурный микроглии, астроциты и Олигодендроциты и обеспечивает надежную характеристику ячейки Морфология и ячеек взаимодействий. От показывает микроскопии морфология каждого типа клеток был совершенно разные с 2D, 3D-Хама и 3D Хама-базальной пластинки смесь платформ. В системе 2D морфология явно предвзятым вдоль плоскости поверхности, но по сравнению с 3D Хама, Микроглия и астроциты были обычно меньше внутри матрицы, за исключением Олигодендроциты кластеров. В сканирования электронной микроскопии клетки были обычно более круглый сформированы на Хама. Это может быть обусловлено главным образом клетки, инкапсулированы, с ограниченным потенциалом для изменения матрицы для передвижения и свободного передвижения и роста процессов. Нарост клеток в Хама был обычно радиальные для астроциты и олигодендроциты. Хотя эти клетки Расширенные процессы, их организации предположить, что их движение по всей матрицы и способность взаимодействовать с другими клетками было ограничено. Кроме того Предыдущая работа показала замораживания трещиноватых Хама быть пористым без взаимосвязанных сетей, которые могут объяснить отсутствие нарост65,70. Это может быть возможным, что некоторые из этих клеток не переживет фотополимеризации, оставаясь сохранились в матрице, однако жизнеспособность систематически оценивалось в нашей предыдущей работы и оставался 80% (0,5% w/v) в течение недели65.
Чтобы улучшить взаимодействие клетки с матрицей в 3D культуре, мы ввели базальной пластинки смесь как матрицы биосовместимых и изменяемый компонент. Было установлено, что клетки интеграции с матрицей заметно улучшилось, со всеми типами клеток, показаны широкие процессы, по сравнению с культуры 2D и 3D Хама. Базальной пластинки смесь состоит из различных компонентов базальной пластинки и формулируется главным образом для поддержки глиальных дифференцировка нервных стволовых клеток прекурсоров71. Это не было неожиданным, что глиальные клетки ответил на смесь базальной пластинки и впоследствии окружающие 3D матрицы, но степень интеграции предлагает здоровые ткани-среде. Сравнение Хама Хама базальной пластинки смесь, морфология гидрогеля не появляются совершенно разные, поэтому клетки могут быть более активно его реконструкцию. Учитывая простоту добавления этой биологически активных компонентов это не невообразимое использовать различные laminas и/или белка подсказки к формированию культуры условий для нейронов. В направлении потенциальных будущих эта система может использоваться для различения нейронов нейронной прародителями в сочетании с смешанная глии для различных эффектных миелинизации или нейро воспалительные повреждения модели.
В случае серьезных и пагубных травмы ЦНС или неприятие биоматериала резидентов ткани инициирует воспалительных реакций, способных усугубить нейродегенеративные и демиелинизации. Это обычно приводит к образованию глиальных шрам раздел на сайте травмы, что препятствует регенерации. В этом исследовании были подробно изложены методы для methacrylated фото полимеризуется на основе гиалуроновой кислоты 3D лески с намерением моделирования первоначальный клеточный ответ за глиальных рубцов; Микроглии реактивности, экзоцитоз вербовки и гипертрофии и Олигодендроциты травмы и вывода. 3D Мобильный леску был разработан для включения всех трех типов глиальных клеток и дальнейшие изменения с смесью многокомпонентных базальной пластинки. Он определяется, конфокальных и сканирования электронной микроскопии изображений, что клетки были инкапсулированы в Хама и смогли лучше интегрировать когда смесь базальной пластинки была введена. Эти результаты могут привести к несколько новых приложений. Хама одиночку может служить для создания систем совместного культуры где намерение ограничить взаимодействие к ячейке или исследование перегонять доставки лекарств, с помощью геля как ограниченное матрица загружен диффузии наркотиков. Гидрогели, включения смесь базальной пластинки в матрице Хама позволяют более единообразную среду ткани как способный моделирования острого воспаления, глиоза или глиальных рубцов и позволяет также высок объём характеристика глиальных bioreactivity имплантаты, наркотиков и устройства развития и другие стратегии по сокращению и восстановить воспалительных повреждений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы признательны за финансовую поддержку от Сенти, CFI, AIHS, служб здравоохранения Альберты и Дэви дар для исследования мозга.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Materials for HAMA synthesis and photopolymerization | |||
