Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Methode um ein räumlich detaillierte finite-Elemente-Modell der intrazellulären Architektur der Herzzellen von Elektronenmikroskopie und konfokalen Mikroskopie-Bilder zu erstellen. Die Kraft dieses räumlich detaillierte Modell zeigt anhand von Fallbeispielen in Kalzium Signal- und Bioenergetik.
Abstract
Mit dem Aufkommen der dreidimensionalen (3D) imaging-Technologien wie die Elektronenstrahl-Tomographie hat Serien-Block-Face scanning Electron Microscopy und konfokale Mikroskopie, die wissenschaftliche Gemeinschaft beispiellosen Zugang zu großen Datenmengen bei Sub-Mikrometer Auflösung, die charakterisieren die architektonische Umgestaltung begleitet Veränderungen in der Cardiomyocyte Funktion in Gesundheit und Krankheit. Allerdings wurden diese Datasets für die Untersuchung der Rolle der zellulären Architektur Umbau in Cardiomyocyte Funktion genutzt. Dieses Protokoll dient, wie erstelle ich eine genaue finite-Elemente-Modell der eine Cardiomyocyte mit hochauflösende Elektronenmikroskopie und konfokalen Mikroskopie-Bildern zu skizzieren. Eine detaillierte und genaue Modell der zellulären Architektur hat erhebliches Potenzial zur erlauben neue Einblicke in Cardiomyocyte Biologie, mehr als Experimente allein sammeln können. Die Kraft dieses Verfahrens liegt in seiner Fähigkeit, Informationen aus zwei unterschiedlichen bildgebender Verfahren der Cardiomyocyte Ultrastruktur, eine einheitliche und detaillierte Modell von der Cardiomyocyte zu entwickeln rechnerisch zu verschmelzen. Dieses Protokoll beschreibt Schritte zur Integration von Elektron Tomographie und konfokalen Mikroskopie Bilder von erwachsenen männlichen Wistar (Name für eine bestimmte Rasse Albino Ratte) Ratte Kardiomyozyten, ein halb-sarkomers finite-Elemente-Modell von der Cardiomyocyte zu entwickeln. Das Verfahren erzeugt eine 3D finite-Elemente-Modell, das eine präzise, hochauflösende Darstellung enthält (in der Größenordnung von ~ 35 nm) der Verteilung der Myofibrillen und Mitochondrien und Ryanodin-Rezeptor-Cluster, die das notwendige Kalzium für Cardiomyocyte freigeben Kontraktion von sarcoplasmic Retikuläre Netzwerk (SR) in die Myofibril und cytosolischen Fach. Das Modell erzeugt hier wie eine Illustration nicht Details der quer-Röhrchen-Architektur oder die sarcoplasmic Retikuläre Netzwerk zu übernehmen und daher ein minimaler Modell von der Cardiomyocyte ist. Dennoch kann das Modell bereits im Simulations-basierte Untersuchungen über die Rolle der Zellstruktur in Kalzium Signalisierung und mitochondriale Bioenergetik, wird dargestellt und diskutiert anhand von zwei Fallbeispielen, die präsentiert werden nach angewendet werden die ausführliches Protokoll.
Introduction
Erregung-Kontraktion Kupplung (ECC) im Herzen bezieht sich auf das wichtige und komplizierte Kopplung zwischen elektrischen Erregung der Cardiomyocyte Membran und die anschließende mechanische Kontraktion der Zelle bei jedem Herzschlag. Mathematische Modelle spielten eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung eines quantitativen Verständnis der vernetzten biochemischen Prozesse, die Regeln des Aktionspotentials1, zytosolischen Kalzium Signalisierung2, Bioenergetik3, und die anschließende Kontraktionskraft Generation. Solche Modelle haben auch erfolgreich vorausgesagt Änderungen an den Herzschlag bei einer oder mehrere dieser biochemischen Prozesse unterliegen Änderungen4,5. Die hoch organisiert Ultrastruktur von der Cardiomyocyte hat zunehmend erkannt worden, eine entscheidende Rolle in der normalen KONTRAKTILE Funktion der Zelle und das ganze Herz. In der Tat treten Änderungen der Morphologie und Organisation von Komponenten der kardialen Ultrastruktur parallel zu biochemischen Veränderungen bei Erkrankungen wie z. B. Hypertrophie6, Herzinsuffizienz7und Diabetische Kardiomyopathie8. Ob diese strukturellen Veränderungen sind leicht, adaptive oder pathologischen Reaktionen an die veränderten biochemische Bedingungen ist noch weitgehend unbekannt9. Die von Natur aus enge Kopplung zwischen Form und Funktion in der Biologie bedeutet, dass experimentelle Studien allein können nicht tiefere Einblicke als Korrelationen zwischen strukturellen Umgestaltung und Cardiomyocyte Funktion. Eine neue Generation von mathematischen Modellen, die die strukturelle Montage der subzellulären Komponenten, zusammen mit der gut untersuchten biochemischen Prozesse integrieren können sind notwendig, um eine umfassende, quantitativen Verständnis der Beziehung entwickeln zwischen Struktur, Biochemie und Kontraktionskraft in Herzmuskelzellen. Dieses Protokoll beschreibt Methoden, die verwendet werden können, strukturell genau finite Elemente Modelle von Kardiomyozyten zu generieren, die für solche Untersuchungen verwendet werden kann.
Der letzte zehn Jahren erhebliche Fortschritte in der 3D-Elektronen-Mikroskopie10, konfokale11und Super-Auflösung Mikroskopie12 , die noch nie da gewesenen, hochauflösende Einblicke in die Nano-Maßstab und Mikromaßstab Montage der gesehen hat die subzelluläre Komponenten von der Cardiomyocyte. Vor kurzem wurden diese Datasets zur erzeugt Rechenmodelle Cardiomyocyte Ultrastruktur13,14,15,16. Diese Modelle verwenden eine gut etablierte engineering Simulationsmethode mit dem Namen der finite-Elemente-Methode17, finite-Elemente rechnerische Netze erstellen über die biochemischen Prozesse, die und Cardiomyocyte Kontraktionen simuliert werden können. Allerdings sind diese Modelle begrenzt durch die Auflösung und Details, die eine Methode der Mikroskopie in einem Bild-Dataset bereitstellen kann. Z. B. Elektronenmikroskopie Nanometer-Detailgenauigkeit der Zellstruktur erzeugen können, aber es ist schwierig, spezifische Proteine innerhalb des Bildes zu identifizieren, das Erstellen eines Modells notwendig wäre. Auf der anderen Seite bieten Höchstauflösung Lichtmikroskop kontrastreiche Bilder mit Auflösungen in der Größenordnung von 50 nm von nur ein paar molekularen Komponenten auswählen der Zelle. Nur durch die Integration von ergänzenden Informationen aus diesen bildgebenden Verfahren kann man die Empfindlichkeit der Funktion realistisch zu Veränderungen in der Struktur erkunden. Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie ist noch kein Routineeingriff und es würde immer noch die Einschränkung, dass nur eine begrenzte Anzahl von Komponenten kann in der Immunfluoreszenz-Ansicht gebeizt und mit der Elektronenmikroskopie Ansicht korreliert leiden.
Dieses Protokoll stellt einen neuartigen Ansatz18 , die verwendet statistische Methoden19 zu analysieren und rechnerisch Sicherung Lichtmikroskopie Informationen über die räumliche Verteilung von Ionenkanälen Elektronenmikroskopie-Informationen über andere Herz- Ultrastruktur Komponenten, wie z. B. Myofibrillen und Mitochondrien. Dadurch entsteht ein finite-Elemente-Modell, das mit biophysikalischen Modelle von biochemischen Prozessen verwendet werden kann, zur Untersuchung der Rolle von Cardiomyocyte subzellulären Organisation auf die biochemischen Prozesse, die Cardiomyocyte Kontraktion zu regulieren. Zum Beispiel dieses Protokoll könnte verwendet werden, um Modelle aus gesunden erstellen und Streptozocin-induzierte Diabetische kardialen Myozyten untersuchen die Auswirkungen der strukturellen Umgestaltung auf Herzmuskelzellen-Funktion, die in diabetischen Tier beobachtet wird Modelle8. Ein weiterer Vorteil des statistischen Charakters der die vorgestellte Methode ist auch im Protokoll dargestellt: die Methode kann mehrere Instanzen von finite-Elemente-Geometrien, die genau die experimentell beobachteten Schwankungen der Zellstruktur imitieren generieren.
Im Überblick, die Protokoll-Schritte umfassen: (i) Vorbereitung von Herzgewebe für Elektronenmikroskopie erzeugen 3D-Bilder mit ausreichender Auflösung und Kontrast; (Ii) Wiederaufbau und Segmentierung von 3D-Bild Stacks von Elektronenmikroskopie Daten mit Hilfe eines 3D Elektronenmikroskopie Wiederaufbau- und Bildanalyse-Software namens IMOD20; (Iii) Verwendung von iso2mesh21 , um ein finite-Elemente-Netz mit den segmentierten Daten als Eingabe zu erzeugen; (iv) unter Verwendung neuartiger Algorithmus und Codes, die Verteilung von Ionenkanälen auf das finite-Elemente-Netz abzubilden.
