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Bioengineering

Melhorado o hidrogel 3D culturas de células gliais primárias para In Vitro modelagem de Neuroinflammation

Published: December 8, 2017 doi: 10.3791/56615
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,3, 1,2,4, 3, 1,2,5
1Department of Psychiatry, University of Alberta, 2Alberta Innovates-Health Solutions Interdisciplinary Team in Smart Neural Prostheses (Project SMART), University of Alberta, 3Department of Chemical and Materials Engineering, University of Alberta, 4Division of Physical Medicine and Rehabilitation, University of Alberta, 5Centre for Neuroscience, University of Alberta

Summary

Neste documento, apresentamos um protocolo para a cultura 3D do rato as células da glia derivado do cérebro, incluindo astrócitos, oligodendrócitos e micróglia. Vamos demonstrar a cultura de células primárias, síntese de hidrogel de ácido hialurônico methacrylated (HAMA), encapsulamento HAMAphoto-polimerização e celular e amostra de processamento de imagem microscópica confocal e varredura de elétrons.

Abstract

No sistema nervoso central, numerosas lesões agudas e doenças neurodegenerativas, bem como implantados dispositivos ou biomateriais projetado para melhorar o resultado da função no mesmo resultado: inflamação em excesso leva à gliose, citotoxicidade, e/ou formação de uma cicatriz glial que coletivamente agravar lesão ou impedir recuperação saudável. Com a intenção de criar um sistema de modelo cicatriz glial formação e estudo de processos inflamatórios, geramos um andaime celular 3D capaz de habitação primárias culturas de células gliais: micróglia que regulam a resposta do corpo estranho e iniciar o evento inflamatório, astrócitos que respondem para formar uma cicatriz fibrosa e oligodendrócitos tipicamente vulneráveis a lesões inflamatórias. O presente trabalho fornece um método passo a passo detalhado para a fabricação, a cultura e a caracterização microscópica de um andaime de hidrogel 3D à base de ácido hialurônico com rato encapsulado derivado do cérebro células gliais. Além disso, os protocolos para a caracterização de encapsulamento de células e o andaime de hidrogel por imunofluorescência confocal e microscopia eletrônica são demonstrados, bem como a capacidade de modificar o andaime com substratos bioativos, com incorporação de uma mistura de lâmina basal comercial para integração melhorada do celular.

Introduction

Inflamação do sistema nervoso central (SNC) tem sido considerada uma marca registrada de aguda (por exemplo, acidente vascular cerebral isquêmico, traumatismo crânio e lesão medular) e crónica (por exemplo, Alzheimer, Parkinson do e doenças de Huntington) lesão do CNS, Mas é cada vez mais reconhecido como um contribuinte causal neurodegenerativas e distúrbios neuropsiquiátricos. Sustentada ou inflamação inadequada pode causar lesões neurológicas e desmielinização (por exemplo, esclerose múltipla) e influenciam negativamente o desenvolvimento do cérebro (por exemplo, esquizofrenia, autismo) e Estados de humor (por exemplo, depressão, ansiedade transtorno bipolar). Além disso, novas estratégias terapêuticas usando dispositivos implantáveis (ex., interfaces cérebro-computador1,2,3, cerebral profunda estimulação4,5, intraspinal microstimulation6,7,8,9,10) geram uma resposta inflamatória previsível na interface entre o dispositivo e o CNS, resultando em um resposta de tecido protetor que pode causar perda de eficácia ou dispositivo falha durante a vida útil do implante11. Inflamação no SNC é normalmente iniciada por microglia, que funcionam como as células imunes residentes do SNC responsável pela vigilância de tecido e montagem da resposta de corpo estranho (opinião de12). Dependendo da gravidade do insulto, o sinal microglia e recruta adicional de células tipos para um local da lesão. Especificamente, a microglia ativar os astrócitos, que por sua vez atuam como células inflamatórias secundárias e forma uma barreira protetora densa para conter uma lesão local13,14. Microglia também pode iniciar uma cascata de atividade nas células do sistema imunológico periférica, que pode resultar na degradação do BBB para permitir infiltração imune (revista em referência15).

No caso de dispositivos implantados para o CNS, dano tecidual resultante da inserção do dispositivo, bem como a presença contínua do dispositivo estrangeiro pode iniciar um processo denominado cicatrizes gliais. Neste processo, a microglia migrar para e se proliferam no local da lesão. Também iniciam a liberação de fatores inflamatórios para neutralizar ameaças potenciais e recrutar células gliais adicionais. Posteriormente, astrócitos ativados se tornar hipertróficas e começam encapsulando o dispositivo implantado para formar uma barreira fibrosa contínua16. Sinalização inflamatória também serve para promover a retirada de processos neuronais da vizinhança do implante e recrutas eventualmente fibroblastos para reforçar o desenvolvimento de cicatriz glial17. Os oligodendrócitos, responsáveis pela bainha neurônios na mielina para realçar a condutância, não sobreviver a esse processo e células distantes são particionadas do implante por cicatriz18. Cicatrizes gliais grandemente reduz a função e o tempo de vida de dispositivos implantados, particularmente para eléctrodos de gravação e, finalmente, serve para limitar a funcionalidade de interfaces neurais19.

