Summary
该协议概述了一种新的方法, 以建立一个空间详细的有限元模型的细胞内体系结构的电子显微镜和共焦显微图像。通过对钙信号和生物能学的案例研究, 证明了这个空间细节模型的威力。
Abstract
随着三维 (3D) 成像技术的出现, 如电子层析成像、串行块面扫描电子显微镜和共焦显微术, 科学界在亚微米上对大型数据集有前所未有的访问权。在健康和疾病中伴随心肌细胞功能变化的结构重塑的分辨率。然而, 这些数据集已被用于研究细胞结构重塑在心肌功能中的作用。本协议的目的是概述如何使用高分辨电子显微镜和共焦显微图像, 建立一个精确的心肌细胞有限元模型。一个详细和准确的细胞结构模型有很大的潜力, 提供新的洞察力的心肌生物学, 比单独的实验可以获得。这种方法的威力在于它能够从两种不同的心肌细胞超微结构成像模式中融合信息, 从而形成一个统一的、详细的心肌细胞模型。本协议概述了将成人雄性大鼠心肌细胞的电子层析成像和共焦显微图像整合的步骤 (名称为特定品种的白化大鼠), 以建立一个半小节有限元心肌模型。该过程生成一个3D 的有限元模型, 其中包含一个精确的, 高分辨率的描述 (35 nm 的顺序) 的分布线粒体, 肌原纤维和兰尼碱受体簇, 释放必要的钙的心肌细胞收缩从肌网状网络 (SR) 入肌原纤维和胞浆室。此处生成的模型不包含横向小管结构或肌网状网络的细节, 因此是心肌细胞的最小模型。然而, 该模型已经被应用于基于模拟的研究中的细胞结构在钙信号和线粒体生物能学的作用, 这是说明和讨论使用两个个案研究, 提出以下详细的协议。
Introduction
心脏的励磁收缩耦合 (ECC) 是指心肌细胞膜的电刺激与细胞在每次心跳过程中随后的机械收缩之间的重要而复杂的耦合。数学模型在发展对相互关联的生物化学过程的定量理解方面发挥了关键作用, 这些进程调节了动作电位1、胞浆钙信号2、生物能学3 以及随后的收缩力的产生。当其中一个或几个生化过程发生改变时, 这些模型也成功地预测了心跳的变化4,5。心肌细胞的高度组织超微结构越来越被认为对正常收缩功能和整体心脏起着关键作用。事实上, 心脏超微结构成分的形态学和组织的变化与疾病条件的生物化学变化 (如肥厚6、心力衰竭7和糖尿病心肌病8) 平行发生。无论这些结构变化是轻微的, 适应性, 或病理反应变化的生物化学条件仍然很大程度上未知的9。生物学中形式和功能之间固有的紧密耦合意味着实验研究不能比结构重塑和心肌细胞功能之间的相关性提供更深的洞察力。新一代的数学模型可以将子细胞成分的结构组装, 连同经过研究的生物化学过程结合起来, 对关系进行全面、定量的理解是必要的。在心肌细胞的结构、生物化学和收缩力之间。该协议描述了可用于生成结构精确的心肌细胞有限元模型的方法, 可用于此类调查。
过去十年在3D 电子显微术10、共焦11和超分辨率显微镜12上取得了重大进展, 为纳米尺度和微尺度组装提供了前所未有的高分辨率洞察力。心肌细胞的分胞成分。最近, 这些数据集被用来生成心肌细胞超微结构的计算模型13,14,15,16。这些模型使用了一个已建立良好的工程模拟方法, 称为有限元方法17, 以创建有限元计算网格的生物化学过程和心肌收缩可以模拟。但是, 这些模型受显微镜方法可以在图像数据集中提供的分辨率和细节的限制。例如, 电子显微学可以生成纳米级的细胞结构细节, 但很难确定图像内的特定蛋白质, 这将是必要的创建模型。另一方面, 超分辨率光学显微术可以提供高对比度图像在分辨率上的 50 nm 的顺序只有一个选择少数分子成分的细胞。只有通过将互补信息与这些成像方式相结合, 才能切实地探索功能对结构变化的敏感性。相关光和电子显微术仍然不是一个常规的程序, 它仍然会受到限制, 只有有限数量的成分可能被染色在免疫荧光的观点, 并与电子显微镜的看法相关联。
此协议提供了一种新的方法18 , 使用统计方法19分析和计算保险丝光显微学信息关于离子通道的空间分布的电子显微镜信息在其他心脏超微结构成分, 如肌原纤维和线粒体。这产生了一个有限元模型, 可用于生物化学过程的生物物理模型, 以研究心肌细胞分胞组织对调节心肌细胞收缩的生物化学过程的作用。例如, 该协议可用于建立健康和链脲佐菌素诱导的糖尿病心肌细胞模型, 研究结构重塑对糖尿病动物模型中观察到的心肌细胞功能的影响8。该方法还说明了该方法的统计性质的另外一个优点: 该法能产生多实例的有限元几何, 它可以密切模仿实验观察到的细胞结构变化。
作为一项概述, 协议步骤包括: (一) 制备用于电子显微术的心脏组织, 生成具有足够分辨率和对比度的3D 图像;(二) 使用3D 电子显微重建和图像分析软件 (称为 IMOD20) 重建和分割3D 图像栈, 从电子显微镜数据中提取;(iii) 使用 iso2mesh21生成使用分段数据作为输入的有限元网格;(iv) 利用新的算法和编码将离子通道的分布映射到有限元网格上。
在议定书内概述了每一步骤的方法的前提, 并在所附数字中提供了代表性的结果。概述了如何使用生成的空间详细模型来研究在 ECC 中钙的空间动力学, 以及线粒体生物能学。讨论了该议定书目前的一些局限性, 以及正在进行的新的发展, 以克服这些限制, 并进一步促进对细胞结构在心脏系统生物学中的作用的定量理解。还讨论了如何将这些方法推广到其他细胞类型的有限元模型中。
如果用户能够访问预先存在的电子显微图像栈, 则此协议的使用者可能跳过步骤1和步骤2的重建部分。有意与更有经验的电子 microscopists 合作获取其数据的用户可能希望与专家讨论和比较步骤1中的固定和染色程序, 以确定最佳的获取协议。
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Protocol
这里所描述的所有方法都得到了奥克兰大学动物伦理委员会和加利福尼亚大学圣地亚哥机构动物护理和使用委员会的批准, 组织协议最初是在那里制定的。