Die Prämisse des Ansatzes für jeden Schritt wird im Rahmen des Protokolls, und repräsentative Ergebnisse sind in den beigefügten Abbildungen zur Verfügung gestellt. Eine Übersicht ist skizziert angeben, wie die generierten räumlich detaillierte Modelle verwendet werden können, um die räumliche Dynamik von Calcium während ECC sowie mitochondriale Bioenergetik zu studieren. Einige der aktuellen Einschränkungen des Protokolls werden besprochen, sowie Neuentwicklungen, die unternommen werden, um sie zu überwinden und weiter ein quantitatives Verständnis der Rolle der Zellstruktur zu kardialen Systembiologie. Auch wird angesprochen, wie diese Methoden verallgemeinert werden könnten, um finite Elemente Modelle von anderen Zelltypen zu erstellen.
Benutzer dieses Protokolls können Schritt 1 und der Wiederaufbau Teil von Schritt 2 überspringen, wenn sie Zugang zu einer bereits vorhandenen Elektronenmikroskopie-Bildstapel haben. Benutzer, die beabsichtigen, ihre Daten in Zusammenarbeit mit erfahrenen Elektron Mikroskopiker erwerben möchten diskutieren und vergleichen Sie die Fixierung und Färbung Verfahren in Schritt 1 mit dem Experten um eine optimale Protokoll für den Erwerb zu bestimmen.
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Protocol
Alle hier beschriebene Methoden sind genehmigt worden, von der University of Auckland-Tier-Ethik-Kommission und der University of California San Diego institutionelle Pflege der Tiere und Use Committee, wo das Gewebe Protokoll ursprünglich entwickelt wurde.
(1) experimentelle Vorbereitung
- Bereiten Sie Stammlösungen von 0,15 M und 0,3 M Natrium Cacodylate-Puffer bei pH 7.4 gemäß Tabelle 1.
-
Bereiten Sie Glutaraldehyd Fixativ (2 % Paraformaldehyd (PFA) + 2,5 % Glutaraldehyd + 0,2 % Gerbsäure in 0,15 M Natrium Cacodylate Puffer bei pH 7,4) in Tabelle 1 aufgeführten Komponenten.
- 2 g PFA Pulver in 20 mL destilliertem Wasser bei 60 ° C auf einer Heizplatte unter ständigem Rühren auflösen.
- Fügen Sie 1 M NaOH Lösung, bis die Lösung klar ist.
- Warten Sie, bis die Temperatur der Lösung unter 40 ° C ist, dann fügen Sie 10 mL Glutaraldehyd und 20 mL 0,3 M Natrium Cacodylate.
- 0,2 g Gerbsäure und lösen Sie es in die Lösung.
- 50 mL 0,15 M Natrium Cacodylate hinzugeben.
- Speichern Sie drei oder vier 20 mL Fläschchen Funkeln Fixativ im Kühlschrank bei 4 ° C oder auf Eis, wenn am selben Tag verwendet.
- Bereiten Sie Tyrodes-Lösung mit 20 mM 2,3-Butanedione Monoxime (BDM), nach dem Rezept in Tabelle 1.
-
Konstruieren Sie einen Langendorff Apparat in einem Laborabzug.
- Spannen Sie zwei 100 mL kunststoffspritze Röhren an zwei verschiedenen Retorte Ständen, etwa 70 cm hoch aus den Standfuß.
- Schließen Sie die kunststoffspritze Röhren und einen Anschluss-Schlauch mit 3 mm Innendurchmesser Rohr und ein drei-Wege-Hahn, wie in Abbildung 1dargestellt.
- Passen Sie eine 3 mm Außendurchmesser Kanüle an der Unterseite des Steckers Schläuche, wo das Herz zur Perfusion Fixierung gebunden wird.
-
Füllen Sie die Spritze Rohre mit Tyrode Lösung und Fixativ Lösungen bei 37 ° C.
- Entfernen Sie indem man die Spritze Lösungen durch Luftblasen in den Schlauch.
(2) erwerben Sie Elektronenmikroskopie Daten von Cardiomyocyte Ultrastruktur
- Bereiten Sie das Tier auf Exzision und chemische Fixierung des Herzens.
Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, Erwachsene männliche Wistar (Name für eine bestimmte Rasse Albino Ratte) Ratte Herzgewebe zu verarbeiten. Das Protokoll kann Änderungen verlangen, wenn das Herzgewebe artfremder bezogen wird.- Betäuben Sie das Tier durch die Behandlung der Ratte (200-250 g durch das Körpergewicht) mit 0,5 mL 250 U/mL Heparin durch intraperitoneale Injektion. 10 min. warten Sie, dann behandeln Sie die Ratte mit intraperitoneale Injektion von Pentobarbital (210 mg/kg Körpergewicht).
- Bestätigen Sie einen richtigen Grad der Narkose durch die Prüfung des Zehe Prise Reflexes.
- Das Tier durch zervikale Dislokation einschläfern.
- Ernte, die das Herz mit Dissektion Verfahren ähnlich wie zuvor veröffentlichte JoVE Artikel22,23, dann legen Sie es in Eiskalter Kochsalzlösung.
- Isolieren der Aorta ascendens und cannulate. Stellen Sie sicher, dass die Spitze der Kanüle direkt über das Semi-lunar Ventil sitzt in den Herzkranzgefäßen abzweigen. Binden Sie einen Faden fest um die Aorta ascendens.
- Verbinden Sie die Kanüle mit der Schwerkraft angetrieben Langendorff Apparat betrieben bei ~ 70 cm oberhalb des Bodens des Systems (Abbildung 1).
- Drehen Sie den Absperrhahn am Langendorff-System, das Herz mit Tyrodes-Lösung, einschließlich 20 mM BDM (Myosin-Hemmer) für 2 – 3 min. durchspülen.
- Drehen Sie den Absperrhahn zur Perfusion mit Fixativ von 2 % Paraformaldehyd, 2,5 % Glutaraldehyd und 0,2 % Gerbsäure in 0,15 M Natrium Cacodylate bei 37 ° C für 10 min beginnen. Im Erfolgsfall wird das Herz verwandeln hellbraun und werden steif und gummiartig.
- Mit einer Rasierklinge, Gewebe Blöcke von der linken Herzkammer (seitliche) kostenlos Wand zu sezieren und zu erhalten Gewebe blockiert ca. 1 mm3 in der Größe.
- Store die Proben in vorgekühlte 20 mL Funkeln Fläschchen mit der gleichen Fixativ auf Eis für 2 h speichern so viele Proben wie möglich in das Fläschchen und sicherzustellen, dass die Proben in die Lösung getaucht werden.
Achtung: Es ist wichtig, die Proben erst nach dem 100 % Abtrocknung Schritt unten kalt zu halten.
- Weitere Fixierung und Färbung der Proben für Elektronenmikroskopie.
- 100 mL von 0,15 M Natrium Cacodylate Puffer in ein Becherglas gießen und Abkühlen auf Eis.
- Bereiten Sie gleiche Volumina von 4 % Osmium ausgefällt und 0,3 M Natrium Cacodylate, gefolgt von dem Zusatz von 0,08 g Kaliumferrocyanid, eine Heavy-Metal-Fleck-Lösung mit 2 % Kaliumferrocyanid in 2 % Osmium ausgefällt und 0,15 M Natrium Cacodylate zu machen. Die Lösung auf Eis abkühlen.
- Das Fixiermittel, Pipette und ersetzen Sie es mit genügend kalt 0,15 M Natrium Cacodylate Puffer zu Proben in das Fläschchen Tauchen. Legen Sie die Fläschchen für 5 min auf Eis.
- Wiederholen Sie Schritt 2.2.3 vier weitere Male mit 0,15 M Natrium Cacodylate, überschüssige Fixativ zu entfernen.
Achtung: Verwenden Sie nicht glaspipetten, weil winzige Scherben in die Probe gelangen können und während Gewebe-Block Schnitt Diamant Messer ruinieren können. Es ist wichtig, alle Lösungen auf Eis Vorkühlen, bevor Sie sie zum Beispiel hinzufügen. Es ist auch wichtig, dass die Probe fallenden Lösung aller Zeiten bleibt (sehr kurze Zeiträume Teilschutz dauert nicht mehr als ein paar Sekunden können während der Lösung Austausch kurz toleriert werden). Beim Waschen oder Lösungen zu ersetzen, fügen Sie die neue Lösung schnell nach dem Entfernen der vorherigen Lösung hinzu. Halten Sie die Fläschchen funkeln auf dem Eis zwischen den Waschgängen. Beachten Sie, dass dieser Schritt ist nicht empfindlich, die Gewebe-Blöcke Zeit kann etwas länger, bei Bedarf gewaschen werden. - Ersetzen Sie Natrium Cacodylate Puffer mit eiskalten Heavy-Metal-Fleck-Lösung zu, und speichern Sie es über Nacht auf dem Eis. Sicherzustellen Sie, dass die ferrocyanid gut vermischt ist, durch schütteln das Fläschchen mit der hand; die Lösung sollte schwarz werden.