Várias abordagens têm sido exploradas para aumentar a biocompatibilidade e a atividade de interface de dispositivos implantados no CNS21,20,22,23. Uma extensa revisão está disponível no projeto biocompatível destas interfaces neurais24. As estratégias mais proeminentes incluem em torno do eletrodo com revestimentos compatíveis tais como polyelthyleneglycol (PEG), ácidos polilático-co-glicólico (PLGA)25, ou realçando o eléctrodo com polímeros condutores, tais como a poli (etileno dioxythiophene) (PEDOT) e polipirrol (PPA)26,,27,28,29,30,31. Revestimentos bioativos também têm sido empregados para fornecer dicas para o crescimento de tecido neural usando ligantes derivados de matrizes extracelulares, incluindo colagénios, fibronectins e ácidos hialurônico32,33,34 ,35,36,37. A bioatividade destes revestimentos tem sido mais explorada com sistemas de lançamento de fator de crescimento para emular a célula natural secreções30,38,39,40,41 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50. simultaneamente, alguns grupos de pesquisa optou por remodelar a geometria do eletrodo, flexibilidade e composição para diminuir a mecânica incompatibilidade entre o dispositivo e tecido51,52,53 ,54,55,56,57. No total, estas estratégias levaram a muitas melhorias promissoras na próxima geração de aparelhos interfacial neural, no entanto a compatibilidade a longo prazo é uma questão em andamento e progresso pode ser prejudicado por modelos complexos e demorados em vivo .

Abordagens baseadas em modelo animais podem limitar a taxa de transferência experimental e aumentar os custos dos testes de biocompatibilidade do eletrodo. In vitro se aproxima usando cultura de células convencional técnicas oferecem uma alternativa mais econômica, mas não conseguem muito da complexidade da interação entre o dispositivo e tecido58recapitular. Em particular, ensaios de revestimentos de superfície usando limites de cultura celular 2D a modelagem da geometria do eletrodo e a influência de incompatibilidade mecânica e micromovimentos pensados para contribuir para gerar uma resposta do hospedeiro contribuindo para dispositivo falha59 , 60.

Para superar os problemas associados com a cultura de pilha 2D, hidrogel culturas de células neurais têm sido desenvolvidas para uma ampla variedade de aplicações, estudos farmacológicos61, para direcionar a diferenciação celular neural62, para entender a doença vias63,64, ou em camadas em co-cultura com outros tipos de células para a migração celular de modelo, neuroproteção, ou modelo tecido microambiente61. Hidrogel formam-se facilmente em diferentes tamanhos e geometrias podem incorporar vários tipos de culturas de células primárias ou imortalizado e são altamente passíveis de análise por técnicas comumente usadas, tais como a microscopia de fluorescência confocal. Para criar um modelo do processo cicatricial glia, recentemente desenvolvemos e caracteriza-se um sistema de hidrogel 3D com base de ácido hialurônico para testes de alto rendimento da glia resposta para eletrodos implantados (Figura 1)65. Este sistema tem várias vantagens distintas: 1) principais células da glia (oligodendrócitos, astrócitos e microglia) são encapsuladas em uma matriz 3D composta por polímeros de ácido hialurônico, que é um componente da matriz extracelular endógena; 2) a rigidez da matriz pode ser 'afinada' para recriar as propriedades mecânicas do cérebro ou da medula espinhal, tecido; e 3) células podem ser encapsuladas na matriz em uma aproximação rápida de bancada usando fotopolimerização com luz verde, limitando a toxicidade durante o encapsulamento. Este sistema permite características de biocompatibilidade em vivo : dispositivos são inseridos o hidrogel de forma comparável ao tecido, e a resposta celular a dispositivos implantados são monitorados para uma ampla gama de parâmetros65. Estes incluem mecânica incompatibilidade entre os dispositivos e os revestimentos de hidrogel de várias estruturas e pulsos de estimulação elétrica. Este sistema também inclui oligodendrocyte e precursores relacionados, que muitas vezes são recrutados em cicatrizes gliais e presentes. Seus danos, morte e fagocitose por microglia são altamente indicativos de lesão inflamatória e como um modelo reduzido de cicatrizes ou recuperação, eles têm a capacidade de demonstrar re-mielinização dos neurônios66.

Neste documento descrevemos um método para a síntese e a formação de hidrogel de ácido hialurônico híbrido combinado com formulações disponíveis comercialmente membrana basal para melhorar a incorporação de célula. Além disso, demonstraremos a incorporação de culturas de células gliais primárias (oligodendrócitos, astrócitos e microglia) e análise de crescimento de cultura usando imunocitoquímica e microscopia confocal.

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Protocol

O protocolo para a extração do tecido de cérebro de filhotes de ratos Sprague Dawley dia 1, sacrificados por decapitação, foi aprovado pelo Comitê de uso da Universidade de Alberta e cuidado Animal.

1. Microglia e isolamentos Astrocyte67,68

Nota: Todos os meios para isolamento e cultura de pilha é pré-aquecida a 37 ° C em banho-maria. Solução de sal do Hank equilibrada (HBSS) tem 1% penicilina-estreptomicina (PS). Todos Dulbecco modificado mídia da águia com F12 do Ham, mistura de nutrientes (DMEM/F12) é suplementada com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina-estreptomicina (PS). Apenas as misturas com tripsina faltam FBS. Todos os materiais no presente protocolo são estéreis (filtro, álcool, comprado e esterilizada) e cada passo após passo número 1.8 é executado em uma armário com técnica asséptica de biossegurança.