1. 实验准备
- 根据表 1, 在 pH 值为7.4 的情况下, 准备0.15 米和 0.3 m 钠常使用缓冲器的库存解决方案。
-
使用表7.4 中列出的组件, 将戊二醛固定剂 (2% 多聚甲醛 (粉煤灰) + 2.5% 戊二醛 + 0.2% 单宁酸在0.15 米钠常使用缓冲液中 pH 1)。
- 将2克的粉煤灰粉溶于20毫升的蒸馏水中, 在60摄氏度的加热板上连续搅拌。
- 添加1米氢氧化钠溶液, 直到解决方案明确。
- 等到溶液的温度低于40摄氏度, 然后加入10毫升戊二醛和20毫升的0.3 米常使用钠。
- 加入0.2 克丹宁酸, 溶解于溶液中。
- 加入50毫升的0.15 米常使用钠。
- 储存三或四20毫升的固定在冰箱中的固定剂在4摄氏度, 或在冰上, 如果在同一天使用。
- 根据表 1中的食谱, 准备 Tyrode 的 20 mM 23 butanedione 肟 (BDM) 的解决方案。
-
在通风柜内构造一个 Langendorff 装置。
- 夹紧两个100毫升塑料注射器管到两个不同的反击立场, 大约70厘米高从立场基地。
- 使用3毫米内径油管和三路旋塞阀连接塑料注射器管和连接器管,如图1所示。
- 适合3毫米外径套管的底部连接器油管, 其中心脏将被绑在灌注固定。
-
用 Tyrode 的溶液和固定液在37摄氏度填充注射器管。
- 通过通过注射器溶液, 去除油管内的气泡。
2. 获得心肌细胞超微结构的电子显微数据
- 准备动物的心脏切除和化学固定。
注意: 本协议详细介绍了处理成年男性的步骤 (名称为特定品种的白化大鼠) 大鼠心脏组织。当心脏组织来源于其他物种时, 该协议可能需要修改。- 麻醉动物通过腹腔注射治疗大鼠 (体重200-250 克), 0.5 毫升 250 U/毫升肝素。等待10分钟, 然后治疗大鼠腹腔注射戊巴比妥 (210 毫克/千克体重)。
- 通过测试脚趾捏反射来确认适当的麻醉程度。
- 宫颈脱位弄死动物。
- 用解剖程序来收割心脏类似于以前发布的朱庇特文章22,23, 然后将它放在冰冷的盐水中。
- 分离升主动脉和 cannulate。确保套管尖端位于半月阀的上方, 在那里冠状动脉分支关闭。将一根线紧紧地拴在上升的主动脉上。
- 将套管连接至重力驱动的 Langendorff 装置, 其操作在系统底座上方70厘米处 (图 1)。
- 拧 Langendorff 系统上的旋塞阀灌注心脏与 Tyrode 的解决方案, 包括20毫米 BDM (肌球蛋白抑制剂) 2-3 分钟。
- 拧旋塞阀开始灌注与固定剂2% 多聚甲醛, 2.5% 戊二醛, 0.2% 单宁酸在0.15 米钠常使用在37°c 10 分钟。如果成功, 心脏将变淡褐色并且变得僵硬和橡胶。
- 使用刀片, 解剖组织块从左心室 (侧) 游离壁和获得组织块约1毫米3大小。
- 将样品存放在冰上的同一固定剂的预冷20毫升闪烁瓶中, 2 小时, 在瓶中储存尽可能多的样品, 并确保样品在溶液中被淹没。
注意: 在下面的100% 脱水步骤之后保持样品的冷是很重要的。
- 电子显微镜样品的进一步固定和染色。
- 在玻璃烧杯中倒入100毫升的0.15 米常使用钠缓冲液, 在冰上冷却。
- 准备等量的4% 锇毒气和 0.3 M 钠常使用, 其次是添加0.08 克钾盐, 使一个重金属染色溶液含有2% 钾盐在2% 锇毒气和0.15 米钠常使用。在冰上冷却溶液。
- 将固定器取出, 用足够冷的 0.15 M 钠常使用缓冲液将其替换成瓶子中的浸泡样品。把瓶子放在冰上5分钟。
- 重复步骤2.2.3 四次, 0.15 米常使用钠去除多余的固定剂。
注意: 不要使用玻璃吸管, 因为微小的碎片可以进入样品, 并可以破坏钻石刀在组织块切片。在将冰的所有解决方案添加到样品之前, 先冷却所有的溶液是很重要的。同样重要的是, 该样本始终保持在解决方案的所有时间 (很短的部分覆盖率持续不超过几秒钟, 可能会在解决方案交换期间短暂容忍)。在清洗或替换解决方案时, 在删除上一个解决方案后, 快速添加新解决方案。把闪烁的瓶子放在洗的冰间。请注意, 此步骤不是时间敏感, 如果需要, 组织块可以洗得稍长一些。 - 用冰冷重金属染色液取代常使用钠缓冲器, 并将其贮存在冰上过夜。用手摇动瓶子, 确保盐混合良好;解决方案应该变成黑色。
注意: 在执行此步骤时, 在油烟机中工作, 因为锇是有毒的。 - 稀释4% 水中醋酸铀 (UA) 库存解决方案 (表 1) 到2% 使用相同数量的库存 UA 溶液和双蒸馏水, 并冷却到冰上。
- 用冰冷却0.15 米常使用钠代替重金属染色, 并让样品在冰上孵化5分钟。
- 重复步骤2.2.7 四次冰上冲洗任何过量的重金属染色溶液。
- 将样品冲洗四次, 在纯净水之间进行2分钟的等待期 (双蒸馏足够)。
- 用冰冷2% 取代纯净水, 让样品在冰上孵化60-120 分钟。
- 冷却五20毫升的乙醇 (足以淹没样品) 冰, 将用于脱水步骤。六瓶在蒸馏水中乙醇的百分比增加了: 20%、50%、70%、90% 和100%。
- 将纯丙酮倒入另一20毫升闪烁瓶中, 与乙醇瓶一起冷却在冰上。
- 在纯净水中冲洗样品四次, 用2分钟的时间在冰上洗涤过量的 UA。
- 乙醇脱水样品。
- 冷乙醇系列脱水在样品瓶内连续更换溶液如下, 冰: 20% 乙醇为10分钟;50% 乙醇10分钟;70% 乙醇10分钟;90% 乙醇10分钟;然后两次在100% 乙醇10分钟。
- 转换样品到室温通过替换最后100% 乙醇与冷却的纯净的丙酮并且安置样品瓶在室温实验室长凳10分钟。
- 在室温下, 在纯丙酮中再进行10分钟的洗涤, 以去除瓶子内可见的凝结。在孵化时, 要组成丙酮/树脂溶液。
- 用50:50 纯丙酮和环氧树脂 (与制造商所说的环氧树脂元件的比例) 替换瓶中的纯丙酮。使用同一批次中的所有组件。将树脂填充的样品瓶放在转子上过夜。