Achtung: Arbeiten Sie in der Dunstabzugshaube, wenn diesen Schritt durchführen, weil Osmium giftig ist. - 4 % wässrige Uranyl (UA)-Acetat-Stammlösung (Tabelle 1), 2 % gleiche Volumina der Aktie UA Lösung mit doppelt destilliertem Wasser verdünnen und auf Eis abkühlen.
- Ersetzen Sie Heavy-Metal-Fleck mit Eis gekühlt 0,15 M Natrium Cacodylate Puffer zu, und lassen Sie die Probe für 5 min auf Eis zu brüten.
- Wiederholen Sie Schritt 2.2.7 vier weitere Male auf dem Eis keine überschüssige Heavy-Metal-Fleck-Lösung abwischen.
- Spülen Sie die Proben viermal, mit einer 2-Minuten-Wartezeit dazwischen in gereinigtem Wasser (bidestilliertem ist ausreichend).
- Gereinigtes Wasser zu ersetzen mit eiskalten 2 % UA und auch das Muster inkubieren 60-120 min auf Eis.
- Kühlen Sie fünf 20 mL Funkeln Fläschchen von Ethanol (genug, um Proben zu tauchen ab) auf dem Eis, die in der Dehydrierung Schritt verwendet werden. Die sechs Fläschchen haben zunehmende Prozentsätze von Ethanol in destilliertem Wasser: 20 %, 50 %, 70 %, 90 % und 100 %.
- Gießen Sie Aceton in ein anderes Fläschchen 20 mL funkeln und Cool auf dem Eis zusammen mit den Ethanol-Fläschchen.
- Spülen Sie Proben in gereinigtem Wasser viermal mit Wartezeiten von 2 min auf Eis, überschüssige UA zu waschen.
- Proben im Äthanol zu entwässern.
- Entwässern in kaltem Ethanol-Serie durch das sukzessive ersetzen-Lösung in das Probenfläschchen wie folgt auf Eis: 20 % Ethanol für 10 min; 50 % Ethanol für 10 min; 70 % Ethanol für 10 min; 90 % Ethanol für 10 min; dann zweimal in 100 % igem Ethanol für 10 Minuten.
- Übergang von Probe auf Raumtemperatur indem das endgültige 100 % Ethanol mit gekühlten Aceton und legen das Probenfläschchen auf einem Labortisch Raumtemperatur für 10 min.
- Führen Sie eine weitere 10 min Waschen in Aceton bei Raumtemperatur, Kondensation zu entfernen, zu beobachten in den Fläschchen ist. Während der Inkubation, Aceton/Harz-Lösungen bilden.
- Ersetzen Sie das Aceton in den Fläschchen mit 50: 50 reines Aceton und Epoxyd-Harz (mit Proportionen für Epoxid-Harz-Komponenten wie vom Hersteller angegeben). Verwenden Sie alle Komponenten aus der gleichen Charge. Lassen Sie die Harz gefüllten Probenfläschchen über Nacht auf einem Rotor.
- Proben in Harz einbetten.
- Ersetzen von 50: 50-Harz mit 75 % Harz (25 % Aceton) und 3 h, gefolgt von weiteren Inkubation/Infiltration in der 100 % Harz für 4 h bei Raumtemperatur inkubieren.
- Ersetzen Sie 100 % Harz mit frischen 100 % Harz zu, und lassen Sie die Probengefäße Übernachtung für tieferes Eindringen des Harzes in den Gewebeproben.
- Nehmen Sie Proben aus dem Fläschchen und legen Sie sie in Containern, die Ofen-freundlich sind und eine flache Basis; Aluminium oder Silberfolie Tassen backen kann zum Beispiel für diesen Zweck verwendet werden.
- Gießen Sie vorsichtig (um Verschiebung der Proben zu vermeiden) frisches Harz über die Proben (so einbetten Proben im Harz) und Harz und Proben in einem Ofen bei 60 ° C für 48 h polymerisieren.
- Neu richten Sie Harz Blöcke zu Bildzellen im Querschnitt aus.
- Erhalten Sie 1 µm dicken Messstrecken aus der Harz-Blöcke mit ein regungsloses mit einem Glas Messer Zelle Ausrichtung24zu beurteilen.
- Färben die dicken Testabschnitte für 20 s mit 1 % Toluol blau und 1 % Borax.
- Muskel Zelle Ausrichtung unter dem Hellfeld-Mikroskop zu untersuchen.
- Basierend auf der Ausrichtung abgeleitet aus den Bildern der gefärbten Messstrecken, neu auszurichten, längs oder schräg ausgerichtet (ähnlich wie Abbildung 2A) Harz-Blöcke, um sicherzustellen, dass das Glas Messer Zellen ausgesetzt sind, so dass sie im Querschnitt (geschnitten werden ähnlich wie Abbildung 2 b).
- Bild Gewebeschnitte mit Elektronenstrahl-Tomographie.
- Semi-dünne Abschnitte erhalten (~ 300 nm) des umorientiert Gewebes Blöcke mit einem Diamant Messer und übertragen die Abschnitte auf Kupfer Raster25.
- Färben Sie die Dicke Abschnitte mit 2 % UA und Sato Blei25.
- Kolloidale Goldpartikel auf beiden Seiten der Abschnitte25anwenden.
- Erhalten Sie Sätze von Einzel- oder Doppel-Mittellinie Tilt-Serie der projizierten Bilder von-70 ° bis + 70 °25.
- IMOD20 verwenden, um das 3D-Bild Stapel (eine Reihe von 2D Bildern, die 3D Informationen ein einzelnes Elektron Tomographie Abschnitts enthalten) rekonstruieren der Zelle. Im nächsten Schritt wird diese rekonstruierten Stapel segmentiert werden.
3. segment Myofibrillen und Mitochondrien Regionen aus dem EM 3D-Bild Dataset
- Führen Sie das IMOD Programm "3dmod".
- Innerhalb der grafischen Benutzeroberfläche von 3dmod geben Sie die Adresse der ".rec" oder ".mrc"-Datei, die enthält die 3D rekonstruiert Bild Dataset der Zelle (in Schritt 2.7 erzeugt) in das Textfeld mit der Bezeichnung "Image-Dateien:", dann drücken Sie "OK".
- Unter dem Menü "Datei", wählen Sie neues Modell, dann speichern Sie die Datei mit einem entsprechenden Namen mit der "Save-Modell als"... Menüpunkt unter "File".
Hinweis: Ein Objekt in IMOD kann eine Sammlung von segmentierten Komponenten enthalten, aus denen sich das "Objekt". Standardmäßig enthält ein neues Modell ein neues Objekt mit der Id "#1". - Wählen Sie unter Menü "Spezial" "Zeichenwerkzeuge". Dadurch wird eine neue Symbolleiste wie gezeigt in der Abbildung 3Ageöffnet.
Hinweis: Es gibt verschiedene Tools, die verwendet werden können, um Konturen um die verschiedenen Organelle Grenzen zu erstellen. Weitere Informationen über Möglichkeiten zur Verwendung dieser Tools finden Sie in der IMOD20 Dokumentation. - Wählen Sie die Option "Formen" im Menü "Zeichenwerkzeuge", und bewegen Sie die Maus über in das Bildfenster; eine kreisförmige Kontur zentriert auf den Mauszeiger wird angezeigt.
- Ziehen Sie durch gedrückt halten der mittleren Maustaste über einem Mitochondrium (dunklere Bereiche der Image-Dateien, wie durch Abgrenzungen mit grünen Höhenlinien in Abbildung 3A) den Umfang des Kreises Kontur in die Form seiner Grenze.
- Sobald die Konturierung der Mitochondrium Grenze abgeschlossen ist, lassen Sie die mittlere Taste und wiederholen Sie die Schritte 3.6 für jedes Mitochondrium in den Daten. Jede Kontur wird von IMOD als eine neue Kontur innerhalb des gleichen Objekts automatisch erkannt werden.
- Unter den "Edit | Objekt "-Menü, wählen Sie"Neu", um ein neues Objekt zu erstellen. Dies erhöht die Gesamtzahl der Objekte von einem automatisch und weisen Sie diese Zahl auf das neue Objekt.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.6 und 3.7 Myofibril Konturen zu segmentieren.
- Wiederholen Sie Schritt 3,8, gefolgt von 3,6, Schritt, die Zelle Grenze sowie zu segmentieren.
- Speichern Sie die Modelldatei im Menü "Datei".
- Führen Sie die folgenden Befehle in einem Befehlszeilenfenster konvertieren Sie jedes Objekt in eine binäre Maske gruppieren, wie in Abbildung 4A-Cdargestellt.
- Extrahieren Sie ein bestimmtes Objekt aus dem Modell "Imodextract Objekt Modelfile Outputmodelfile" wo "Objekt" die Anzahl der ist zu extrahierenden Objekt.