  1. Por cérebro, pré-aquecer 15 mL de HBSS e 12,5 mL DMEM/F12 a 37 ° C em tubos de centrifuga conico de 50 mL e aproximadamente 2 mL de tripsina 0,25% com ácido de 1 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em um tubo de centrifuga conico de 15 mL. Aqueça um adicional 25 mL de DMEM/F12. Quente tripsina cerca de 10 min antes de usar para evitar a perda de atividade enzimática.
  2. Despeje o suficiente calorosa HBSS 6 estéril e pratos de cultura de 10 cm para cobrir a superfície. Prepare um prato de 10 cm para cada dois cérebros mais um prato adicional 6 cm.
  3. Coloque até 2 cérebros em cada prato2 de 10 cm (Figura 2A).
  4. Sob um microscópio de dissecação, use pinças curvas e retas para separar os córtices ao longo da linha mediana e o cerebelo com o tronco cerebral. Isso resulta em três secções de tecido por um cérebro (Figura 2B).
  5. Descasque a camada fina, semi transparente (meninges) de tecido contendo vasos sanguíneos a partir de cada seção de tecido e descarte, transferindo o tecido restante em um prato de cultura separada. Segure as camadas finas expostas os cortes de tecido, com a pinça e cuidadosamente Puxe até grandes porções são 'pendurado' no tecido cerebral. Finalmente remova esta parte puxando suavemente. Ver Figura 2-2E para imagens representativas de antes, durante e após esta etapa.
  6. Em uma armário de biossegurança, remova o restante HBSS o prato de cultura, mantendo cuidadosamente o tecido. Macerar o tecido com um bisturi e transferir o tecido ao tubo pré-aquecido 15 mL com tripsina.
  7. Incube este tubo para 25 min em um banho de 37 ° C para digerir o tecido enzimaticamente.
  8. Centrifugar o tubo para baixo a 500 x g por 2 min à temperatura ambiente e deite fora o sobrenadante.
  9. Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, adicione 10 mL de DMEM/F12 quente para inactivar a tripsina e triture a solução 5 vezes para romper o tecido.
  10. Centrifugar o tubo para baixo a 500 x g por 2 min à temperatura ambiente e deite fora o sobrenadante.
  11. Usando uma pipeta sorológica 10ml, Ressuspender o sedimento em 10 mL de DMEM/F12 quente e transferir a solução para um tubo cônico de centrífuga de 50 mL.
  12. Utilizando uma seringa de 10 mL com uma agulha de 18 calibre, Triture a solução 3 vezes.
  13. Distribua esta solução em incrementos de 12,5 mL de DMEM/F12 quente por cérebro.
  14. Pipetar incrementos de 1 mL da solução triturado em um prato bem 12 (1 por cérebro).
  15. Incube a 37 ° C e 5% CO2em uma incubadora de cultura celular umidificado. Substituir a mídia depois de três dias e atualizar mídia a cada três dias subsequentes. Depois de 2 semanas, as células podem ser coletadas para experimentos.

2. Macromer síntese69

  1. Pesar de 375 mg de sal de ácido hialurônico (Ah) em um tubo de centrifuga conico de 50 mL e adicionar 37,5 mL de água destilada.
  2. Liberar a solução com um reaccional por 1 min e proceda à sonicação a mistura até que ela aparece homogênea e perde sua viscosidade gelatinosa. Esse processo pode levar de 6 h.
  3. Solução de transferência para um copo de 100 mL com um magnético mexer bar (38 mm) e agite vigorosamente à temperatura ambiente.
  4. Cuidadosamente, titula 5.0 M de NaOH na mistura HA e medida com papel de pH até o pH estabiliza entre 8 e 12.
  5. Colete 3 mL de anidrido metacrílico fresco (MA, 94%), coberta de nitrogênio durante o armazenamento.
    Nota: MA é exposta à atmosfera de longa duração (dias), perderá sua reatividade.
    Atenção: Todo o uso de MA deve ser feito em uma coifa.
  6. Adicione 200 µ l de MA na mistura HA solução. A reação reduz o pH da solução abaixo de 8.
  7. Repita as etapas de 2,4 para 2,6 até a 3 mL de MA foram adicionados à solução. Este processo pode demorar até 1-2 h.
  8. Permitir que a reação de continuar durante a noite a 4 ° C, sem misturar.
  9. Transferir a solução para 400 mL de álcool etílico frio (EtOH) em um copo de 500 mL e permitir a precipitação de 24-72 h a 4 ° C. 56
  10. Com cuidado decantar a maior parte da solução para um copo separado para a eliminação e recolher o precipitado em um tubo de centrifuga conico de 50 mL. Isso pode ser distribuído em tubos de 2-4, se necessário.
  11. Centrifuga os tubos em 200 g de x em uma centrífuga por 2 min em temperatura ambiente e descartar o sobrenadante.
  12. Encher o tubo com frio EtOH, misturar a solução com um reaccional por 1 min e repita o passo 2.10-2.11.
  13. Adicionar 25 mL de água desionizada estéril, misturar a solução com um reaccional por 1 min, proceda à sonicação (> 20 kHz) por 1h e incubar a 4 ° C durante a noite.
  14. Coloque a solução em um freezer-80 ° C por 15 min ou até congelado ou flash congelamento em nitrogênio líquido.
    Atenção: Ao usar nitrogênio líquido, use luvas de proteção, uma máscara e um avental.
  15. Gelo seco o tubo (abaixo de 0,1 mBar e -30 ° C) por 24-48 h até um pó de neve, como é produzido.
  16. Neste ponto, teste a amostra para a pureza através de 1H da ressonância magnética nuclear, onde a quantidade de prótons de metacrilato (picos em 6.1 e 5,6 ppm), em relação a prótons metílicos (1,9 ppm), na espinha dorsal HA pode ser confirmada. Um rácio mínimo de 95% de metacrilato de prótons de metilo é aceitável. 69