- 在树脂中嵌入样品。
- 用75% 树脂 (25% 丙酮) 代替50:50 树脂, 孵育3小时, 然后在室温下在100% 树脂中进一步孵化/浸润4小时。
- 用新鲜的100% 树脂取代100% 树脂, 并在一夜之间留下样品瓶, 以加深树脂进入组织样品的深度。
- 从瓶子里取出样品, 放在烤箱友好的容器里, 并放置一个平坦的底座;例如, 铝或银箔烘烤杯可用于此目的。
- 轻轻地倒 (以避免样品的位移) 新鲜树脂在样品 (因而嵌入样品在树脂) 和聚合树脂和样品在烤箱在60°c 为 48 h。
- 将树脂块重新定向到剖面上的图像单元。
- 从树脂块中获得1µm 厚的测试部分, 使用 ultramicrotome 与玻璃刀来评估单元方向24。
- 二十年代用1% 甲苯蓝和1% 硼砂染色厚的试验段。
- 在明亮的田野显微镜下检查肌肉细胞的方向。
- 根据从染色测试部分的图像推断出的方向, 重新定向纵向或斜向定向 (类似于图 2A) 树脂块, 以确保单元格暴露在玻璃刀上, 以便将其切割成剖面 (类似于图 2B)。
- 图像组织切片使用电子层析成像。
- 使用菱形刀获得调整后的组织块的半薄部分 (~ 300 毫微米), 并将剖面转移到铜网格25。
- 用 2% UA 和佐藤引线25着色厚剖面。
- 在25节的两侧应用胶体金粒子。
- 获取从-70 °到 +70 °25的单个或双轴倾斜序列投影图像的集合。
- 使用 IMOD20重建3D 图像栈 (一系列2D 图像, 提供单个电子层析切片的3D 信息) 的单元格。此重建堆栈将在下一步骤中进行分段。
3. 从 EM 3D 图像数据集中分割肌原纤维和线粒体区域
- 执行 IMOD 程序 "3dmod"。
- 在3dmod 图形用户界面中, 输入包含该单元格的3D 重建图像数据集 (在步骤2.7 中生成) 到标记为 "图像文件:" 的输入框中的 ". rec" 或 ". mrc" 文件的地址, 然后按 "确定"。
- 在 "文件" 菜单下, 选择 "新建模型", 然后使用适当的名称保存该文件, 方法是 "文件" 下的 "保存模型为"..。
注意: IMOD 中的对象可以包含构成 "对象" 的分段组件的集合。默认情况下, 新模型包含 id 为 "#1" 的新对象。 - 在 "特殊" 菜单下, 选择 "绘图工具"。这将打开一个类似于图 3A中所示的新工具栏。
注意: 有几种工具可用于在不同的细胞器边界周围创建轮廓。有关如何使用这些工具的更多帮助, 请在 IMOD20文档中找到。 - 在 "绘图工具" 菜单中选择 "造型" 选项, 然后将鼠标移到图像窗口;将出现一个以鼠标指针为中心的圆形轮廓。
- 通过在线粒体 (图像文件的较暗区域) 按住鼠标中键 (如图 3A中的绿色轮廓线分界所示), 将圆轮廓的周长拖到其边界的形状中。
- 一旦轮廓的线粒体边界完成, 释放中间按钮和重复步骤3.6 为每个线粒体在数据。每个轮廓将自动被 IMOD 识别为一个新的轮廓在同一对象内。
- 在 "编辑 |对象 "菜单中, 选择" 新建 "以创建新对象。这将自动递增一个对象的总数, 并将此数字分配给新对象。
- 重复步骤3.6 和3.7 以分割和保存肌原纤维轮廓。
- 重复步骤 3.8, 后跟步骤 3.6, 以分割单元格边界。
- 将模型文件保存在 "文件" 菜单下。
- 在命令行窗口中执行以下命令, 将每个对象分组转换为二进制掩码, 如图 4-c中所示。
- 从模型 "imodextract 对象 modelfile outputmodelfile" 中提取特定对象, 其中 "对象" 是要提取的对象的编号。
- 为该对象创建掩码: imodmop 掩码 255 outputmodelfile imagefile outputmask. mrc
- 将文件转换为 tif 堆栈: mrc2tif outputmask outputmask. tif
4. 从分段元件中创建有限元网格
- Iso2mesh 是一个自由可用的 MATLAB 程序, 将 TIFF 图像栈转换为体积四面体有限元网格。从 iso2mesh.sourceforge.net 下载并添加 iso2mesh 到 MATLAB 路径。
- 下载源代码和数据, 以模拟 RyR 集群在网格上从 github 网站 https://github.com/CellSMB/RyR-simulator。
- 启动 CardiacCellMeshGenerator MATLAB 应用程序 (图 5)。
- 使用 GUI 左上角的三按钮将不同的细胞器组件掩码加载到 MATLAB 中。
- 创建另一个二进制图像堆栈, 界定肌原纤维和线粒体之间的间隙,如图6A 所示。
- 打开 ImageJ。
- 使用文件 |打开对话框, 将肌原纤维和线粒体 tiff 堆栈加载到程序中。
- 通过选择 "过程 |" 来启动图像加法插件计算器加 "。
- 选择肌原纤维图像栈作为 i1, 将线粒体图像堆栈作为 i2, 并选择 "添加" 运算符。单击 "确定"。
- 在表示4.5.4 结果的新图像堆栈出现后, 选择 "编辑 |反转 "以生成类似图 6A的图像堆栈。
- 通过推送 CardiacCellMeshGenerator 程序上的 "RyRGapsFile" 按钮, 加载包含肌原纤维和线粒体之间间隙的二进制图像栈的文件。
- 在 GUI 上推送 "生成网格"。这将使用 "cgalmesh" 选项触发 iso2mesh 命令 v2m, 以生成与图 4E类似的四面体网格。在这个步骤的末尾将输出三个文件: 一个. 元器件文件、一个. 面文件和一个. 节点文件, 其中包含组成元素的节点列表、构成面孔的节点和节点的坐标。分别。
5. 将感兴趣的离子通道的空间变化密度数学映射到有限元网格上。
-