- Erstellen Sie eine Maske für das Objekt: Imodmop-Maske 255 Outputmodelfile Imagefile outputmask.mrc
- Konvertieren Sie die Datei in ein Tif-Stack: mrc2tif -s outputmask.mrc outputmask.tif
4. Erstellen Sie ein Finite-Elemente-Netz aus den segmentierten Komponenten
- Iso2mesh ist eine frei verfügbare MATLAB-Programm, TIFF Bild Stapel in volumetrischen tetraedrischen finite-Elemente-Netze zu konvertieren. Herunterladen und iso2mesh von iso2mesh.sourceforge.net die MATLAB-Pfad hinzuzufügen.
- Laden Sie die Source-Codes und Daten RyR Cluster auf dem Netz von Github Website https://github.com/CellSMB/RyR-simulator zu simulieren.
- Starten Sie die CardiacCellMeshGenerator MATLAB-Anwendung (Abbildung 5).
- Laden Sie die verschiedenen Organelle Komponente Masken in MATLAB mit den drei Tasten auf der linken oberen Seite des GUI.
- Erstellen Sie ein weiteres binäres Bild-Stapel, die Lücken zwischen den Myofibrillen und Mitochondrien wie in Abbildung 6Aabgrenzt.
- ImageJ zu öffnen.
- Mit Hilfe der Datei | Im Dialog, die Myofibrillen und Mitochondrien TIFF-Stapel ins Programm zu laden.
- Das Bild-Zusatz-Plugin zu initiieren, durch die Auswahl "Prozess | Rechner Plus ".
- Wählen Sie die Myofibril Bildstapel als i1, die Mitochondrien Stack als i2 Bild, und wählen Sie den Operator "Hinzufügen". Klicken Sie auf "OK".
- Nachdem ein neue Bild-Stack, das Ergebnis der 4.5.4 darstellt angezeigt wird, wählen Sie "Bearbeiten | Invert"um ein Bildstapel ähnlich wie Abbildung 6Azu produzieren.
- Laden Sie die Datei mit den binären Bildstapel der Lücken zwischen den Myofibrillen und Mitochondrien durch Drücken der Taste "RyRGapsFile" auf das CardiacCellMeshGenerator-Programm.
- Drücken Sie "Erzeugen Mesh" auf der grafischen Benutzeroberfläche. Dies löst die iso2mesh Befehl v2m mit der Option "Cgalmesh", einem Tetraedernetz ähnlich wie Abbildung 4Ezu generieren. Drei Dateien werden am Ende dieses Schrittes: eine .ele-Datei, eine .face-Datei und eine .node-Datei, die die Liste der Knoten, aus denen sich die Elemente, die Knoten, aus denen sich die Gesichter und die Koordinaten der Knoten enthält , beziehungsweise.
5. mathematisch Karte die räumlich unterschiedliche Dichte von Ionenkanälen von Interesse auf der Finite-Elemente-Netz.
-
Generieren Sie die notwendigen Eingaben für RyR-Simulator durch Drücken der Taste beschriftet generieren RyR-Simulator-Eingänge auf der grafischen Benutzeroberfläche.
Hinweis: Die Schaltfläche löst eine Funktion generateRyRsimulatorInputs.m, die die folgende Informationen aus Schritt 4 verwendet, um die Eingänge zu generieren:
(1) OutDir: der Ort, um Output-Dateien, die für RyR Cluster Simulation notwendig sind.
(2) Imres: die Pixel-Auflösung in den drei Richtungen der Bild-Stacks.
(3) Myofibril_file: die Datei mit den binären Bildstapel wie in Abbildung 4 b.
(4) Sarcolemma_file: die Datei mit den binären Bildstapel wie in Abbildung 4A.
(5) Ryrgaps_file: die Datei mit den binären Bildstapel wie in Abbildung 5A.- Nachdem diese Funktion ausgeführt wird, überprüfen Sie, ob die folgenden Dateien in dem Verzeichnis angegeben als OutDir Pfad erstellt wurden:
- d_axial_micron.txt, die axialen Abstand zwischen der Position der Z-Scheibe und der Rest der Pixel im Bildstapel darstellt.
- d_radial_micron.txt, die die euklidische Entfernung (ausgenommen die axiale Komponente) von jedem Pixel im Satz möglicher RyR Cluster Standorte auf die Pixel auf der Z-Scheibe-Ebene darstellt.
- W_micron.txt, die die Liste der Raumkoordinaten aller verfügbaren Positionen darstellt, denn RyR Cluster anwesend zu sein.
- Die restlichen 3 Dateien in den Ordner enthalten das Suffix "_pixel" anstatt "_micron" zu bezeichnen, dass die Werte innerhalb dieser Dateien in Pixel Koordinaten Form geschrieben worden sein.
-
RyR Cluster Ausschüttungen auf die binäre Bildstapel der Myofibrillen zu simulieren.
- Drücken Sie die Schaltfläche "Open RyR-Simulator in R", R-Programm zu initiieren.
- Auf dem R-gui, wählen Sie "Datei | Öffnen"und suchen Sie die Datei"Settings. R"innerhalb des Pakets RyR-Simulator (RyR-Simulator/Quelle/Einstellungen. (R).
- Auch öffnen Sie die Datei Ryr-Simulator-Parallel. R (befindet sich im RyR-Simulator/Quelle/Ryr-Simulator-Parallel. (R). Umgebungen wie Rstudio (https://www.rstudio.com) oder eine einfache Kommandozeilen-Schnittstelle verwendet werden können, z.B. mit dem R64-Befehl in eine Schale oder Befehl Fenster.
- Ändern Sie die Parameter in den Einstellungen. R-Datei siehe unten:
- Die Adresse des Ordners, die Dateien in 5.1.2 für ein experimentell gewonnenen konfokale Bildstapel RyR Cluster und Myofibrillen enthält Path2 gesetzt.
Hinweis: Die Github Repository Ordner Eingabe-Dateien/Meister-Cell / bereits enthält Dateien, die erstellt wurden für eine zuvor gesammelten Bildstapel. - Legen Sie Path4 auf eine Adresse des Ordners Speicherort der Dateien, die in Schritt 5.1.2 generiert wurden.
- Sollwert Path3 in einen Ordner, wo der Benutzer die simulierten RyR Cluster Standorte gerettet werden will.
- Satz N, die Anzahl der RyR Cluster im Modell (in der Regel im Bereich von 200 bis 300) simuliert werden.
- Etol, eine Einstellung, die Differenz zwischen der experimentell gemessenen räumlichen Verteilung von RyR Clustern und das Modell simuliert räumliche Verteilung von RyR Clustern Toleranz festgelegt.
- Legen Sie NumIter, die Anzahl der Versuche beschränken, mit denen die RyR-Simulator um ein simulierte RyR Cluster Muster zu finden, die den Etol Wert gerecht wird.
Hinweis: Werte für Etol und NumIter, typische Werte in den Einstellungen festgelegt wurden. R-Datei. - Legen NumPatterns die Anzahl verschiedener RyR Cluster Muster, die die Benutzer simulieren möchte (es ist in der Regel nützliche Praxis 99 Patterns für statistische Vertrauen zu simulieren).
- Set NumCores ermöglichen die Verwendung von mehreren CPU Threads (Kerne) für schnellere Parallelverarbeitung mit R, die Punkt-Muster zu simulieren.
- Die Adresse des Ordners, die Dateien in 5.1.2 für ein experimentell gewonnenen konfokale Bildstapel RyR Cluster und Myofibrillen enthält Path2 gesetzt.
- Überprüfen Sie, ob die folgenden Pakete installiert sind mit dem Paketinstaller gui in R: Schnee, DoSNOW, Doparallel, Foreach, Iteratoren und Rgl.
- Führen Sie den Simulator durch Eingabe des folgenden Befehls im Befehlsfenster R: Quelle ("Pfad zur Ryr-Simulator-Parallel. R', Chdir = TRUE)
Hinweis: Die Ausgabe des Programms RyR-Simulator ist eine Liste von .txt-Dateien (eine NumPatterns-Datei wird generiert werden), die Koordinate Listen in N Zeilen enthalten und 3 Spalten, die die x-, y- und Z-Koordinaten der N darstellen simuliert RyR Cluster.
-
Punkte als räumliche Dichte auf ein Rechenmodell mit der CardiacCellMeshGenerator Karte.
- Durch Auswahl der Schaltfläche mit der Beschriftung "Select RyR Punktedatei", wählen Sie eine simulierte RyR Cluster Verteilung Textdatei von denen, die durch RyR-Simulator ausgegeben wurden.
- Führen Sie "RyR Dichte Mapper" auf dem GUI in MATLAB. Dies wird die räumlichen Positionen der simulierten RyR Cluster in der txt-Datei in Schritt 5.3.1 auf der finite-Elemente-Netz zuordnen, die im Schritt mit einer Methode namens eine sphärische Kernel Intensität Schätzer Methode264,8 generiert wurde.