| Hyaluronic acid (HA) | Sigma-Aldrich | 53747-10G | Streptococcus equi, MW: 1.5 - 1.8 X 10^6 |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 275585-100ML | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| Ethanol (EtOH) | Commerical Alcohols Inc. | Anhydrous | |
| Phosphate buffered saline (pH 7.4) tablets | Fisher Scientific | 18912014 | |
| Triethanolamine (TEA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| 1-Vinyl-2pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | |
| EosinY (EY) | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 440159-100ML | |
| Beaker (100 mL) | Corning | 1000-100 | |
| Beaker (500 mL) | Corning | 1000-600 | |
| pH paper (Labstick) | Sigma-Aldrich | 9580 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2. Materials for glial cell isolation and cell culture | |||
| P1-2 Sprague Dawley rat pups | Charles River | CD Sprague Dawley rat strain code 001 | |
| Dissector scissors - slim blades (small) | Fine Science Tools | 14081-09 | |
| Surgical scissors - Toughcut (large) | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11521-10 | |
| Curved fine forceps (Dumont #7) | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14170-112 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
| Penicillin-streptomycin (PS) | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 12483-020 | |
| 0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Gibco | 25200-072 | |
| Poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P-6282 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-5 | |
| 12 well Tissue culture treated plates (Cellstar) | Greiner Bio-One | 665 108 | |
| 10 mL serological pipette | Fisher Scientific | 13-676-10F | |
| 25 mL serological pipette | Fisher Scientific | 12-676-10K | |
| Petri dish (60 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri dish (100 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Microscope Coverslip (18 mm) | Fisher Scientific | 12-545-100 18CIR | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3. Materials for microscopy (confocal and scanning electron microscopy) | |||
| Mouse monoclonal anti-CNPase | abcam | ab6319 | |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako Laboratory Chemicals | 019-17741 | |
| Chicken anti-GFAP | abcam | ab4674 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | |
| Fluoromount-G | Fisher Scientific | 00-4958-02 | |
| Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Buffered (10%) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Paraformaldehyde | Electon Microscopy Sciences | 157-8 | Buffered (8%) |
| Guteraldehyde | Electon Microscopy Sciences | 16019 | Buffered (8%) |
| Osmium tetraoxide | Electon Microscopy Sciences | 19152 | Buffered (2%) |
| Hexamethyldilazane (HMDS) | Electon Microscopy Sciences | 16700 | |
| Ethanol (EtOH) | Electon Microscopy Sciences | 15055 | Anhydrous |
| Microscope Slide (25 X 75 X 1 mm) | VWR International | 48311-703 |
References
- Shih, J. J., Krusienski, D. J., Wolpaw, J. R. Brain-Computer Interfaces in Medicine. Mayo Clin. Proc. 87, 268-279 (2012).
- Kennedy, P. R., Bakay, R. A. Restoration of neural output from a paralyzed patient by a direct brain connection. Neuroreport. 9, 1707-1711 (1998).
- Kennedy, P. R., Bakay, R. A., Moore, M. M., Adams, K., Goldwaithe, J. Direct control of a computer from the human central nervous system. IEEE Trans. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 8, 198-202 (2000).
- Mayberg, H. S., et al. Deep Brain Stimulation for Treatment-Resistant Depression. Neuron. 45, 651-660 (2005).
- Dougherty, D. D., et al. A Randomized Sham-Controlled Trial of Deep Brain Stimulation of the Ventral Capsule/Ventral Striatum for Chronic Treatment-Resistant Depression. Biol. Psychiatry. 78, 240-248 (2015).
- Bamford, J. A., Marc Lebel, R., Parseyan, K., Mushahwar, V. K. The Fabrication, Implantation, and Stability of Intraspinal Microwire Arrays in the Spinal Cord of Cat and Rat. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 25, 287-296 (2017).