通过按下标签生成 RyR 模拟器输入的 GUI, 为 RyR 模拟器生成必要的输入。
注意: 该按钮将触发一个函数 generateRyRsimulatorInputs, 它使用步骤4中的以下信息生成输入:
(1) outDir: RyR 集群模拟所必需的输出文件的位置。
(2) imres: 图像栈三方向上的像素分辨率。
(3) myofibril_file: 包含二进制图像堆栈的文件, 如图 4B所示。
(4) sarcolemma_file: 包含二进制图像堆栈的文件, 如图 4A所示。
(5) ryrgaps_file: 包含二进制图像堆栈的文件, 如图 5A所示。- 执行此函数后, 检查是否在指定为 outDir 路径的目录中创建了以下文件:
- d_axial_micron, 表示 z 盘位置与图像栈中像素的其余部分之间的轴向距离。
- d_radial_micron, 表示从可能的 RyR 簇位置集合中的每个像素到 z 圆盘平面上的像素的欧氏距离 (不包括轴向分量)。
- W_micron, 它代表 RyR 簇的所有可用位置的空间坐标列表。
- 文件夹中的其余3个文件包含后缀 "_pixel", 而不是 "_micron", 表示这些文件中的值已以像素坐标形式写出。
-
在肌原纤维的二进制图像栈上模拟 RyR 簇分布。
- 按下标签为 "打开 RyR 模拟器" 的按钮以启动 r 程序。
- 在 R gui 上, 选择 "文件 |打开 "并查找文件" 设置。R "在 RyR 模拟器封装 (RyR 模拟器/源/设置。R)。
- 同时打开文件 ryr 模拟器并行。R (位于 RyR-模拟器/源/RyR-模拟器-平行。R). 可以使用 Rstudio (https://www.rstudio.com) 或普通命令行界面等环境,例如使用 shell 或命令窗口中的 R64 命令。
- 更改设置中的参数。R 文件, 详情如下:
- 将 Path2 设置为包含5.1.2 中列出的文件的文件夹地址, 以获取 RyR 群集和肌原纤维的共焦图像堆栈。
注意: github 存储库文件夹输入文件/主单元格/已包含为以前收集的图像堆栈生成的文件。 - 将 Path4 设置为存储步骤5.1.2 中生成的文件的文件夹地址。
- 将 Path3 点设置为用户希望保存模拟 RyR 群集位置的文件夹。
- 设置 N 到要在模型中模拟的 RyR 簇的数目 (通常在200到300的范围内)。
- 设置 etol, 一个公差设置, 为实验测量的 RyR 簇的空间分布和模型模拟空间分布的 RyR 簇的差异。
- 设置 numIter 以限制 RyR 模拟器在找到满足 etol 值的模拟 RyR 群集模式时所需的尝试次数。
注意: etol 和 numIter 的值已设置为设置中的典型值。R 文件。 - 将 numPatterns 设置为用户要模拟的不同 RyR 群集模式的数量 (通常, 它是模拟99模式以统计置信度的有用实践)。
- 设置 numCores 以允许使用多个 CPU 线程 (内核), 以便用 R 更快地并行处理以模拟点模式。
- 将 Path2 设置为包含5.1.2 中列出的文件的文件夹地址, 以获取 RyR 群集和肌原纤维的共焦图像堆栈。
- 请检查以下软件包是使用 R 中的软件包安装程序 gui 安装的: 雪、doSNOW、doparallel、foreach、迭代器和 rgl。
- 通过在 R 命令窗口中输入以下命令来执行模拟器: 源 (' ryr-模拟器的路径-并行。R ', chdir = TRUE)
注: RyR 模拟器程序的输出是一个 .txt 文件列表 (将生成一个 numPatterns 文件), 其中包含 n 行和3列中的坐标列表, 代表 n 个模拟 RyR 簇的 x、y 和 z 坐标。
-
用 CardiacCellMeshGenerator 将点作为空间密度映射到计算模型上。
- 通过选择标记为 "选择 RyR 点文件" 的按钮, 从 RyR 模拟器输出的 RyR 群集分发文本文件中选择一个模拟的。
- 在 MATLAB 中对 GUI 执行 "RyR 密度映射器"。这将将步骤5.3.1 中的模拟 RyR 簇的空间位置映射到在步骤4.8 中生成的有限元素网格中, 使用称为球面核强度估计方法26的方法。
注意: 此步骤的输出为 .txt 扩展名的文件, 其中包含每个计算网格节点上每个单位球面体积的离子通道的数值密度值列表。
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Representative Results
图 2通过图 7提供了本协议中几个关键步骤的代表性结果: (一) 可视化和重新定向组织块以进行横断面电子显微观察;(二) 生成3D 电子显微图像栈;(iii) 将亚细胞超微结构分割为感兴趣的器;(iv) 利用 iso2mesh 生成有限元网格;(v) 模拟 RyR 簇在网格上的真实分布;(vi) 接着将这一空间分布映射为计算网格上的空间密度。
图 2显示典型的明亮字段图像, 显示在纵向定向时单元格的显示方式 (图 2A、标记 L)、斜 (图 2A、标记 O) 和跨分段 (图 2B), 有关切割机。斜向和纵向导向的样品呈现条纹, 而交叉分段的样品不呈现条纹。在横断面视图中毛细血管的出现比斜视图中的更圆。
图 3A显示了一个具有良好质量的声像栈的代表性图像, 当遵循步骤1中的组织准备协议时, 可以获取该堆栈。从显微镜图像倾斜系列执行3D 重建时必须注意。对胶体金粒子的不正确跟踪, 或缺少足够的金粒子, 会显著影响声像的质量-图像对比度和图像焦点。这会影响对不同结构进行显著细分的能力。护理和经验是必要的, 以确保组织块有足够的染色, 并有均匀分布的胶体金颗粒通过组织体积。如果有疑问, 与当地机构的专家实验室或设施进行协商可能会有帮助。如果尝试使用低对比度或不正确的重建数据进行模型生成, 则可能仍会生成模型, 但模拟结果与要仿真的生物系统的特性的对应关系可能较差。图 3B显示了肌原纤维和线粒体的分段模型的代表性图像。