Hinweis: Die Ausgabe von diesem Schritt ist eine Datei mit der Erweiterung .txt, die eine Liste von Werten für die numerische Dichte des ionenkanals pro Volumeneinheit sphärische bei jedem Rechennetz Knoten enthält.
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Representative Results
Abb. 2 bis Abb. 7 bieten repräsentative Ergebnisse mehrere wichtige Schritte in diesem Protokoll: (i) visualisieren und Neuausrichtung der Gewebe Blöcke für Cross-Sectional Elektronenmikroskopie Ansichten; (Ii) erzeugen einen Bildstapel 3D Elektronenmikroskopie; (Iii) Segmentierung subzellulären Ultrastruktur für Organellen von Interesse; (iv) Generierung eines finite-Elemente-Netzes mit iso2mesh; (V) simulieren eine realistische Verteilung von RyR Cluster auf dem Netz; (vi) mit anschließender Zuordnung dieser räumlichen Verteilung als eine räumliche Dichte über das Rechennetz.
Abbildung 2 zeigt typische Hellfeld-Bilder, die zeigen, wie Zellen erscheinen, wenn längs ausgerichtet (Abb. 2A, L gekennzeichnet), schräg (Abb. 2A, O gekennzeichnet) und Schraubzwinge (Abb. 2 b) in Bezug auf die Schnittebene. Schrägen und längs orientierte Proben weisen Rillen, während Schraubzwinge orientierte Proben keine Rillen aufweisen. Die Kapillaren werden auch mehr kreisförmig Querschnittansichten als in schrägen Ansichten angezeigt.
Abbildung 3A zeigt ein repräsentatives Bild von guter Qualität Tomogramm Stapel, der erworben werden kann, wenn das Gewebe Vorbereitung Protokoll in Schritt 1 gefolgt wird. Vorsicht ist geboten beim 3D-Rekonstruktion Tilt a.d.s. Mikroskop Bild durchführen. Falsche Tracking von kolloidalen Goldpartikel oder Mangel an ausreichenden Goldpartikel beeinflussen die Qualität – Bild-Kontrast und Image Fokus – von der Tomogramm erheblich. Dies beeinflusst die Möglichkeit, unterschiedliche Strukturen deutlich zu segmentieren. Sorgfalt und Erfahrung sind notwendig, um sicherzustellen, dass die Gewebe Blöcke ausreichend gefärbt sind und es eine gleichmäßige Verteilung der kolloidalen Goldpartikel durch das Gewebe Volumen ist. Im Zweifelsfall kann es sinnvoll, mit einem spezialisierten Labor oder Anlage an der örtlichen Hochschule beraten sein. Wenn Modellgeneration mit geringem Kontrast versucht wird oder nicht falsch Daten rekonstruiert, Modelle noch erzeugt werden aber die Korrespondenz der Modellierung Ergebnisse mit den Eigenschaften der biologischen Systeme simuliert werden kann arm sein. Abbildung 3 b zeigt ein repräsentatives Bild vom Aussehen einer segmentierten Modell der Myofibrillen und Mitochondrien.
Abbildung 4E zeigt eine 3D Darstellung der Tetraedergitter, die durch iso2mesh entsteht. Solange die Kernaufgaben Bild Stack und Segmentierung von guter Qualität sind, ist dieser Schritt ziemlich robust. Abbildung 6 und Abbildung 6 zeigen eine typische RyR Cluster Verteilung (in rot) innerhalb der 3D zellulären Topologie. In diesem Stadium ist das Netz selbst nicht den Eingang in die RyR Simulator. Ein Bildstapel die Zelle-Grenze und die Lücken zwischen den Myofibrillen und Mitochondrien – erzeugt aus den segmentierten Bildern in Abbildung 4 – bilden die wichtigsten Inputs in den RyR Simulator. Vorsicht ist geboten, um die Grenzen der Myofibrillen und Mitochondrien segment so genau wie möglich; ungenaue Segmentierungen ergäbe eine ungenaue Darstellung der Zelle Topologie in den Daten, die was folglich RyR Platzierung innerhalb des Netzes auswirkt. Dies würde dann die räumlich-zeitliche Dynamik des Kalziums Signalisierung in der Cardiomyocyte (Antrag 1) beeinflussen.
Abbildung 7 zeigt, dass 3 Instanzen der simulierten RyR Cluster auf dem gleichen Netz Topologie nach mit dem kugelförmigen Kernel Intensität Schätzer Algorithmus. Beachten Sie die Veränderung der Organisation der RyR Cluster. Diese Variationen haben gemessen, um innerhalb der Variabilität, die in der experimentellen Daten18gefunden wurde. Vorsicht ist bei der Auswahl der Kernel Kugel Radius und die Schrittweite, über die der Kernel die RyR Cluster Dichte Proben. Diese zwei Faktoren beeinflussen, wie stark oder diffus wird eine Darstellung der Dichte von RyR Cluster auf dem Netz dargestellt werden. Eine Analyse der Wirkung der verschiedenen Werte für diese Parameter wird auf die Wahl der Parameter für einen vernünftigen Netz eingrenzen helfen.
Das resultierende Netz von Clustern, Myofibrillen und Mitochondrien RyR ist ein minimaler Modell der Cardiomyocyte-Struktur. Dieses Netz wurde angewendet, sowie Variationen davon, die von anderen zellulären Strukturdaten, um Kalzium Dynamik und Bioenergetik zu studieren abgeleitet wurden. Ein Überblick über diese beiden Anwendungen ist unten beschrieben, um die Macht der finite-Elemente-Modellierung der Zellstruktur gaben Einblicke über Struktur-Funktions-Beziehungen zu veranschaulichen.
Anwendung 1 18 : Räumlich-zeitliche Dynamik des Kalziums in Kardiomyozyten freisetzen. Dieses Modell wurde verwendet, um die Rolle der heterogenen Verteilung von RyR Cluster Myofibrillen und Mitochondrien auf Kalzium-Signalisierung zu untersuchen. Abbildung 8 zeigt die räumlich-zeitliche Dynamik der zytosolischen Kalzium in der steigenden Phase des vergänglichen wenn auf der Netztopologie generiert aus diesem Protokoll simuliert. Abbildung 8 b zeigt die heterogenen freie Kalzium und Fluorophor-gebunden-Calcium-Konzentration im Laufe der Zeit. Die Pfeile zeigen auf kleine Flecken von hohen Kalzium durch eine höhere Dichte von RyR Clustern oder Mitochondrien in diesen Regionen. Abbildung 8 zeigt simulierte Line-Scan-Bilder, die mit experimentellen Line-Scan-Bilder von Kalzium Dynamik verglichen werden können, die in der Regel erfasst sind mit live konfokalen Mikroskopie. Die Modellsimulation bietet einen viel höheren Auflösung Blick auf die räumliche Heterogenität der Kalzium als experimentell gewonnenen Bild. Darüber hinaus inaktiviert durch das Modell von strukturellen Mikroskopie Daten abgeleitet wird, die Anzahl der Cluster, die bleiben müssen (~ 4-6) nach elektrische Aktivierung für Heterogenitäten auftreten in der konfokalen Linie-Bild genau bestimmt werden konnte. Ähnliche Heterogenitäten werden in den experimentell gewonnenen Line-Scan-Bilder von Kalzium Dynamik in Tiermodellen der Herzinsuffizienz18 beobachtet.
Anwendung 2 27 : Räumlich-zeitliche Dynamik der mitochondrialen Bioenergetik in Kardiomyozyten. Eine übergeordnete Ziel dieser Arbeit ist es, das Verhältnis zwischen Kalzium Dynamik, mitochondriale Bioenergetik und Muskelkontraktion zu studieren. Als ersten Schritt wurden Simulationen von Mitochondrien Oxidative Phosphorylierung in Isolation innerhalb der Cardiomyocyte durchgeführt. Als solche, die Verteilung von RyR Clustern ist nicht erforderlich und können nicht einfach nutzen das Netz bei Schritt 3.4. Als eine komplexere Anwendung könnte der Bioenergetik (Anwendung 2) mit Kalzium Dynamik (Antrag 1) in einem Modell gekoppelt werden, die alle Komponenten im Netz und Modellbau, d.h. Mitochondrien Myofibrillen und Ryanodin betrachtet verwendet Rezeptoren.
Abbildung 9 stellt die Ergebnisse aus dieser räumlichen Stoffwechsel-Simulationen über verschiedene Gebiete eines Netzes mit Schritt 3.4 generiert. Abbildung 9A zeigt die Sauerstoffkonzentration in der Zelle-Querschnitt, während Abbildung 9 b die Konzentration von ADP nur im Myofibril Abteil der Zelle zeigt. Abbildung 9 zeigt die Verteilung der mitochondrialen Membranpotentials über die mitochondriale Netzwerk. Diese Zahlen belegen die ungleichmäßige Verteilung der Mitochondrien und Myofibrillen in der Zelle-Querschnitt. Sie offenbaren auch die inhomogene metabolische Landschaft infolge dieser uneinheitlichen Ultrastruktur. Dies zeigt, dass die Macht der Mikroskopie Daten basierten finite-Elemente-Simulationen für Einblicke auf Struktur-Funktions-Beziehungen, die sonst schwer zu durch experimentelle Methoden allein erhalten sind.