- Holinski, B. J., et al. Intraspinal microstimulation produces over-ground walking in anesthetized cats. J. Neural Eng. 13, 056016 (2016).
- Toossi, A., Everaert, D. G., Azar, A., Dennison, C. R., Mushahwar, V. K. Mechanically Stable Intraspinal Microstimulation Implants for Human Translation. Ann. Biomed. Eng. 45, 681-694 (2017).
- Saigal, R., Renzi, C., Mushahwar, V. K. Intraspinal microstimulation generates functional movements after spinal-cord injury. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 12, 430-440 (2004).
- Lau, B., Guevremont, L., Mushahwar, V. K. Strategies for generating prolonged functional standing using intramuscular stimulation or intraspinal microstimulation. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 15, 273-285 (2007).
- Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. J. Neurosci. Methods. 148, 1-18 (2005).
- Sierra, A., et al. Surveillance, phagocytosis, and inflammation: how never-resting microglia influence adult hippocampal neurogenesis. Neural Plast. 2014, 610343 (2014).
- Holm, T. H., Draeby, D., Owens, T. Microglia are required for astroglial Toll-like receptor 4 response and for optimal TLR2 and TLR3 response. Glia. 60, 630-638 (2012).
- Gao, Z., et al. Reciprocal modulation between microglia and astrocyte in reactive gliosis following the CNS injury. Mol. Neurobiol. 48, 690-701 (2013).
- Jin, X., Yamashita, T. Microglia in central nervous system repair after injury. J. Biochem. (Tokyo). 159, 491-496 (2016).
- Griffith, R. W., Humphrey, D. R. Long-term gliosis around chronically implanted platinum electrodes in the Rhesus macaque motor cortex. Neurosci. Lett. 406, 81-86 (2006).
- Biran, R., Martin, D. C., Tresco, P. A. Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays. Exp. Neurol. 195, 115-126 (2005).
- Fawcett, J. W., Asher, R. A. The glial scar and central nervous system repair. Brain Res. Bull. 49, 377-391 (1999).
- Szarowski, D. H., et al. Brain responses to micro-machined silicon devices. Brain Res. 983, 23-35 (2003).
- Park, D. -W., et al. Graphene-based carbon-layered electrode array technology for neural imaging and optogenetic applications. Nat. Commun. 5, 5258 (2014).
- McAllister, J. P., et al. Biocompatibility of Penetrating Recording Electrode Arrays Implanted Chronically in the Feline Visual Cortex. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 1528 (2005).
- Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. J. Neurochem. 109, 117-125 (2009).
- Chung, H., et al. In vivo Biocompatibility and Stability of Polyimide Microelectrode Array for Retinal Stimulation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 5072 (2003).
- Aregueta-Robles, U. A., Woolley, A. J., Poole-Warren, L. A., Lovell, N. H., Green, R. A. Organic electrode coatings for next-generation neural interfaces. Front. Neuroengineering. 7, (2014).
- Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24, 4337-4351 (2003).
- Yang, J., et al. Ordered surfactant-templated poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) conducting polymer on microfabricated neural probes. Acta Biomater. 1, 125-136 (2005).
- Ludwig, K. A., et al. Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) polymer coatings facilitate smaller neural recording electrodes. J. Neural Eng. 8, 014001 (2011).
- Kim, D. -H., Abidian, M., Martin, D. C. Conducting polymers grown in hydrogel scaffolds coated on neural prosthetic devices. J. Biomed. Mater. Res. A. 71, 577-585 (2004).
- George, P. M., et al. Fabrication and biocompatibility of polypyrrole implants suitable for neural prosthetics. Biomaterials. 26, 3511-3519 (2005).
- Stauffer, W. R., Cui, X. T. Polypyrrole doped with 2 peptide sequences from laminin. Biomaterials. 27, 2405-2413 (2006).
- Green, R. A., Lovell, N. H., Wallace, G. G., Poole-Warren, L. A. Conducting polymers for neural interfaces: challenges in developing an effective long-term implant. Biomaterials. 29, 3393-3399 (2008).