图 4E显示了由 iso2mesh 生成的四面体网格的3D 呈现。只要原始图像栈和分割任务质量好, 这一步就相当健壮。图 6B和图 6C显示了3D 蜂窝拓扑中典型的 RyR 簇分布 (以红色表示)。在这个阶段, 网格本身不是 RyR 模拟器中的输入。从图 4中的分割图像生成的细胞边界的图像栈和肌原纤维与线粒体之间的间隙-构成了 RyR 模拟器的主要输入。必须注意尽可能准确地分割肌原纤维和线粒体的边界;不准确的分割会导致数据中单元拓扑的不准确表示, 从而影响 RyR 在网格中的位置。这将影响心肌细胞中钙信号的时空动态 (应用 1)。
在使用球面核强度估计算法后,图 7显示了同一网格拓扑上的模拟 RyR 簇的3个实例。注意 RyR 簇组织的变化。这些变体被测量为在实验数据18中发现的可变性范围内。在选择内核球体半径和内核采样 RyR 簇密度的步长时, 必须注意。这两个因素影响了 RyR 簇密度的表示在网格上的弥漫。分析不同值对这些参数的影响将有助于缩小合理网格的参数选择。
由此产生的 RyR 簇、肌原纤维和线粒体的网格是心肌细胞结构的最小模型。该网格的应用, 以及它的变化, 从其他细胞结构的数据, 研究钙动力学和生物能学。下面概述了这两种应用, 以说明细胞结构有限元建模的力量, 从而对结构-功能关系进行了深入的研究。
应用程序 118: 钙释放到心肌细胞的时空动力学.该模型用于研究 RyR 簇、肌原纤维和线粒体在钙信号中的异质分布的作用。图 8显示了在该协议生成的网格拓扑上进行模拟时胞浆中钙的时空动态。图 8B显示了随时间推移的非均匀游离钙和荧光钙浓度。箭头指向高钙的小斑点由于 RyR 簇或线粒体的更高的密度在那些区域。图 8C显示了模拟的线扫描图像, 可与使用实时共聚焦显微镜收集的钙动力学的实验行扫描图像进行比较。模型模拟为钙的空间异质性提供了比实验获得的图像更高的分辨率视图。此外, 由于该模型是从结构显微学数据中获得的, 因此在共焦线扫描图像中异质性的电激活后, 必须保持灭活的簇数 (~ 4-6) 可以精确地确定。在实验获得的心脏衰竭动物模型中钙动力学的线扫描图像中观察到类似的异质性18
应用程序 227: 心肌细胞线粒体生物能学的时空动力学。这项工作的一个首要目的是研究钙动力学, 线粒体生物能学和肌肉收缩之间的关系。作为第一步, 对心肌细胞中的线粒体氧化磷酸化进行了模拟。因此, RyR 簇的分布是不需要的, 一个可以简单地使用在步骤3.4 中的网格。作为一个更为复杂的应用, 生物能学 (应用 2) 可以与钙动力学 (应用 1) 结合在一个模型中, 使用在网格和模型构造中考虑的所有组件,即线粒体、肌原纤维和兰尼碱受体。
图 9表示在使用步骤3.4 生成的网格的不同区域上的这些空间代谢模拟的结果。图 9A描述了整个单元格剖面中的氧气浓度, 而图 9B显示的是 ADP 在单元格的肌原纤维隔间中的浓度。图 9C描述了线粒体膜的电位分布。这些数字揭示了细胞横断面线粒体和肌原纤维的非均匀分布。它们还揭示了由于这种非均匀超微结构而导致的不均匀代谢景观。这说明了基于显微数据的有限元模拟的威力, 可以通过单独的实验方法对结构-功能关系进行深入的研究。
图 1: Langendorff 准备化学固定的心脏.(A) Langendorff 灌注仪示意图。旋塞阀包含一个在 Tyrode 和固定解决方案之间切换的阀门。底座上的烧杯用来捕捉通过心脏灌注的溶液。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 在明亮的场显微镜下检查细胞方向.(A) 具有明亮视野的甲苯蓝染厚段的心脏组织, 说明细胞纵向定向 (L) 和斜向 (O) 关于成像平面;例如, 注意纵向定向细胞中的条纹。(B) 具有与成像平面对齐的单元格的横向、横截面的组织节的明亮字段视图。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 电子显微数据的分割.(A) 使用雕刻工具手动分割线粒体的快照。(B) 3D 视图, 完整的人工分割的线粒体, 肌原纤维 (在各种颜色) 和肌膜包裹 (粉红色)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 将二进制图像堆栈转换为3D 四面体网格.(-c)肌膜包裹、肌原纤维和线粒体的二进制面具。(D) 肌原纤维的二进制掩码 (红色) 和线粒体 (绿色) 的合并视图。(E) 使用 iso2mesh 从 (D) 中的图像堆栈生成的代表四面体网格。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: CardiacCellMeshGenerator.与此协议发布相伴的图形用户界面的屏幕快照, 供用户执行步骤4和5。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 模拟一个现实的 RyR 簇分布到一个分割的电子显微图像上的心脏超微结构.(A) 描述肌原纤维和线粒体之间的间隙的二进制图像堆栈, 它表示可在其中找到 RyR 簇的所有像素的集合。(B) 在3D 图像堆栈中描述的3D 几何内的一个模拟 RyR 簇分布 (显示为红色球体) 的3D 渲染 (不绘制为缩放的图像);绿色表面代表图像栈中的线粒体。(C) 放大倍数 (因此, 从步骤4和从步骤3到3D 电子层析图像堆栈的一个切片的计算网格中的 RyR 簇叠加视图中, 将小部分从边界的单元格截面中剪掉。(B) 和 (C) 已从拉贾格帕兰et中修改。18请单击此处查看此图的较大版本.