Abbildung 1: Langendorff Vorbereitung des Herzens zur chemischen Fixierung. (A) schematische Darstellung der Langendorff Perfusion Apparat. Der Absperrhahn enthält ein Ventil zwischen Tyrode wechseln und Fixativ Lösungen. Der Becher an der Basis wird verwendet, um Lösungen zu fangen, die durch das Herz durchspülen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Prüfung Zelle Ausrichtung unter Hellfeld Mikroskopieren. (A) Hellfeld Blick auf Toluol blau gebeizt dicken Abschnitt von Herzgewebe illustrieren Zellen, die längs ausgerichtet (L) und schräg ausgerichtet (O) in Bezug auf die Abbildungsebene; Beachten Sie die Rillen in der Längsrichtung orientierte Zelle, zum Beispiel. (B) Hellfeld Blick auf eine Gewebe-Abschnitt, der die quer, Querschnitt der Zelle mit der Abbildungsebene ausgerichtet hat. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Segmentierung der Elektronenmikroskopie Daten. (A) die Momentaufnahme des manuellen Segmentierung der Mitochondrien mit dem Formen-Werkzeug. (B) ein 3D Ansicht der kompletten segmentiert manuell Mitochondrien, Myofibrillen (in einer Vielzahl von Farben) und Sarkolemm (in rosa). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: binäres Bild Stapel in 3D Tetraedernetz konvertieren. (A-C) Binäre Masken Sarkolemm, Myofibrillen und Mitochondrien, beziehungsweise. (D) zusammengeführten Blick auf die binäre Masken der Myofibrillen (in rot) und Mitochondrien (in grün). (E) repräsentative Tetraedergitter, das aus der Bild-Stack (D) iso2mesh generiert wurde. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: CardiacCellMeshGenerator. Ein Screenshot von der grafischen Benutzeroberfläche, die dieses Protokoll Publikation für die Benutzer führen Sie die Schritte 4 und 5 begleitet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: simuliert eine realistische RyR Cluster Verteilung auf einen Bildstapel segmentierten Elektronenmikroskopie der kardialen Ultrastruktur. (A) A binäres Bild Stack Darstellung die Lücken zwischen den Myofibrillen und Mitochondrien, die die Gruppe alle Pixel darstellen, wo RyR Cluster gefunden werden konnte. (B) ein 3D Rendering (Abbildung nicht maßstabsgerecht gezeichnet) eines simulierten RyR cluster-Distributionen (dargestellt als rote Kugeln) innerhalb der 3D Geometrie dargestellt im 3D-Bild Stapel; die grünen Flächen repräsentieren die Mitochondrien in den Bildstapel. (C) eine höhere-Vergrößerung (so ein kleiner Teil wird geschnitten aus der Zelle Querschnitt an den Grenzen) Blick auf die Überlagerung der RyR Cluster aus Schritt 4 und der Rechennetz aus Schritt 3 auf eine Scheibe des Stapels 3D Elektron Tomographie Bild. (B) und (C) von Rajagopal Et al.geändert wurden. 18 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: räumliche Verteilung der numerische Dichte RyR Cluster von drei simuliert RyR Cluster Muster. Alle Netzknoten sind farbcodiert von weiß für numerische Dichte von 0.0 RyR Cluster/µm3 rot für eine numerische Maximaldichte von 0,99 RyR Cluster/µm3. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 8: Räumliche Heterogenität in [Ca2 +]i in der steigenden Phase des Ca2 + vergänglichen. (A) die durchschnittliche cytosolischen frei diffundieren [Ca2 +]ich (links) und Fluo-4 gebunden Ca2 +, [F4Ca]ich (rechts). (B) und (C) zeigen Zeitraffer schnappschüße frei diffundierende Ca2 + und F4Ca an der Z-Scheibe, Querebene; Schwarze Pfeile markieren Regionen der hohen [Ca2 +]ich durch mitochondriale Cluster; rote Pfeile markieren Regionen der hohen [Ca2 +]i durch mehrere RyR Cluster in der Nähe. (C) simulierte Linie Scans [Ca2 +]ich (Mitte) [F4Ca]ich (rechts). Die Position der Zeile wird auf die Zelle Querschnitt auf der linken Seite angezeigt. Die horizontale Dimension der Zelle Querschnitt wurde als Indikator für das räumliche Ausmaß in den Querschnitten des Bildes angegeben. Diese Zahl wurde von Rajagopal Et al.modifiziert. 18 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 9: räumliche Verteilung von Metaboliten und mitochondriale Membranpotential generiert aus der räumlichen Simulation des kardialen Energiestoffwechsels. (A) Sauerstoff-Konzentration in der Zelle-Querschnitt in Einheiten von µM, (B) Konzentration von ADP nur im Myofibril Teil der Zelle in Einheiten von µM. (C) Verteilung der mitochondrialen Membranpotentials über die mitochondriale Netzwerk in Einheiten von mV. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 10: Visualisierung von einem simulierten RyR Cluster Punktemuster auf die F-Statistik-Paket. Dieses Fenster erscheint am Ende der RyR Cluster-Simulationen, Darstellung der Ersteres der simulierten Punkt-Muster. Dies kann als Indikator verwendet werden, dass RyR-Simulator sowie abgeschlossen hat, und kann die Qualität der simulierten Muster zu befragen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Chemikalien | Mengen |
| 0,2 N HCl | |
| 1 N HCl | 5 mL |
| Destilliertes Wasser | 20 mL |
| 0,15 M Natrium Cacodylate ausgleichslager | |
| Natrium cacodylate | 32,1 g [3H2O] |
| 0,2 N HCl | 25 mL |
| Machen Sie sich 1 L mit destilliertem Wasser | |
| pH 7,4 | |
| 0,3 M Natrium Cacodylate ausgleichslager | |
| Natrium cacodylate | 64,2 g [3H2O] |
| 0,2 N HCl | 25 mL |
| Machen Sie sich 1 L mit destilliertem Wasser | |
| pH 7,4 | |
| Tyrode-Lösung Zusammensetzung | |
| NaCl | 139 mM |
| KCl | 3 mM |
| CaCl2 | 3 mM |
| MgCl2 | 1 mM |
| Glukose | 12 mM |
| Nahco33 | 17 mM |
| Probenecid | 1 mM |
| BDM | 20 mM |
| NaCl/KCl/Nahco33 1 L Lösung | |
| NaCl (Molekulargewicht 58.44 g/Mol) | 81,2 g |
| KCl (Molekulargewicht 74.55 g/Mol) | 2,24 g |
| NaHCO3 (Molekulargewicht 84.01 g/Mol) | 14,28 g |
| In 1 L destilliertem Wasser auflösen | |
| MgCl2/CaCl2 1 L Lösung | |
| CaCl2 (2H2O) (Molekulargewicht 147 g/Mol) | 1,764 g |
| MgCl2 (6H2O) (203.31 g/Mol) | 0,814 g |
| In 1 L destilliertem Wasser auflösen | |
| 1 M 200 mL Glucoselösung | |
| Traubenzucker (Molmasse 180.16 g/Mol) | 36,03 g |
| In 200 mL Doppel destilliertem Wasser auflösen | |
| Tyrode-Lösung 500 mL Lösung | |
| NaCl/KCl/Nahco33 | 50 mL |
| Glukose | 6 mL |
| Doppelt destilliertes Wasser | 400 mL |
| Blase Sauerstoff in Lösung für 5 min | |
| 2 % PFA + 2,5 % Glutaraldehyd + 0,2 % tanic Säure Fixiermittel in 0,15 M Natrium cacodylate | |
| Paraformaldehyd Pulver (PFA) | 2 g |
| Tanic Säure | 0,2 g |
| Destilliertes Wasser | 20 mL |
| 25 % Glutaraldehyd | 10 mL |
| 0,3 M Natrium cacodylate | 20 mL |
| 0,15 M Natrium cacodylate | 50 mL |
| 1 N NaOH | 4 g NaOH/100 mL destilliertes Wasser |
| 4 % Uranyl-Acetat-Stammlösung | |
| Uranyl Acetat | 4 g |
| In der Nähe von kochendem doppelt destilliertes Wasser | 96 mL |
| Lösen Sie UA im in der Nähe von Bioling Wasser mit einem Rührer in einer Fumehood auf. | |
| Filtern Sie UA in braun 200 mL Flasche für Lichtschutz durch einen Whatman Nr. 1 filter | |
| Fest verschließen und beschriften, bei 4 ° C lagern | |
Tabelle 1: Reagenzien und Mengen für Gewebe Vorbereitung für Elektronenmikroskopie.