- Gumbiner, B. M. Cell adhesion: the molecular basis of tissue architecture and morphogenesis. Cell. 84, 345-357 (1996).
- Chan, G., Mooney, D. J. New materials for tissue engineering: towards greater control over the biological response. Trends Biotechnol. 26, 382-392 (2008).
- Green, R. A., Lovell, N. H., Poole-Warren, L. A. Impact of co-incorporating laminin peptide dopants and neurotrophic growth factors on conducting polymer properties. Acta Biomater. 6, 63-71 (2010).
- Green, R. A., Lovell, N. H., Poole-Warren, L. A. Cell attachment functionality of bioactive conducting polymers for neural interfaces. Biomaterials. 30, 3637-3644 (2009).
- Koss, K. M., Unsworth, L. D. Neural tissue engineering: Bioresponsive nanoscaffolds using engineered self-assembling peptides. Acta Biomater. 44, 2-15 (2016).
- Koss, K. M., et al. Brain biocompatibility and microglia response towards engineered self-assembling (RADA)4 nanoscaffolds. Acta Biomater. 35, 127-137 (2016).
- Evans, A. J., et al. Promoting neurite outgrowth from spiral ganglion neuron explants using polypyrrole/BDNF-coated electrodes. J. Biomed. Mater. Res. A. 91, 241-250 (2009).
- Yu, X., Bellamkonda, R. V. Tissue-engineered scaffolds are effective alternatives to autografts for bridging peripheral nerve gaps. Tissue Eng. 9, 421-430 (2003).
- Houweling, D. A., Lankhorst, A. J., Gispen, W. H., Bär, P. R., Joosten, E. A. Collagen containing neurotrophin-3 (NT-3) attracts regrowing injured corticospinal axons in the adult rat spinal cord and promotes partial functional recovery. Exp. Neurol. 153, 49-59 (1998).
- Wells, M. R., et al. Gel matrix vehicles for growth factor application in nerve gap injuries repaired with tubes: a comparison of biomatrix, collagen, and methylcellulose. Exp. Neurol. 146, 395-402 (1997).
- Barras, F. M., Pasche, P., Bouche, N., Aebischer, P., Zurn, A. D. Glial cell line-derived neurotrophic factor released by synthetic guidance channels promotes facial nerve regeneration in the rat. J. Neurosci. Res. 70, 746-755 (2002).
- Fine, E. G., Decosterd, I., Papaloïzos, M., Zurn, A. D., Aebischer, P. GDNF and NGF released by synthetic guidance channels support sciatic nerve regeneration across a long gap. Eur. J. Neurosci. 15, 589-601 (2002).
- Burdick, J. A., Ward, M., Liang, E., Young, M. J., Langer, R. Stimulation of neurite outgrowth by neurotrophins delivered from degradable hydrogels. Biomaterials. 27, 452-459 (2006).
- Piantino, J., Burdick, J. A., Goldberg, D., Langer, R., Benowitz, L. I. An injectable, biodegradable hydrogel for trophic factor delivery enhances axonal rewiring and improves performance after spinal cord injury. Exp. Neurol. 201, 359-367 (2006).
- Jain, A., Kim, Y. -T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27, 497-504 (2006).
- Taylor, S. J., Sakiyama-Elbert, S. E. Effect of controlled delivery of neurotrophin-3 from fibrin on spinal cord injury in a long term model. J. Control. Release Off. J. Control. Release Soc. 116, 204-210 (2006).
- Jhaveri, S. J., et al. Release of nerve growth factor from HEMA hydrogel-coated substrates and its effect on the differentiation of neural cells. Biomacromolecules. 10, 174-183 (2009).
- Lee, A. C., et al. Controlled release of nerve growth factor enhances sciatic nerve regeneration. Exp. Neurol. 184, 295-303 (2003).
- Matsumoto, K., et al. Neurite outgrowths of neurons with neurotrophin-coated carbon nanotubes. J. Biosci. Bioeng. 103, 216-220 (2007).