图 7: 从三个模拟 RyR 簇模式中 RyR 簇的数字密度的空间分布.所有网格节点都是从白色编码的颜色, 用于 0.0 RyR 簇/µm3的数字密度为红色, 用于 0.99 RyR 簇/µm3的最大数字密度。请单击此处查看此图的较大版本.
图 8: 在 ca2 +瞬态的上升阶段, [ca2 +]i中的空间异质性。() 平均胞浆自由扩散 [Ca2 +]i (左) 和 Fluo-4 绑定 Ca2 +, [F4Ca]i (右)。(B) 和 (C) 显示在 z 盘、横向平面上自由扩散 Ca2 +和 F4Ca 的时间间隔快照;由于线粒体聚类, 黑色箭头标记高 [Ca2 +]i的区域;红色箭头标记高 [Ca2 +]i的区域, 原因是邻近的几个 RyR 簇。(C) 模拟行扫描 [Ca2 +]i (中间) [F4Ca]i (右)。行位置显示在左侧的单元格剖面上。单元剖面的水平维数作为图像剖面的空间尺度的指示器提供。此数字已从拉贾格帕兰et al中进行了修改。18请单击此处查看此图的较大版本.
图 9: 由心脏能量代谢的空间模拟产生的代谢物和线粒体膜电位的空间分布.(A) 在整个单元格截面上的氧浓度µM, (B) 的 ADP 浓度仅在µM 单位的肌原纤维部分.(C) 线粒体膜电位在线粒体中的分布网络单位为 mV。请单击此处查看此图的较大版本.
图 10: R 统计数据包上模拟 RyR 群集点模式的可视化.这个窗口出现在 RyR 簇模拟的结论, 描绘了第一个模拟点模式。这可以作为一个指示器, RyR 模拟器已经结束, 并可能询问的质量模拟模式。请单击此处查看此图的较大版本.
| 化学品 | 数量 |
| 0.2 N HCl | |
| 1 N HCl | 5毫升 |
| 蒸馏水 | 20毫升 |
| 0.15 米常使用钠缓冲库存 | |
| 常使用钠 | 32.1 g [3H2O] |
| 0.2 N HCl | 25毫升 |
| 用蒸馏水弥补1升 | |
| pH 值7。4 | |
| 0.3 米常使用钠缓冲库存 | |
| 常使用钠 | 64.2 g [3H2O] |
| 0.2 N HCl | 25毫升 |
| 用蒸馏水弥补1升 | |
| pH 值7。4 | |
| Tyrode 解决方案组成 | |
| Nacl | 139毫米 |
| 氯化钾 | 3毫米 |
| CaCl2 | 3毫米 |
| 氯化镁2 | 1毫米 |
| 葡萄糖 | 12毫米 |
| NaHCO3 | 17毫米 |
| 丙磺舒 | 1毫米 |
| BDM | 20毫米 |
| 氯化钠/氯化钾/NaHCO3 1 L 溶液 | |
| 氯化钠 (分子量58.44 克/摩尔) | 81.2 克 |
| 氯化钾 (分子量74.55 克/摩尔) | 2.24 克 |
| NaHCO3 (分子量84.01 克/摩尔) | 14.28 克 |
| 溶于1升蒸馏水 | |
| 氯化镁2/CaCl2 1 L 解决方案 | |
| CaCl2 (2H2O) (分子量147克/摩尔) | 1.764 克 |
| MgCl2 (6H2O) (203.31 克/摩尔) | 0.814 克 |
| 溶于1升蒸馏水 | |
| 1米葡萄糖200毫升溶液 | |
| 葡萄糖 (分子量180.16 克/摩尔) | 36.03 克 |
| 溶于200毫升双蒸馏水 | |
| Tyrode 溶液500毫升溶液 | |
| 氯化钠/氯化钾/NaHCO3 | 50毫升 |
| 葡萄糖 | 6毫升 |
| 双蒸馏水 | 400毫升 |
| 溶液中气泡氧5分钟 | |
| 2% 粉煤灰 + 2.5% 戊二醛 +0.2% tanic 酸固定剂在0.15 米常使用钠中的含量 | |
| 多聚甲醛粉 (粉煤灰) | 2克 |
| Tanic 酸 | 0.2 克 |
| 蒸馏水 | 20毫升 |
| 25% 戊二醛 | 10毫升 |
| 0.3 米常使用钠 | 20毫升 |
| 0.15 米常使用钠 | 50毫升 |
| 1 N 氢氧化钠 | 4克 NaOH/100 毫升蒸馏水 |
| 4% 醋酸铀溶液 | |
| 醋酸铀 | 4克 |
| 近沸腾双蒸馏水 | 96毫升 |
| 用通风橱中的搅拌器在近 bioling 水中溶解 UA。 | |
| 通过惠特曼 #1 过滤器将 UA 过滤成200毫升的棕瓶以保护光线 | |
| 盖紧和标签, 存放在4°c | |
表 1: 电子显微镜组织准备的试剂和数量。
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Discussion
上述协议概述了生成一种新的心肌细胞超微结构有限元几何模型的关键步骤。该方法使不同显微学 (或原则上, 其他数据) 模式的计算融合, 形成了一个更全面的心肌细胞动力学计算模型, 其中包括空间单元结构的细节。目前还没有其他的协议可以创建这样一个心肌细胞模型。