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Discussion
Das obige Protokoll beschreibt wichtige Schritte, um ein neuartiges finite-Elemente geometrischen Modell des Cardiomyocyte Ultrastruktur erzeugen. Die Methode ermöglicht rechnerische Verschmelzung der verschiedenen Mikroskopie (oder andere Daten grundsätzlich) Modalitäten eine umfassendere Computermodell der Cardiomyocyte Dynamik entwickeln, die Details der räumlichen Zellarchitektur enthält. Derzeit gibt es kein anderes Protokoll zur Verfügung, um ein solches Modell für eine Cardiomyocyte zu erstellen.
Schritt 1 beschreibt ein Protokoll zur Perfusion Fixierung. Alternativ könnte das Herz werden herausgeschnitten, in kleinere Stücke zerlegt und eingetaucht in Fixiermittel. Aber dieser Prozess muss schnell erfolgen und kann haben unterschiedliche Ergebnisse, je nach Größe der Proben. Erfahrung der Autoren sorgt Perfusion gründliche Infiltration der Fixativ in Gewebe und Zellen. Die Autoren haben auch zuvor das Herz mit Krebs-Henseliet-Lösung um das Herz durchblutet schlagen vor Fixierung. Dies ermöglicht Messungen an arbeitenden Herzen vor Fixierung.
Die Elektronenmikroskopie Verarbeitungsschritte in Schritt2 sind typisch für Elektronenstrahl-Tomographie. Die Verarbeitung Lösung Mengen, insbesondere der befleckenden Lösungen und Timings können abweichen, bei anderen bildgebenden Verfahren wie z. B. serielle-Block-Fläche Rasterelektronenmikroskopie oder Ionenstrahl-Mikroskopie28fokussiert. Die erworbenen Elektronenmikroskopie Bilder müssen in verschiedenen Organellen Regionen, wie Mitochondrien, Myofibrillen und transversale Tubuli segmentiert werden. Dies kann manuell oder automatisiert durchgeführt werden. Der Kontrast in den Bildstapel ist teilweise abhängig von dem Erfolg des Protokolls Färbung, aber einige von diesen Kontrast geht verloren, wenn Tomographie durchführen. Dieses Protokoll beschreibt manuelle Schritte zur Segmentierung der unterschiedlichen Strukturen, obwohl neue Methoden, um automatische Segmentierung29 durchzuführen günstiger im Allgemeinen werden Datendurchsatz zu verbessern.
Die wichtigsten Eigenschaften in der Elektronenmikroskopie-Dataset zu prüfen sind die Bild-Kontrast und Struktur-Erhaltung. Die Färbung Rezept und das Harz einbetten Mischungen in diesem Protokoll wurden für hohen Kontrast zwischen den Z-Scheiben aus den Herzmuskelzellen Myofibrillen und Mitochondrien verfeinert. Zum Beispiel haben die Autoren Calciumchlorid anstelle von Gerbsäure in Schritt 1.2 früher das sarcoplasmic Retikuläre Netzwerk abzugrenzen. Dies half bei der Ermittlung der äußeren Grenzen der Myofibril Bündel während Organelle Segmentierung. Zusätzliche Färbung chemischen Komponenten und Zeiten können auch verwendet werden, für die Visualisierung von membranstrukturen, wie dem sarkoplasmatischen Retikulum oder quer-axial Tubuli30.
Die Bilder müssen auch strukturelle Degradation untersucht werden. Schlechte Fixierung oder Elektronenmikroskopie Verarbeitung kann in schweren Verlust von Mitochondrien Cristae, hoher Anteil an verdrängt oder geschwollenen Mitochondrien und Zerfall von Teilen der Zellmembran (Sarkolemm) führen. Eine näherte und sorgfältige Untersuchung kann auch Verlust der t-Rohr zeigen und SR Membranen, sind aber weniger offensichtlich für das ungeübte Auge. Lösungen für dieses Problem gehören: (i) eine gründliche Perfusion; (Ii) zerlegen das Gewebe in kleine Proben, die auch tiefes Eindringen der Fixiermittel und Flecken zu gewährleisten; (Iii) sicherstellen, dass die Elektronenmikroskopie Verarbeitung im kalten Lösungen oder auf Eis erfolgt überall dort, wo angegeben; und (iv) um sicherzustellen, dass die Timings zum Beizen und Dehydrierung (Austrocknung insbesondere) strikt eingehalten werden.
Eine typische Cardiomyocyte ist ~ 20 µm im Durchmesser Querschnitt und ~ 100 µm in der Länge. Dies macht imaging ganzes Herzzellen eine große Herausforderung dar. Darüber hinaus erschwert die wechselnden Ausrichtung der Muskelfasern innerhalb der Herzen31 weiter den Erwerb eines Bildes Volume die transversalen und longitudinalen Achsen einer Zelle von Interesse deren Achsen ausgerichtet sind. Bild-Analyse-Programmen wie IMOD ermöglichen synthetische Neuausrichtung der Daten in eine gewünschte Richtung. Jüngste Fortschritte in seriellen Block-Gesicht scanning Electron Microscopy28 und damit verbundenen Bildverarbeitungs-Algorithmen29 auch dazu beitragen, diese Probleme zu beheben. Dennoch, sorgfältige Prüfung der Dicke Abschnitte unter einem Lichtmikroskop und anschließende Neuorientierung des Blocks (Schritt 2.5) erhöht die Wahrscheinlichkeit von Zellen mit günstigen Ausrichtung der Längs- und Querrichtung Achsen mit der Bildgebung imaging Achsen. Dadurch wird sichergestellt, dass die meisten das Zellvolumen in das Blickfeld erfasst werden werden.
Protokoll-Schritte 3, 4 und 5 benötigen Software aufgeführt in der Tabelle der Materialien installiert werden. IMOD, R-Statistik-Paket, iso2mesh und Fidschi (eine Version von ImageJ für Mikroskopie-Daten) haben umfangreiche Dokumentation und Tutorials auf wie man sie benutzt. CardiacCellMeshGenerator ist eine MATLAB-Anwendung, die entwickelt wurden, um es einfacher für den Anwender zur Erstellung des Modells in einem einfachen Workflow. Benutzer können den gesamten Quellcode und Anwendungspaket von Github RyR-Simulator Repository Link (https://github.com/CellSMB/RyR-simulator/tree/JoVE) herunterladen. Die Anwendung, CardiacCellMeshGenerator.miappinstall, kann in MATLAB als app installiert werden. Die Eingaben für das Netz in diesem Protokoll generiert finden Sie innen RyR-Simulator/Eingabe-Dateien /-Tomo-Zielzelle /, während die zusätzliche Eingänge für RyR-Cluster-Simulator be inside RyR-Simulator/Eingabe-Dateien/Meister-Zelle found can /. Vor der Einleitung der app, sollten Benutzer sicherstellen, dass die installierten iso2mesh-Ordner und seine Unterordner die MATLAB-Pfad hinzugefügt wurden. In ähnlicher Weise sicherzustellen Sie, dass die R-Pakete notwendig (Table of Materials) für die Cluster-Simulator auch in R. installiert wurden
Ein Fortschrittsbalken worden in der app das Netz zu generieren, wenn Sie die Eingaben für die RyR Cluster Simulator zu generieren, als beim Zuordnen von RyR Cluster dichten auf dem Netz mit RyR Dichte Mapper aufgenommen; die app rendert 3D-Netz in der GUI, wenn die Netz-Generation Schritt abgeschlossen hat. Nach Abschluss die RyR Cluster-Simulationen auf das R-User-Interface, ein grafische Fenster erscheint (Abbildung 10), Darstellung eines simulierten 3D RyR Cluster Punkt Muster.
Die Schaltfläche "Generieren Mesh" auf dem GUI löst die iso2mesh-Funktion, um einem Tetraedernetz zu generieren. Die modellauflösung kann durch Parametrierung der "iso2mesh" auf der grafischen Benutzeroberfläche, die maximale tetraedrischen Volumen und Edge Elementlänge anpassen eingestellt werden. Das Programm unterscheidet derzeit Elemente, aus denen sich die Myofibril-Region und die Mitochondrien-Regionen; Dieses Feature wird erweitert und weitere Komponenten der Zelle in der Zukunft sind.
Benutzer können 3D-Rendering des Netzes und die RyR Cluster verwenden, um diese Schritte zu beheben. Die RyR Simulation Clustereinstellungen, Etol und NumIter, im Inneren Einstellungen. R beeinflussen die Genauigkeit der RyR-Cluster-Simulationen; Diese beiden Parameter bestimmen, wann eine RyR Cluster Muster Simulation beendet. Diese Parameter können bei Betrachtung der Verteilung der RyR Cluster im Fenster "R" (Abbildung 10) angepasst werden, um sicherzustellen, dass: (i) alle Cluster sind in der Nähe von den Z-Scheiben; und (Ii) die Cluster verteilen sich über den gesamten Querschnitt, anstatt in einer Region aggregieren. Eine ad-hoc- Sensitivitätsanalyse der Simulationen auf diese beiden Parameter kann durchgeführt werden, um eine geeignete Kombination von Etol und NumIter zu bestimmen.