3. gel formação e encapsulamento 3D65

  1. Lamela e preparação de molde
    1. Fazer uma solução de água 50 mL de água destilada de 2% 3-(trimetoxissilil) metacrilato de propilo em um tubo de centrifuga conico de 50 mL.
    2. Coloque as lamelas de vidro 18mm em solução e rock por 1h à temperatura ambiente. Até 50 lamelas podem ser adicionadas ao mesmo tempo.
    3. Enxague as lamelas serialmente mergulhando cada 3 copos de 100 mL de água desionizada.
    4. Seque as lamelas no vácuo a 40 ° C durante a noite com um dessecador e forno.
    5. Mergulhe rapidamente as lamelas individuais em 70% EtOH com fórceps.
    6. Sem secagem, gota cada lamela num poço de uma placa bem 12.
    7. Lave e aspire a cada poço com água desionizada estéril (1 mL por bem).
    8. Adicione 1 mL de estéril 2 µ g /mL poli-L-lisina (PLL) a cada poço e incubar durante > 2 h.
    9. Aspirar a solução PLL e permitir as lamelas ao ar seco.
    10. Mergulhe o polydimethyl moldes siloxano (PDMS) (ver Figura 1) em 70% EtOH e coloque um em cima do centro de cada lamela e deixar secar ao ar e criar uma vedação entre o molde e o vidro.
      1. Prepare moldes PDMS, lançando os reagentes de pré-mistura PDMS na proporção de 10:1 em um prato fundo chato de poliestireno. A quantidade de PDMS preparado é selecionada para produzir uma folha de aproximadamente 1 mm de espessura. Para poços de formulário em PDMS, cortar as folhas com um soco de círculo com um diâmetro interno de 10.
  2. Preparação da pilha
    Nota: Todas as etapas do protocolo são realizadas com técnica estéril em uma armário de biossegurança. Solução tamponada fosfato salina (PBS) é ajustada para pH 7,4 para todas as etapas.
    1. 24 h antes do encapsulamento de célula em HAMA, refrescar o meio para as culturas primárias de 2 semana (da etapa 1.15) nas 12 placas bem. Adicionar 1 mL de DMEM/F12 (10% FBS e 1% PS) médio por bem.
    2. Para cada placa de 12 células prepare 12,5 mL de tripsina diluída (0,25% do trypsin-EDTA diluído a 30% com mídia DMEM/F12) e 25 mL DMEM/F12 (10% FBS e 1% PS) e quente na 37 ° C em banho-maria.
    3. Coletar meio condicionado de placas usando uma pipeta sorológica 10ml (> 0,5 mL por bem), cuidadosamente Aspire o líquido restante e substituir com 1ml por alvéolo de tripsina diluído (0,075% do trypsin-EDTA) por 20-30 min em uma incubadora (37 ° C, 5% CO2) até a camada de células confluente desanexa da placa.
    4. Recuperar material de células suspensas com uma pipeta de 1 mL (aparece como uma única peça flutuante) e recolher em um tubo de centrifuga conico de 15 mL. Diluído com uma quantidade equivalente de DMEM/F12 (PS FBS e 1% 10%) e centrifugar 200 x g por 2 min à temperatura ambiente, descartar o sobrenadante.
    5. Ressuspender o sedimento celular em 10 mL quente DMEM/F12 (10% FBS e 1% PS), Triture as células 5 vezes com uma pipeta de 10 mL e centrifugar a 200 x g por 2 min.
    6. Decante o sobrenadante, re-suspender as células em 5 mL quente DMEM/F12 e transferir as células para um tubo de centrifuga conico de 50 mL.
    7. Utilizando uma seringa de 10 mL com uma agulha de 18 calibre, Triture a solução da célula 3 vezes e filtrar a suspensão através de uma peneira de célula de 40 µm para um novo tubo de centrifuga conico.
    8. Coletar 10 µ l de suspensão de células, diluir 1: 100 em DMEM quente/F12 e contagem de células com um contador de célula automatizada
    9. Incube em banho maria a 37 ° C até a etapa de encapsulamento.
  3. Encapsulamento de célula
    Nota: Todas as etapas do protocolo são realizadas com técnica estéril em uma armário de biossegurança.
    1. Para cada placa de 12 do 3D hidrogel quente 12,5 mL de DMEM/F12 e 12,5 mL de DMEM/F12 condicionada mídia coletada durante a preparação da célula.
    2. Pesar a quantidade de ácido hialurônico methacrylated (HAMA) necessário para uma concentração final de 0.5% wt/Vol. dissolver este HAMA em PBS estéril de filtrado com uma concentração de (2% wt/vol); uma concentração de 4 vezes maior do que a concentração final é utilizada para acomodar a adição de células e outros reagentes. Um prato bem 12 de hidrogel requer ~ 350 µ l PBS com 7 mg HAMA.
    3. Proceda à sonicação (> 20 kHz) soluções até HAMA é totalmente dissolvido por 60 min.
    4. Prepare soluções individuais de 10% de trietanolamina (TEA) e 1-vinil-2-pirrolidona (NVP) e uma solução de 1 mM de eosina Y (EY) em alíquotas de 1 mL de pH de PBS estéril 7,4.
    5. Para uma 12 placa bem, faz uma mistura final 1,4 mL de 1 x 107 células, 0,5% wt/vol HAMA (350 µ l de 2% wt/vol), 0,1% chá (14 µ l de 10%), 0,1% NVP (µ l 14 de 10%,) e 0,01 mM EY (14 µ l de 1 mM) e 20% mistura de lâmina basal (280 µ l de estoque). O volume restante é PBS.
    6. Misturar a solução e pipetar 100 µ l em cada molde PDMS com uma ponta de 1 mL.
    7. Expor amostras para uma luz de LED de alta intensidade verde (~ 520 nm, 60 mW, em uma fechado 20 x 20 cm x 20 caixa cm) por 5 min à temperatura ambiente.
    8. Adicione 1 mL por poço de quente condicionado DMEM/F12 para um prato bem 12.
    9. Segure cada lamela entre o polegar e o indicador, lentamente Retire o molde PDMS com pinça curvada, tomando cuidado para não deslocar o gel e colocá-lo em um poço com meio condicionado.
    10. Adicionar um adicional 1ml quente DMEM/F12 para cada poço.
    11. Incube as placas a 37 ° C com 5% de CO2 por 2 semanas, refrescante mídia celular toda semana por pipetagem 1ml de mídia de cada poços e substituindo com 1 mL DMEM/F12.