步骤1概述了一个灌注固定的协议。或者, 心脏可以切除, 解剖成小块, 浸泡在固定体。然而, 这一过程必须迅速完成, 并可以有不同的结果, 取决于样品的大小。在作者的经验, 灌注确保彻底渗透的固定剂进入组织和细胞。作者也曾经用克雷布斯-Henseliet 溶液灌注心脏, 使心脏在固定前跳动。这使得在固定前的工作心脏测量。
步骤2中的电子显微处理步骤是电子层析成像的典型方法。当使用其他成像技术 (如串行块面扫描电子显微镜或聚焦的离子束显微镜28) 时, 处理解决方案的数量, 特别是染色溶液和计时可能会有所不同。获得的电子显微图像必须分割成不同的细胞器官区域, 如线粒体, 肌原纤维和横管。这可以手动或自动化的方式进行。图像栈中的对比度部分依赖于染色协议的成功, 但在进行层析成像时, 有些对比度会丢失。此协议描述了用于分割不同结构的手动步骤, 尽管执行自动分割29的新方法通常会更有利于提高数据吞吐量。
在电子显微数据集中检查的最重要的品质是图像对比度和结构保存。本协议中的染色配方和树脂嵌入混合物经改良后, 肌原纤维、线粒体和心肌细胞的 z 盘之间有较高的对比度。例如, 作者以前用氯化钙代替单宁酸在步骤1.2 中标定了肌网状网络。这有助于识别肌原纤维束在细胞器分割过程中的外边界。其他染色化学成分和时间也可用于可视化膜结构, 如肌网或横向轴向小管30。
这些图像还必须检查结构退化。质量不高的固定或电子显微处理可导致严重的线粒体嵴丢失, 脱落或肿胀的线粒体比例较高, 细胞膜部分 (肌膜包裹) 解体。仔细仔细的检查也可能显示 t 型管和 SR 膜的损失, 但对未经训练的眼睛来说却不那么明显。解决这一问题的办法包括: (一) 确保彻底灌注;(二) 将组织解剖成小样本, 同时确保固定剂和污渍的深度渗透;(iii) 确保在冷溶液或在指定的冰面上进行电子显微处理;(iv) 确保严格遵守染色和脱水 (特别是脱水) 的定时。
一个典型的心肌细胞是20µm 的横断面直径和100µm 的长度。这使成像整个心脏细胞的一个重大挑战。此外, 心脏中肌肉纤维的变化方向31进一步复杂化了图像卷的获取, 其坐标轴与感兴趣单元的横向和纵向轴对齐。像 IMOD 这样的图像分析程序使数据的合成重新对齐成为理想的方向。串行块面扫描电子显微镜的最新进展28和相关的图像处理算法29还有助于解决这些问题。然而, 仔细检查在轻的显微镜下厚的部分和随后的重新定位块 (步骤 2.5) 将增加成像细胞的可能性, 合理地对准纵向和横向轴与成像轴。这将确保大多数单元格卷将在视图字段中捕获。
协议步骤3、4和5要求安装材料表中列出的软件。IMOD, R 统计数据包, iso2mesh 和斐济 (一个版本的 ImageJ 的显微资料) 有广泛的文件和教程, 如何使用它们。CardiacCellMeshGenerator 是一个 MATLAB 应用程序, 它已经开发出来, 使用户更容易在一个简单的工作流中构建模型。用户可以从 github RyR 模拟器存储库链接 (https://github.com/CellSMB/RyR-simulator/tree/JoVE) 下载整个源代码和应用程序包。应用程序 CardiacCellMeshGenerator miappinstall 可以作为应用程序安装在 MATLAB 中。该协议生成的网格输入可以在 RyR 模拟器/输入文件/目标明天单元格中找到, 而 RyR 集群模拟器的额外输入可以在 RyR 模拟器/输入文件/主电池中找到。在启动应用程序之前, 用户应确保已安装的 iso2mesh 文件夹及其子文件夹已添加到 MATLAB 路径中。同样, 确保在 r 中安装了群集模拟器所需的 R 软件包 (材料表)。
在生成网格时, 应用程序中已包括一个进度条, 当生成 RyR 集群模拟器的输入时, 以及使用 RyR 密度映射程序映射网格上的 RyR 簇密度时;当网格生成步骤结束时, 该应用程序将在 GUI 中呈现3D 网格。在 R 用户界面上完成 RyR 群集模拟后, 将出现一个图形窗口 (图 10), 其中描述了模拟的 3D RyR 群集点模式之一。
GUI 上的 "生成网格" 按钮将触发 iso2mesh 函数以生成四面体网格。可以通过在 GUI 上设置 "iso2mesh 参数" 来调整模型分辨率, 以调整最大四面体元素体积和边缘长度。该计划目前区分构成肌原纤维区域和线粒体区域的元素;此功能将扩展到将来包含单元格的其他组件。
用户可以使用网格和 RyR 簇的3D 渲染来解决这些步骤。RyR 集群模拟设置, etol 和 numIter, 内部设置。R 影响 RyR 簇模拟的精度;这两个参数确定 RyR 群集模式模拟何时终止。这些参数可以在检查 R 窗口中的 RyR 簇分布 (图 10) 时进行调整, 以确保: (i) 所有群集都靠近 z 光盘;(二) 集群分布在整个剖面上, 而不是聚集在任何一个区域。可以进行对这两个参数进行模拟的即席灵敏度分析, 以确定 etol 和 numIter 的适当组合.