Die kugelförmige Kernel Intensität Schätzer in Schritt 5 verwendet eine Sphäre des gewählten Durchmesser als ein Kernel, der über das Volumen von Interesse (die räumliche 3D-Modell in diesem Zusammenhang) übergeben wird. Diese Parameter sind einstellbar für diese Glättung Algorithmus auf die GUI in Abbildung 5: (1) R_sphere definiert den Radius des kugelförmigen Kernel glätten; (2) Hval definiert die iterative räumliche Schrittweite über die iterativ über das Volumen der sphärische Kernel übergeben werden muss.
Eine einfache Methode um festzustellen, ob die räumliche Dichte Parameter ausreichen ist, überprüfen Sie die Verteilung der RyR Cluster Dichtewerte wie in Abbildung 7dargestellt. Die Dichtewerte sollten verteilt werden, so dass die Nachbarschaft von hoher Dichtewerte ähnlicher Größe auf die Größe eines Clusters RyR Mikroskopie Daten ist.
Das aktuelle Protokoll produziert ein finite-Elemente-Modell, nur die realistische Verteilung der Myofibrillen und Mitochondrien RyR Cluster enthält. Eine Erweiterung zu diesem Schritt wäre die Verteilung von anderen Ionenkanälen zu simulieren, die bei ECC, wie Sarco endoplasmic retikulären Calcium Pumpen (SERCA2a), Natrium-Calcium-Austauscher (NCX) und die sarcolemmal Kalzium Pumpen eine Rolle spielen. Der Schlüssel zu diesen Erweiterungen ist eine Analyse der räumlichen Verteilung von Ionenkanälen von Immunfluoreszenz Daten. Zum Beispiel NCX Kanäle gemessen wurden über die t-Rohrmembranen bei einem durchschnittlichen Abstand von 0,67 µm gleichmäßig verteilt werden, aber ihre Beziehung zu RyR Clustern ist nicht so klar32. Auf der anderen Seite SERCA2a targeting Antikörper zuvor verwendet wurden, um die SR33markieren, aber nicht die räumliche Dichte der SERCA2a wurden in der Literatur beschrieben. Daher in diesem Stadium kann eine gleichmäßige Verteilung des SERCA 2A über das SR-Netzwerk und NCX über die t-Tubuli mit Vorsicht ausgegangen werden.
Wie in den Vertreter Ergebnissen gezeigt, das daraus resultierende finite-Elemente-Netz mit finite-Elemente-Berechnungen34 lässt sich biochemische Prozesse wie Calcium signaling18 und Bioenergetik27 als Reaktion-Diffusion simulieren Prozesse. Zu diesem Zweck werden Ionenkanäle als Reaktion Websites an Knoten innerhalb der Netztopologie dargestellt. Die Reaktion Websites dienen als Quellen oder senken der verschiedenen chemischen Spezies um den Fluss chemischer Spezies durch diese Ionenkanäle in verschiedenen Kompartimenten der Zelle darzustellen. Die Ausgabe Mesh und RyR Dichte Dateien aus diesem Protokoll können mit anderen Integrator oder in jeder anderen Umgebung verwendet werden vorausgesetzt, dass die Software die Funktion, diese Text-Dateien zu erkennen. Text-Dateien können auch durch Skripte oder Software eines Drittanbieters für input-Datei Format Anforderungen des Umfelds der Wahl manipuliert werden. Die erste Anwendung auf Kalzium Dynamik zeigt nur die Nützlichkeit dieses Modell für die Kalzium-Aufstrich, aber dies bedeutet nicht, dass das Netz für längeren Zeitskalen verwendet werden kann. Die Mesh und Cluster dichten lässt sich simulieren mehrere Kalzium-Zyklen mit der Aufrechterhaltung der Homöostase und Stabilität nur abhängig von der finite-Elemente-Solver, der verwendet wird.
Ein längerfristiges Ziel ist, diese Pipeline Modellbau um zu machen, einfache Erstellung strukturell genau finite Elemente Modelle von Kardiomyozyten und anderen Zelltypen zu verbessern. Ein automatischer Segmentierungsalgorithmus wurde vor kurzem entwickelt die auf seriell-Block-Scan Elektronenmikroskopie Gesichtsdaten von Kardiomyozyten zum Erstellen eines Modells der Myofibrillen und Mitochondrien Verteilung in der gesamten Zelle mit minimalem Benutzer angewendet werden können Eingabe29. Diese Methode wird erweitert um die t-Röhrchen und SR Membran Netzwerke in Zukunft zu segmentieren. Eine allgemeinere Version des RyR-Simulator-Algorithmus, der es Benutzern ermöglichen, analysieren und simulieren Co Standorte zwischen Ionenkanal und Organellen, sowie zwischen verschiedenen Ionenkanal-Typen in einer Hochdurchsatz-Mode ist auch in der Entwicklung. Ein nahtloses Protokoll für den Aufbau eines vollständigen Modells der Zelle würde Wissenschaftlern modellbasierte Hypothesen Tests auf die Beziehung zwischen Zellaufbau und Zellfunktion mehr routinemäßig durchführen, als derzeit mit experimentellen Ansätzen ermöglichen. allein.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Royal Society von New Zealand Marsden schnell starten Grant 11-UOA-184, Human Frontiers Science Programm Research Grant RGP0027/2013 und die australische Forschung Rat Discovery Project Grant DP170101358 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 25% Glutaraldehyde EM Grade (500 ml bottle) | Merck | 354400-500ML | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Tannic Acid | Sigma-Aldrich | 403040-500G | 100g EM grade |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4593 | |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | 75632-10ML | 4% in water, 5 ml bottle (or 10 ml bottle also available) |
| Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 | 25g bottle |
| Potassium Ferrocyanide | Merck Millipore | 104973 | |
| Toluene blue | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Borax | Sigma-Aldrich | S9640 | also termed sodium borate |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | Diluted to different percentages with pure water |
| Acetone | EM Sciences | RT10017 | |
| Resin kit | EM Sciences | 14040 | ACM Durcupan works well |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1Normal solution |
| Equipment | |||
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscope | ThermoFisher Scientific | Tecnai F30 | http://www.leica-microsystems.com/ |
| Retort stand | Proscitech | T752 | |
| Tubing | BioStrategy | 75831-346 | for langendorff perfusion apparatus, 3 mm diameter is recommended but not essential |
| Stopcocks | SDR | QP13813 | for langendorff tubing; product is only an example, user can select any |
| retort stand clamps | Proscitech | T715 | |
| Plastic syringes | SDR | QPC1108 | for solutions on langendorff apparatus |
| Cannulation silk suture, 7-0 | TeleFlex | 15B051000 | for tieing heart on langedorff apparatus |
| Cannula | Made from 3 mm outer-diameter steel needle | ||
| Rubber petri dish mat | Proscitech | H068 | for use as cutting board during fixed-heart dissection |
| Razor blades | Proscitech | L056 | for cutting fixed-heart into small blocks for EM processing |
| Glass bottles | BioStrategy | 89000-236 | for storing solutions during tissue fixation and processing for EM |
| Beakers | BioStrategy | 213-0477 | for storing solutions temporarily and during perfusion |
| Scintillation vials | BioStrategy | 548-2170 | for tissue samples during EM processing |
| Dissection kit | Proscitech | T161 | for animal dissection |
| Syringe Filters | Proscitech | WS3-02225S | for purification of Uranyl Acetate |
| Aluminium/silver foil baking cups | From any baking products store | ||
| Dupont Diamond knife | BioStrategy | 102680-780 | 35 degree angle version produces best sections. |
| Colloidal Gold | BBI Solutions | EM. GC15 | 15 nm colloidal gold |
| EM mesh grids | Proscitech | GCU150 | a variety of sizes can be tested: GCU150h, GCU200h for example |
| Plastic disposal pippettes | Proscitech | LCH20 | best to use plastic disposables especially when working with resin |
| Software | |||
| SerialEM | University of Boulder | tomography acquisition | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| IMOD | University of Boulder | image alignment and segmentation | |
| iso2mesh | available at http://iso2mesh.sourceforge.net | ||
| Fiji or similar image processing software | ImageJ | Fiji is Just Image J | available at https://fiji.sc for manipulation of binary image stacks |
| RyR-Simulator codes/data | CellSMB group | available at https://github.com/CellSMB/RyR-simulator | |
| CardiacCellMeshGenerator | CellSMB group | comes with RyR-Simulator under folder "gui-version" | |
| R-statistics software | R-project | Download from https://www.r-project.org | |
| spatstat | R-project | install via R program | |
| rgl | R-project | install via R program | |
| doparallel | R-project | install via R program | |
| foreach | R-project | install via R program | |
| doSNOW | R-project | install via R program | |
| iterators | R-project | install via R program |
References
- Noble, D., Rudy, Y. Models of cardiac ventricular action potentials: iterative interaction between experiment and simulation. Phil. Trans. R. Soc. A: Math., Phys. and Eng. Sci. 359 (1783), 1127-1142 (2001).
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