4. microscopia

  1. Imunocitoquímica
    Nota: Um microscópio confocal invertido foi usado para estas amostras de imagem e ImageJ foi usado para processar e exibir as imagens. Microglia, astrócitos, oligodendrócitos e núcleos, serão rotulados após 3 semanas na cultura de HAMA.
    1. Pré-aqueça o tampão PBS formol a 10% (pH 7.0) em um banho de 37 ° C.
      Atenção: Apesar de formol pode ser usado fora uma coifa, este material é reativo com tecido e deve ser tratar com cuidado e luvas sempre. Deve ser dispose separadamente.
    2. Aspire cuidadosamente com mídia de placas e Pipetar 1 mL de formol a 10% a cada poço.
    3. Incube as placas a 37 ° C em um 5% de CO2 por 20 min.
    4. Aspire o líquido de cada prato, Pipetar 2 mL de PBS (pH 7,4) em cada poço e incube por 15 min.
    5. Repita a etapa 4.1.4 duas vezes.
    6. Aspire o líquido das placas, adicione 1 mL por alvéolo de PBS com 10% de soro de cavalo normal (NHS) e 0,5% triton X-100 e agitar suavemente a uma velocidade mínima) por 1h.
    7. Repita a etapa 4.1.4 três vezes.
    8. Aspire o líquido e adicionar 1 mL por bem da seguinte mistura em PBS: coelho ionizado cálcio ligadora adaptador molécula (Iba1) 1:1, 000, frango proteína fibrilar glial (GFAP) 1:5, 000, mouse 2', 3'-cíclico-nucelotide 3'-phophodiesterase (CNPase) 1:1, 000, 1% NHS , e 0.1% celular surfactante perfurantes. Incube a 4 ° C durante a noite, a placa de balanço mais suavemente possível.
    9. Repita a etapa 4.1.4 três vezes com a incubação do 1h no meio.
    10. Aspire o líquido e adicionar 1 mL por bem da seguinte mistura em PBS: 647 nm animado burro anticorpo anti-1: 200, 546 nm animado cabra anticorpo antifrango 1: 200, 488 nm animado burro anticorpo anti-rato 1: 200, 1% do NHS, 1:1,000 azul mancha nuclear. Incube a temperatura ambiente durante 1 h, agite-o suavemente a placa.
    11. Repita o passo 4 três vezes com a incubação do 1h no meio.
    12. Para preservar o hidrogel, Aspire o tampão e mergulhe-os em 0,5 mL de meio de montagem da célula de 1 min. pipeta para fora o meio de montagem e coloque delicadamente uma lamela em cima do gel, criando uma camada entre o vidro. Adicione uma pequena quantidade de meio de montagem para o lado descoberto das lamelas para impedir a secagem do hidrogel.
      Nota: Para solução de problemas, géis podem ser fotografadas no passo 4.1.11. para ver a rotulagem adequada antes de processamento adicional.
  2. Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
    Nota: Para visualizar o hidrogel, um microscópio eletrônico de varredura foi usado para estas amostras de imagem.
    1. Pré-aquece uma mistura fixador de paraformaldeído de glutaraldeído e 2% de 2,5% em PBS (0,1 M) em banho maria a 37 ° C.
      Atenção: Estes reagentes são altamente reativos com tecidos e devem ser manuseados com cuidado e luvas. Deveriam ser tratadas em uma coifa, tanto quanto possível e eliminados separadamente.
    2. Aspire o meio das placas de cultura de células e adicionar 1 mL da mistura fixador pré-aquecido.
    3. Incube as placas a 37 ° C em um 5% de CO2 por 20 min.
    4. Coloque as placas em 4 ° C (geladeira/refrigerador) durante a noite.
    5. Aspirar a solução fixador dos poços e adicione 1 mL de PBS.
    6. Aspire o líquido de cada prato, adicione 2 mL de PBS em cada poço e incube por 15 min.
    7. Repita a etapa 4.2.6 mais duas vezes.
    8. Aspirar a PBS e adicionar 1 mL de tetróxido de ósmio 1% tamponado em PBS a cada poço.
      Nota: Até amostras são secas, esta etapa e todas as etapas subsequentes são realizadas em uma coifa.
    9. Permitir a fixação de ocorrer para vapor de ósmio de 30 min. de líquido pode corrigir outras amostras no mesmo prato; Portanto, particionar amostras em conformidade antes desta etapa.
      Cuidado: Tetróxido de ósmio é altamente reativo com tecido e volátil. É perigoso e deve ser tratada na coifa com luvas. - E qualquer imediato lavados deve ser descartado separadamente.
    10. Repita a etapa 4.2.6 três vezes.
    11. Aspire o líquido e adicionar as misturas desidrata na lista abaixo, em ordem e incubar (temperatura ambiente) durante o tempo indicado. Comece adicionando gradualmente etanol (EtOH) seguido então hexamethyldisilazane (HMDS). Consulte a tabela 2 para cada incremento.
      Nota: Ao adicionar HMDS, as lamelas podem fortemente aderir ao plástico e tornar-se muito difíceis de remover. Isto pode ser evitado, colocando uma pequena plataforma de plástico sob o deslizamento de vidro após a primeira aplicação do HMDS. Após a segunda incubação de EtOH, a amostra pode ser retirada e extinto em nitrogênio líquido, por alguns segundos para congelar a fratura da amostra.
    12. Cuidadosamente retire as amostras secas e montar as amostras em stubs de microscópio eletrônico de varredura com fita dupla face condutora.
    13. Por pulverização catódica revestir as amostras com uma quantidade mínima de ouro. Colocar as amostras em um suporte e operar a máquina por 2 min em 15 mA.