在步骤5中, 球面核强度估计器使用选定直径的球体作为内核, 传递到感兴趣的体积 (这一上下文中的3D 空间模型)。可以根据图 5中 GUI 上的此平滑算法调整这些参数: (1) r_sphere 定义球面内核平滑的半径;(2) hval 定义了迭代空间步长, 球面内核必须在该卷上迭代传递。
确定空间密度参数是否足够的简单方法是检查 RyR 簇密度值的分布情况, 如图 7所示。应分布密度值, 使高密度值邻域的大小与显微数据中 RyR 簇的大小相似。
目前的协议产生一个有限元模型, 仅包含肌原纤维、线粒体和 RyR 簇的真实分布。这个步骤的一个扩展是模拟其他离子通道在 ECC 中发挥作用的分布, 如泄漏-内质网状钙泵 (SERCA2a)、钠钙交换器 (NCX) 和 sarcolemmal 钙泵。这些扩展的关键是从免疫荧光数据分析离子通道的空间分布。例如, NCX 通道被测量成均匀分布在 t 管状膜上, 平均间距为0.67 µm, 但它们与 RyR 簇的关系不那么清晰32。另一方面, SERCA2a 靶向抗体以前被用来标记 SR33, 但 SERCA2a 的空间密度并没有在文献中报道。因此, 在这个阶段, SERCA 2A 在 SR 网络上的均匀分布和 t 小管的 NCX 可以谨慎地假设。
如代表结果所示, 所得到的有限元网格可以与有限元求解34一起模拟生化过程, 如钙信号18和生物能学27 作为反应扩散过程。为此, 离子通道在网格拓扑中的节点上表示为反应点。反应场所充当不同化学物种的来源或汇, 代表化学物种通过这些离子通道进入细胞的不同隔间的流动。该协议的输出网格和 RyR 密度文件可以与任何其他集成商或任何其他环境中使用, 前提是软件具有识别这些文本文件的功能。文本文件还可以由脚本或第三方软件操作, 以满足选择环境的输入文件格式要求。钙动力学的第一个应用仅证明了这个模型对钙向上的效用, 但这并不表明网格不能用于较长的时间尺度。网格和聚类密度可用于模拟多个钙循环, 维持稳态和稳定只依赖于所使用的有限元求解器。
一个长期的目标是改善这一模型建设的管道, 使其易于建立结构准确的心肌细胞和其他细胞类型的有限元模型。最近开发了一种自动分割算法, 可应用于心肌细胞的串口扫描电子显微数据, 在最小用户的情况下建立整个细胞的肌原纤维和线粒体分布模型。输入29。该方法将扩展到今后对 t 小管和 SR 膜网络的分割。一个更广义的版本的 RyR 模拟器算法, 将使用户能够分析和模拟在离子通道和细胞器之间, 以及不同的离子通道类型之间的共同位置, 在高吞吐量的方式也正在开发中。建立一个完整的细胞模型的无缝协议将使科学家能够对细胞结构和细胞功能之间的关系进行基于模型的假设测试, 这比目前的实验方法更常规。独自。
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Disclosures
作者声明他们没有竞争的财政利益。
Acknowledgments
这项工作得到新西兰皇家学会快速入门补助金 11-UOA-184, 人类前沿科学项目研究赠款 RGP0027/2013 和澳大利亚研究委员会发现项目赠款 DP170101358。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 25% Glutaraldehyde EM Grade (500 ml bottle) | Merck | 354400-500ML | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Tannic Acid | Sigma-Aldrich | 403040-500G | 100g EM grade |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4593 | |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | 75632-10ML | 4% in water, 5 ml bottle (or 10 ml bottle also available) |
| Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 | 25g bottle |
| Potassium Ferrocyanide | Merck Millipore | 104973 | |
| Toluene blue | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Borax | Sigma-Aldrich | S9640 | also termed sodium borate |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | Diluted to different percentages with pure water |
| Acetone | EM Sciences | RT10017 | |
| Resin kit | EM Sciences | 14040 | ACM Durcupan works well |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1Normal solution |
| Equipment | |||
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscope | ThermoFisher Scientific | Tecnai F30 | http://www.leica-microsystems.com/ |
| Retort stand | Proscitech | T752 | |
| Tubing | BioStrategy | 75831-346 | for langendorff perfusion apparatus, 3 mm diameter is recommended but not essential |
| Stopcocks | SDR | QP13813 | for langendorff tubing; product is only an example, user can select any |
| retort stand clamps | Proscitech | T715 | |
| Plastic syringes | SDR | QPC1108 | for solutions on langendorff apparatus |
| Cannulation silk suture, 7-0 | TeleFlex | 15B051000 | for tieing heart on langedorff apparatus |
| Cannula | Made from 3 mm outer-diameter steel needle | ||
| Rubber petri dish mat | Proscitech | H068 | for use as cutting board during fixed-heart dissection |
| Razor blades | Proscitech | L056 | for cutting fixed-heart into small blocks for EM processing |
| Glass bottles | BioStrategy | 89000-236 | for storing solutions during tissue fixation and processing for EM |
| Beakers | BioStrategy | 213-0477 | for storing solutions temporarily and during perfusion |
| Scintillation vials | BioStrategy | 548-2170 | for tissue samples during EM processing |
| Dissection kit | Proscitech | T161 | for animal dissection |
| Syringe Filters | Proscitech | WS3-02225S | for purification of Uranyl Acetate |
| Aluminium/silver foil baking cups | From any baking products store | ||
| Dupont Diamond knife | BioStrategy | 102680-780 | 35 degree angle version produces best sections. |
| Colloidal Gold | BBI Solutions | EM. GC15 | 15 nm colloidal gold |
| EM mesh grids | Proscitech | GCU150 | a variety of sizes can be tested: GCU150h, GCU200h for example |
| Plastic disposal pippettes | Proscitech | LCH20 | best to use plastic disposables especially when working with resin |
| Software | |||
| SerialEM | University of Boulder | tomography acquisition | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| IMOD | University of Boulder | image alignment and segmentation | |
| iso2mesh | available at http://iso2mesh.sourceforge.net | ||
| Fiji or similar image processing software | ImageJ | Fiji is Just Image J | available at https://fiji.sc for manipulation of binary image stacks |
| RyR-Simulator codes/data | CellSMB group | available at https://github.com/CellSMB/RyR-simulator | |
| CardiacCellMeshGenerator | CellSMB group | comes with RyR-Simulator under folder "gui-version" | |
| R-statistics software | R-project | Download from https://www.r-project.org | |
| spatstat | R-project | install via R program | |
| rgl | R-project | install via R program | |
| doparallel | R-project | install via R program | |
| foreach | R-project | install via R program | |
| doSNOW | R-project | install via R program | |
| iterators | R-project | install via R program |
References
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