- Khaled, I., et al. A Flexible Base Electrode Array for Intraspinal Microstimulation. IEEE Trans. Biomed. Eng. 60, 2904 (2013).
- David-Pur, M., Bareket-Keren, L., Beit-Yaakov, G., Raz-Prag, D., Hanein, Y. All-carbon-nanotube flexible multi-electrode array for neuronal recording and stimulation. Biomed. Microdevices. 16, 43-53 (2014).
- Hsu, H. -L., et al. Flexible UV-ozone-modified carbon nanotube electrodes for neuronal recording. Adv. Mater. Deerfield Beach Fla. 22, 2177-2181 (2010).
- Lacour, S. P., et al. Flexible and stretchable micro-electrodes for in vitro and in vivo neural interfaces. Med. Biol. Eng. Comput. 48, 945-954 (2010).
- Lin, C. -M., Lee, Y. -T., Yeh, S. -R., Fang, W. Flexible carbon nanotubes electrode for neural recording. Biosens. Bioelectron. 24, 2791-2797 (2009).
- Richter, A., et al. A simple implantation method for flexible, multisite microelectrodes into rat brains. Front. Neuroengineering. 6, 6 (2013).
- Rousche, P. J., et al. Flexible polyimide-based intracortical electrode arrays with bioactive capability. IEEE Trans. Biomed. Eng. 48, 361-371 (2001).
- Polikov, V. S., Block, M. L., Fellous, J. -M., Hong, J. -S., Reichert, W. M. In vitro model of glial scarring around neuroelectrodes chronically implanted in the CNS. Biomaterials. 27, 5368-5376 (2006).
- Sohal, H. S., Clowry, G. J., Jackson, A., O'Neill, A., Baker, S. N. Mechanical Flexibility Reduces the Foreign Body Response to Long-Term Implanted Microelectrodes in Rabbit Cortex. PloS One. 11, e0165606 (2016).
- Moshayedi, P., et al. The relationship between glial cell mechanosensitivity and foreign body reactions in the central nervous system. Biomaterials. 35, 3919-3925 (2014).
- Hopkins, A. M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. 3D in vitro modeling of the central nervous system. Prog. Neurobiol. 125, 1-25 (2015).
- Pöttler, M., Zierler, S., Kerschbaum, H. H. An artificial three-dimensional matrix promotes ramification in the microglial cell-line, BV-2. Neurosci. Lett. 410, 137-140 (2006).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. 0, 42-51 (2014).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12, 207-218 (2014).
- Jeffery, A. F., Churchward, M. A., Mushahwar, V. K., Todd, K. G., Elias, A. L. Hyaluronic acid-based 3D culture model for in vitro testing of electrode biocompatibility. Biomacromolecules. 15, 2157-2165 (2014).
- Fitch, M. T., Silver, J. CNS Injury, Glial Scars, and Inflammation. Exp. Neurol. 209, 294-301 (2008).
- Churchward, M. A., Todd, K. G. Statin treatment affects cytokine release and phagocytic activity in primary cultured microglia through two separable mechanisms. Mol. Brain. 7, 85 (2014).
- Lai, A. Y., Todd, K. G. Differential regulation of trophic and proinflammatory microglial effectors is dependent on severity of neuronal injury. Glia. 56, 259-270 (2008).
- Hachet, E., Van Den Berghe, H., Bayma, E., Block, M. R., Auzély-Velty, R. Design of biomimetic cell-interactive substrates using hyaluronic acid hydrogels with tunable mechanical properties. Biomacromolecules. 13, 1818-1827 (2012).
- Eslami, M., Javadi, G., Agdami, N., Shokrgozar, M. A. Expression of COLLAGEN 1 and ELASTIN Genes in Mitral Valvular Interstitial Cells within Microfiber Reinforced Hydrogel. Cell J (Yakhteh). , (2015).
- Shaltouki, A., Peng, J., Liu, Q., Rao, M. S., Zeng, X. Efficient Generation of Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells in Defined Conditions. STEM CELLS. 31, 941-952 (2013).