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Representative Results

Para modelar a resposta do hospedeiro de tecido neural e a cicatriz glial em uma alta taxa de transferência, sistema in vitro requer um andaime celular 3D com um material de matriz que é biocompatível e não incorrer em um evento citotóxico durante formação em situ é modificável com componentes bioativos para guiar a resposta benevolente. Para este efeito, temos criado um sistema de andaime celular 3D à base de ácido hialurônico e encapsulado uma população principal célula glial mista para estudar interações célula-célula e bioreactivity glia. Realizou-se um breve estudo visual de células e andaimes. Morfologia de subpopulações de células, incluindo os oligodendrócitos (CNPase em verde), microglia (Iba1 em vermelho), e astrócitos (GFAP em amarelo), são mostrados pela microscopia confocal de imunofluorescência (Figura 3Ai-ii-Ci-ii). Morfologia de andaime e célula combinada também são mostrados pelo SEM (Figura 3Aiii-iv - Ciii-iv). Nestas imagens, tanto baixa (i e iii) e alta (ii e iv) resolução imagens representativas são mostradas. Um revestimento de lamela PLL 2D (Figura 3A) foi comparado com um 3D 0,5% w/v HAMA andaime (Figura 3B) e uma mistura de mistura de lâmina basal 20% v/v em 0,5% w/v HAMA (Figura 3). Isto foi feito para demonstrar as diferenças morfológicas em 2D e cultura de células 3D, bem como o efeito da introdução de uma lâmina biológica para o cadafalso. Uma reconstrução 3D também está disponível na informação suplementar.

Morfologia celular de cada tipo de célula que mudou com a introdução de uma plataforma 3D. Em 2D cultura aderente (lamelas de vidro revestido PLL), oligodendrócitos apareceram normalmente redondos e formadas redes pequenas geralmente conectando com levemente rotulado GFAP processos. Microglia foram menor do que as outras células e tinha pequenos processos de ramificação que não se estendem longe de seus corpos celulares (< 20 µm). Astrócitos foram mais diversamente moldados, alguns tendo uma morfologia radial com menores corpos celulares e processos finos, ramificação extensivos, enquanto outros eram fibrosos com uma aparência achatada e alguns processos amplos que revestir a superfície. Na cultura de HAMA 3D, oligodendrócitos apareceram em clusters tendo ramificou-se para esferas menores. Microglia eram redondos com alguns processos, e astrócitos foram arredondados ou ramificou-se radialmente para redes de um único cluster. Geralmente, estas células apareceram outgrown de pontos únicos ou permanecer em áreas de a HAMA sem fazer contato com outras células, que é ao contrário da cultura 2D e é sugestivo de mobilidade limitada pela matrix. Quando 20% v/v de uma mistura de lâmina basal foi adicionado à mistura de foto-polimerização, todos os subtipos gliais integrada com a plataforma 3D e formaram a mais extensas, interativas estruturas ramificadas. Oligodendrócitos estendido bulbosos processos radialmente semelhantes para as morfologias de mistura de lâmina basal-não, mas além disso apareceram para estender processos junto as finas redes interconectadas de processos astrocyte, ramificando-se em todo o andaime. Microglia foram dispersadas entre estas redes de celular, tendo espalhar com mais consistente com sua morfologia em tecido fino processos. Em geral, as morfologias sugerem que todos os três tipos de glia integrado na mistura de lâmina basal-HAMA livremente, potencialmente através de qualquer aumento da aderência ao substrato misto ou através de maior capacidade de remodelar o andaime.

Quando observado por SEM, morfologia celular foi vista a corroborar as micrografias confocal. A matriz de HAMA apareceu como uma superfície lisa com 10-50 µm poros vistos ligeiramente abaixo da superfície. As células foram aderentes à superfície da HAMA e também eram fracamente visíveis nas camadas abaixo. Estes glia não formou morfologias comparáveis àquelas observadas na cultura 2D, porém com a adição de uma mistura de lâmina basal, observou-se extensa rede. Fibras grossas astrocyte, com clusters menores de micróglia observaram-se tanto sobre a superfície de mistura de lâmina basal-HAMA e estendendo-se através da matriz de forma perfeita. Isto pode ser visto de forma fraca, como a matriz dobrada ao redor das células, sugerindo que as células podem estar alterando o andaime para formados em suas conformações desejadas.

Figure 1
Figura 1: esquemático de ácido hialurônico methacrylated (HAMA)-com base em protocolo de cultura e fotopolimerização de célula 3D. Células gliais (cultura de cérebro de rato primária 2 semana) são misturadas com HAMA e pipetadas em um molde de polidimetilsiloxano (PDMS) sobre uma lamela de vidro. Esta mistura é exposta a uma luz de LED de alta intensidade verde para polimerizar o hidrogel por 5 min. O molde é removido e o gel é incubado em mídia. Células representativas incluem microglia (vermelho), (amarelos) astrócitos e oligodendrócitos (verde). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: dissecação do cérebro de filhote de rato de Sprague Dawley 1 dia. Imagens do cérebro inteiro (A), a dissecação dos córtices e cerebelo (B), um único córtex com meninges (C), peeling das meninges com fórceps (D) e o córtex meninge-livre (E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Imunofluorescência confocal (i-ii) e digitalização micrografias de elétron (iii-iv) de populações de células glia misto em revestimentos PLL 2D (A), HAMA (B) e mistura de lâmina basal de HAMA (C). Inferior (i, iii) e superior (ii, iv) ampliação de imagens é mostradas. Rótulos incluem Iba1 em vermelho para microglia, GFAP em amarelo para uma mancha nuclear Hoechst, CNPase em verde para oligodendrócitos e astrócitos. Escala de barras = 25 µm para imagens confocal e (iii) de 50 e 20 µm (iv) para digitalização de micrografias de elétron. Hidrogel eram 0,5% p/v, e mistura de lâmina basal foi de 20% em volume. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Suplementar Figura 1: reconstrução 3D de imunofluorescência MICROGRÁFICO de mistura de lâmina basal-HAMA com misturado populações de células da glia mistura de lâmina basal-HAMA. Rótulos incluem Iba1 em vermelho para microglia, GFAP em amarelo para uma mancha nuclear Hoechst, CNPase em verde para oligodendrócitos e astrócitos. Hidrogel eram 0,5% p/v, e Getrex foi de 20% em volume. Clique aqui para baixar este arquivo.

HAMA Lâmina basal NVP CHÁ EY
Concentração de trabalho 0,5% w/v 20% v/v 0,10% 0,10% .01 mM
Placa de 12 2% p/v 100% w/v 10% v/v 10% v/v 1 mM
Total de 1,4 mL 350 Μ l Μ L 280 Μ L 14 Μ L 14 Μ L 14

Tabela 1: Exemplo de encapsulamento da célula.

Componente de Conteúdo Tempo de incubação
EtOH 30% 30 min
EtOH 50% 30 min
EtOH 70% 30 min
EtOH 90% 20 min
EtOH 100% 20 min
EtOH 100% 20 min
EtOH:HMDS 75:25 20 min
EtOH:HMDS 50:50:00 20 min
EtOH:HMDS 25:75 20 min
HMDS 100% 20 min
HMDS 100% Durante a noite

Tabela 2: Incrementos graduais de EtOH e HMDS na desidratação.

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Discussion

Com o objectivo de gerar um sistema de cultura 3D para modelo bioreactivity gliais e o processo de cicatrização glia, nós desenvolvemos um sistema que pode oferecer suporte primário microglia culta, astrócitos e oligodendrócitos e permite a caracterização robusta de célula interações morfologia e célula-célula. Das micrografias mostradas, a morfologia de cada tipo de célula foi distintamente diferente com plataformas de mistura lâmina HAMA-Basal de 2D, 3D-HAMA e 3D. No sistema 2D, morfologia distintamente era inclinada ao longo do plano da superfície, mas quando comparado com o 3D HAMA, microglia e astrócitos eram geralmente menores dentro da matrix, com excepção dos clusters de oligodendrocyte. Em micrografias de elétron a digitalização, as células eram geralmente mais redondo em forma de sobre a HAMA. Isto pode ser em grande parte devido as células serem encapsuladas, com capacidade limitada para modificar a matriz para a locomoção e a livre circulação e crescimento de processos. Consequência de célula em a HAMA foi tipicamente radial para astrócitos e oligodendrócitos. Enquanto estas células processos estendidos, sua organização sugerem que limitava seus movimentos ao longo da matriz e a capacidade de interagir com outras células. Além disso, trabalho anterior mostrou-se congelar-fraturou HAMA ser poroso sem redes interconectadas, que podem explicar esta falta de consequência65,70. É possível que algumas dessas células não sobreviveu a fotopolimerização, permanecendo preservado na matriz, no entanto, viabilidade foi avaliada sistematicamente em nosso anterior funciona e manteve-se ao longo de uma semana6580% (0,5% p/v).

Para melhorar a interação da célula com a matriz na cultura 3D, introduzimos uma mistura de lâmina basal como um componente da matriz biocompatível e modificável. Integração de células com a matriz foi encontrada para ser consideravelmente melhorada, com todos os tipos de célula, mostrando extensivos processos em comparação com a cultura 2D e 3D HAMA. A mistura de lâmina basal é composta por uma variedade componentes de lâmina basal e principalmente é formulada para suportar glia diferenciação de células-tronco neurais precursores71. Não foi inesperado que as células gliais responderam com a mistura de lâmina basal e posteriormente a matriz circundante 3D, mas o nível de integração sugere um ambiente semelhante ao tecido saudável. Comparando-se à mistura de lâmina basal-HAMA HAMA, a morfologia de hidrogel não aparecer distintamente diferente, portanto as células podem ser mais ativamente remodelação. Considerando a simplicidade da adição deste componente Bioativo, não é inimaginável usar diferentes dos podócitos e/ou sugestões de proteína para favorecer as condições de cultura para os neurônios. No sentido de futuro potencial, este sistema poderia ser usado para diferenciar os neurônios dos progenitores neurais em conjunto com glia misto para uma variedade de mielinização impactante ou modelos de lesões neuro-inflamatória.

Em caso de lesões de CNS de graves e prejudiciais ou rejeição de biomaterial, o tecido residente inicia reações inflamatórias capazes de agravar a neurodegeneração e desmielinização. Isto normalmente resulta na formação de uma cicatriz glial particionar o local da lesão, o que impede a regeneração. Neste estudo, os métodos foram detalhados para um methacrylated foto-polimerizado à base de ácido hialurônico 3D andaime com a intenção de modelar a resposta celular inicial por trás da formação de cicatriz glial; microglial reatividade, recrutamento de astrocyte e hipertrofia e lesão oligodendrocyte e retirada. Um andaime de célula 3D foi projetado para incorporar todos os três tipos de células gliais e ainda mais foi modificado com uma mistura de multi-componentes lâmina basal. Foi determinado, por microscopia confocal e digitalização de imagem, isso que as células foram encapsuladas em a HAMA e melhor foram capazes de integrar quando a mistura de lâmina basal foi introduzida. Esses resultados podem levar a diversas aplicações de romance. HAMA sozinho pode servir para criar sistemas de co-cultura onde a intenção é limitar a interação célula a célula ou estudo destilar entrega de drogas usando o gel como uma matriz limitada difusão carregado de drogas. Hidrogel incorporando a mistura da lâmina basal para a matriz de HAMA permite um ambiente semelhante ao tecido mais consistente capaz de inflamação aguda, gliose ou cicatrizes gliais de modelagem e permite ainda mais elevado-throughput caracterização da glia bioreactivity para implantes, desenvolvimento de drogas e dispositivo e outras estratégias para reduzir e recuperar de lesões inflamatórias.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Os autores estão gratos pelo apoio financeiro do NSERC, CFI, AIHS, serviços de saúde de Alberta e a doação de Davey para a pesquisa do cérebro.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Materials for HAMA synthesis and photopolymerization
Hyaluronic acid (HA) Sigma-Aldrich 53747-10G Streptococcus equi, MW: 1.5 - 1.8 X 10^6
Methacrylic anhydride (MA) Sigma-Aldrich 275585-100ML
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 221465-25G
Ethanol (EtOH) Commerical Alcohols Inc. Anhydrous
Phosphate buffered saline (pH 7.4) tablets Fisher Scientific 18912014
Triethanolamine (TEA) Sigma-Aldrich 90279-100ML
1-Vinyl-2pyrrolidinone (NVP) Sigma-Aldrich V3409-5G
EosinY (EY) Sigma-Aldrich E6003-25G
Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate Sigma-Aldrich 440159-100ML
Beaker (100 mL) Corning 1000-100
Beaker (500 mL) Corning 1000-600
pH paper (Labstick) Sigma-Aldrich 9580
Name Company Catalog Number Comments
2. Materials for glial cell isolation and cell culture
P1-2 Sprague Dawley rat pups Charles River CD Sprague Dawley rat strain code 001
Dissector scissors - slim blades (small) Fine Science Tools 14081-09
Surgical scissors - Toughcut (large) Fine Science Tools 14130-17
Fine forceps (Dumont #5) Fine Science Tools 11521-10
Curved fine forceps (Dumont #7) Fine Science Tools 11271-30
Hank's balanced salt solution (HBSS) Gibco 14170-112
Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) Gibco 11320-033
Penicillin-streptomycin (PS) Gibco 15140-122
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 12483-020
0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Gibco 25200-072
Poly-L-lysine (PLL) Sigma-Aldrich P-6282
50 mL conical centrifuge tube Fisher Scientific 05-539-13
15 mL conical centrifuge tube Fisher Scientific 05-539-5
12 well Tissue culture treated plates (Cellstar) Greiner Bio-One 665 108
10 mL serological pipette Fisher Scientific 13-676-10F
25 mL serological pipette Fisher Scientific 12-676-10K
Petri dish (60 mm X 15 mm) Fisher Scientific FB0875713A
Petri dish (100 mm X 15 mm) Fisher Scientific FB0875712
Microscope Coverslip (18 mm) Fisher Scientific 12-545-100 18CIR
Name Company Catalog Number Comments
3. Materials for microscopy (confocal and scanning electron microscopy)
Mouse monoclonal anti-CNPase abcam ab6319
Rabbit anti-Iba1 Wako Laboratory Chemicals 019-17741
Chicken anti-GFAP abcam ab4674
Hoechst 33342 Fisher Scientific 62249
Fluoromount-G Fisher Scientific 00-4958-02
Formalin Sigma Aldrich HT501128-4L Buffered (10%)
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
Horse Serum Gibco 16050-122
Paraformaldehyde Electon Microscopy Sciences 157-8 Buffered (8%)
Guteraldehyde Electon Microscopy Sciences 16019 Buffered (8%)
Osmium tetraoxide Electon Microscopy Sciences 19152 Buffered (2%)
Hexamethyldilazane (HMDS) Electon Microscopy Sciences 16700
Ethanol (EtOH) Electon Microscopy Sciences 15055 Anhydrous
Microscope Slide (25 X 75 X 1 mm) VWR International 48311-703

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Melhorado o hidrogel 3D culturas de células gliais primárias para <em>In Vitro</em> modelagem de Neuroinflammation
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Koss, K. M., Churchward, M. A.,… More

Koss, K. M., Churchward, M. A., Jeffery, A. F., Mushahwar, V. K., Elias, A. L., Todd, K. G. Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (130), e56615, doi:10.3791/56615 (2017).

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